黃 花 蜜 菜 中 的 Wedelolactone 對 前 列 腺 癌 及 骨 癌 細 胞 的 生 長 抑 制 之 探 討 指 導 老 師 : 蕭 培 文 教 授 作 者 : 黃 暉 凱 學 號 :9357 學 校 : 台 中 一 中
目 錄 一 摘 要..3 二 動 機..3 三 前 言 及 背 景.. 四 研 究 目 的..5 五 設 備 器 材 與 試 劑..5 六 實 驗 過 程 或 方 式..5 七 實 驗 結 果..7 八 討 論 與 結 論.19
一 摘 要 本 實 驗 以 Wedelolactone (IKK 激 脢 抑 制 劑 ) 作 為 藥 劑, 加 於 人 類 前 列 腺 癌 細 胞 以 及 骨 癌 細 胞, 以 探 討 Wedelolactone 對 於 這 些 不 同 癌 細 胞 的 影 響 我 們 將 各 種 癌 細 胞 養 在 1 孔 培 養 盤 上, 對 其 加 入 不 同 濃 度 的 Wedelolactone, 觀 察 於 加 藥 後 第 8 天 觀 察 並 做 結 晶 紫 染 色 法, 分 析 細 胞 生 長 的 狀 況 結 果 發 現 各 種 不 同 時 期 的 前 列 腺 癌 細 胞 均 會 受 Wedelolactone 抑 制, 而 骨 癌 細 胞 則 幾 乎 不 受 影 響, 因 此 推 測 此 藥 對 前 列 腺 癌 細 胞 具 有 較 高 生 長 抑 制 性 二 動 機 新 世 紀 的 疾 病 癌 症 在 國 內 外 十 大 死 因 中 居 高 不 下, 而 目 前 的 治 療 方 法 效 果 不 顯 著 且 常 造 成 人 體 其 它 組 織 的 傷 害, 這 是 個 棘 手 問 題, 人 們 往 往 聞 之 色 變 ; 若 是 能 找 到 方 法, 能 有 效 殺 死 癌 細 胞 而 不 對 正 常 細 胞 造 成 傷 害, 將 十 分 有 益 於 癌 症 的 治 療 前 列 腺 癌 是 一 個 日 嚴 重, 影 響 老 年 男 性 的 健 康 問 題 此 病 似 乎 日 益 普 遍, 人 口 老 化 是 主 要 原 因 之 一, 但 高 脂 肪 食 物 和 遺 傳 因 素 似 乎 亦 是 引 致 此 種 癌 症 的 原 因 它 在 歐 西 國 家 的 發 病 率 較 東 方 國 家 為 高, 但 在 亞 洲 也 有 日 益 嚴 重 的 趨 勢 在 美 國, 前 列 腺 癌 的 發 病 率 佔 男 性 惡 性 腫 瘤 的 第 二 位, 而 死 亡 率 佔 第 三 位 在 香 港, 每 十 萬 人 死 於 前 列 腺 癌 者 為 三 人 左 右, 遠 較 美 國 為 低 前 列 腺 癌 的 病 因 目 前 還 不 甚 明 瞭, 可 能 與 性 激 素 有 關, 絕 大 部 分 的 前 列 腺 癌 發 生 在 前 列 腺 後 葉, 多 為 腺 癌 早 期 的 前 列 腺 癌 常 無 症 狀, 常 見 的 排 尿 症 狀 與 前 列 腺 肥 症 相 似, 即 尿 頻 夜 尿 排 尿 困 難 尿 痛 及 尿 瀦 留 等 前 列 腺 癌 可 隨 淋 巴 管 轉 移 往 附 近 之 淋 巴 腺, 亦 可 循 血 循 環 轉 移 往 骨 骼 前 列 腺 癌 有 很 多 生 化 腫 瘤 標 記, 過 去 最 常 用 的 是 血 清 酸 性 磷 酸 酵 素, 但 其 特 異 性 和 敏 感 性 均 不 高 近 來 比 較 常 用 的 是 前 列 腺 特 異 抗 原 (PSA), 這 是 一 種 所 有 前 列 腺 細 胞 均 有 分 泌 的 一 種 蛋 白 質, 當 一 個 男 性 年 紀 漸 長, 前 列 腺 會 發 大, 故 PSA 之 濃 度 亦 會 隨 年 齡 而 增 高 ;PSA 值 如 在 或 以 下, 患 癌 的 可 能 性 極 低 ; 但 如 PSA 值 在 以 上 時, 患 癌 的 可 能 性 便 很 高 了 前 列 腺 癌 大 多 發 展 緩 慢, 隱 匿 性 的 可 長 期 無 明 顯 發 展, 但 在 出 現 症 狀 之 後, 多 數 發 展 