食 品 中 動 物 性 成 分 檢 驗 - 猪 成 分 之 定 性 檢 驗 修 正 總 說 明 為 加 強 食 品 中 動 物 性 植 物 性 成 分 之 管 理, 並 依 據 食 品 衛 生 管 理 法 第 三 十 八 條 規 定 : 各 級 主 管 機 關 執 行 食 品 食 品 添 加 物 食 品 容 器 或 包 裝 及 食 品 用 洗 潔 劑 之 檢 驗, 其 檢 驗 方 法, 由 中 央 主 管 機 關 定 之, 爰 擬 具 食 品 中 動 物 性 成 分 檢 驗 - 猪 成 分 之 定 性 檢 驗, 其 修 正 要 點 如 下 : 一 修 正 英 文 標 題 二 刪 除 PCR 試 驗 相 關 內 容, 包 含 裝 置 試 藥 器 具 及 材 料 試 劑 之 配 製 及 鑑 別 試 驗 三 修 正 鑑 別 試 驗 用 引 子 及 探 針 四 修 正 對 照 用 物 質
食 品 中 動 物 性 成 分 檢 驗 - 猪 成 分 之 定 性 檢 驗 修 正 對 照 表 修 正 規 定 現 行 規 定 說 明 食 品 中 動 物 性 成 分 檢 驗 方 法 猪 成 分 之 定 性 檢 驗 Method of Test for Animal-Derived Ingredients in Foods-Qualitative Test of Swine Ingredient 1. 適 用 範 圍 : 本 檢 驗 方 法 適 用 於 食 品 中 猪 成 分 之 定 性 檢 驗 2. 檢 驗 方 法 : 檢 體 經 DNA 萃 取 後, 以 即 時 聚 合 酶 鏈 反 應 (real-time polymerase chain reaction, real-time PCR) 之 方 法 2.1. 工 作 環 境 : 工 作 平 台 需 寬 敞 潔 淨 光 線 良 好 檢 體 前 處 理 檢 體 DNA 抽 取 real-time PCR 試 劑 配 製 及 檢 驗 過 程 皆 需 有 區 隔 空 間, 避 免 交 叉 污 染 Real-time PCR 試 劑 之 配 製 應 於 無 菌 操 作 台 內 進 行 ( 註 1) 2.2. 裝 置 2.2.1. 即 時 聚 合 酶 鏈 反 應 器 :ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System 或 Roche LightCycler, 或 同 級 品 2.2.2. 冷 凍 乾 燥 裝 置 : 溫 度 可 達 -40 以 下, 真 空 度 可 達 133 mbar 以 下, 供 檢 體 乾 燥 用 2.2.3. 振 盪 型 粉 碎 機 :Retsch MM200, 或 同 級 品 2.2.4. 真 空 乾 燥 裝 置 : 供 DNA 乾 燥 用 2.2.5. 高 壓 滅 菌 釜 2.2.6. 無 菌 操 作 台 2.2.7. 加 熱 振 盪 器 : 具 55 溫 控 及 振 盪 功 能 2.2.8. 微 量 冷 凍 離 心 機 (Micro refrigerated centrifuge): 可 達 20000 g, 並 具 4 溫 控 功 能 2.2.9. 離 心 機 : 供 各 式 微 量 離 心 管 離 心 用 2.2.10. 分 光 光 度 計 : 具 波 長 260 nm 280 nm 食 品 中 動 物 性 成 分 檢 驗 方 法 猪 成 分 之 定 性 檢 驗 Method of Test for Animal-Derived Ingredients in Foods-Qualitative Test of Swine Ingredients 1. 適 用 範 圍 : 本 檢 驗 方 法 適 用 於 食 品 中 猪 肉 猪 心 猪 肝 等 組 織 器 官 猪 血 或 其 他 製 品 之 定 性 檢 驗 2. 檢 驗 方 法 : 聚 合 酶 鏈 反 應 (Polymerase chain reaction, PCR) 方 法 2.1. 工 作 環 境 : 工 作 平 台 需 寬 敞 潔 淨 光 線 良 好 檢 體 前 處 理 檢 體 DNA 抽 取 PCR 試 劑 配 製 及 PCR 等 實 驗 過 程 皆 需 有 區 隔 空 間, 避 免 交 叉 污 染 PCR 試 劑 之 配 製 應 於 無 菌 操 作 台 內 進 行 ( 註 1) 2.2. 裝 置 2.2.1. 分 光 光 度 計 : 具 波 長 260 nm 280 nm 2.2.2. 旋 渦 混 合 器 (Vortex mixer) 2.2.3. 真 空 乾 燥 裝 置 : 供 DNA 乾 燥 用 2.2.4. 加 熱 振 盪 器 : 具 55 溫 控 及 振 盪 功 能 2.2.5. 微 量 冷 凍 離 心 機 : 可 達 20000 g, 並 具 4 溫 控 功 能 2.2.6. 離 心 機 : 供 各 式 微 量 離 心 管 離 心 用 2.2.7. 