否 还 有 其 他 未 知 的 隐 形 突 变 不 得 而 知 ; 同 时 菌 株 本 身 是 多 种 营 养 物 质 的 缺 陷 型, 因 此 难 以 判 断 对 细 胞 产 生 的 影 响 是 否 完 全 来 自 hemb 突 变 同 时 目 前 的 研 究 结 果 还 有 矛 盾 之 处,he

5- 氨 基 乙 酰 丙 酸 脱 水 酶 缺 失 对 大 肠 杆 菌 生 长 的 影 响 1,2 2 1 2 尚 柯, 郭 小 飞, 王 艳 萍, 郑 平 (1. 天 津 科 技 大 学 食 品 工 程 与 生 物 技 术 学 院, 天 津 300457)(2. 中 科 院 天 津 工 业 生 物 技 术 研 究 所, 天 津 300308) 摘 要 :5- 氨 基 乙 酰 丙 酸 (ALA) 脱 水 酶 直 接 关 系 到 ALA 的 积 累, 研 究 该 酶 突 变 对 细 胞 的 影 响 对 生 物 法 生 产 ALA 具 有 重 要 意 义, 然 而 目 前 这 方 面 认 识 比 较 混 乱 本 研 究 通 过 无 痕 敲 除 E.coli MG1655 菌 株 的 ALA 脱 水 酶 的 结 构 基 因 hemb, 发 现 ALA 脱 水 酶 酶 活 大 幅 降 低, 且 突 变 株 生 长 受 到 极 大 的 影 响, 但 是 仍 然 有 10% 的 残 余 酶 活 支 持 细 胞 微 弱 且 不 依 赖 于 ALA 生 长 本 研 究 的 结 果 加 深 了 对 ALA 代 谢 途 径 的 了 解, 为 构 建 高 效 积 累 ALA 的 工 程 菌 株 提 供 了 依 据 关 键 词 :5- 氨 基 乙 酰 丙 酸 ;ALA 脱 水 酶 ; 无 痕 敲 除 文 章 篇 号 :1673-9078(2011)7-742-746 Influence of 5-Aminolevulinic Acid Dehydratase Deletion on E.coli Growth SHANG Ke 1,2, GUO Xiao-fei 2, WANG Yan-ping 1, ZHENG Ping 2 (1.Food Engineering and Biotechnology College, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China) (2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China) Abstract: 5-Aminolevulinic acid dehydratase (ALAD) affects the accumulation of ALA. Therefore study of the effect of ALAD mutation on cells is of great significance for ALA bioproduction. However, the present knowledge is still contradictive. In this study, by knocking out ALAD-encoding gene hemb of E.coli MG1655, the enzyme activity and growth of the mutant were compared with those of the wild type strain. It was found that the ALAD activity of the mutant was dramatically decreased. The cells grew very slowly compared to the wild type. Interestingly, 10% residual activity was detected and was supposed to support the weak growth of the mutant, which was not evidently resumed by the addition of ALA. The results improve the understanding of ALA metabolism and will benefit for the construction of ALA-producing