較 快, 發 現 時 已 有 遠 處 轉 移 的 患 者, 五 年 生 存 率 只 有 四 分 之 一, 故 應 作 定 期 檢 查 和 及 早 處 理 很 幸 運 地, 我 參 加 了 中 研 院 所 舉 辦 的 高 中 生 物 資 優 生 培 育 計 畫, 並 有 幸 加 入 生 農 所 蕭 培 文 老 師 的 實 驗 室, 因 此 能 對 前 列 腺 癌 有 更 進 一 步 的 了 解 蕭 老 師 的 實 驗 室 已 發 現 IKK ( 蛋 白 質 激 脢 ) 對 於 前 列 腺 癌 細 胞 生 長 的 重 要 性, 而 此 實 驗 室 有 許 多 不 同 的 癌 症 細 胞 以 及 不 同 時 期 的 前 列 腺 癌 症 細 胞 株, 因 此, 我 的 實 驗 便 以 3
IKK 的 抑 制 劑 Wedelolactone 作 為 藥 劑, 對 不 同 種 癌 細 胞 以 及 不 同 時 期 癌 細 胞 做 加 藥 處 理, 來 實 驗 其 對 於 前 列 腺 癌 的 抑 制 效 果 三 前 言 及 背 景 ( 一 )Wedelolactone 的 簡 介 : Wedelolactone 是 一 種 Coumestans 結 構 的 化 合 物, 早 在 198 年 就 在 一 些 天 然 物 如 旱 蓮 草 黃 花 蜜 菜 中 分 離 出 來 Wedelolactone 早 期 是 用 來 治 療 蛇 毒 肝 炎 發 炎 反 應, 近 期 又 被 發 現 是 IKK( 蛋 白 質 激 脢 ) 的 抑 制 劑 H 3 CO O O OH OH O Wedelolactone OH ( 二 ) 前 列 腺 癌 細 胞 株 Rv/3-13( 簡 稱 13) 的 簡 介 : CWR 是 一 個 人 類 前 列 腺 癌 細 胞 將 CWR 種 到 老 鼠 裡, 然 後 將 老 鼠 醃 掉, 尚 能 存 活 的 細 胞 取 出 成 為 Rv1 Rv1 算 是 一 個 混 合 體, 內 有 部 分 細 胞 需 要 雄 性 賀 爾 蒙, 部 分 不 需 要 ( 而 下 面 介 紹 的 AI 是 幾 乎 都 不 需 要 雄 性 賀 爾 蒙 來 促 進 其 生 長 ) Rv/3-13 則 是 蕭 老 師 實 驗 室 將 某 些 特 殊 基 因 轉 植 入 Rv1 但 對 此 實 驗 並 無 影 響, 因 此 此 實 驗 就 用 Rv/3-13 來 代 替 Rv1 PS:p8 p78 是 指 細 胞 培 養 的 代 數 p8 模 擬 較 前 期 的 前 列 腺 癌 ;p78 模 擬 較 後 期 的 前 列 腺 癌 ( 三 ) 前 列 腺 癌 細 胞 株 AI- 的 簡 介 : 正 常 的 Rv/3-13 需 要 雄 性 素 來 促 進 生 長 ( 相 對 於 AI 是 需 要 的 ) 而 此 細 胞 是 將 的 medium 中 去 掉 雄 性 素, 而 將 能 夠 存 活 的 少 數 Rv/3-13 以 去 雄 性 素 的 medium 繼 續 培 養, 進 而 挑 選 出 可 在 此 種 medium 中 成 長 的 前 列 腺 癌 細 胞 株 AI- 現 今 治 療 前 列 腺 癌 的 方 法 之 一, 有 用 雌 性 素 來 抑 制 雄 性 素, 以 達 到 扼 殺 前 列 腺 癌 細 胞 的 作 用 AI 系 列 的 前 列 腺 癌 細 胞 不 需 要 雄 性 素 就 能 正 常 生 長, 因 而 用 此 來 模 擬 不 需 雄 性 素, 更 惡 化 的 前 列 腺 癌 細 胞 ( 四 ) 前 列 腺 癌 細 胞 株 AI- 的 簡 介 : 挑 選 方 法 與 AI- 相 同, 但 此 細 胞 株 生 長 速 度 較 AI- 快 速 ( 五 ) 骨 癌 細 胞 株 UOS 的 簡 介 : UOS 細 胞 株 是 在 19 年, 從 一 個 染 上 骨 癌 的 15 歲 女 孩 的 骨 頭 組 織 中 被 培 養 UOS 屬 於 附 著 性 細 胞, 早 期 是 和 WI-38 cells 共 同 培 養 時 UOS 對 insulin-like growth factor I (IGF-I) insulin-like growth factor II (IGF II) 的 接 受 器 有 正 面 的 反 應
