西 北 植 物 学 报 文 章 编 号 盐 穗 木 过 氧 化 氢 酶 基 因 的 克 隆 与 功 能 分 析 彭 丹 张 霞 张 富 春 新 疆 大 学 生 命 科 学 与 技 术 学 院 新 疆 生 物 资 源 基 因 工 程 重 点 实 验 室 乌 鲁 木 齐 摘 要 利 用 同 源 基 因 克 隆 法 从 新 疆 荒 漠 盐 碱 地 多 年 生 灌 木 盐 穗 木 中 克 隆 获 得 盐 穗 木 过 氧 化 氢 酶 基 因 序 列 分 析 表 明 基 因 开 放 阅 读 框 为 )$ 编 码 个 氨 基 酸 推 测 编 码 蛋 白 质 的 分 子 量 为 *+ 等 电 点 为 基 因 序 列 比 对 发 现 与 多 种 植 物 过 氧 化 氢 酶 基 因 具 有 较 高 的 同 源 性 半 定 量,-., 结 果 表 明 基 因 受 盐 胁 迫 而 上 调 表 达 将 构 建 的 重 组 质 粒 $ - 转 化 大 肠 杆 菌 /+ 以 0.-1 诱 导 重 组 蛋 白 - 的 表 达 +. 1 和 %%2& 印 迹 检 测 显 示 重 组 蛋 白 的 分 子 量 大 小 为 *+ 其 大 小 与 推 测 的 大 小 一 致 在 低 温 诱 导 下 以 可 溶 性 形 式 表 达 且 表 现 出 一 定 的 过 氧 化 氢 酶 活 性 盐 胁 迫 实 验 结 果 显 示 在 添 加 /3 /4 以 及 / 甘 露 醇 的 / 培 养 基 中 重 组 质 粒 转 化 菌 的 生 长 情 况 和 生 长 速 率 明 显 优 于 对 照 表 明 可 明 显 提 高 大 肠 杆 菌 的 耐 盐 性 该 研 究 结 果 将 有 助 于 从 抗 氧 化 角 度 认 识 盐 生 植 物 盐 穗 木 的 耐 盐 分 子 机 理 关 键 词 盐 穗 木 过 氧 化 氢 酶 原 核 表 达 耐 盐 性 功 能 鉴 定 中 图 分 类 号 5 文 献 标 志 码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收 稿 日 期 修 改 稿 收 到 日 期 基 金 项 目 国 家 计 划 前 期 研 究 专 项 资 助 作 者 简 介 彭 丹 女 在 读 硕 士 研 究 生 主 要 从 事 植 物 分 子 生 物 学 研 究!"#$%&' & 通 信 作 者 张 富 春 博 士 教 授 主 要 从 事 分 子 生 物 学 与 基 因 工 程 (!"#!"# % #&
西 北 植 物 学 报 卷 土 壤 中 过 量 的 盐 分 会 破 坏 植 物 细 胞 中 活 性 氧, 的 产 生 和 清 除 的 动 态 平 衡 状 态 导 致 植 物 体 内 积 累 高 浓 度 的 活 性 氧 物 质 包 括 超 氧 阴 离 子 过 氧 化 氢 和 羟 基 自 由 基 等 这 类 物 质 在 植 物 体 内 如 不 能 及 时 清 除 将 会 对 植 物 的 生 长 发 育 产 生 严 重 的 毒 害 作 用 如 降 低 植 物 细 胞 膜 脂 流 动 性 破 坏 蛋 白 质 功 能 损 伤 叶 绿 体 和 线 粒 体 结 构 最 终 导 致 植 物 死 亡 植 物 在 长 期 进 化 过 程 中 形 成 了 防 御 活 性 氧 自 由 基 毒 害 的 保 护 机 制 其 中 起 主 要 作 用 的 是 由 抗 氧 化 酶 抗 氧 化 剂 组 成 的 抗 氧 化 系 统 其 中 过 氧 化 氢 酶 - 是 抗 氧 化 酶 成 员 之 一 主 要 定 位 在 过 氧 化 物 酶 体 乙 醛 酸 循 环 体 等 细 胞 器 中 能 够 迅 速 有 效 地 清 除 光 呼 吸 线 粒 体 电 子 传 递 及 脂 肪 酸 氧 化 等 过 程 中 产 生 的 将 其 催 化 分 解 为 和 保 护 生 物 大 分 子 免 受 氧 化 伤 害 - 可 提 高 植 物 