中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 2 卷 第 7 期 2 年 7 月 367 山 楂 总 黄 酮 对 复 合 因 素 致 大 鼠 脂 肪 肝 模 型 脂 质 代 谢 与 低 密 度 脂 蛋 白 受 体 表 达 的 影 响 罗 先 钦, 黄 崇 刚, 伍 小 波 2, 刘 剑 毅, 胡 荣, 兰 波, 徐 嘉 红. 重 庆 市 中 药 研 究 院 药 理 毒 理 研 究 所, 重 庆 6 2. 西 南 大 学 药 学 院 中 医 药 学 院, 重 庆 76 摘 要 : 目 的 研 究 山 楂 总 黄 酮 对 复 合 因 素 致 大 鼠 脂 肪 肝 模 型 脂 质 代 谢 与 低 密 度 脂 蛋 白 受 体 (LDL-R) 表 达 的 影 响 方 法 采 用 复 合 因 素 致 大 鼠 脂 肪 肝 动 物 模 型 造 模 成 功 后 将 动 物 随 机 分 成 6 组, 分 别 ig 给 予 山 楂 总 黄 酮.3.2 g/kg, 东 宝 甘 泰 g/kg, 模 型 组 和 对 照 组 每 天 ig 给 予 等 体 积 生 理 盐 水 造 模 后 给 药 期 间 末 次 给 药 后 分 别 检 测 血 清 丙 氨 酸 转 氨 酶 (ALT) 天 冬 氨 酸 转 氨 酶 (AST) 碱 性 磷 酸 酶 (AKP) 活 性, 以 及 三 酰 甘 油 (TG) 总 胆 固 醇 (TC) 高 密 度 脂 蛋 白 - 胆 固 醇 (HDL-C) 低 密 度 脂 蛋 白 - 胆 固 醇 (LDL-C) 水 平 ; 末 次 给 药 后 检 测 血 液 流 变 学 指 标 和 肝 组 织 匀 浆 TG 和 TC 水 平, 同 时 取 肝 左 叶 分 别 用 于 病 理 检 查 观 察 显 微 结 构 变 化,RT-PCR 和 免 疫 组 化 检 测 LDL-R mrna 和 蛋 白 表 达 结 果 山 楂 总 黄 酮 作 用 于 复 合 因 素 致 脂 肪 肝 大 鼠 模 型, 其 血 清 中 脂 质 肝 TC 和 肝 TG 与 模 型 组 比 较 有 显 著 性 降 低 ; 血 清 ALT AST 和 AKP 活 性 与 模 型 组 比 较 有 显 著 性 降 低 ; 山 楂 总 黄 酮 能 明 显 降 低 全 血 黏 度 ( 高 切 和 低 切 ) 红 细 胞 聚 集 指 数 红 细 胞 压 积 以 及 明 显 增 加 红 细 胞 变 形 指 数 ; 病 理 组 织 学 检 查 显 示, 各 给 药 组 脂 肪 变 性 和 炎 症 反 应 程 度 较 模 型 组 均 有 一 定 的 减 轻 RT-PCR 和 免 疫 组 化 结 果 显 示, 模 型 组 大 鼠 肝 组 织 LDL-R mrna 和 蛋 白 表 达 与 对 照 组 比 较 显 著 降 低 (P<.) 山 楂 总 黄 酮 和 东 宝 甘 泰 对 复 合 因 素 致 脂 肪 肝 模 型 大 鼠 肝 组 织 LDL-R mrna 和 蛋 白 表 达 降 低 有 明 显 抑 制 作 用 结 论 山 楂 总 黄 酮 可 能 通 过 调 节 脂 肪 代 谢 改 善 肝 脏 功 能 和 增 加 LDL-R mrna 和 蛋 白 的 表 达, 起 到 治 疗 大 鼠 脂 肪 肝 的 作 用 关 键 词 : 山 楂 总 黄 酮 ; 脂 肪 肝 ; 脂 质 代 谢 ; 低 密 度 脂 蛋 白 受 体 (LDL-R); 复 合 因 素 中 图 分 类 号 :R28. 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 :23-267(2)7-367 - 7 Effect of total flavones of Crataegi Fructus on lipid metabolism and expression of low density lipoprotein receptor in rats with fatty liver induced by complex factors LUO Xian-qin, HUANG Chong-gang, WU Xiao-bo 2, LIU Jian-yi, HU Rong, LAN Bo, XU Jia-hong. Institute of Pharmacology and Toxicology, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 6, China 