聚 合 酶 鏈 反 應 器 :ABI PRISM 9700 Sequence Detector, 或 同 級 品 2.2.8. 即 時 聚 合 酶 鏈 反 應 器 ( 註 2) :ABI PRISM 7700 Sequence Detector 或 Roche LightCycler, 或 同 級 品 2.2.9. 電 泳 槽 : 供 DNA 電 泳 用 2.2.10. 振 盪 型 粉 碎 機 2.2.11. 照 相 裝 置 : 供 拍 攝 電 泳 膠 片 用 2.2.12. 紫 外 燈 箱 : 具 波 長 312 nm 365 一 修 正 英 文 標 題 二 刪 除 PCR 試 驗 相 關 內 容, 包 含 裝 置 試 藥 器 具 及 材 料 試 劑 之 配 製 及 鑑 別 試 驗 三 修 正 鑑 別 試 驗 用 引 子 及 探 針 四 修 正 對 照 用 物 質 五 增 列 附 註 二 及 三 六 增 修 訂 部 分 文 字
2.2.11. 冷 凍 設 備 : 具 冷 藏 及 凍 結 功 能 2.2.12. 旋 渦 混 合 器 (Vortex mixer) 2.2.13. 酸 鹼 度 測 定 儀 (ph meter) 2.2.14. 水 浴 裝 置 : 溫 差 ±1 以 內 者 2.2.15. 天 平 : 最 大 稱 重 量 為 2000 g, 靈 敏 度 為 0.1 g; 最 大 稱 重 量 為 100 g, 靈 敏 度 為 1 mg 註 1: 本 方 法 所 使 用 或 提 及 之 產 品 品 牌 不 代 表 為 同 類 產 品 中 最 好 者 ; 反 之, 未 使 用 或 提 及 之 產 品 品 牌 亦 不 代 表 為 同 類 產 品 中 較 差 者 2.3. 試 藥 2.3.1.DNA 抽 取 用 試 藥 : 乙 醇 (96-100%) 採 分 子 生 物 分 析 級 試 藥 ; 適 用 於 動 物 DNA 抽 取 之 市 售 套 組 ( 註 2) 2.3.2.Real-time PCR 用 2.3.2.1. 鑑 別 試 驗 用 引 子 及 探 針 2.3.2.1.1. 哺 乳 類 家 禽 類 及 魚 類 ( 標 的 基 因 :12S ribosomal RNA, 供 作 內 部 對 照 基 因 ) 引 子 F: 12SF,5 -CAAACTGGGATTAGATACCC CACTA-3 引 子 R: 12SR,5 -ATCGRTTMTAGAACAGGCT nm 紫 外 燈 2.2.13. 冷 凍 設 備 : 具 冷 藏 及 凍 結 功 能 2.2.14. 高 壓 滅 菌 釜 2.2.15. ph 測 定 儀 2.2.16. 水 浴 裝 置 : 溫 差 在 ±1.0 以 內 者 2.2.17. 天 平 : 最 大 秤 重 量 為 2000 g, 靈 敏 度 為 0.1 g; 最 大 秤 重 量 為 100 g, 靈 敏 度 為 1 mg 2.2.18. 無 菌 操 作 台 註 1: 本 方 法 所 使 用 或 提 及 之 產 品 品 牌 不 代 表 為 同 類 產 品 中 最 好 者 ; 反 之, 未 使 用 或 提 及 之 產 品 品 牌 亦 不 代 表 為 同 類 產 品 中 較 差 者 註 2: 確 認 試 驗 用 2.3. 試 藥 2.3.1. DNA 抽 取 用 :RNase 乙 醇 (96~ 100%) 均 採 分 子 生 物 分 析 級 試 藥,DNeasy Tissue 套 組 2.3.2. 聚 合 酶 鏈 反 應 (PCR) 用 ( 註 3) 2.3.2.1. 鑑 別 試 驗 用 引 子 2.3.2.1.1. 哺 乳 類 及 家 禽 類 ( 標 的 基 因 : myostatin, 供 作 內 部 對 照 基 因 ) 引 子 F:MYF, 5 -TTGTGCAAATCCTGAGACTCAT-3 引 子 R:MYR, 5 -ATACCAGTGCCTGGGTTCAT-3 PCR 增 幅 產 物 大 小 97 bp 2.3.2.1.2. 猪 ( 標 的 基 因 :growth hormone) 引 子 F:SWF, 5 -TCAGTTTACACTCACCTGATAGC ATCT-3 引 子 R:SWR, 5 -GGGTGGTGGAGAGGGGTGAATT- 3 PCR 增 幅 產 物 大 小 108 bp ( 註 4) 2.3.2.2. 確 認 試 驗 用 引 子 及 探 針 2.3.2.2.1. 哺 乳 類 及 家 禽 類 ( 標 的 基 因 : myostatin, 供 作 內 部 對 照 基 因 ) 引 子 F:MYF, 5 -TTGTGCAAATCCTGAGACTCAT-3 引 子 R:MYR, 5 -ATACCAGTGCCTGGGTTCAT-3 探 針 P:MYP,