他 也 表 現 出 許 多 抗 原, 包 括 blood type A, Rh+, HLA A, Aw3, B1, Bw35, and B(+/-). ( 六 ) 結 晶 紫 染 色 & 測 吸 光 子 : 我 們 採 取 結 晶 紫 染 色 (specific lysis assay by crystal violet staining) 分 析 黏 著 性 細 胞 之 細 胞 生 長 情 形 原 理 是 黏 著 性 細 胞 死 亡 後 會 浮 起, 而 留 下 的 細 胞 數 目 多 寡 則 經 由 其 吸 收 的 染 劑 決 定, 因 為 先 將 細 胞 固 定 後, 細 胞 越 多 則 吸 收 的 染 劑 越 多, 經 測 量 染 劑 之 特 殊 吸 光 值 就 可 以 知 道 細 胞 存 活 情 形 四 研 究 目 的 ( 一 ) 探 討 Wedelolactone 對 於 不 同 時 期 及 不 同 惡 程 度 的 前 列 腺 癌 細 胞 抑 制 的 效 果 ( 二 ) 比 較 Wedelolactone 對 於 前 列 腺 癌 細 胞 及 骨 癌 細 胞 的 抑 制 效 果 五 設 備 器 材 與 試 劑 ( 一 ) 器 材 :incubator flask tube 離 心 機 血 球 計 數 器 1-well plate 9-well plate incubator pipette elisa reader ( 二 ) 試 劑 : FBS CD-FBS PBS Trypsin Sodium pyruvate Glutamine glutaldehyde ddho crystal violet % 醋 酸 Wedelolactone ( 三 ) 細 胞 株 :Rv/3-13 AI- AI- UOS 六 實 驗 過 程 或 方 式 ( 一 ) 解 凍 細 胞 1. 從 液 態 氮 取 出 欲 解 凍 之 細 胞. 在 37 水 域, 使 之 成 半 溶 狀 態 3. 在 laminor flow 內 打 開, 取 至 5cc 離 心 管 1 x g 離 心 5 分 鐘. 把 上 清 液 吸 掉, 再 加 入 7cc medium, 打 散 後 放 入 75T flask 內 5. 放 入 37 細 胞 培 養 箱 內 培 養 ( 二 ) 繼 代 培 養 1. 在 空 間 將 滿 ( 約 八 分 滿 ) 的 75T flask 加 入 1 cc trypsin, 切 開 細 胞 對 flask 的 附 著, 使 細 胞 漂 浮. 放 入 37 5% CO ( 模 擬 人 體 環 境 ) incubator 3 分 鐘, 讓 trypsin 作 用 3. 再 加 入 3 cc medium, 將 細 胞 打 散, 取 約 1/3 量 的 細 胞 放 入 新 的 75T flask. 將 新 的 75T flask 補 入 5 cc medium, 即 可 放 入 incubator 培 養 5. 待 細 胞 約 八 分 滿, 再 循 環 至 第 1 點 5
( 三 ) 種 細 胞 1. 將 欲 實 驗 的 細 胞 拿 出 ( 在 flask 內 ), 吸 掉 medium. 加 入 trypsin, 放 入 incubator 3 分 鐘, 使 其 切 開 細 胞 對 flask 的 附 著, 讓 細 胞 漂 浮 3. 吸 岀 細 胞 移 至 tube 內, 打 散 使 其 均 勻 混 合. 用 血 球 計 數 器 算 出 細 胞 濃 度 ( 隻 / ml) 5. 加 入 medium 將 細 胞 濃 度 調 到 1 隻 / ml. 如 圖, 將 細 胞 加 入 1 well plate, 每 well.5 ml ( 即 每 well 1 隻 細 胞 ) ( 圖 為 做 一 種 細 胞 所 需 的 盤 數 ) 7. 