血 管 性 血 友 病 因 子 裂 解 酶 抗 原 及 活 性 与 年 龄 及 性 别 1 的 关 系 分 析 * 董 宁 征, 季 顺 东, 阮 长 耿 苏 州 大 学 附 属 第 一 医 院, 江 苏 省 血 液 研 究 所, 江 苏 苏 州 (215006) E-mail:changgengruan@hotmail.com 摘 要 : 目 的 : 通 过 检 测 健 康 体 检 者 血 浆 中 ADAMTS13 的 抗 原 及 活 性, 比 较 不 同 性 别 和 年 龄 组 间 ADAMT13 的 抗 原 及 活 性 的 差 别, 分 析 ADAMTS13 与 年 龄 及 性 别 的 关 系, 为 ADAMTS13 相 关 疾 病 的 判 断 提 供 依 据 方 法 : 用 Frests-VWF73 试 剂 盒 检 测 血 浆 中 ADAMTS13 的 活 性 ; 用 夹 心 酶 联 免 疫 反 应 试 剂 盒 (ELISA) 检 测 ADAMTS13 抗 原 含 量 结 果 : 各 年 龄 组 ADMATS13 的 活 性 均 值 无 显 著 差 异 ; 而 ADAMTS13 抗 原 量 随 年 龄 的 改 变 而 改 变, 21-40 岁 年 龄 组 最 高, 为 109.7 ± 23.3 %, 在 60 岁 以 上 组 及 低 龄 组 (16-20 岁 ) 显 著 降 低 ; ADAMTS13 的 抗 原 及 活 性 水 平 在 男 女 性 别 间 无 显 著 差 异 关 键 词 : 血 管 性 血 友 病 因 子 裂 解 酶 ; 抗 原 ; 活 性 ; 年 龄 ; 性 别 血 管 性 血 友 病 因 子 裂 解 酶 (ADAMTS13) 是 一 种 调 控 血 管 性 血 友 病 因 子 (vwf) 结 构 与 功 能 的 金 属 蛋 白 酶, 其 作 用 于 vwfa2 区 842 位 酪 氨 酸 与 843 位 蛋 氨 酸 之 间 的 肽 键, 将 VWF 单 体 裂 解 为 相 对 分 子 量 为 170 10 3 和 140 10 3 的 两 个 片 段 [1] ADAMTS13 活 性 的 变 化 与 多 种 生 理 病 理 状 态 下 相 关,ADAMTS13 活 性 的 缺 乏, 系 血 栓 性 血 小 板 减 少 性 紫 癜 (TTP) 发 病 的 主 要 机 制, 也 是 诊 断 TTP 的 重 要 标 准 ADAMTS13 抗 原 及 活 性 在 不 同 年 龄 正 常 人 群 的 分 布 情 况, 及 其 与 性 别 的 关 系, 国 内 外 研 究 资 料 甚 少, 国 外 仅 有 文 献 报 道 ADAMTS13 活 性 与 年 龄 的 关 系 [2] 本 文 旨 在 研 究 ADAMTS13 与 年 龄 及 性 别 的 关 系, 为 临 床 疾 病 的 判 断 提 供 依 据 1. 对 象 及 方 法 1.1 研 究 对 象 健 康 体 检 者 共 87 例, 年 龄 l6~78 岁, 平 均 年 龄 (45.3±21.4) 岁 ; 男 性 44 例, 年 龄 16~78 岁, 平 均 (45.0±21.6) 岁 ; 女 性 43 例, 年 龄 l7~75 岁, 平 均 年 龄 (42.6±21.2) 岁, 均 无 血 栓 性 疾 病 史 正 常 人 混 合 血 浆 取 自 40 例 献 血 员 1.2 方 法 1.2.1 血 样 标 本 采 集 和 保 存 : 取 静 脉 血, 使 用 0.129mol/L 的 枸 橼 酸 钠 抗 凝, 采 集 后 均 3000rpm 离 心 5 分 钟, 分 离 血 浆, 分 装 后 冻 存 -30 备 用 1.2.2 ADAMTS13 活 性 的 测 定 [3] 应 用 Frets-VWF73 试 剂 盒 ( 购 自 日 本 Peptide Institute) 检 测 ADAMTS13 的 活 性 根 据 试 剂 盒 使 用 说 明 进 行 操 作, 使 用 前 依 次 加 入 37µl DMSO 和 117µl 水 溶 解 荧 光 标 记 的 ADAMTS13 底 物 Frets-VWF73, 用 反 应 缓 冲 液 (5 mm Bis-Tris, 25mM CaCl 2, 0.05%Tween-20, ph 6.0) 稀 释 正 常 人 混 合 血 浆 和 待 测 样 本 (1:25 稀 释 ), 加 入 96 孔 板, 每 孔 100 µl, 随 后 每 1 本 课 题 得 到 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 (30470732) 教 育 部 博 士 点 基 金 (20040285003) 和 苏 州 大 学 附 属 第 一 医 院 血 液 学 135 工 程 重 点 学 科 开 放 课 题 基 金 (135XY0406) 的 资 助 -1-