CCTCTAG-3 探 針 P: 12SP,5 -(FAM)-CACCGCCAAGTCCTT TGRGTTTTARGC-(TAMRA)-3 PCR 增 幅 產 物 大 小 155 bp 2.3.2.1.2. 猪 ( 標 的 基 因 :12S ribosomal RNA) 引 子 F: P12F,5 -GGAACAATAGTAAGCACAA TCATAGC-3 引 子 R: P12R,5 -CATAAAAACTTTCGTGTGG TGGA-3 探 針 P: P12P,5 -(FAM)-CATGTAGAAAATGT AGCCCATTTCTTTCCA-(TAMRA)-3 PCR 增 幅 產 物 大 小 121 bp 註 2: 1. 合 成 之 引 子 及 探 針, 拆 封 後, 以 無 菌 去 離 子 水 稀 釋 成 適 當 濃 度, 分 裝 後 置 於 -20 貯 存 備 用, 另 探 針 需 避 光 保 存 探 針 5 端 採 用 6-carboxy-fluorescein (FAM) 標 記,3 端 採 用 6-carboxytetramethyl-rhodamine (TAMRA) 標 記 2. 內 部 對 照 基 因 引 子 及 探 針 之 序 列 中,R 為 混 合 鹼 基 代 碼 (A/G), 表 示 同 時 含 A 及 G;M 為 混 合 鹼 基 代 碼 (A/C), 表 示 同 時 含 A 及 C 2.3.2.2. TaqMan Universal PCR Master Mix( 適 用 於 ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System) 本 試 劑 內 含 real-time PCR 所 需 去 氧 核 糖 核 苷 三 磷 酸 聚 合 酶 等, 使 用 時 添 加 引 子 探 針 及 待 測 檢 體 DNA 2.3.2.3. LightCycler FastStart DNA Master HybProbe ( 適 用 於 Roche LightCycler) 本 試 劑 內 含 real-time PCR 所 需 去 氧 核 5 -(FAM)-CCCATGAAAGACGGTACA AGGTATACTG-(TAMRA)-3 PCR 增 幅 產 物 大 小 97 bp 2.3.2.2.2. 猪 ( 標 的 基 因 :growth hormone) 引 子 F:SWF, 5 -TCAGTTTACACTCACCTGATAGC ATCT-3 引 子 R:SWR, 5 -GGGTGGTGGAGAGGGGTGAATT- 3 探 針 P:SWP, 5 -(FAM)-CCTCAATACTCCAGAACC CCTCATTTTCCTC-(TAMRA)-3 PCR 增 幅 產 物 大 小 108 bp 註 3: 合 成 之 引 子, 拆 封 後, 以 無 菌 純 水 稀 釋 成 適 當 濃 度, 分 裝 後 置 於 20 貯 存 備 用 註 4: 合 成 之 探 針, 拆 封 後, 以 無 菌 純 水 稀 釋 成 適 當 濃 度, 分 裝 後 置 於 20 貯 存 備 用, 探 針 需 避 光 保 存 2.3.2.3. 去 氧 核 苷 三 磷 酸 (deoxyribonucleotide triphosphate, dntp) 含 去 氧 腺 苷 三 磷 酸 (deoxyadenosine triphosphate, datp), 去 氧 胞 苷 三 磷 酸 (deoxycytidine triphosphate, dctp), 去 氧 鳥 糞 嘌 呤 苷 三 磷 酸 (deoxyguanosine triphosphate, dgtp) 及 去 氧 胸 苷 三 磷 酸 (deoxythymidine triphosphate, dttp) 各 2.5 mm 之 溶 液 2.3.2.4. 聚 合 酶 Taq DNA polymerase (2 U/µL), 或 同 級 品 2.3.2.5. TaqMan Universal PCR Master Mix( 確 認 試 驗 用, 適 用 於 ABI PRISM 7700) 內 含 PCR 所 需 去 氧 核 苷 三 磷 酸 聚 合 酶 等 試 劑, 使 用 者 僅 需 自 行 添 加 引 子 探 針 及 待 測 檢 體 DNA 即 可 2.3.2.6. LightCycler-FastStart DNA Master Hybridization Probes ( 確 認 試 驗 用, 適 用 於 Roche LightCycler)