2. College of Pharmaceutical and Traditional Chinese Medicine, Southwest University, Chongqing 76, China Abstract: Objective To investigate the effect of total flavones of Crataegusi Fructus (TFCF) on lipid metabolism and expression of low density lipoprotein receptor (LDL-R) in rats with fatty liver induced by complex factors. Methods Animal model of fatty liver was established by alcohol combined with high fat diet. Rats were randomly divided into six groups, except the normal and model groups, rats in TFCF groups were daily ig administered with TFCF (.3,, and.2 g/kg), and rats in Dong-Bao-Gan-Tai group were daily ig administered with Dong-Bao-Gan-Tai ( g/kg). It was measured that the contents of ALT, AST, AKP, TG, TC, HDL-C, and LDL-C, the blood viscosity, and indexes in the serum, TG and TC in the liver during this experiment, respectively. The left lobe of liver was observed by histopathological staining, and the immunohistochemical staining and RT-PCR were used to observe the effects on the expressions of LDLR mrna and protein. Results Compared with the model group, TFCF groups could remarkably decrease the content of lipids, ALT, AST, and AKP in the serum and TC and TG in the liver of the experimental fatty liver induced by alcohol combined with high fat diet; remarkably decrease the blood viscosity (Sr3 and Sr2) and assembling index of RBC, as well as hematocrit (HCT), but remarkably increase the deformation index of red blood cells (RBC). The pathomorphological results of hepatic tissue showed that fatty degeneration and inflammatory reaction of TFCF groups were lightened compared with the model group. The 收 稿 日 期 :2-- 基 金 项 目 : 重 庆 市 科 委 项 目 (2AAAS) 作 者 简 介 : 罗 先 钦 (979 ), 男, 四 川 隆 昌 人, 硕 士, 助 理 研 究 员, 长 期 从 事 中 药 药 理 研 究 开 发 工 作 Tel: (23)89293 E-mail: lxq_23@63.com