strain. Key words: 5-aminolevulinic acid (ALA); ALA dehydratase; gene knockout 5- 氨 基 乙 酰 丙 酸 (ALA) 是 所 有 四 氢 吡 咯 化 合 物 的 共 同 前 体 [1], 因 其 在 农 业 和 医 药 领 域 的 应 用 价 值, 引 起 人 们 利 用 生 物 法 合 成 ALA 的 广 泛 兴 趣 ALA 脱 水 酶 (5-aminolevulinic acid dehydratase, ALAD), 由 hemb 基 因 编 码, 该 酶 催 化 两 分 子 ALA 不 对 称 缩 合 生 成 胆 色 素 原 (PBG), 并 进 一 步 代 谢 生 成 其 它 四 吡 咯 类 化 合 物 作 为 ALA 代 谢 途 径 的 下 游 关 键 酶, ALA 脱 水 酶 的 活 性 降 低 有 助 于 ALA 的 积 累, 因 此 目 前 在 发 酵 生 产 ALA 过 程 中, 一 般 采 用 添 加 该 酶 的 底 物 类 似 物, 如 乙 酰 丙 酸 (LA) 来 抑 制 该 酶 活 性 [2] D- 葡 萄 糖 也 可 以 抑 制 ALAD 的 活 性, 但 同 时 也 抑 制 ALA 的 合 成 [3] 发 酵 过 程 中 添 加 抑 制 剂 不 仅 增 加 了 发 酵 工 艺 的 复 杂 度, 而 且 提 高 了 成 本 利 用 分 子 生 物 学 手 段 突 变 或 者 弱 化 该 酶 的 表 达 是 另 一 个 可 行 的 方 法 曾 有 实 验 室 通 过 自 发 诱 变 及 化 学 诱 变 处 理 不 同 的 营 养 缺 陷 型 菌 株 获 得 了 失 去 全 部 或 部 分 ALAD 酶 活 的 收 稿 日 期 :2011-03-17 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 (31070037); 天 津 科 委 应 用 基 础 与 前 沿 技 术 研 究 计 划 基 金 (10JCZDJC16200); 中 科 院 优 秀 青 年 科 技 专 项 基 金 (KSCX2-EW-Q-13) 通 讯 作 者 : 郑 平, 博 士, 副 研 究 员, 研 究 方 向 : 微 生 物 代 谢 工 程 hemb 突 变 株 [4~6], 但 突 变 对 细 胞 造 成 的 影 响 却 不 相 同 Li [4] 等 人 在 大 肠 杆 菌 营 养 缺 陷 型 菌 株 C600 基 础 上, 通 过 自 发 诱 变 获 得 了 hemb 突 变 株 RP522, 并 对 其 进 行 酶 活 及 生 长 情 况 进 行 测 定 实 验 无 法 检 测 到 ALA 脱 水 酶 活 力, 突 变 株 生 长 很 弱, 并 且 添 加 ALA 不 能 改 善 其 生 长 情 况 O Neill [5] 等 人 对 C600 菌 株 进 行 了 化 学 诱 变 实 验, 获 得 了 hem-201 突 变 株, 其 hemb 发 生 了 突 变 该 突 变 大 幅 度 降 低 了 ALAD 的 酶 活, 但 是 仍 然 有 10% 的 剩 余 酶 活 实 验 发 现 无 论 是 否 添 加 ALA, 在 LB 培 养 基 上 突 变 株 生 长 都 非 常 缓 慢 有 意 思 的 是, 该 突 变 株 同 时 失 去 了 合 成 ALA 的 能 力, 在 甘 油 培 养 基 上 的 生 长 必 须 依 赖 外 加 的 ALA 至 于 发 生 这 些 变 化 的 原 因 则 没 有 更 进 一 步 的 实 验 研 究 然 而 Xie [6] 等 人 在 大 肠 杆 菌 MG1655 及 来 源 于 W677 的 hemb 突 变 的 营 养 缺 陷 型 菌 株 CGSC4676 中 分 别 过 表 达 球 形 红 细 菌 的 ALA 合 成 酶 基 因, 在 成 分 与 LB 培 养 基 类 似 的 丰 富 培 养 基 上 突 变 株 的 生 长 情 况 良 好, 与 MG1655 没 有 显 著 差 别,ALA 产 量 也 与 MG1655 无 明 显 差 异 综 上 所 述, 目 前 已 有 的 相 关 研 究 采 用 的 是 自 发 突 变 或 化 学 诱 变 获 得 的 突 变 株, 除 了 已 知 的 hemb 突 变, 是 742