糖 核 苷 三 磷 酸 聚 合 酶 等, 且 內 附 25 mm 氯 化 鎂 溶 液, 使 用 時 添 加 引 子 探 針 及 待 測 檢 體 DNA 2.3.3. 對 照 用 物 質 : 猪 肉 或 使 用 衛 生 福 利 部 食 品 藥 物 管 理 署 提 供 編 號 S201 之 參 考 質 體 作 為 對 照 用 物 質 ( 註 3) 2.4. 器 具 及 材 料 2.4.1. 吸 管 (Pipette):10 µl 20 µl 100 µl 200 µl 及 1000 µl 2.4.2. 吸 管 尖 頭 (Pipette tips):10 µl 20 µl 200 µl 及 1000 µl 2.4.3. 離 心 管 :200 µl 600 µl 1.5 ml 及 2 ml 2.4.4. PCR 反 應 管 :200 µl 2.4.5. PCR 玻 璃 毛 細 管 :Roche LightCycler 專 用 2.4.6. 玻 璃 或 塑 膠 瓶 :50 ml 100 ml 250 ml 500 ml 1000 ml 及 2000 ml 2.4.7. 塑 膠 離 心 管 :50 ml 註 3: 使 用 之 塑 膠 或 玻 璃 器 皿 均 為 無 DNase 污 染 ( 註 4) 2.5.Real-time PCR 溶 液 之 配 製 內 含 PCR 所 需 去 氧 核 苷 三 磷 酸 聚 合 酶 等 試 劑, 使 用 者 僅 需 自 行 添 加 引 子 探 針 及 待 測 檢 體 DNA 即 可 2.3.3. 電 泳 用 試 藥 : 溴 化 乙 錠 (ethidium bromide) 瓊 膠 (agarose) 溴 酚 藍 (bromophenol blue) 二 甲 苯 藍 (xylene cyanol FF) 乙 二 銨 四 乙 酸 二 鈉 (ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt, Na 2 -EDTA) 三 羥 甲 基 氨 基 甲 烷 (tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris)) 甘 油 硼 酸, 均 採 分 子 生 物 分 析 級 試 藥 DNA 分 子 量 標 記 物 質 (DNA molecular weight marker) : 100-bp DNA Ladder Marker 2.3.4. 對 照 用 物 質 : 猪 肉 猪 血 及 其 組 織 器 官 等 皆 可, 或 使 用 行 政 院 衛 生 署 藥 物 食 品 檢 驗 局 提 供 編 號 pidm1 之 參 考 質 體 作 為 對 照 用 物 質 ( 註 5) 2.4. 器 具 及 材 料 2.4.1. 吸 管 (Pipette):10 µl 20 µl 100 µl 200 µl 及 1000 µl 2.4.2. 電 泳 膠 片 製 作 盤 2.4.3. 吸 管 尖 頭 (Pipette tips):10 µl 20 µl 200 µl 及 1000 µl 2.4.4. 離 心 管 :200 µl 600 µl 1.5 ml 及 2 ml 2.4.5. PCR 反 應 管 :200 µl 及 500 µl ( 註 2.4.6. PCR 玻 璃 毛 細 管 6) : Roche LightCycler 專 用 2.4.7. 玻 璃 或 塑 膠 瓶 :50 ml 100 ml 250 ml 500 ml 1000 ml 及 2000 ml 2.4.8. 塑 膠 離 心 管 :50 ml 2.4.9. 過 濾 膜 : 孔 徑 為 0.45 µm, 材 質 為 nitro-cellulose 註 5: 使 用 之 塑 膠 或 玻 璃 器 皿 均 為 無 DNase 污 染 註 6: 儀 器 使 用 Roche LightCycler 時, 才 需 使 用 2.5. 試 劑 之 配 製 2.5.1. 5 倍 TBE (Tris-borate-EDTA) 緩
2.5.1. ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System 鑑 別 試 驗 用 5 µm 引 子 F 1.25 µl 5 µm 引 子 R 1.25 µl 3.3 µm 探 針 P 1.7 µl TaqMan Universal PCR 12.5 µl Master Mix 檢 體 DNA 溶 液 ( 總 量 100 5.0 µl ng) 無 菌 去 離 子 水 3.3 µl 總 體 積 25.0 µl 衝 溶 液 稱 取 三 羥 甲 基 氨 基 甲 烷 54.0 g 硼 酸 27.5 g 及 0.5 M ph 8.0 EDTA 溶 液 20 ml, 加 水 溶 解 後 定 容 至 1000 ml, 供 作 5 倍 TBE 緩 衝 溶 液 臨 用 前 以 水 稀 釋 為 0.5 倍 2.5.2. 2 % 膠 片 稱 取 瓊 膠 2.0 g, 加 入 0.5 倍 TBE 緩 衝 溶 液 100 ml, 加 熱 攪 拌 至 瓊 膠 完 全 溶 解, 適 當 冷 卻 後, 倒 入 電 泳 膠 片 製 作 盤, 並 置 入 適 當 之 尺 梳, 待 膠 片 凝 固 後, 即 可 使 用 2.5.3. 6 倍 載 入 膠 片 緩 衝 溶 液 (6 gel loading buffer) 稱 取 溴 酚 藍 25.0 g 二 甲 苯 藍 0.25 g 及 量 取 甘 油 30 ml, 加 入 無 菌 水 使 成 100 ml, 並 置 於 4 冰 箱 貯 存 備 用 2.5.4. 