368 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 2 卷 第 7 期 2 年 7 月 RT-PCR and immuno-histochemical staining results showed that compared with the normal group, the model group could remarkably decrease the expression of low density lipoprotein receptor (LDL-R) mrna and protein in the liver; Compared with the model group, TFCF groups and Dong-Bao-Gan-Tai group could remarkably increase the expression of LDL-R mrna and protein in the liver of the experimental fatty liver. Conclusion The results show that TFCF has good effects on the treatment of fatty liver induced by alcohol combined with high fat diet in rats. The possible action mechanism of TFCF possess obvious effect of regulating the disorder of lipid metabolism, ameliorating hepatic function, as well as increasing the expression of LDL-R in hepatic cells of rats. Key words: total flavones of Crataegi Fructus (TFCF); fatty liver; lipid metabolism; low density lipoprotein receptor (LDL-R); complex factors 山 楂 为 蔷 微 科 山 楂 属 植 物 山 里 红 Grataegus pinnatifida Bunge var. major N. E. Br 或 山 楂 Grataegus pinnatifida Bunge 的 干 燥 成 熟 果 实, 具 有 消 食 化 积 活 血 化 瘀 的 功 效, 用 于 肉 食 积 滞 胃 脘 胀 满 泻 痢 腹 痛 瘀 血 经 闭 产 后 瘀 阻 心 腹 刺 痛 疝 气 疼 痛 高 血 脂 症 等 [] 山 楂 中 主 要 含 有 黄 酮 类 有 机 酸 类 等 成 分 现 代 药 理 研 究 表 明 [2-6], 山 楂 总 黄 酮 具 有 降 血 压 增 加 冠 脉 流 量 强 心 调 血 脂 等 作 用 因 此, 山 楂 总 黄 酮 的 研 究 开 发 具 有 重 要 的 意 义 为 此, 本 研 究 拟 通 过 复 制 与 人 类 脂 肪 肝 病 因 病 理 特 征 极 为 相 似 的 复 合 因 素 致 大 鼠 脂 肪 肝 动 物 模 型, 观 察 山 楂 总 黄 酮 的 抗 脂 肪 肝 作 用 及 其 对 低 密 度 脂 蛋 白 受 体 (LDL-R)mRNA 和 蛋 白 表 达 的 影 响 材 料. 动 物 雄 性 SD 大 鼠, 体 质 量 (2±2)g,SPF 级 合 格 证 号 SCXK( 渝 )22, 重 庆 市 中 药 研 究 院 动 物 室 提 供.2 药 物 山 楂 总 黄 酮 (TFCF, 含 总 黄 酮 8.98%, 重 庆 市 中 药 研 究 院 药 物 化 学 室 提 供 ), 东 宝 甘 泰 片 ( 吉 林 通 化 东 宝 药 业 股 份 有 限 公 司, 批 号 6), 戊 巴 比 妥 钠 ( 上 海 化 学 试 剂 采 购 供 应 站 试 剂 厂 ), 肝 素 [ 中 国 医 药 ( 集 团 ) 上 海 化 学 试 剂 公 司 ],9% 乙 醇 ( 重 庆 市 中 药 研 究 院 后 勤 处 ), 胆 固 醇 ( 北 京 鼎 国 生 物 技 术 有 限 责 任 公 司 ), 三 号 胆 盐 ( 北 京 奥 博 星 生 物 技 术 有 限 责 任 公 司 ).3 试 剂 血 清 丙 氨 酸 转 氨 酶 (ALT) 天 冬 氨 酸 转 氨 酶 (AST) 碱 性 磷 酸 酶 (AKP) 三 酰 甘 油 (TG) 总 胆 固 醇 (TC) 高 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 (HDL-C) 低 