抗 逆 水 平 包 括 提 高 植 物 耐 干 旱 耐 盐 耐 高 温 及 低 温 减 轻 重 金 属 毒 害 保 护 植 物 减 轻 辐 射 损 伤 的 能 力 盐 穗 木 属 于 盐 生 旱 生 多 汁 半 灌 木 是 荒 漠 主 要 的 盐 生 植 物 之 一 对 塔 里 木 河 中 下 游 天 然 植 被 带 的 凋 查 研 究 发 现 在 多 枝 柽 柳 花 花 柴 盐 穗 木 等 种 植 物 群 落 类 型 中 能 耐 受 最 大 盐 胁 迫 的 为 盐 穗 木 群 落 盐 穗 木 可 积 累 有 机 渗 透 调 节 剂 甜 菜 碱 并 在 盐 胁 迫 下 含 量 增 加 其 含 量 与 植 物 耐 盐 性 呈 正 相 关 暗 示 盐 穗 木 具 有 独 特 的 耐 盐 生 理 机 制 开 展 盐 穗 木 研 究 对 于 开 发 和 利 用 盐 生 植 物 资 源 改 良 农 作 物 具 有 广 阔 的 应 用 前 景 本 研 究 利 用 同 源 克 隆 法 获 得 盐 穗 木 过 氧 化 氢 酶 基 因 % 半 定 量,-., 分 析 在 盐 胁 迫 下 的 表 达 模 式 为 研 究 的 生 理 功 能 将 构 建 至 原 核 表 达 载 体 $ - 上 检 测 该 蛋 白 的 表 达 是 否 能 提 高 宿 主 菌 的 抗 逆 性 为 通 过 基 因 工 程 技 术 提 高 植 物 耐 受 盐 胁 迫 及 其 他 非 生 物 胁 迫 提 供 候 选 基 因 并 通 过 原 核 表 达 系 统 更 有 效 快 捷 地 鉴 定 基 因 功 能 有 助 于 筛 选 植 物 抗 逆 性 的 功 能 基 因 材 料 和 方 法 & & 材 料 盐 穗 木 的 种 子 采 自 新 疆 五 家 渠 北 沙 窝 盐 碱 地 在 实 验 室 去 外 壳 后 用 升 汞 消 毒 无 菌 水 洗 净 后 播 种 于 含 ; 琼 脂 培 养 基 的 培 养 皿 中 长 出 幼 嫩 植 株 后 移 栽 至 珍 珠 岩 和 蛭 石 < 的 混 合 基 质 中 以 ; 营 养 液 浇 灌 培 养 温 度 为 = = 光 照 时 间 为 9 光 强 约 以 周 龄 幼 苗 为 实 验 材 料 盐 胁 迫 处 理 用 / 3 溶 液 浇 灌 根 部 处 理 9 时 分 别 取 同 化 枝 ' 样 品 迅 速 冻 存 于 液 氮 中 $ - 载 体 为 本 实 验 室 保 存 大 肠 杆 菌 + /+ 感 受 态 购 于 北 京 全 式 金 公 司 $;+- 载 体! 酶 ;;/> 逆 转 录 酶 限 制 性 内 切 酶, 和! 等 购 自 大 连 宝 生 物 公 司 植 物 总,3 提 取 试 剂 盒 等 购 自 北 京 天 根 公 司 其 它 试 剂 均 为 分 析 纯 & ' 方 法 & ' & 盐 穗 木 总 的 提 取 和 的 合 成 称 取 盐 穗 木 同 化 枝 ' 迅 速 置 于 液 氮 中 充 分 研 磨 采 用 -&'%& 的 植 物 总,3 提 取 试 剂 盒 提 取 总,3 经 定 量 和 电 泳 检 测 合 格 后 参 照 ;;/> 逆 转 录 酶 的 说 明 书 合 成 +3 & ' '$%& 的 克 隆 与 序 列 分 析 根 据 30 已 发 表 植 物 - 核 苷 酸 序 列 比 对 分 析 其 开 放 阅 读 框 保 守 序 列 在 基 因,8 两 端 设 计 简 并 上 游 引 物? -11 -- -; 1@ --@ - 1-? 和 下 游 引 物?---1--11- -- --1 1? 以 盐 穗 木 +3 为 模 板 使 用! 