否 还 有 其 他 未 知 的 隐 形 突 变 不 得 而 知 ; 同 时 菌 株 本 身 是 多 种 营 养 物 质 的 缺 陷 型, 因 此 难 以 判 断 对 细 胞 产 生 的 影 响 是 否 完 全 来 自 hemb 突 变 同 时 目 前 的 研 究 结 果 还 有 矛 盾 之 处,hemB 突 变 究 竟 对 细 胞 产 生 什 么 影 响 还 有 待 解 析 在 本 研 究 中, 我 们 通 过 基 因 敲 除 获 得 了 hemb 单 基 因 缺 失 的 突 变 株, 实 验 发 现 突 变 株 的 ALAD 酶 活 失 去 了 90% 左 右, 并 且 hemb 的 缺 失 对 细 胞 生 长 造 成 了 非 常 大 的 影 响, 但 并 不 会 产 生 依 赖 ALA 生 长 的 营 养 缺 陷 型 本 研 究 的 结 果 丰 富 了 对 ALA 代 谢 途 径 的 认 识, 为 改 造 工 程 菌 生 产 ALA 提 供 了 理 论 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 实 验 材 料 1.1.1 菌 种 及 质 粒 E.coli DH5α/λPir MG1655 由 本 实 验 室 提 供,E.coli Top10 购 自 全 式 金 公 司 ; 自 杀 型 质 粒 pds132 由 法 国 LMPA 实 验 室 友 情 提 供, 平 末 端 载 体 peasy-blunt 购 自 全 式 金 公 司 1.1.2 工 具 酶 及 试 剂 PCR 高 保 真 酶 限 制 酶 连 接 酶 购 自 Takara Biotech 公 司 ;PCR 验 证 酶 (2 Taq Mix) 购 自 全 式 金 ; 基 因 组 试 剂 盒 购 自 索 莱 宝 ; 质 粒 小 提 试 剂 盒 及 DNA 胶 回 收 试 液 体 培 养 :250 ml 三 角 瓶 装 液 量 100 ml,37 200 r/min 摇 瓶 培 养 26 h 固 体 培 养 :37 培 养 箱 培 养 20 h 1.2 实 验 方 法 1.2.1 基 因 组 提 取 提 取 大 肠 杆 菌 基 因 组 的 方 法 参 照 索 莱 宝 试 剂 盒 说 明 书 1.2.2 基 于 同 源 重 组 的 无 痕 敲 除 以 KEGG 上 已 发 表 的 MG1655 基 因 组 为 模 板 设 计 引 物, 扩 增 MG1655 ALA 脱 水 酶 基 因 hemb 的 上 下 游 同 源 臂, 命 名 为 F 和 R 片 段 F 片 段 的 上 游 引 物 A:5 -GGG GAGCTCTGATAGCCAGAGTGCAAGCCAATG-3 ( 下 划 线 为 Sac I 酶 切 位 点 ) 和 下 游 引 物 B:5 -CTGAAAAT CAGATCCGCACCCGCACGGCAACACCAGGTCGTT AAGG-3 ; R 的 上 游 引 物 C:5 -CCTTAACGACCTGG TGTTGCCGTGCGGGTGCGGATCTGATTTTCAG-3 和 下 游 引 物 D:5 -GGGTCTAGATTGAAACGCCACCCG CAGG-3 ( 下 划 线 为 Xba I 酶 切 位 点 ) 分 别 胶 回 收 纯 化 F 和 R 片 段, 经 过 适 当 稀 释 后 作 为 模 板, 利 用 融 合 PCR 技 术 把 两 个 同 源 臂 连 接 并 扩 增, 条 件 见 表 1 胶 回 收 融 合 片 段, 命 名 为 hemb-fr 表 1 融 合 PCR 的 条 件 Table 1 Fusion PCR conditions 剂 盒 购 自 Biomiga 公 司 ; 蛋 白 定 量 试 剂 盒 购 自 Bio-Red PCR 温 度 时 间 公 司 94 3 min 5- 氨 基 乙 酰 丙 酸 胆 色 素 原 二 硫 苏 糖 醇 (DTT) 94 30 sec 牛 血 清 蛋 白 (BSA) 对 二 甲 氨 基 苯 甲 醛 等 购 自 Sigma 55~65 40 sec 公 司, 氯 化 血 红 素 冰 醋 酸 高 氯 酸 三 氯 乙 酸 乙 酰 72 1 min 丙 酮 氯 仿 以 及 其 他 常 用 化 学 试 剂 购 自 国 药 72 3 min 1.1.3 主 要 仪 器 94 3 min 实 验 中 用 到 的 主 要 仪 器 :PCR 为 Applied