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 (LDL-C) 等 试 剂 盒 均 由 四 川 省 迈 克 科 技 有 限 公 司 提 供 丙 酮 ( 重 庆 东 方 试 剂 厂 ), 无 水 乙 醇 ( 重 庆 川 东 化 工 有 限 公 司 化 学 试 剂 厂 ), LDL-R 抗 体 免 疫 组 化 试 剂 盒 ( 武 汉 博 士 德 生 物 工 程 公 司 );RT-PCR 试 剂 盒 Taq DNA 聚 合 酶 DNA 引 物 购 自 上 海 Promega 公 司 ; 焦 碳 酸 二 乙 基 (DEPC, 北 京 鼎 国 生 物 技 术 有 限 公 司 ),Olig (dt) (Fermentas 公 司 );TRIpure 试 剂 ( 百 泰 克 生 物 技 术 有 限 公 司 ), 琼 脂 糖 (Agarose II,Marker I,Tian Gen 公 司 ). 仪 器 AW22 型 电 子 天 平 ( 日 本 岛 津 公 司 ),AllegraX 2 型 离 心 机 ( 美 国 贝 克 曼 库 尔 特 有 限 公 司 ),72 型 全 自 动 生 化 分 析 仪 ( 日 本 HITACHI 公 司 ),722 分 光 光 度 计 ( 重 庆 川 仪 九 厂 ),Mias 2 病 理 图 像 处 理 系 统 ( 四 川 大 学 图 像 图 形 研 究 所 ),Fasco 3B 全 自 动 血 液 流 变 快 测 仪 ( 重 庆 大 学 维 多 生 物 工 程 研 究 所 ),Sysmex F 82 半 自 动 血 液 分 析 仪 ( 日 本 东 亚 公 司 ), 核 酸 蛋 白 分 析 仪 (Gene Quant Pro), 稳 压 稳 流 电 泳 仪 电 泳 槽 (DYY 型, 北 京 市 六 一 仪 器 厂 ), Bio-Rad 凝 胶 图 像 分 析 仪, Laboratories-segrate,QL 9 旋 涡 混 合 器 ( 江 苏 海 门 市 麒 麟 医 用 仪 器 厂 );PCR 仪 (Eppendorf 公 司 ), Milli-Q 超 纯 水 系 统 (MilliPORE 公 司 ),Air Tech 超 净 工 作 台 ( 苏 净 集 团 安 泰 公 司 ) 2 方 法 2. 复 合 因 素 ( 酒 精 合 并 高 脂 饮 食 ) 致 大 鼠 脂 肪 肝 [7] 模 型 的 复 制 及 药 物 处 理 8 只 SD 雄 性 大 鼠 正 常 饲 养 周 后, 除 对 照 组 只 外, 其 余 大 鼠 均 每 天 饲 以 高 脂 饲 料 (88% 基 础 饲 料 +.% 猪 油 +.% 胆 固 醇 +.% 三 号 胆 盐 配 方 ), 同 时 每 天 ig 给 予 6% 乙 醇 ( ml/ g), 持 续 个 月, 建 立 复 合 因 素 致 大 鼠 脂 肪 肝 动 物 模 型 在 造 模 个 月 后 通 过 大 鼠 尾 静 脉 取 血, 检 测 血 清 生 化 指 标, 同 时 随 机 取 只 大 鼠 肝 匀 浆, 检 测 TC TG 水 平, 观 察 造 模 情 况 根 据 血 清 TC 和 TG 值 将 剩 余 9 只 大 鼠 随 机 分 为 组, 即 模 型 组 及 山 楂 总 黄 酮 低 中 高 剂 量 组 和 东 宝 甘 泰 组 其 中 模 型 组 山 楂 总 黄 酮 高 剂 量 组 和 东 宝 甘 泰 组 各 3 只, 以 利 于 在 实 验 过 程 中 监 测 肝 脏 脂 肪 变 的 恢 复 情 况, 其 余 各 组 均 为 只 在 造 模 个 月 后 停 止 给 予 乙 醇, 分 别 ig 给 予.3.2 g/kg 山 楂 总 黄 酮, 东 宝 甘 泰
中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 2 卷 第 7 期 2 年 7 月 369 g/kg, 模 型 组 和 对 照 组 每 天 ig 给 予 等 体 积 生 理 盐 水, 均 连 续 给 药 周 ( 其 中 在 给 药 第 2 周 末, 停 止 给 予 高 脂 饲 料, 分 别 从 模 型 组 山 楂 总 黄 酮 高 剂 量 组 和 东 宝 肝 泰 组 各 取 只 大 鼠 检 测 肝 脂 质, 给 药 第 周 末 从 东 宝 肝 泰 组 中 取 只 大 鼠 检 测 肝 脂 质 ) 2.2 取 材 及 标 本 制 备 末 次 给 药 后 动 物 禁 食 2 h, 用 mg/kg 戊 巴 比 妥 钠 