膠 片 染 液 稱 取 溴 化 乙 錠 0.1 g, 加 水 10 ml 溶 解, 供 作 原 液 ( 含 溴 化 乙 錠 10 mg/ml), 使 用 前 需 以 水 稀 釋 成 含 溴 化 乙 錠 1 µg/ml 溴 化 乙 錠 為 致 癌 物 質, 配 製 時 應 注 意 安 全 ( 註 7) 2.5.5. PCR 溶 液 2.5.5.1 鑑 別 試 驗 用 10 倍 PCR 緩 衝 溶 液 ( 含 15 2.5 µl mm MgCl 2 ) Taq DNA polymerase (2 1.0 µl U/µL) 2.5 mm dntp 4.0 µl 10 µm 引 子 F 1.0 µl 10 µm 引 子 R 1.0 µl 模 版 DNA ( 總 量 100 ng) 5.0 µl 無 菌 純 水 10.5 µl 總 體 積 25.0 µl 2.5.5.2.ABI PRISM 7700 Sequence Detector 確 認 試 驗 用 5 µm 引 子 F 1.25 µl 5 µm 引 子 R 1.25 µl 3.3 µm 探 針 P 1.7 µl TaqMan Universal PCR 12.5 µl Master Mix 模 版 DNA ( 總 量 100 ng) 5.0 µl 無 菌 純 水 3.3 µl 總 體 積 25.0 µl
2.5.2. Roche LightCycler 鑑 別 試 驗 用 5 µm 引 子 F 1.5 µl 5 µm 引 子 R 1.5 µl 3.3 µm 探 針 P 1.5 µl LightCycler FastStart DNA 2.0 µl Master HybProbe 25 mm 氯 化 鎂 溶 液 2.4 µl 檢 體 DNA 溶 液 ( 總 量 100 ng) 5.0 µl 無 菌 去 離 子 水 6.1 µl 總 體 積 20.0 µl 註 4: Real-time PCR 溶 液 應 置 於 冰 浴 中 配 製 2.6. 檢 體 DNA 之 製 備 ( 註 5) 2.6.1. 檢 體 之 處 理 乾 燥 檢 體 直 接 以 粉 碎 機 研 磨 成 細 粉 溼 狀 檢 體 經 冷 凍 乾 燥 處 理 後, 再 以 粉 碎 機 研 磨 成 細 粉 檢 體 需 貯 存 於 乾 燥 及 冷 凍 環 境 中 註 5: 1. 研 磨 檢 體 時 應 於 區 隔 之 空 間 進 行, 避 免 交 叉 污 染 2. 溼 狀 檢 體 之 乾 燥 時 間 可 視 乾 燥 程 度 調 整 2.6.2. DNA 之 抽 取 採 用 適 用 於 動 物 DNA 抽 取 之 市 售 套 組, 依 套 組 操 作 說 明 步 驟 抽 取 DNA 抽 取 之 DNA 溶 液 收 集 至 已 滅 菌 之 1.5 ml 離 心 管, 作 為 檢 體 DNA 原 液 依 2.6.3. 節 測 定 DNA 濃 度 後, 置 於 -20 冷 凍 保 存 2.5.5.3. Roche LightCycler 確 認 試 驗 用 5 µm 引 子 F 1.5 µl 5 µm 引 子 R 1.5 µl 3.3 µm 探 針 P 1.5 µl LightCycler-FastStart DNA 2.0 µl Master Hybridization Probes 25 mm MgCl 2 溶 液 2.4 µl 模 版 DNA ( 總 量 40 ng) 5.0 µl 無 菌 純 水 6.1 µl 總 體 積 25.0 µl 註 7: PCR 溶 液 應 置 於 冰 浴 中 配 製 2.6. 檢 體 DNA 之 製 備 2.6.1. 檢 體 之 處 理 檢 體 為 乾 燥 肉 乾 或 粉 ( 碎 ) 狀 者, 可 直 接 以 粉 碎 機 研 磨 成 細 粉 檢 體 為 溼 狀 肉 塊 或 肉 加 工 品, 經 冷 凍 乾 燥 處 理 後, 再 以 粉 碎 機 研 磨 成 細 粉 備 用 檢 體 需 貯 存 於 乾 燥 及 冷 藏 或 冷 凍 環 境 中 2.6.2. DNA 之 抽 取 採 用 DNeasy Tissue 套 組 及 內 附 試 劑 材 料 (ATL 試 劑 proteinase K 試 劑 AL 試 劑 離 心 管 柱 (DNeasy spin column) 收 集 管 AW1 AW2 與 AE 試 劑 ), 亦 可 採 用 其 他 市 售 套 組 2.6.2.1. 稱 取 檢 體 約 25 mg ( 註 8), 置 入 2 ml 離 心 管 2.6.2.2. 加 入 ATL 試 劑 180 µl 以 及 proteinase K 20 µl, 以 振 盪 器 混 合 均 勻 2.6.2.3. 於 55 振 盪 反 應 直 到 檢 體 溶 解 2.6.2.4. 加 入 AL 試 劑 200 µl, 以 振 盪 器 混 合 均 勻 2.6.2.5. 水 浴 70,10 分 鐘 2.6.2.6. 加 入 乙 醇 (96~100%) 200 µl, 以 振 盪 器 混 合 均 勻 2.6.2.7. 取 混 合 液 注 入 吸 附 管 柱, 以 6000 g (8000 rpm) 離 心 1 分 鐘, 並 將 收 集 管 及 濾 液 丟 棄 2.6.2.8. 將 吸 附 管 柱 套 入 新 的 收 集 管,