Biosystems 94 30 sec 公 司 产 品,DNA 电 泳 为 Baygene 公 司 产 品 ; 蛋 白 电 泳 60~70 30 sec 凝 胶 成 相 仪 为 Bio-red 产 品 ; 酶 标 仪 为 Molecular Devices 72 1 40 公 司 产 品 72 8 min 1.1.4 培 养 基 LB 培 养 基 [7] (m/v):0.5% 酵 母 提 取 物,1% 蛋 白 胨, Cycle1:2 to 4,5 个 循 环 Cycle2:7 to 9,28 个 循 环 1% 氯 化 钠 ( 固 体 培 养 基 额 外 加 2% 琼 脂 粉 ); 在 需 要 的 情 况 下 添 加 抗 生 素, 其 浓 度 为 : 氨 苄 青 霉 素 :50 μg/ml; 氯 霉 素 :32 μg/ml; 在 需 要 的 情 况 下 添 加 不 同 浓 度 的 ALA LB 固 体 培 养 基 添 加 10% 蔗 糖 (m/v), 用 于 基 因 敲 除 的 反 向 筛 选 M9 基 本 培 养 基 [7], 以 0.4% 葡 萄 糖 为 碳 源, 用 于 验 证 突 变 株 的 生 长 情 况 1.1.5 细 菌 培 养 将 连 接 成 功 的 hemb-fr 片 段 通 过 平 末 端 连 接 到 peasy-blunt 载 体 上, 转 入 Top10 感 受 态 细 胞 进 行 蓝 白 斑 筛 选, 挑 选 克 隆 进 行 测 序, 将 获 得 的 重 组 质 粒 命 名 为 pzs1; 经 Sac I Xba I 双 酶 切 pzs1 质 粒 胶 回 收 hemb-fr 片 段, 连 接 到 pds132 自 杀 型 质 粒, 转 入 E.coli DH5α/λPir 感 受 态 细 胞, 菌 落 PCR 验 证, 提 取 验 证 正 确 的 质 粒, 命 名 为 pzs2, 电 转 化 MG1655 感 受 态 细 胞, 氯 霉 素 抗 性 培 养 挑 取 正 确 的 转 化 子, 纯 化 后 在 普 通 LB 液 体 培 养 基 中 培 养, 涂 布 含 有 15% 蔗 糖 的 LB 培 养 基 进 行 反 向 筛 选, 743

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 挑取转化子进行菌落 PCR 验证 将验证正确的克隆纯化 保种 命名为 ZSEc2 1.2.3 生长情况测定 以 MG1655 菌株在 LB 培养基中的生长情况作为对 照 测定 ZSEc2 突变株在 LB 培养基中的生长曲线 初 始接种吸光值为 0.05 根据固定时间取样 测定 600 nm 下的吸光值 外加 ALA 对突变株生长的影响 通过在 LB 培养基 中添加不同浓度的 ALA 液体培养 测定生长曲线 突变株在以葡萄糖为碳源的基本培养基中的生长 分别添加 3 mg/l ALA 和 3 mg/l ALA 30 μm VB12 液 体好氧培养 26 h 测定终点 OD600 值 1.2.4 酶活测定 ALA 脱水酶的酶活测定方案根据文献[8]实行 蛋白 定量方案参见 bio-red 蛋白定量试剂盒说明书 以牛血清 蛋白作为对照 将酶活力单位定义为 37 条件下 每分钟产生 1 nmol 胆色素原(PBG)所需的酶量定义为一个酶活力单位 (1 U) 1.2.5 胞内 ALA 含量的测定 以 MG1655 野生型作为对照 测定 ZSEc2 在 LB 液 体培养基中培养 16 h 以后的胞内 ALA 含量 取样 离 心收集菌体 用 Tris-HCl 缓冲液洗涤 3 次 用 Tris-HCl 缓冲液重悬 保证野生型和突变株重悬液的 OD 值均为 8.7 超声破碎 取等量细胞破碎液用 Ehrich s 试剂测定 胞内的 ALA 含量[8] 2 结果与讨论 2.1 基于同源重组的 hemb 基因的无痕敲除 以 MG1655 基因组为模板 用引物 A 和 D 通过融 合 PCR 获得了预期大小为 1400 bp 的条带 电泳结果见 图 1 2011, Vol.27, No.7 图 1 显示在不同的退火温度条件下都能获得目的产 物 其中最后一组 连接期 64.2 扩增期 69.2 的效果较好 与杂带分离较为清晰 采用最后一组的条 件扩大体系 PCR 扩增并进行胶回收获得融合片段 在利用同源重组敲除基因时 将获得的不含 hemb 基因的突变片段连接到 pds132 自杀型载体[9]上获得 