ip 麻 醉, 腹 正 中 切 口 开 腹, 观 察 肝 脏 的 大 小 颜 色 质 地, 腹 主 动 脉 采 血 7 ml, 其 中 ml 注 入 试 管 离 心 后 测 定 血 清 相 应 指 标,3 ml 注 入 % 肝 素 抗 凝 试 管 中 测 定 血 液 流 变 学 相 关 指 标 同 时, 取 出 肝 脏, 称 质 量, 迅 速 取 左 叶 肝 组 织 分 别 用 于 常 规 病 理 学 检 查 (% 中 性 福 尔 马 林 固 定 ) 免 疫 组 化 (% 多 聚 甲 醛 固 定 ) RNA 提 取 ( 液 氮 速 冻 后, 7 冰 箱 冻 存 待 用 ) 其 余 肝 组 织 匀 浆 进 行 相 关 指 标 检 测 2.3 血 清 生 化 指 标 测 定 大 鼠 血 清 ALT AST AKP TG TC HDL-C LDL-C 采 用 72 型 全 自 动 生 化 分 析 仪 测 定 2. 血 液 流 变 学 指 标 测 定 将 大 鼠 血 液 3 ml 注 入 % 肝 素 抗 凝 试 管 中, 测 定 全 血 黏 度, 再 将 全 血 离 心, 测 定 血 浆 黏 度, 并 计 算 出 聚 集 指 数 刚 性 指 数 变 形 指 数, 采 用 全 自 动 血 液 流 变 快 测 仪 测 定 2. 肝 脏 组 织 生 化 指 标 测 定 处 死 大 鼠 后, 迅 速 取 出 肝 脏, 在 相 同 部 位 切 下 2 mg 组 织, 将 肝 组 织 置 于 预 冷 的 2 ml 无 水 乙 醇 和 丙 酮 ( ) 混 合 液 中, 冰 浴 下 制 备 % 匀 浆 液, 3 r/min, 离 心 min, 取 上 清 液 按 试 剂 盒 说 明 书 进 行 TG TC 测 定 2.6 肝 脏 组 织 HE 染 色 动 物 处 死 后, 取 cm cm. cm 肝 左 叶 组 织, 浸 泡 于 % 中 性 甲 醛 固 定, 石 蜡 包 埋,HE 染 色, 光 镜 观 察 肝 组 织 病 理 改 变, 肝 脏 损 伤 程 度 分 级 : 肝 脏 组 织 结 构 正 常, 未 见 明 显 病 理 变 化 ; + 灶 性 肝 细 胞 轻 微 脂 肪 变 性, 少 量 脂 滴 堆 积 ; ++ 局 部 区 域 肝 细 胞 显 著 性 脂 肪 变 性, 许 多 脂 滴 堆 积 于 肝 细 胞 内 ; +++ 大 片 区 域 肝 细 胞 广 泛 性 脂 肪 变 性, 大 量 脂 滴 堆 积 于 肝 细 胞 内 2.7 RT-PCR 测 定 肝 组 织 LDL-R mrna 的 表 达 按 TRI pure 试 剂 盒 抽 提 纯 化 操 作 方 法 提 取 肝 脏 组 织 总 RNA 提 取 的 RNA 通 过 紫 外 光 分 光 光 度 计 测 定 26 28 nm 的 吸 光 度 (A) 值, 计 算 RNA 纯 度 和 浓 度 按 反 转 录 试 剂 盒 说 明 书 将 RNA 反 转 录 成 cdna 第 链, 再 进 行 PCR 扩 增 PCR 反 应 体 系 总 体 积 为 2 μl: buffer μl,dntp μl, Taq DNA Polymerase μl,ldl-r 上 下 游 引 物 各.2 μl,β-actin 上 下 游 引 物 各.2 μl,cdna 模 板 μl,depc 水 7 μl 使 用 β-actin 作 为 内 参 照 引 物 序 列 由 重 庆 升 博 公 司 提 供,LDL-R 引 物 序 列 上 游 : -CAAGGACCTCAAGATTGGCTATG-3, 下 游 : -AGAGCAGAAACCCTATGGAACC-3, 扩 增 片 段 长 度 为 22 bp;β-actin 上 游 : -AATGAGC GGTTCCGATGC-3, 下 游 : -CGAAGGTGGACAG TGAGGC-3, 扩 增 片 段 长 度 为 3 bp 反 应 条 件 : 9 预 变 性 min,9 变 性 2 s,ldl-r β-actin 退 火 温 度 分 别 为 8 退 火 2 s,72 延 伸 s, 共 32 个 循 环 末 次 循 环 72 延 伸 7 min, 并 在 低 温 保 存 产 物 经 2% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 析, 利 用 凝 胶 成 像 仪 拍 照, 测 定 电 泳 条 带 吸 光 度 值, 计 算 LDL-R 与 β-actin 吸 光 度 比 值 2.8 免 疫 组 化 