酶 扩 增 目 的 基 因., 产 物 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 切 胶 纯 化 后 连 接 $;+- 载 体 并 转 化 + 菌 液., 和 酶 切 鉴 定 出 阳 性 克 隆 后 送 至 北 京 六 合 华 大 基 因 科 技 股 份 有 限 公 司 测 序 测 序 结 果 利 用 30 的,88& %29 $& ) &&9 '$2 "% ' 2( 寻 找 基 因 的,8 在 线 软 件!.:.2.2 9 $%!$ :2'$ 9 预 测 蛋 白 的 分 子 量 和 等 电 点.,- 9 $$2 2'$2 )& %! 9 预 测 蛋 白 的 亚 细 胞 定 位 30 的 /- 功 能 9 $) & ) &&9 ' ' 搜 索 同 源 序 列 使 用 +3 ; 3 软 件 进 行 序 列 同 源 性 比 对 ; 1 构 建 基 因 同 源 进 化 树 & ' 半 定 量 () 分 析 基 因 的 表 达 模 式 以 高 盐 处 理 不 同 时 间 的 盐 穗 木 同 化 枝 +3 为 模 板 用 设 计 的 特 异 性 上 游 引 物? - - -1-1 -1-11? 和 下 游 引 物? 1--11- -- --1 1--? 扩 增 基 因 以! 上 游 引 物? 11 1 1 11 -? 下 游 引 物?-1 1-1-? 为 内 参 基 因 在 相 同 条
期 彭 丹 等 盐 穗 木 过 氧 化 氢 酶 基 因 的 克 隆 与 功 能 分 析 件 下 进 行 半 定 量,-.,., 的 产 物 按 照! 亮 度 一 致 时 的 上 样 量 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 根 据 基 因 特 异 条 带 的 有 无 及 亮 度 分 析 检 测 其 盐 响 应 特 征 & ' * 原 核 表 达 载 体 构 建 及 蛋 白 诱 导 表 达 在 的,8 序 列 两 端 设 计 添 加 酶 切 位 点 的 上 游 引 物?11---11 --- 1--- 1? 下 划 线 为, 酶 切 位 点 和 下 游 引 物? 1 1 -----1--11- -- -? 下 划 线 为! 酶 切 位 点 以 盐 穗 木 +3 为 模 板 进 行., 扩 增., 产 物 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 切 胶 纯 化 后 用, 和! 进 行 双 酶 切 同 时 双 酶 切 $ - 载 体 切 胶 纯 化 二 者 过 夜 连 接 后 转 化 + 菌 液., 和 酶 切 鉴 定 出 阳 性 克 隆 后 送 测 序 测 序 正 确 的 重 组 质 粒 与 对 照 $ - 质 粒 同 时 转 化 大 肠 杆 菌 /+ 菌 株 挑 取 阳 性 克 隆 转 化 子 及 空 载 对 照 于 含 ' / 氨 苄 青 霉 素 的 / 液 体 培 养 基 中 = 过 夜 培 养 次 日 以 接 种 量 放 大 培 养 + 为 时 加 入 /0.-1 诱 导 表 达 9 后 离 心 收 集 菌 体 用 /. 缓 冲 液 重 悬 菌 体 加 入 上 样 缓 冲 液 煮 沸 & 后 离 心 取 上 清 用 于 +. 1 检 测 总 蛋 白 表 达 情 况 确 定 蛋 白 表 达 后 冰 浴 超 声 破 碎 诱 导 后 的 菌 体 分 别 收 集 沉 淀 和 上 清 进 行 +. 1 电 泳 以 分 析 蛋 白 的 可 溶 性 & ' + 蛋 白 诱 导 表 达 的 条 件 优 化 挑 取 阳 性 克 隆 转 化 子 于 含 ' / 氨 苄 青 霉 素 的 / 液 体 培 养 基 中 = 过 夜 培 养 次 日 以 接 种 量 放 大 培 养 至 + 为 时 加 入 /0.-1 分 别 于 = = = 诱 导 表 达 9 取 超 声 破 碎 后 的 上 清 进 行 +. 1 确 定 诱 导 温 度 加 入 0.-1 使 其 终 浓 度 分 别 为 / 的 0.-1 诱 导 9 样 品 处 理 后 进 行 +. 