pzs2 质粒 pds132 载体具有 Cm 抗性筛选标记 R6K 复制起点和 sacb 反向筛选标记 R6K 复制起点导致该质 粒只能在含有pir 基因的菌株如DH5α/λpir 中才可以复制 存在 在含有 Cm 抗性的 LB 培养基上挑取能够生长的 10 个克隆 以 A 和 D 为引物进行菌落 PCR 鉴定 结果 见图 2 图 2 菌落 PCR 鉴定结果 Fig.2 Colony PCR confirmation 注 M DNA marker 1~10 不同克隆的菌落 PCR 产物 根据菌落 PCR 鉴定结果 只有 2 号菌株含有 1.4 kb 的突变片段 因此是含有正确连接产物 pzs2 的菌株 提取质粒 电转化 MG1655 涂布 Cm 抗性平板 在这 一步操作中 因为 MG1655 中不含有 pir 基因 菌株在 选择压力下 只有当 pzs2 质粒整合到基因组上 即发 生第一次同源重组 才可以在 Cm 抗性平板上生长 挑 选单克隆 在含有 10%蔗糖的 LB 培养基中进行第二次 同源重组 不发生同源重组的细胞因为含有来自质粒的 sacb 基因 不能在含有蔗糖的培养基上生长 而发生重 组的细胞则可以生长 同源重组的后果有两种可能性 回复成野生型或者是 hemb 基因被敲除的突变株 实际 在筛选平板上我们观察到了大小明显不同的两种菌落 分别挑取大小菌落 以 A 和 D 为引物进行菌落 PCR 验 证 结果见图 3 图 3 菌落 PCR 鉴定 ZSEc2 图 1 融合 PCR 电泳图 Fig.1 Gel electrophoresis of fusion PCR products 注 M DNA marker 1~5 号 融合 PCR 产物 其 PCR 条件分别为 连接期退火温度 55.7 57.6 59 62 64.2 扩增期退火温度 60.7 62.6 64 67 69.2 744 Fig.3 Colony PCR verification of ZSEc2 注 M DNA marker 1~8 号为挑取的单菌落 9 为 pzs2 质粒对照 10 为 MG1655 基因组对照 图 3 显示 1 3 4 号克隆含有 2.5 kb 片段而没有 1.4 kb 融合片段 说明是野生型的回复突变株 6 7 8

号 克 隆 含 有 1.4 kb 融 合 片 段 条 带, 并 且 在 2.5 kb 左 右 没 有 条 带, 应 该 为 正 确 的 ZSEc2 突 变 株 2 5 号 克 隆 似 乎 两 个 片 段 都 有, 推 测 可 能 是 10% 蔗 糖 不 足 以 完 全 致 死 没 发 生 第 二 次 同 源 重 组 的 含 sacb 基 因 的 菌 株 将 6 号 克 隆 进 行 纯 化, 作 为 后 期 实 验 所 用 的 突 变 株 ZSEc2 本 实 验 构 建 的 hemb 突 变 株 特 异 性 地 缺 失 了 hemb 结 构 基 因 (975 bp) 的 810 bp 片 段 (101~910 bp), 其 中 包 括 活 性 中 心 的 关 键 Lys 残 基, 剩 余 部 分 无 法 形 成 完 整 的 四 级 结 构, 实 验 也 没 有 影 响 其 他 可 能 相 关 的 调 节 基 因 同 时 使 用 无 痕 敲 除 避 免 了 在 最 终 获 得 的 突 变 株 中 引 入 抗 生 素 抗 性 基 因 等 选 择 标 记, 因 而 不 会 对 突 变 体 生 长 造 成 其 它 额 外 的 影 响 2.2 突 变 株 生 长 情 况 测 定 MG1655 和 突 变 株 ZSEc2 在 普 通 LB 培 养 基 中 的 生 长 情 况 对 照 见 图 4 图 4 MG1655 与 ZSEc2 在 LB 培 养 基 上 的 生 长 情 况 比 较 Fig.4 Comparison of growth between MG1655 and ZSEc2 in LB medium 图 4 结 果 显 示, 在 LB 培 养 基 中 突 变 株 ZSEc2 的 生 长 情 况 与 野 生 型 相 比 非 常 差, 最 终 OD 只 有 不 到 0.2, 而 野 生 型 则 可 以 达 到 5.5 左 右, 说 明 hemb 基 因 编 码 的 ALA 脱 水 酶 对 细 菌 的 生 长 有 关 键 作 用, 这 是 由 于 ALA 代 谢 生 成 的 物 质 对 细 胞 生 长 是 不 可 或 缺 的 