染 色 检 测 肝 组 织 LDL-R 蛋 白 表 达 采 用 链 霉 菌 抗 生 物 素 蛋 白 - 过 氧 化 物 酶 免 疫 组 化 法 (SP) 肝 组 织 石 蜡 切 片 常 规 脱 蜡 至 水, 用 高 温 进 行 抗 原 修 复,3% 过 氧 化 氢 灭 活 内 源 性 酶 处 理 后,%BSA 封 闭 2 min, 滴 加 不 同 浓 度 特 异 性 一 抗 后 过 夜, 次 日 滴 加 偶 联 二 抗, 室 温 3 min 后 DAB 显 色, 苏 木 精 复 染, 透 明, 封 片 每 次 实 验 均 设 阴 性 对 照 (PBS 液 代 替 一 抗 ), 结 果 显 示 阴 性 应 用 Olympas 医 学 生 物 图 像 分 析 系 统, 进 行 免 疫 组 化 图 像 分 析, 经 标 准 灰 度 值 校 正 后, 每 个 观 察 组 随 机 取 个 视 野, 测 定 LDL-R 蛋 白 的 平 均 积 分 光 密 度 值 2.9 统 计 学 处 理 数 据 均 用 x ± s 表 示, 计 量 资 料 进 行 单 因 素 方 差 分 析, 计 数 资 料 的 比 较 采 用 χ 2 检 验, 均 采 用 SPSS3. 统 计 软 件 计 算 3 结 果 3. 山 楂 总 黄 酮 对 脂 肪 肝 模 型 大 鼠 肝 功 能 的 影 响 由 表 可 见, 在 给 药 第 2 周 末, 山 楂 总 黄 酮 各 组 大 鼠 血 清 ALT 和 AKP 活 性 与 模 型 组 比 较 显 著 降 低, 山 楂 总 黄 酮 低 高 剂 量 组 AST 活 性 与 模 型 组 比 较 显 著 降 低 ; 在 给 药 第 周 末, 山 楂 总 黄 酮 各 组 及 模 型 组 ALT AST AKP 活 性 与 对 照 组 比 较 无 统 计 学 差 异, 表 明 血 清 酶 学 指 标 已 接 近 正 常 提 示 山 楂 总 黄 酮 在 给 药 第 2 周 末 对 复 合 因 素 致 脂 肪 肝 模 型 大 鼠 ALT AST 和 AKP 活 性 升 高 有 明 显 抑 制 作 用
37 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 2 卷 第 7 期 2 年 7 月 表 山 楂 总 黄 酮 对 复 合 因 素 致 脂 肪 肝 大 鼠 肝 功 能 的 影 响 ( x ± s ) Table Effects of TFCF on hepatic function of rats with fatty liver induced by complex factors ( x ± s ) 剂 量 /(g kg ) 动 物 / 只 ALT/(U L ) 造 模 后 给 药 第 2 周 末 给 药 第 周 末 对 照 - 2.7± 7. **.8±.8 * 36.2±9.2 模 型 - 2 62.3±3.9.83±.6 33.±8.2 山 楂 总 黄 酮.3 6.6±3.68 32.± 3.8 ** 3.7±.72 7.± 9.6 3.3± 7.33 ** 32.3±6.2.2 2 6.38±6.98 36.8± 9.6 * 36.83±9. 东 宝 甘 泰 68.36±9.2 7.9±2 39.±.9 剂 量 /(g kg ) 动 物 / 只 AST/(U L ) 造 模 后 给 药 第 2 周 末 给 药 第 周 末 对 照 - 6.±9.7 ** 29.±26.2 * 86.38±. 模 型 - 2 2.±3.9 23.8±39.96 87.36±2.3 山 楂 总 黄 酮.3 263.9±.87 69.6±.78 ** 9.78± 7.87 272.9±8.97 2.±2.83 9.7±6.79.2 2 26.92±2.77 27±27.63 * 92.7±2.7 东 宝 甘 泰 23.7±3.77 87.27±26.27 ** 96.88±2.73 剂 量 /(g kg ) 动 物 / 只 AKP/(U L ) 造 模 后 给 药 第 2 周 末 给 药 第 周 末 对 照 - 97.3± 6. ** 23.±3.2 ** 3.±2.7 模 型 - 2.8± 78.3 32.92±9.2 77.33±26.83 山 楂 总 黄 酮.3 32.7±2.9 29.±37.9 ** 72.±2.2 62.±62.82 36.9±3.29 ** 99.7±3.2.2 2 37.23±29. 279.67±76.2 ** 87.92±7.27 东 宝 甘 泰 2.36±3.79 36.82±68.8 ** 8.