孔 再 加 入 100µl 的 底 物 ( 终 浓 度 为 2 µm) 检 测 荧 光, 连 续 检 测 1h, 每 5 分 钟 测 一 次 以 不 同 比 例 稀 释 的 正 常 人 混 合 血 浆 作 标 准 曲 线, 计 算 待 测 样 品 ADAMTS13 的 活 性 水 平 1.2.3 ADAMTS13 抗 原 的 测 定 [4] 用 三 抗 体 夹 心 ELISA 法 ( 试 剂 盒 由 比 利 时 Leuven 大 学 血 栓 研 究 室 提 供 ) 检 测 ADAMTS13 抗 原 水 平 具 体 方 法 如 下, 使 用 抗 ADAMTS13 单 克 隆 抗 体 2G3(4µg/ml) 包 被 96 孔 板,4 过 夜 以 一 定 比 例 稀 释 的 正 常 人 混 合 血 浆 作 标 准 曲 线 50µl 患 者 血 浆 按 1/4, 1/8,1/16 稀 释, 加 入 每 孔 37 孵 育 1h 一 抗 为 2 株 生 物 素 标 记 的 抗 ADAMTS13 单 克 隆 抗 体 13F7 8C10, 混 合 后 浓 度 1µg/ml, 室 温 孵 育 1h 加 1/15000 稀 释 的 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 Avidin(Sigma 公 司, 美 国 ), 室 温 孵 育 1 小 时 使 用 邻 苯 二 胺 显 色 1.5M 的 硫 酸 终 止 反 应 酶 标 仪 读 取 490nm 条 件 下 的 吸 光 度 值 计 算 待 测 样 品 ADAMTS13 的 抗 原 水 平 1.2.4 统 计 学 方 法 以 SPSS6.0 软 件, 以 ANOVA 进 行 组 间 比 较 检 验, 各 组 结 果 以 x ± s 表 示 2. 结 果 2.1 不 同 年 龄 组 正 常 人 血 浆 中 ADAMTS13 抗 原 和 活 性 的 测 定 : 87 例 健 康 体 检 者 中, ADAMTS13 抗 原 最 低 值 为 60.8 % mu/ml, 最 高 值 为 141.%, 平 均 值 为 90.8 ± 24.2%; 活 性 平 均 值 为 82.1± 14.8 %, 最 低 值 为 46.3%, 最 高 值 为 119.0% 正 常 人 群 中 ADAMTS13 抗 原 及 活 性 均 无 极 端 值 出 现 不 同 年 龄 组 人 群 血 浆 中 ADAMTS13 的 抗 原 及 活 性 测 定 结 果 见 表 1 及 图 1 各 年 龄 组 ADMATS13 的 活 性 均 值 无 显 著 差 异 ; 而 ADAMTS13 抗 原 量 随 年 龄 的 改 变 而 改 变,21-40 岁 年 龄 组 达 到 最 高 值 109.7 ± 23.3 %, 在 60 岁 以 上 组 及 低 龄 组 (16-20 岁 ) 抗 原 量 显 著 降 低, 与 21-40 岁 年 龄 组 相 比, 差 异 显 著,p<0.01 表 1 不 同 年 龄 组 正 常 人 血 浆 中 ADAMTS13 抗 原 和 活 性 ( x±s) 年 龄 组 例 数 ADAMTS13 活 性 % ADAMTS13 抗 原 % 16-20 20 80.8 ± 15.9 76.0 ± 12.8 21-40 29 81.1 ± 14.3 109.7 ± 23.3 41-60 15 77.9 ± 16.7 99.3 ± 22.4 > 60 23 87.3 ± 12.4 74.5 ± 11.4 与 21-40 岁 年 龄 组 相 比 p<0.01, 差 异 显 著 -2-
% ADAMTS13 relative to NHP 140 120 100 80 60 40 20 0 ** ** antigen Activity 16-20 20-40 41-60 >60 Fig1: ADAMTS13 antigen and activity in different age groups ** 与 21-40 岁 年 龄 组 相 比 p<0.01, 差 异 显 著 2.2 不 同 性 别 组 血 浆 中 ADAMTS13 抗 原 和 活 性 的 测 定 : ADAMTS13 抗 原 量 及 活 性 水 平 与 性 别 的 关 系 见 图 2, 男 性 血 浆 中 ADAMT13 的 抗 原 及 活 性 水 平 均 分 别 为 87.1 ± 21.9 % 和 80.8 ± 14.3 %, 低 于 女 性 人 群 ( 抗 原 和 活 性 分 别 为 94.7 ± 26.8 % 和 86.1 ± 17.2 %, 但 性 别 间 的 差 异 无 统 计 学 意 义 % ADAMTS13 relative to NHP 140 120 100 80 60 40 20 0 female male antigen activity Fig. 2. ADAMTS13 antigen and activity in females and males 3. 讨 论 ADAMTS13 活 性 的 改 变 见 于 多 种 生 理 及 病 理 条 件, 活 性 明 显 降 低 见 于 大 部 分 TTP 患 者 (ADAMTS13 基 因 突 变 或 机 体 产 生 抗 ADAMTS13 的 抗 体 ), 新 生 儿 肝 炎 慢 性 肾 功 能 不 全 急 性 炎 症 外 科 大 手 术 后 及 老 年 人 也 可 见 ADAMTA13 活 性 的 降 低 [2], 其 活 性 的 增 高 见 于 ITP 患 者 [5] 而 ADAMTS13 抗 原 的 变 化 仅 见 于 遗 传 性 及 获 得 性 TTP 患 者 [6] 不 同 年 龄 组 及 性 别 间 ADAMTS13 的 变 化 情 况 国 内 尚 无 研 究 报 告 -3-