我 们 也 发 现 在 LB 培 养 基 中 添 加 ALA 代 谢 终 产 物, 如 血 红 素, 并 不 能 促 进 突 变 株 的 生 长, 这 可 能 是 由 于 E.coli K12 菌 株 不 含 有 将 血 红 素 从 胞 外 转 运 到 周 质 空 间 的 外 膜 转 运 蛋 白 [10] 为 了 避 免 LB 培 养 基 中 可 能 含 有 微 量 的 ALA 及 维 生 素 B 12 ( 其 合 成 需 要 ALA) 对 突 变 株 生 长 造 成 影 响, 我 们 考 察 了 突 变 株 在 M9 基 本 培 养 基 中 的 生 长, 发 现 突 变 株 可 以 微 弱 生 长 ; 在 培 养 基 中 添 加 微 量 ALA, 或 添 加 ALA 及 VB 12, 并 不 能 明 显 改 善 生 长 说 明 hemb 结 构 基 因 缺 失 并 不 会 产 生 ALA 的 营 养 缺 陷 型 突 变 株 在 LB 培 养 基 中 外 加 不 同 浓 度 ALA 的 情 况 下, 突 变 株 ZSEc2 的 生 长 情 况 见 图 5 图 5 不 同 浓 度 ALA 对 突 变 株 在 LB 培 养 基 中 生 长 的 影 响 Fig.5 The effect of ALA on mutant growth in LB medium 图 5 表 明, 尽 管 加 入 外 源 ALA 可 以 在 一 定 程 度 上 缩 短 延 迟 期, 提 高 最 终 的 菌 体 OD 值, 但 是 这 种 作 用 非 常 微 弱, 最 终 OD 值 基 本 在 0.2~0.25 的 范 围 内, 突 变 株 的 生 长 远 远 低 于 野 生 型, 因 此 ALA 并 不 能 使 突 变 株 的 [4] 生 长 恢 复 到 野 生 型 的 水 平, 该 结 果 与 Li 等 人 的 结 论 比 [6] 较 接 近, 而 与 Xie 等 人 的 结 果 不 同 Xie 等 人 在 含 有 琥 珀 酸 和 甘 氨 酸 的 复 杂 培 养 基 中 培 养 过 表 达 外 源 ALA 合 成 酶 的 MG1655 及 CGSC4676,ALA 终 产 量 为 4 g/l 左 右, 突 变 株 的 生 长 和 野 生 型 菌 株 没 有 明 显 差 别, 细 胞 干 重 分 别 达 到 4 g/l 和 3.9 g/l 但 是 在 本 试 验 中, 即 使 在 外 加 4 g/l ALA 的 情 况 下,ZSEc2 突 变 株 的 生 长 仍 然 非 常 差 2.3 突 变 株 与 野 生 型 的 ALA 脱 水 酶 酶 活 对 比 测 定 了 MG1655 和 ZSEc2 的 ALAD 酶 活 MG1655 野 生 型 的 ALAD 酶 活 为 (5.24±0.36) 10-2 U, 比 活 力 为 0.19±0.01 U/mg 蛋 白 ;ZSEc2 突 变 株 的 ALAD 酶 活 为 (5.19±1.06) 10-3 U, 比 活 力 为 (2.16±0.41) 10-2 U/mg 蛋 白 对 MG1655 和 ZSEc2 的 ALAD 酶 活 测 定 数 据 显 示 : hemb 基 因 缺 失 的 突 变 株 ZSEc2 的 ALAD 酶 活 与 野 生 型 MG1655 相 比, 显 著 降 低, 比 活 力 低 10 倍, 说 明 hemb 基 因 被 成 功 地 敲 除 了 有 趣 的 是 突 变 株 中 仍 然 有 微 弱 的 ALAD 酶 活 的 存 在, 这 或 者 是 由 于 大 肠 杆 菌 中 存 在 其 它 尚 未 被 发 现 的 可 以 催 化 相 同 反 应 的 酶, 或 者 是 由 于 其 他 酶 的 非 特 异 性 催 化 引 起, 当 然 也 可 能 是 由 于 酶 活 测 定 的 显 色 反 应 特 异 性 不 够 高 造 成 的 误 差, 然 而 结 合 突 变 株 在 LB 培 养 基 以 及 基 本 培 养 基 上 可 以 生 长 的 情 况 看, 我 们 认 为 前 者 的 可 能 性 更 大 2.4 hemb 基 因 缺 失 对 胞 内 ALA 积 累 的 影 响 O Neill [5] 等 人 获 得 的 hem-201 突 变 株 不 仅 失 去 了 90% 的 ALAD 活 力, 而 且 也 失 去 了 合 成 ALA 的 能 力 [6] Xie 等 人 提 到 突 变 株 的 ALA 合 成 酶 活 性 显 著 降 低, ALA 产 量 与 野 生 型 相 比 相 差 不 大 因 此, 可 以 通 过 测 定 745