放 入 incubator 培 養, 天 後 開 始 treatment ( 四 ) 加 藥 處 理 1. 在 種 細 胞 兩 天 後 ( 即 加 藥 後 第 天 ), 將 染 出, 作 為 之 後 細 胞 生 長 倍 率 的 基 準 值 ( 細 胞 數 目 當 1). 剩 下 的 3 組 ( 如 右 圖, 個 plate 為 一 組 ) 便 依 右 圖 所 示, 加 不 同 濃 度 的 Wedelolactone 並 換 新 medium 3. 加 藥 後 第 天, 取 出 一 組 作 結 晶 紫 染 色 測 其 細 胞 數, 剩 下 的 組 繼 續 依 原 本 藥 的 濃 度 更 換 新 的 medium. 加 藥 後 第 天, 在 取 出 一 組 作 結 晶 紫 染 色 測 其 細 胞 數, 剩 下 的 1 組 繼 續 依 原 本 藥 的 濃 度 更 換 新 的 medium 5. 加 藥 後 第 天, 取 出 最 後 一 組 作 結 晶 紫 染 色 測 其 細 胞 數. 最 後, 從 加 藥 後 第 天 到 第 天, 將 其 畫 成 Growth Curve, 即 可 了 解 細 胞 的 生 長 狀 況 ( 五 ) 利 用 結 晶 紫 染 色 的 方 式 紀 錄 細 胞 生 長 情 形, 做 growth curve 在 加 藥 後 第 天 染 出 的 當 起 始 值 ( 細 胞 數 目 當 作 1), 加 藥 後 第.. 天 染 出 的 跟 第 天 比 較 以 下 是 染 色 及 測 O.D value of 595 nm 以 顯 示 細 胞 數 目 的 方 式 : 1. 吸 去 medium 然 後 用 PBS 洗 兩 次 (1 ml/well). 加 5 μl 1% glutaldehyde (5 μl /well) for 15 minutes. ( 固 定 細 胞 於 well 上 ) 3. 吸 去 glutaldehyde 然 後 加.1% crystal violet ( μl /well) for 3 minutes.( 染 色 ). 吸 去 crystal violet 然 後 用 ddh O 洗 兩 次 5. 乾 了 以 後, 用 % 醋 酸 (1 ml/well) 溶 出 crystal violet. 收 集 於 9well plate( μl /well) 測 O.D value of 595 nm
七 實 驗 結 果 ( 一 ) Wedelolactone on 13 p8 13 p8 在 加 入 Wedelolactone 後 數 天 之 細 胞 成 長 倍 數 及 生 存 曲 線 : 細 胞 成 長 倍 數 Treat\day 1 5.733 8.773.857.1uM 1 5.999 8.753 3.3981.1uM 1 5.139 9.3 1.535 1uM 1 1.555 5.537 1.955 1uM 1.1887.8831.81987 Growth Curve 13 p8 3 5 15 1 5-5.1uM Wed..1uM Wed. 1uM Wed. 1uM Wed. 7
Wedelolactone on 13 P8 5 15 1 5.1uM.1uM 1uM 1uM Concentration * 倍 顯 微 鏡 下 的 癌 細 胞 生 長 情 形 Treat with Wed. s on 13 p8.1 M.1 M 1 M 1 M 8
Treat with Wed. s on 13 p8.1 M.1 M 1 M 1 M ( 二 ) Wedelolactone on 13 p78 13 p78 在 加 入 Wedelolactone 後 數 天 之 細 胞 成 長 倍 數 及 生 存 曲 線 : 細 胞 成 長 倍 數 treat\day 1.91755 7.995 8.9858.1uM 1.33 8.859 9.35851.1uM 1.98 7.87181 7.189 1uM 1 1.9555.589 5.85383 1uM 1.1397.899.55 Growth Curve Wedelolactone on 13 P78 1 1 8.1uM.1uM 1uM 1uM 9