本 研 究 对 不 同 年 龄 组 及 性 别 间 正 常 人 血 浆 中 ADAMTS13 抗 原 和 活 性 进 行 了 测 定, 结 果 发 现 各 年 龄 组 ADMATS13 的 活 性 均 值 无 显 著 差 异 ; 而 ADAMTS13 抗 原 量 随 年 龄 的 改 变 而 改 变,21-40 岁 年 龄 组 最 高, 为 109.7 ± 23.3 %, 在 60 岁 以 上 组 及 低 龄 组 (16-20 岁 ) 显 著 降 低 ;ADAMTS13 的 抗 原 及 活 性 水 平 在 男 女 性 别 间 无 显 著 差 异 在 国 际 上 首 次 报 道 了 ADAMTS13 的 抗 原 与 年 龄 性 别 的 关 系, 而 ADAMTS13 活 性 与 年 龄 的 关 系 也 不 同 于 以 前 国 外 的 报 道 [2] 本 研 究 结 果 之 一,ADAMTS13 活 性 与 年 龄 的 关 系, 即 各 年 龄 组 ADMATS13 的 活 性 无 显 著 差 异, 不 随 年 龄 的 增 大 而 降 低, 不 同 于 国 外 的 报 道 [2] 可 能 的 原 因 有 :1. 人 种 的 不 同, 文 献 显 示, 中 国 汉 族 人 群 ADAMTS13 的 抗 原 量 显 著 低 于 高 加 索 人 [5],ADAMTS13 基 因 的 某 些 多 态 性 分 布 也 不 同 于 西 方 人 群 及 日 本 人 群 [7] ;2. 检 测 方 法 的 不 同,ADAMTS13 活 性 检 测 方 法 有 多 种 [8], 以 前 多 采 用 残 余 胶 原 结 合 试 验 [9] ( 也 采 用 该 法 ), 该 法 血 浆 需 要 置 于 含 尿 素 的 缓 冲 液 中 透 析, 可 能 的 影 响 因 素 较 多, 故 目 前 国 际 上 多 采 用 方 便 重 复 性 好 的 Frets-VWF73 法, 即 本 文 采 用 的 检 测 方 法 本 研 究 的 结 果, 提 供 了 不 同 年 龄 段 ADAMTS13 活 性 及 抗 原 的 范 围, 排 除 了 性 别 对 ADAMTS13 的 影 响, 为 ADAMTS13 的 变 化 的 判 断 提 供 依 据, 也 为 不 同 年 龄 段 患 者 的 诊 断 提 供 一 定 的 依 据, 有 一 定 的 临 床 应 用 价 值 致 谢 本 研 究 所 使 用 的 ADAMTS13 抗 原 试 剂 盒 为 比 利 时 Leuven 大 学 Hans Deckmyn 教 授 所 在 研 究 室 提 供, 实 验 中 得 到 Hendrik B Feys 的 协 助, 在 此 深 表 感 谢 -4-
参 考 文 献 1. Dong, J.F., Structural and functional correlation of ADAMTS13. Curr Opin Hematol, 2007. 14(3): p. 270-6. 2. Mannucci, P.M., et al., Changes in health and disease of the metalloprotease that cleaves von Willebrand factor. Blood, 2001. 98(9): p. 2730-5. 3. Kokame, K., et al., FRETS-VWF73, a first fluorogenic substrate for ADAMTS13 assay. British Journal of Haematology, 2005. 129(1): p. 93-100. 4. Feys HB, L.F., Dong N, Pareyn I, Vauterin S, Vandeputte N, Noppe W, Ruan C, Deckmyn H, Vanhoorelbeke K., ADAMTS-13 plasma level determination uncovers antigen absence in acquired thrombotic thrombocytopenic purpura and ethnic differences. J Thromb Haemost., 2006. 4((5)): p. 955-62. 5. Liu, F., et al., Alteration of ADAMTS13 antigen levels in patients with idiopathic thrombotic thrombocytopenic purpura, idiopathic thrombocytopenic purpura and systemic lupus erythematosus. Thromb Haemost, 2006. 95(4): p. 749-50. 