突 变 株 胞 内 的 ALA 积 累 量 来 判 断 突 变 株 是 否 失 去 合 成 Technol., 1984, 6: 390-401 ALA 的 能 力 [2] Saikeur A, Choorit W, Prasertsan P, et al, Influence of precursors 比 较 了 MG1655 和 ZSEc2 在 胞 内 积 累 ALA 的 差 异 and inhibitor on the production of extracellular 5-aminolevulinic 在 二 者 菌 体 量 相 同 的 情 况 下, 基 于 ALA 标 准 曲 线 计 算 acid and biomass by Rhodopseudomonas palustris KG31 [J]. 出 野 生 型 及 突 变 株 的 胞 内 ALA 含 量 见 表 2 Biosci. Biotechnol. Biochem., 2009,5:987-992 表 2 胞 内 ALA 含 量 对 比 [3] Lee D H, Jun W J, Kim K M, et al, Inhibition of Table 2 Comparison of intracellar ALA accumulation 5-aminolevulinic acid dehydratase in recombinant Escherichia 菌 株 ALA 含 量 /(mg/l) coli using D-glucose [J]. Enzyme MicrobiolTechnol., 2003, 25: MG1655 0.14±0.033 1751-1755 ZSEc2 1.178±0.168 [4] Li J M, Umanoff H, Proenca R, et al. Cloning of the Escherichia 根 据 表 2 的 数 据 可 以 看 出,ZSEc2 突 变 株 中 的 ALA coli K-12 hemb gene [J]. J. Bacteriol., 1988, 170: 1021-1025 含 量 比 野 生 型 菌 株 高 10 倍 左 右, 说 明 突 变 株 可 以 合 成 [5] O Neill G P, Thorbjarnardóttir S, Michelsen U, et al., ALA, 而 且 hemb 基 因 的 敲 除 的 确 有 利 于 胞 内 ALA 的 积 5-aminolevulinic acid dehydratase deficiency can cause 累 5-aminolevulinate auxotrophy in Escherichia coli [J]. J. 3 结 论 与 展 望 Bacteriol., 1991, 103: 94-100 [6] Xie L, Eiteman M A, Altman E, Production of 5-aminolevulinic 本 研 究 通 过 无 痕 敲 除 的 方 法, 成 功 地 构 建 了 大 肠 杆 acid by an Escherichia coli aminolevulinate dehydratase mutant 菌 MG1655 的 hemb 基 因 缺 失 株 与 以 往 利 用 诱 变 获 得 that overproduces Rhodobacter sphaeroides aminolevulinate 的 hemb 突 变 株 类 似 研 究 相 比, 本 研 究 避 免 了 诱 变 可 能 synthesis [J]. Biotechl. Lett., 2003, 25: 1751-1755 产 生 的 其 它 不 确 定 的 突 变, 因 而 更 准 确 地 表 征 了 hemb [7] Sambrook J, Fitsch E F, Maniatis T, Cold Spring Harbor 基 因 缺 失 对 大 肠 杆 菌 的 影 响 实 验 发 现, 突 变 株 的 ALAD Laboratory Press [M]. Molecular Cloning, 1989 酶 活 显 著 降 低, 为 野 生 型 的 10% 左 右 ; 该 突 变 株 在 LB [8] Dhanasekaran S, Chandra N R, Sagar C, et al., 5-aminolevulinic 培 养 基 和 M9 培 养 基 上 可 以 生 长, 而 添 加 ALA 对 突 变 株 acid dehydratase from Plasmodium falciparum [J]. J. Biol. 