Wedelolactone on 13p78 1 8.1uM.1uM 1uM 1uM Concentration * 倍 顯 微 鏡 下 的 癌 細 胞 生 長 情 形 Treat with Wed. s on 13 p78.1 M.1 M 1 M 1 M 1
Treat with Wed. s on 13 p78.1 M.1 M 1 M 1 M Treat with Wed. s on 13 p78.1 M.1 M 1 M 1 M 11
( 三 ) Wedelolactone on AI- AI- 在 加 入 Wedelolactone 後 數 天 之 細 胞 成 長 倍 數 及 生 存 曲 線 : 細 胞 成 長 倍 數 treat\day 1.315 7.139 11.558.1uM 1.185 7.333 1.938.1uM 1.7913 5.83388 9.178 1uM 1 3.135.378833 5.9817 1uM 1 1.73887 1.1388.8 Growth Curve Wedelolactone on AI 1 1 1 8.1uM Wed..1uM Wed. 1uM Wed. 1uM Wed. Wedelolactone on AI 1 1 8 Concentration.1uM.1uM 1uM 1uM 1
* 倍 顯 微 鏡 下 的 癌 細 胞 生 長 情 形 Treat with Wed. s on AI-.1 M.1 M 1 M 1 M Treat with Wed. s on AI-.1 M.1 M 1 M 1 M 13
Treat with Wed. s on AI-.1 M.1 M 1 M 1 M ( 三 ) Wedelolactone on AI- AI- 在 加 入 Wedelolactone 後 數 天 之 細 胞 成 長 倍 數 及 生 存 曲 線 : 細 胞 成 長 倍 數 treat\day 1 3.95 9.31115 15.1.1uM 1 3.985 9.11 17.939.1uM 1 3.717 8.83579 1.955 1uM 1.1355.893 11.9139 1uM 1 3.8189.5575.9815 Growth Curve Wedelolactone on AI 5 15 1 5.1uM Wed..1uM Wed. 1uM Wed. 1uM Wed. 1
Wedelolactone on AI 18 1 1 1 1 8.1uM.1uM 1uM Concentration 1uM * 倍 顯 微 鏡 下 的 癌 細 胞 生 長 情 形 Treat with Wed. s on AI-.1 M.1 M 1 M 1 M 15
Treat with Wed. s on AI-.1 M.1 M 1 M 1 M Treat with Wed. s on AI-.1 M.1 M 1 M 1 M 1
( 三 ) Wedelolactone on UOS UOS 在 加 入 Wedelolactone 後 數 天 之 細 胞 成 長 倍 數 及 生 存 曲 線 : 細 胞 成 長 倍 數 treat\day 1 1.7197 3.3333 11.718.1uM 1 1.5793 3.3371 11.8911.1uM 1 1.1395 3.57113 1.379 1uM 1 1.585 3.7558 1.313 1uM 1 1.51395.1113 1.593 Growth Curve Wedelolactone on UOS 15 1 5.1uM.1uM 1uM 1uM Wedelolactone on UOS 1 1 1 8.1uM.1uM 1uM Concentration 1uM 17
* 倍 顯 微 鏡 下 的 癌 細 胞 生 長 情 形 Treat with Wed. s on UOS.1 M.1 M 1 M 1 M 18