6. Feys, H.B., et al., ADAMTS-13 plasma level determination uncovers antigen absence in acquired thrombotic thrombocytopenic purpura and ethnic differences. J Thromb Haemost, 2006. 4(5): p. 955-62. 7. Gao, W.D.L., Su J, Wang ZY, Ruan CG, The frequency of P475S polymorphism in von Willebrand factor-cleaving protease in the Chinese population and its relevance to arterial thrombotic disorders. Thrombosis and Haemostasis., 2004. 91: p. 1257-1258. 8. Tripodi, A., et al., Measurement of von Willebrand factor cleaving protease (ADAMTS-13): results of an international collaborative study involving 11 methods testing the same set of coded plasmas. J Thromb Haemost, 2004. 2(9): p. 1601-9. 9. Rick, M.E., et al., Clinical use of a rapid collagen binding assay for von Willebrand factor cleaving protease in patients with thrombotic thrombocytopenic purpura. Thromb Haemost, 2002. 88(4): p. 598-604. Determination of ADAMTS13 antigen and activity levels in different age and gender groups of normal control Dong Ningzheng, Ji Shundong, Ruan Changgeng*. Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou, Jiangsu (215006) Abstract AIM: ADAMTS13 is a metalloproteases regulated for von Willebrand factor multimers (VWF) size in plasma, but there is little knowledge on the behavior of the proteases in many physiological conditions. In this study, we investigated the ADAMTS13 antigen levels and activity in 87 normal controls, and analysis the relations of ADAMTS13 antigen and activity levels with age and gender, provide important knowledge to diagnosis ADAMTS13 related diseases. Methods: ADAMTS13 activity levels were detected by new developed Frests-VWF73 kits, ADAMTS13 antigen levels were analyzed by ELISA kits. Results: In the whole group of 87 healthy control, the range of ADAMTS13 activity is from 46.3% to 119.0%, and antigen is from 60.8% to 141.9%. There is no significant difference of ADAMTS13 acitivity levels in different age groups, but the antigen levels were changed with age, it reached the highest level in the age groups 21 to 40 years (109.7 ± 23.3 %), and it was significant lower in groups old than 60 years and groups 16 to 20 years; Neither antigen levels nor activity levels of ADAMTS13 were different from males and females. Keywords: ADAMTS13; antigen; activity; age; gender -5-