1 检 测 确 定 诱 导 剂 浓 度 在 最 佳 温 度 和 诱 导 剂 浓 度 下 诱 导 不 同 时 间 取 样 进 行 +. 1 电 泳 确 定 诱 导 时 间 & ',- " 印 迹 检 测 融 合 蛋 白 %%2& 印 迹 分 析 参 照 文 献 将 蛋 白 从 +. 1 胶 上 转 移 到 硝 酸 纤 维 素 膜 上 以 抗 标 签 鼠 单 克 隆 抗 体 稀 释 度 为 < 作 为 一 抗 以 带 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 羊 抗 鼠 0'1 稀 释 度 为 < 作 为 二 抗 用 + 作 为 显 色 反 应 的 底 物 & '. 融 合 蛋 白 的 活 性 检 测 参 考 文 献 中 过 氧 化 氢 酶 活 性 的 测 定 方 法 离 心 收 集 诱 导 后 对 照 菌 / $ - 及 重 组 菌 /$ - 的 菌 体 沉 淀 ' 用.$ 重 悬 菌 体 冰 浴 超 声 破 碎 后 收 集 上 清 即 得 粗 酶 液 取 / 粗 酶 液 加 到 /. 含 / 的 缓 冲 液 中 以 含 / 的.$ 缓 冲 液 为 对 照 用 紫 外 分 光 光 度 计 测 定 样 品 在 & 处 光 密 度 的 减 少 值 过 氧 化 氢 酶 活 性 ' & A " - #$ " 其 中 以 每 下 降 为 个 酶 活 单 位 " - 为 粗 酶 提 取 液 总 体 积 /" 为 测 定 用 粗 酶 液 体 积 / #$ 为 菌 体 重 量 ' & ' / 重 组 菌 的 抗 性 分 析 将 对 照 菌 和 重 组 菌 阳 性 克 隆 划 线 培 养 挑 取 单 克 隆 于 含 ' / 氨 苄 青 霉 素 / 液 体 培 养 基 中 = 过 夜 培 养 次 日 以 接 种 量 放 大 培 养 至 + 为 时 加 入 /0.-1 于 = 诱 导 表 达 9 用 / 液 体 培 养 基 将 菌 液 + 均 调 成 稀 释 至 及 倍 后 取 / 点 涂 于 / 及 含 / 3 / 4 / 甘 露 醇 的 / 平 板 上 = 过 夜 培 养 观 察 其 生 长 情 况 将 上 述 诱 导 后 的 对 照 菌 与 重 组 菌 + 调 成 一 致 为 分 别 取 / 于 / / 以 及 添 加 / 3 / 4 / 甘 露 醇 的 / 液 体 培 养 基 中 培 养 每 隔 9 测 + 值 进 行 生 长 曲 线 的 绘 制 独 立 实 验 次 每 次 取 个 重 复 结 果 与 分 析 ' & 盐 穗 木 过 氧 化 氢 酶 基 因 的 克 隆 与 序 列 分 析 使 用 简 并 引 物 从 盐 穗 木 同 化 枝 中 克 隆 获 得 大 小 约 )$ 的 基 因 片 段 序 列 已 向 1%& &* 提 交.2.2 软 件 预 测 其 编 码 个 氨 基 酸 残 基 图 分 子 量 为 *+ 等 电 点 为 在 线 软 件.,- 预 测 盐 穗 木 氧 化 氢 酶 的 亚 细 胞 定 位 于 过 氧 化 物 酶 体 /- 比 对 发 现 与 盐 地 碱 蓬 %&' 烟 草! '!! 及 拟 南 芥! 基 因 的 核 苷 酸 序 列 一 致 性 分 别 为 及 使 用 ; 1 软 件 近 邻 相 接 法 对 不 同 植 物 的 氨 基 酸 序 列 作 进 化 树 分 析 表 明 盐 穗 木 的 基 因 与 同 科 植 物 盐 地 碱 蓬 的 基 因 处 于 同 一 进 化 支 亲 缘 关 系 最 近 图 由 此 确 定 克 隆 所 得 序 列 为 盐 穗 木 的 一 个 过 氧 化 氢 酶 基 因 命 名 为 盐 穗 木 过 氧 化 氢 酶 基 因 ' ' 盐 胁 迫 下 $%& 的 表 达 分 析 图 结 果 表 明 的 表 达 量 随 着 高 盐 处