八 討 論 與 結 論 Wedelolactone on 13 p8 Wedelolactone on 13 P78 3 1-1.1uM Wed..1uM Wed. 1uM Wed. 1uM Wed. 15 1 5.1uM.1uM 1uM 1uM Wedelolactone on AI Wedelolactone on AI 1 5 1 1 8.1uM Wed..1uM Wed. 1uM Wed. 1uM Wed. 15 1 5.1uM Wed..1uM Wed. 1uM Wed. 1uM Wed. Wedelolactone on UOS 15 1 5.1uM.1uM 1uM 1uM ( 一 ) Rv/3-13 所 衍 生 的 不 同 惡 性 程 度 的 前 列 腺 癌 細 胞,Wedelolactone 皆 有 明 顯 的 抑 制 效 果 由 實 驗 結 果 可 發 現,Wedelolactone 不 論 是 對 於 13 p8 13 p78, 皆 有 相 同 的 抑 制 效 果 因 此 Wedelolactone 不 只 可 以 抑 制 早 期 前 列 腺 癌, 對 於 晚 期 的 前 列 腺 癌 亦 有 所 作 用 ( 二 ) 前 列 腺 癌 細 胞 不 論 其 為 雄 性 素 依 存 或 不 依 存,Wedelolactone 皆 有 明 顯 的 抑 制 效 果 一 開 始 猜 測 Wedelolactone 或 許 是 因 為 間 接 抑 制 了 雄 性 素 對 癌 細 胞 的 生 長 幫 助, 藉 此 對 於 前 列 腺 癌 細 胞 有 抑 制 效 果 因 此 我 便 對 AI 系 列 的 前 列 腺 癌 細 胞 亦 19
做 相 同 的 處 理, 以 期 對 AI 有 較 不 明 顯 的 抑 制, 但 結 果 是,Wedelolactone 對 於 不 需 要 雄 性 素 的 AI 亦 有 抑 制 作 用, 因 此 Wedelolactone 抑 制 前 列 腺 癌 細 胞 的 機 制 還 有 待 研 究 ( 三 ) Wedelolactone 濃 度 達 1μΜ 以 上, 加 藥 第 天 後, 開 始 對 前 列 腺 癌 細 胞 產 生 明 顯 抑 制 而 Wedelolactone 對 於 骨 癌 細 胞, 則 幾 乎 沒 有 抑 制 性 實 驗 結 果 如 上 述 但 實 驗 後 發 現,UOS 在 加 藥 後 第 天,Wedelolactone 濃 度 為 1μM 的 細 胞, 竟 出 現 細 胞 老 化 現 象 ( 如 圖 ), 但 還 未 死 亡, 因 此 還 是 會 吸 收 染 劑 此 現 象 仍 跟 前 列 腺 癌 細 胞 直 接 死 亡 有 所 不 同, 因 實 驗 只 做 一 次, 恐 有 誤 差, 因 此 還 需 再 做 更 進 一 步 的 探 討 與 證 實 但 大 致 上,Wedelolactone 對 於 骨 癌 細 胞 的 抑 制 效 果, 遠 低 於 前 列 腺 癌 細 胞 ( 四 ) Wedelolactone 對 於 前 列 腺 癌 細 胞 有 專 一 性 Wedelolactone 對 於 骨 癌 細 胞, 相 較 於 前 列 腺 癌 細 胞, 幾 乎 不 對 其 有 任 何 抑 制 效 果, 因 此 猜 測 此 藥 只 對 前 列 腺 癌 有 效 由 此 可 推 論,Wedelolactone 的 目 標 物 應 該 位 於 前 列 腺 細 胞 相 對 於 其 他 體 細 胞 之 特 有 處 本 來 是 要 再 以 正 常 人 體 之 纖 維 母 細 胞 作 為 另 一 個 對 照 組, 礙 於 時 間 關 係 沒 有 做 完 但 後 來 實 驗 室 學 長 姐 有 做 此 實 驗, 發 現 相 較 於 前 列 腺 癌 細 胞, 正 常 人 體 之 纖 維 母 細 胞 明 顯 較 不 受 Wedelolactone 所 抑 制, 因 此 Wedelolactone 對 於 前 列 腺 癌 細 胞 應 有 專 一 性