2.6.3. DNA 濃 度 測 定 及 純 度 判 斷 取 適 量 之 檢 體 DNA 原 液, 以 無 菌 去 離 子 水 做 適 當 倍 數 之 稀 釋, 分 別 測 定 260 nm 及 280 nm 之 吸 光 值 (O.D.) 以 波 長 260 nm 吸 光 值 乘 50 ng/µl 及 稀 釋 倍 數, 即 為 檢 體 DNA 原 液 濃 度 DNA 溶 液 純 度 則 以 O.D. 260 /O.D. 280 比 值 作 判 斷, 其 比 值 應 介 於 1.7~2.0 注 入 AW1 試 劑 500 µl 到 吸 附 管 柱, 以 6000 g (8000 rpm) 離 心 1 分 鐘 後, 將 收 集 管 及 濾 液 丟 棄 2.6.2.9. 將 吸 附 管 柱 套 入 新 的 收 集 管, 注 入 AW2 試 劑 500 µl 到 吸 附 管 柱, 以 20000 g (14000 rpm) 離 心 3 分 鐘 後, 將 收 集 管 及 濾 液 丟 棄 2.6.2.10. 將 吸 附 管 柱 套 入 新 的 1.5 ml 離 心 管 2.6.2.11. 加 入 AE 試 劑 100 µl 至 吸 附 管 柱, 於 室 溫 下 靜 置 1 分 鐘 後, 再 以 6000 g (8000 rpm) 離 心 1 分 鐘 2.6.2.12. 再 加 入 AE 試 劑 100 µl, 於 室 溫 下 靜 置 1 分 鐘 後, 再 以 6,000 g (8,000 rpm) 離 心 1 分 鐘 2.6.2.13. 將 溶 出 液 ( 約 200μL) 收 集 至 已 滅 菌 之 1.5 ml 離 心 管, 為 萃 取 DNA 原 液 2.6.2.14. 依 2.6.3.2. 節 測 量 DNA 濃 度 並 記 錄 後, 置 於 -20 冷 凍 保 存 註 8: 抽 取 脾 臟 等 含 細 胞 數 量 眾 多 的 組 織 DNA, 秤 取 量 不 可 超 過 10 mg 抽 取 肝 臟 或 腎 臟 等 含 豐 富 RNA 的 組 織 DNA, 於 步 驟 2.6.2.4. 之 後 加 入 RNase (100 mg/ml) 4μL, 混 合 均 勻 後 於 室 溫 下 靜 置 2 分 鐘 2.6.3. DNA 濃 度 測 定 及 純 度 判 斷 2.6.3.1. 檢 體 DNA 溶 液 於 使 用 前 自 冷 凍 庫 中 取 出, 於 室 溫 下 進 行 溶 解 2.6.3.2. 取 適 當 量 之 DNA 溶 液 以 無 菌 純 水 做 適 當 倍 數 之 稀 釋, 分 別 測 定 260 nm 及 280 nm 之 吸 光 值 (O.D.) 以 O.D. 260 乘 以 50 ng/μl 即 為 DNA 溶 液 之 濃 度 計 算 O.D. 260 / O.D. 280 比 值, 其 比 值 應 介 於 1.7~2.0 間 ( 註 9) 2.7. 鑑 別 試 驗 2.7.1. PCR 操 作 步 驟 以 無 菌 純 水 適 當 稀 釋 DNA 溶 液 引 子
備 用 取 PCR 反 應 管, 並 依 照 2.5.5.1. 節 配 製 PCR 溶 液, 依 序 加 入 純 水 10 倍 PCR 緩 衝 液 dntp 引 子 DNA polymerase 及 DNA 溶 液, 混 合 均 勻 後, 將 反 應 管 置 於 離 心 機 瞬 間 離 心, 使 混 合 液 聚 積 於 反 應 管 之 底 部 移 入 PCR 反 應 器, 依 據 引 子 類 別 並 參 照 2.7.2. 節 設 定 反 應 條 件, 進 行 反 應, 結 束 後, 取 出 PCR 增 幅 產 物, 進 行 電 泳 分 析 2.7.2. PCR 條 件 步 驟 溫 度 時 間 1. 最 初 變 性 95 5 min 2. 變 性 95 30 sec 3. 黏 接 測 試 猪 基 因 60 30 sec 測 試 哺 乳 類 及 家 禽 54 30sec 類 基 因 4. 延 展 72 30 sec 步 驟 2 至 步 驟 4, 共 進 行 40 個 循 環 反 應 5. 最 終 延 展 72 7 min 2.7.3. 膠 片 電 泳 分 析 取 適 量 之 6 倍 載 入 膠 片 緩 衝 溶 液, 分 別 與 無 菌 純 水 ( 空 白 組 ) 及 PCR 增 幅 產 物 混 合 均 勻, 注 入 2% 膠 片 孔 中, 以 50 或 100 伏 特 電 壓 進 行 電 泳 同 時, 必 須 取 DNA 分 子 量 標 記 物 質 進 行 電 泳, 作 為 PCR 增 幅 產 物 大 小 之 判 別 與 計 算 依 據 經 電 泳 後 之 膠 片 置 入 膠 片 染 液 中 進 行 染 色 約 15 分 鐘, 續 置 入 水 中 漂 洗 及 褪 染, 再 置 於 紫 外 燈 箱 上, 以 波 長 365 nm 之 紫 外 光 照 射 觀 察 是 否 有 明 顯 之 DNA 螢 光 帶, 並 判 讀 結 果 每 次 實 驗 必 須 同 時 測 試 正 反 應 及 負 反 應 對 照 組 2.7.4. 