的 生 长 情 况 也 没 有 本 质 影 响 Chem., 2004,8:6934-6942 另 外 本 研 究 也 用 实 验 数 据 证 实 了 hemb 基 因 的 缺 失 [9] Philippe N, Alcaraz J P, Coursange E, et al., Improvement of 有 利 于 ALA 的 积 累 不 过 考 虑 到 该 操 作 同 时 也 严 重 影 pcvd442, a suicide plasmid for gene allele exchange in 响 了 突 变 株 的 生 长, 因 此 不 宜 用 于 工 业 化 生 产, 可 以 考 bacteria [J]. Plasmid, 2004,51:246-255 虑 采 用 其 他 方 法, 例 如 弱 化 ALAD 表 达 [10] Létoffé S, Delepelaire P, Wandersman C, The housekeeping 参 考 文 献 dipeptide permease is the Escherichia coli heme transporter and functions with two optional peptide binding proteins [J]. Proc. [1] Rebeiz C A, Montazer Z A, Hopen H, et al, Photodynamic Natl. Acad. Sci. USA., 2006, 34: 12891-12896 herbicides I concepts and phenomenology [J]. Enzyme Microb. ( 上 接 第 809 页 ) [3] Phalruschaphan T. Comparision of peeling and extraction methods in the production of tamarind seed gum [J]. The Kaselsart Joumal Natural Sciences, 1982, 16(2): 74-81 [4] 章 程 辉, 王 秀 兰. 罗 望 子 黄 酮 类 化 合 物 提 取 工 艺 研 究 [J]. 广 西 热 带 农 业,2008,3:52-54 [5] 闫 克 玉, 高 远 翔. 大 孔 吸 附 树 脂 法 纯 化 槐 米 总 黄 酮 的 研 究 [J]. 现 代 食 品 科 技,2009,25(6):596-599 [6] N N Shankaracharya, Tamarind - Chemistry, Technology and Uses - A critical appraisal [J]. Food Sci Technol, 1998, 35(3): 193-208 [7] Y Sudjaroen, R Haubner, G Wurtele, et al. Isolation and structure elucidation of phenolic antioxidants from Tamarind (Tamarindus indica L.) seeds and pericarp [J]. Food and Chemical Toxicology, 2005, 43 : 1673 [8] Sevag M G, lackman D B, Smolens J. The isolation of the components of streptococcal nucleoprotein in serologically active form [J]. Journal of biological chemistry, 1938, 124: 425-436 [9] 刘 光 海. 金 银 花 多 糖 的 提 取 与 精 制 及 含 量 测 定 [J]. 湖 南 中 医 药 大 学 学 报,2009.29(11):33-34 746