西 北 植 物 学 报 卷 图 的 核 苷 酸 序 列 及 推 测 的 氨 基 酸 序 列 8' 3# % % % #%& %&% # %&% #%& % ( 理 时 间 的 延 长 呈 先 上 升 后 下 降 的 趋 势 说 明 为 盐 胁 迫 响 应 基 因 ' 融 合 蛋 白 诱 导 表 达 及 可 溶 性 分 析 为 研 究 的 生 理 学 功 能 将 鉴 定 正 确 的 重 组 菌 和 对 照 菌 经 /0.-1 诱 导 9 后 菌 体 总 蛋 白 经 +. 1 电 泳 检 测 结 果 显 示 可 诱 导 表 达 出 分 子 量 大 小 约 为 *+ 目 的 蛋 白 *+ 加 标 签 *+ 的 特 异 性 蛋 白 条 带 图 与 预 测 大 小 一 致 表 明 融 合 蛋 白 可 在 大 肠 杆 菌 中 表 达 菌 体 超 声 破 碎 后 的 上 清 和 沉 淀 经 +. 1 检 测 发 现 融 合 蛋 白 主 要 存 在 于 菌 体 沉 淀 中 图 为 使 外 源 蛋 白 在 大 肠 杆 菌 中 以 可 溶 性 功 能 蛋 白 的 形 式 存 在 在 不 同 温 度 下 诱 导 表 达 结 果 显 示 在 低 温 = 诱 导 时 上 清 中 目 的 蛋 白 的 表 达 量 有 所 升 高 低 温 可 提 高 可 溶 性 蛋 白 的 表 达 量 ' * 融 合 蛋 白 表 达 的 条 件 优 化 为 提 高 可 溶 性 融 合 蛋 白 的 表 达 量 分 别 对 诱 导 剂 浓 度 和 诱 导 时 间 进 行 了 优 化 0.-1 浓 度 条 件 优 化 的 +. 1 电 泳 结 果 显 示 在 / 0.-1 诱 导 后 上 清 中 目 的 蛋 白 表 达 量 较 高 而 在 /0.-1 范 围 内 上 清 中 目 的 蛋 白 的 表 图 不 同 植 物 - 氨 基 酸 序 列 的 的 系 统 进 化 树 分 析 8'.9: '%&% 2%% (- &% #%& % 图 在 / 3 处 理 不 同 时 间 的 表 达 分 析 8'!$2% &$ %2&( & 2% $ & %3 2%#& %2 (%2%& %$%2 达 无 明 显 差 异 图 考 虑 到 0.-1 对 细 菌 具 毒 性 选 取 /0.-1 为 诱 导 浓 度 同 时 在 = 添 加 /0.-1 诱 导 蛋 白 表 达 不 同 时 间 的 +. 1 电 泳 显 示 在 诱 导 9 时 上 清 中 的 目 的
期 彭 丹 等 盐 穗 木 过 氧 化 氢 酶 基 因 的 克 隆 与 功 能 分 析 蛋 白 表 达 量 较 高 图 因 此 优 化 的 诱 导 条 件 为 = 0.-1 诱 导 浓 度 / 诱 导 时 间 9 ' + 融 合 蛋 白 的 - " 印 迹 及 酶 活 活 性 检 测 %%2& 印 迹 结 果 表 明 诱 导 后 的 重 组 菌 呈 现 大 小 *+ 的 显 色 条 带 而 对 照 菌 无 此 条 带 图 证 明 表 达 诱 导 出 的 蛋 白 为 - 过 氧 化 氢 酶 活 性 测 定 结 果 显 示 对 照 菌 有 内 源 的 过 氧 化 氢 酶 表 达 但 重 组 菌 的 过 氧 化 氢 酶 活 性 显 著 高 于 对 照 菌 约 倍 图 表 明 外 源 表 达 融 合 标 签 的 - 具 有 过 氧 化 氢 酶 活 性 ', 重 组 菌 的 抗 性 分 析 将 对 照 菌 和 重 组 菌 同 时 以 上 述 优 化 条 件 诱 导 出 可 溶 性 目 的 蛋 白 后 点 涂 在 / 培 养 基 过 夜 培 养 结 果 发 现 对 照 菌 与 重 组 菌 的 菌 落 生 长 情 况 相 似 而 在 添 加 /3 /4 的 / 培 养 基 上 时 对 照 菌 生 长 明 显 受 到 抑 制 重 组 菌 的 菌 落 生 长 数 显 著 高 于 对 照 菌 在 含 有 / 甘 露 醇 的 / 培 养 基 上 与 重 组 菌 相 比 对 照 菌 生 长 也 受 到 一 定 抑 制 图 生 长 曲 线 测 定 结 果 显 示 在 / 液 体 培 养 中 对 照 菌 和 重 组 菌 快 速 生 长 生 长 速 率 基 本 一 图 - 蛋 白 在 大 肠 杆 菌 /+ 中 表 达 的 +. 