鑑 別 檢 體 DNA 之 PCR 增 幅 產 物 電 泳 結 果, 須 與 正 反 應 對 照 組 及 DNA 分 子 量 標 記 物 質 之 電 泳 結 果 進 行 相 互 比 對, 當 檢 體 DNA 與 正 反 應 對 照 組 DNA 二 者 皆 出 現 PCR 增 幅 產 物, 且 經 由 DNA 分 子 量 標 記 物 質 估 算 PCR 增 幅 產 物 大 小 為 108 bp 者, 即 判 定 該 檢 體 含 有 猪 物 種 成 分 註 9:PCR 定 性 試 驗 結 果 之 判 讀 係 以 PCR 增 幅 產 物 大 小 判 定, 當 測 試 結 果 判 讀 困 難 時, 建 議 進 行 確 認 試
2.7. Real-time PCR 鑑 別 試 驗 2.7.1. Real-time PCR 操 作 步 驟 2.7.1.1. Real-time PCR ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System 以 無 菌 去 離 子 水 適 當 稀 釋 檢 體 DNA 原 液 引 子 及 探 針 備 用 取 PCR 反 應 管, 依 照 2.5.1. 節 配 製 PCR 溶 液, 依 序 加 入 TaqMan Universal PCR Master Mix 稀 釋 過 之 引 子 及 探 針, 混 合 均 勻 後, 分 裝 20 µl 入 PCR 反 應 管 中, 各 別 加 入 檢 體 DNA 溶 液 5 µl, 再 將 PCR 反 應 管 置 於 離 心 機 中, 以 200 g 瞬 間 離 心, 移 入 real-time PCR 反 應 器, 依 下 列 條 件 進 行 反 應 同 時 另 製 作 正 反 應 及 負 反 應 對 照 組 步 驟 溫 度 時 間 1. 熱 活 化 50 2 min 2. 最 初 變 性 95 10 min 3. 變 性 95 15 sec 4. 黏 接 延 展 60 1 min 步 驟 3 至 步 驟 4, 共 進 行 45 個 循 環 反 應 5. 冷 卻 35 45 sec 2.7.1.2. Real-time PCR-Roche LightCycler 以 無 菌 去 離 子 水 適 當 稀 釋 檢 體 DNA 原 液 引 子 及 探 針 備 用 取 PCR 反 應 管, 依 照 2.5.2. 節 配 製 PCR 溶 液, 依 序 加 入 LightCycler FastStart DNA Master HybProbe 25 mm 氯 化 鎂 溶 液 稀 釋 過 之 引 子 及 探 針, 混 合 均 勻 後, 分 裝 15 µl 於 玻 璃 毛 細 管 中, 各 別 加 入 檢 體 DNA 溶 液 5 µl, 再 將 毛 細 管 置 於 離 心 機 中, 驗 檢 體 DNA 之 抽 取 與 製 備, 其 純 度 將 直 接 影 響 後 續 PCR 測 試 結 果, 建 議 抽 取 之 檢 體 DNA 可 先 進 行 內 部 對 照 基 因 PCR 測 試, 以 確 定 是 否 含 有 DNA 及 其 純 度 本 PCR 定 性 反 應 條 件 係 採 ABI PRISM 9700 設 定 之, 若 使 用 其 他 機 型, 應 自 行 檢 討 反 應 條 件 2.8. 確 認 試 驗 : 本 實 驗 視 需 要 而 操 作 之 2.8.1. PCR 操 作 步 驟 2.8.1.1. 即 時 聚 合 酶 鏈 反 應 (Real-time PCR)-ABI PRISM 7700 Sequence Detector 以 無 菌 純 水 適 當 稀 釋 檢 體 DNA 溶 液 引 子 及 探 針 備 用 取 適 量 無 菌 純 水, 並 依 照 2.5.5.2. 節 配 製 PCR 溶 液, 依 序 加 入 Master Mix 稀 釋 過 之 引 子 及 探 針, 混 合 均 勻 後, 分 裝 20 µl 入 PCR 反 應 管 中, 再 各 別 加 入 稀 釋 過 之 檢 體 DNA 溶 液 5 µl, 最 後 將 PCR 反 應 管 置 於 離 心 機 中, 以 200 g (1500 rpm) 瞬 間 離 心, 移 入 即 時 聚 合 酶 鏈 反 應 器, 依 下 列 條 件 進 行 反 應 每 次 實 驗 皆 須 製 作 負 反 應 及 正 反 應 對 照 組 步 驟 溫 度 時 間 1. 熱 活 化 50 C 2 min 2. 最 初 變 性 95 C 10 min 3. 變 性 95 C 15 sec 4. 黏 接 延 展 測 試 猪 基 因 60 C 1 min 測 試 哺 乳 類 及 家 禽 54 1min 類 基 因 步 驟 3 至 步 驟 4, 共 進 行 45 個 循 環 反 應 5. 冷 卻 35 C 45 sec 2.8.1.2. 即 時 聚 合 酶 鏈 反 應 (Real-time PCR)-Roche LightCycler 以 無 菌 純 水 適 當 稀 釋 檢 體 DNA 溶 液 引 子 及 探 針 備 用 取 適 量 無 菌 純 水, 並 依 照 2.5.5.3. 節 配 製 PCR 溶 液, 依 序 加 入 LightCycler-FastStart DNA Master Hybridization Probes 稀 釋 過 之 引 子 及 探 針, 混 合 均 勻 後, 分 裝 15 µl 於 玻 璃 毛 細 管 中, 再 各 別 加 入 稀 釋 過 之 檢 體 DNA 5 µl, 最 後 將 毛 細 管 置 於 離 心 機
以 800 g 瞬 間 離 心, 移 入 real-time PCR 反 應 器, 依 下 列 條 件 進 行 反 應 同 時 另 製 作 正 反 應 及 負 反 應 對 照 組 步 驟 溫 度 時 間 1. 最 初 變 性 95 10 min 2. 變 性 95 5 sec 3. 黏 接 60 25 sec 4. 延 展 72 8 sec 步 驟 2 至 步 驟 4, 共 進 行 45 個 循 環 反 應 5. 冷 卻 35 45 sec 2.7.2. Real-time PCR 螢 光 分 析 檢 體 DNA 經 real-time PCR 反 應 後, 直 接 從 real-time PCR 反 應 器 上 之 螢 幕 觀 察 探 針 所 產 生 之 螢 光 增 幅 曲 線, 即 可 判 讀 反 應 結 果 同 時 另 測 試 正 反 應 及 負 反 應 對 照 組 2.7.3. 確 認 檢 體 DNA 之 real-time PCR 增 幅 產 物 螢 光 分 析 圖 與 正 反 應 對 照 組 螢 光 分 析 圖 進 行 相 互 比 對, 當 檢 體 DNA 與 正 反 應 對 照 組 之 real-time PCR 螢 光 分 析 圖 均 出 現 經 由 探 針 所 產 生 之 螢 光 增 幅 曲 線, 即 確 認 該 real-time PCR 增 幅 產 物 為 猪 之 基 因 片 段, 可 確 認 該 檢 體 中 含 有 猪 成 分 附 註 : 1. 本 檢 驗 方 法 最 低 檢 測 濃 度 為 0.1% ( 以 乾 重 計 ) 2. 檢 體 DNA 之 製 備 將 影 響 測 試 結 果, 檢 體 DNA 應 進 行 內 部 對 照 基 因 測 試 3. 本 方 法 反 應 條 件 分 析 不 適 時, 可 依 所 使 用 之 儀 器, 設 定 適 合 之 反 應 條 件 4. 本 檢 驗 方 法 之 測 試 範 圍 係 指 能 夠 抽 取 出 DNA 者 之 食 品, 經 過 高 度 加 工 造 成 DNA 過 度 裂 解 之 食 品 不 適 用 於 本 檢 驗 方 法 中, 以 800 g (3000 rpm) 瞬 間 離 心, 移 入 即 時 聚 合 酶 鏈 反 應 器, 依 下 列 條 件 進 行 反 應 每 次 實 驗 皆 須 製 作 負 反 應 及 正 反 應 對 照 組 步 驟 溫 度 時 間 1. 最 初 變 性 95 C 10 min 2. 變 性 95 C 5 sec 3. 黏 接 測 試 猪 基 因 60 C 25 sec 測 試 哺 乳 類 及 家 禽 54 25sec 類 基 因 4. 延 展 72 C 8 sec 步 驟 2 至 步 驟 4, 共 進 行 45 個 循 環 反 應 5. 冷 卻 35 C 45 sec 2.8.2. 即 時 聚 合 酶 鏈 反 應 螢 光 分 析 檢 體 DNA 經 即 時 聚 合 酶 鏈 反 應 後, 直 接 從 即 時 聚 合 酶 鏈 反 應 器 上 之 螢 幕 觀 察 探 針 所 產 生 之 螢 光 增 幅 曲 線, 即 可 判 讀 反 應 結 果 每 次 實 驗 必 須 同 時 測 試 正 反 應 及 負 反 應 對 照 組 2.8.3. 確 認 檢 體 DNA 之 PCR 增 幅 產 物 螢 光 分 析 結 果 須 與 正 反 應 對 照 組 螢 光 分 析 結 果 進 行 相 互 比 對, 當 檢 體 DNA 與 正 反 應 對 照 組 之 PCR 螢 光 分 析 結 果, 皆 出 現 經 由 探 針 所 產 生 之 螢 光 增 幅 曲 線, 即 確 認 該 PCR 增 幅 產 物 為 該 測 試 猪 物 種 之 基 因 片 段, 可 確 認 該 檢 體 中 含 有 猪 物 種 成 分 註 : 1. 本 PCR 定 性 檢 驗 方 法 之 最 低 檢 測 濃 度 為 0.1%( 以 乾 重 計 ) 2. 本 檢 驗 方 法 之 測 試 範 圍 係 指 能 夠 抽 取 出 DNA 者 之 食 品, 經 過 高 度 加 工 或 不 含 DNA 之 食 品 不 適 用 於 本 檢 驗 方 法