1 电 泳 图 未 诱 导 空 载 /$ - 0.-1 诱 导 空 载 /$ - 未 诱 导 /$ -- 0.-1 诱 导 / $ - 总 蛋 白 = 诱 导 沉 淀 = 诱 导 上 清 = 诱 导 上 清 = 诱 导 上 清 ; 低 分 子 量 标 准 蛋 白 8'+. 1 &: (-$2%& %!$2% && /+ && # %/$ - 0& # %/$ - && # %/$ -- %!$2% & $2%&& # %/$ -+%$ #& %2 = #$%2& & #& %2 = #$%2& & #& %2 = #$%2& & #& %2 =; / % #2 %'9 $2%& 2*%2 图 = 培 养 /0.-1 不 同 时 间 诱 导 - 蛋 白 的 +. 1 电 泳 图 诱 导 9 上 清 诱 导 9 上 清 诱 导 9 上 清 诱 导 9 上 清 诱 导 9 上 清 诱 导 9 上 清 ; 低 分 子 量 标 准 蛋 白 8' +. 1 &: (-$2%&%!$2% & (%2%& %$%2 & # % ):/0.-1& = #$%2& &9#$%2& &9#$%2& &9 #$%2& & 9#$%2& & 9 #$%2& & 9; / % #2 %'9 $2%& 2*%2 图 %%2&) 检 测 融 合 蛋 白 的 表 达 图 = 培 养 不 同 0.-1 浓 度 诱 导 - 蛋 白 的 +. 1 电 泳 图 /0.-1 诱 导 上 清 沉 淀 / 0.-1 诱 导 上 清 沉 淀 /0.-1 诱 导 上 清 沉 淀 /0.-1 诱 导 上 清 沉 淀 ; 低 分 子 量 标 准 蛋 白 8'+. 1 &: (-$2%&%!$2% & #& %2 (%2%& & %& 2&(0.-1 = #$%2& & &%$ & # % ):/0.-1 #$%2& & &%$ & # % ):/0.-1 #$%2& & &%$ & # % ): /0.-1 #$%2& & &%$ & # % ):/0.-1 ; / % #2 %'9 $2%& 2*%2 诱 导 后 /$ - 总 蛋 白 0.-1 诱 导 后 /$ - 总 蛋 白 8'!$2% &&: ( 9%(#& $2%&): %%2&)&' - $2%& ( /$ -( %2& # %- $2%& ( /$ - ( %2& # % 图 重 组 菌 与 对 照 菌 过 氧 化 氢 酶 活 性 的 测 定 8' %: (& 2 & 2% )&&
西 北 植 物 学 报 卷 图 重 组 菌 和 对 照 菌 的 生 长 情 况 和 生 长 曲 线 / 平 板 )/3/4/ 甘 露 醇 8'$: &9%'2 9&:( 9%2% )&& )%2& & 2 / $ % )/3/4/ && 致 而 在 含 /3 的 / 液 体 中 培 养 时 对 达 量 上 调 暗 示 其 可 能 在 抵 御 盐 胁 迫 过 程 的 初 级 阶 段 照 菌 的 生 长 基 本 处 于 停 滞 状 态 重 组 菌 可 进 入 对 数 生 发 挥 功 能 长 期 但 其 生 长 缓 慢 在 含 / 4 的 / 液 研 究 证 实 用 大 肠 杆 菌 系 统 可 成 功 分 析 基 因 在 胁 体 中 对 照 菌 生 长 延 滞 在 9 后 开 始 进 入 对 数 生 长 迫 耐 受 中 的 功 能 利 用 大 肠 杆 菌 系 统 能 够 表 达 期 而 重 组 菌 培 养 9 后 生 长 较 快 在 / 甘 出 来 自 细 菌 和 低 等 真 核 生 物 有 活 性 的 过 氧 化 氢 露 醇 胁 迫 条 件 下 对 照 菌 生 长 较 重 组 菌 缓 慢 图 酶 但 目 前 利 用 该 系 统 尚 未 得 到 可 溶 性 有 活 性 的 这 些 结 果 证 实 在 离 子 胁 迫 和 渗 透 胁 迫 条 件 下 植 物 过 氧 化 氢 酶 重 组 蛋 白 本 研 究 通 过 降 低 诱 导 - 提 高 了 大 肠 杆 菌 的 生 长 能 力 温 度 可 提 高 可 溶 性 蛋 白 表 达 量 %%2& 印 迹 显 示 重 讨 论 植 物 对 逆 境 的 抵 抗 存 在 相 互 协 同 的 机 制 例 如 在 低 温 驯 化 过 程 中 产 生 的 低 温 抗 性 也 增 强 植 物 的 抗 旱 能 力 植 物 过 氧 化 氢 酶 基 因 可 通 过 清 除 作 用 使, 保 持 一 定 的 浓 度 范 围 参 与 植 物 的 各 种 抗 逆 反 应 包 括 冷 热 病 害 水 分 盐 干 旱 等 本 研 究 采 用 同 源 克 隆 法 获 得 盐 穗 木 过 氧 化 氢 酶 基 因 的,8 序 列 包 含 )$ 核 苷 酸 编 码 个 氨 基 酸 残 基 克 隆 得 到 的 盐 穗 木 基 因 与 同 属 藜 科 植 物 盐 地 碱 蓬 亲 缘 关 系 最 近 基 因 差 异 表 达 的 变 化 反 映 了 植 物 在 该 条 件 下 基 因 表 达 调 控 的 变 化 在 盐 胁 迫 下 差 异 表 达 的 变 化 反 映 植 物 在 短 时 间 内 表 组 蛋 白 确 实 为 标 签 融 合 蛋 白 证 实 的 正 确 表 达 对 低 温 诱 导 的 重 组 菌 和 对 照 菌 进 行 的 酶 活 性 测 定 表 明 重 组 菌 的 过 氧 化 氢 酶 活 性 显 著 高 于 对 照 说 明 融 合 蛋 白 具 有 过 氧 化 氢 酶 生 物 活 性 对 重 组 菌 株 的 抗 性 分 析 发 现 在 / 3 / 4 的 离 子 胁 迫 下 对 照 菌 生 长 明 显 受 到 抑 制 而 重 组 菌 生 长 较 好 在 / 甘 露 醇 渗 透 胁 迫 处 理 下 对 照 菌 的 生 长 情 况 也 优 于 对 照 菌 总 之 抗 性 试 验 表 明 重 组 蛋 白 能 够 提 高 大 肠 杆 菌 对 离 子 胁 迫 和 渗 透 胁 迫 的 耐 受 能 力 而 这 一 耐 受 性 与 诱 导 表 达 的 过 氧 化 氢 酶 活 性 有 关 外 源 表 达 的 过 氧 化 氢 酶 及 时 清 除 离 子 胁 迫 和 渗 透 胁 迫 产 生 的 活 性 氧 物 质 保 护 宿 主 菌 免 受 氧 化 伤 害
期 彭 丹 等 盐 穗 木 过 氧 化 氢 酶 基 因 的 克 隆 与 功 能 分 析 本 研 究 克 隆 获 得 并 探 讨 其 表 达 模 式 评 价 了 对 盐 穗 木 盐 胁 迫 的 响 应 特 性 利 用 原 核 表 达 系 统 表 达 出 具 有 生 物 活 性 的 盐 穗 木 过 氧 化 氢 酶 并 证 实 该 酶 的 过 量 表 达 可 提 高 大 肠 杆 菌 盐 胁 迫 的 耐 受 能 力 有 助 于 从 抗 氧 化 物 酶 的 角 度 阐 明 盐 穗 木 耐 盐 的 分 子 机 理 参 考 文 献 6B4.& %2& % B'!!% ;,--, ; ;% 9&( & :%2& % B!!&(')!* ; +.B /// ; ; ', %(%& : & & &%& : &! &&$& #2&') 2% B (')* '! 0 30 //.80-0/3.& : ':& 2##2% ( %B)+!, ' 3B8 陈 金 峰 31 13 王 宫 南 31 ; 程 素 满.2 '2%) #%(#& &&$& 2%2% &B** ' -'!%! 西 北 植 物 学 报 '/& 9&% % - /, 6@4 4,6@; 4 ;,40 '(% (:% '%&%%!$2% & &2% $ & % () $&) 2# &(% & B!. /0+, 3;@/ 3.> 3+ /0B1-2& '%& ) $&%!$2%&' 9%% '%&%9 % %2%%% %9 (% $& $ 9 '%&& %2 & & 2% & %! %2% B!,'! ('&0 ; / 马 长 乐 31.. 王 萍 萍 6@ 曹 子 谊 ' &&'&(%2%& '%&%%!$2% & (%&%&' &2% $ & %2% B *! %! 植 物 学 报 *+ & 9&% % /03 4 31/03 @ &&'%!$2% && $9: ' &: ()2 %'%&%&9&% % ))'% 2) %$%2! % '%&%#& %29% 2% B! '(' /0- 李 涛 @03/4 尹 林 克 @ 3 严 成 5#&% ( &&2 &&&: & %'% && 9% %2% 9%( -2, %2 B.! /', 干 旱 区 地 理 ',& 9&% % 31 B 王 俊 华 6 31 @/ 曾 幼 玲 @ 31B 杨 洁 ' +% %2 && (': &%)% &%&0 & 1 & & 92 &2%%& 93 ):,../B** '-'!%! 西 北 植 物 学 报 '.& 9&% % ;,4B8,0-8; 30-0- ; % #2&&' ;3% @ 2* /) 22:;&# & % &$2&' 2) 2/) 2 2:.2% 31 85 王 凡 强 31 6 7 王 正 祥 / 邵 蔚 蓝 '.#2( && $2 $%2 %( 9%2)% %&%&'&%%2%2 B, %! 微 生 物 学 报 *' & 9&% % 邹 琦 植 物 生 理 学 实 验 指 导 ; 北 京 中 国 农 业 出 版 社, @ ;;0,.+.'!$2% && $#2( & (#)%)%2 %$&% (22% )&&' B * '! 631B 张 建 斌 B0 贾 彩 红 + 315B 邓 秋 菊 '&&'& %!$2% &&: ( &)&&#& %2%& 2 & %& 2% B ** '-'!%! 西 北 植 物 学 报 '& 9&% % /0 31 @ 梁 文 裕 B018 焦 广 飞 @7, 游 向 荣 ' +(%2%& %!$2% && '%&%&&' (;&-(2 1,' 1' #)"%%% && 2%9: 2& B** '-'!%! 西 北 植 物 学 报 & & 9&% % 8 吴 凡 @ ; 余 梅 ' &&'& (#& & 92%2 & ( 92%% #$%2! % #% '%&% (29 $9: %%! '& '&'&!, ' B** '-'!%! 西 北 植 物 学 报 '& 9&% % 1.- 4 1,/.4, ++@ ; 4')+, &:$%+, 2&2$&( 2(2%! 2% %9 $9: %%! &(%2 ) 2%%2& %& ' B! '('. 3+, 31 0 ;, ++@4,1/' &&'& %!$2% &&: ( &2&2$&( 2$2%&(29 2 %'2 &! 1 & />%2 &(%22% 2%%2& %& ' B! 0- / B/3. + %2: ($2 $%2 % &' %B * ' * 31 /3 ;0+- ;/ -6 ' ; % #2 %& ( &9% %2' # %!$2% && $2 $%2 %('9 & %& %$&%B! '!)! ; 3+ /., @ ;4,' ; % #2 %& ( && $2 $%2 %('9 & %& %2 % % %!$2%% & B * '!.' /0371 林 星 谷 4 31+ 孔 德 仓. 317 ; 庞 晓 明 ' &&'&#%%!$2% &&: ( %'%&%&+ &' & & &B** '-'!%! 西 北 植 物 学 报 ' & 9&% % ;;+ 5> / 1'%(#& &&$&(#&# & 2%%B &!1 2 ' '!*!,&