±3.2 与 模 型 组 比 较 : * P<. ** P<. * P<. ** P<. vs model group 3.2 山 楂 总 黄 酮 对 脂 肪 肝 模 型 大 鼠 血 清 脂 质 的 影 响 由 表 2 可 见, 山 楂 总 黄 酮 在 给 药 第 2 周 末 各 剂 量 组 大 鼠 血 清 中 脂 质 与 模 型 组 比 较 没 有 统 计 学 差 异 ; 在 给 药 第 周 末, 中 高 剂 量 组 大 鼠 血 清 中 脂 质 与 模 型 组 比 较 有 显 著 性 降 低 提 示 山 楂 总 黄 酮 对 复 合 因 素 致 脂 肪 肝 模 型 大 鼠 血 清 中 脂 质 升 高 有 明 显 抑 制 作 用 3.3 山 楂 总 黄 酮 对 脂 肪 肝 模 型 大 鼠 肝 组 织 TC TG 的 影 响 由 表 3 可 见, 在 给 药 第 周 末, 山 楂 总 黄 酮 中 高 剂 量 组 大 鼠 肝 组 织 的 TC 和 TG 值 与 模 型 组 比 较 有 显 著 性 降 低, 提 示 山 楂 总 黄 酮 对 复 合 因 素 致 脂 肪 肝 模 型 大 鼠 的 肝 组 织 TC TG 升 高 有 明 显 抑 制 作 用 3. 山 楂 总 黄 酮 对 脂 肪 肝 模 型 大 鼠 血 液 流 变 学 指 标 的 影 响 由 表 可 见, 在 给 药 第 周 末, 山 楂 总 黄 酮 高 剂 量 组 能 明 显 降 低 复 合 因 素 致 脂 肪 肝 模 型 大 鼠 的 全 血 黏 度 ( 高 切 和 低 切 ) 和 红 细 胞 聚 集 指 数 ; 山 楂 总 黄 酮 各 剂 量 组 能 明 显 降 低 大 鼠 的 红 细 胞 压 积 ; 山 楂 总 黄 酮 低 剂 量 组 能 明 显 增 加 大 鼠 的 红 细 胞 变 形 指 数, 以 上 指 标 均 与 模 型 组 比 较 有 显 著 性 差 异 提 示 山 楂 总 黄 酮 对 复 合 因 素 致 脂 肪 肝 模 型 大 鼠 全 血 黏 度 红 细 胞 聚 集 指 数 和 红 细 胞 压 积 的 升 高 有 明 显 降 低 作 用 3. 山 楂 总 黄 酮 对 脂 肪 肝 模 型 大 鼠 肝 脏 病 理 组 织 学 的 影 响 由 图 和 表 可 知, 山 楂 总 黄 酮 中 剂 量 组 能 明 显 改 善 大 鼠 肝 脏 组 织 的 病 理 组 织 学 变 性, 与 模 型 组 比 较 有 显 著 性 差 异, 但 山 楂 总 黄 酮 低 高 剂 量 组 对 肝 组 织 病 理 组 织 学 变 性 有 明 显 改 善 趋 势 提 示 山 楂 总 黄 酮 对 复 合 因 素 致 脂 肪 肝 模 型 大 鼠 肝 组 织 的 病 理 学 改 变 有 明 显 缓 解 修 复 作 用
中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 2 卷 第 7 期 2 年 7 月 37 表 2 山 楂 总 黄 酮 对 复 合 因 素 致 脂 肪 肝 大 鼠 血 清 脂 质 的 影 响 ( x ± s ) Table 2 Effects of TFCF on lipid in serum of rats with fatty liver induced by complex factors ( x ± s ) 剂 量 / 动 物 / TC/(mmol L ) TG/(mmol L ) (g kg ) 只 造 模 后 给 药 第 2 周 末 给 药 第 周 末 造 模 后 给 药 第 2 周 末 给 药 第 周 末 对 照 -.±.7 **.±.2 **.23±.9 **.67±.2.78±. **.26±.2 模 型 - 2 7.2±2.2.8±3 2.8±.6.68±..9±.2.29±.2 山 楂 总 黄 酮.3 6.8±2.2.2±.2.8±.27.7±.76.77±.7.9±.22 7.±2.9 6.2±.36.76±. *.62±9.98±.23 ±. **.2 2 7.9±3.7.6±.92.6±.36 **.6±.7.8±.3.72±. ** 东 宝 甘 泰 7.8±2.23.±.78.98±..82±.79.3±.37.9±.29 * 剂 量 / 动 物 / HDL-C/(mmol L ) LDL-C/(mmol L ) (g kg ) 只 造 模 后 给 药 第 2 周 末 给 药 第 周 末 造 模 后 给 药 第 2 周 末 给 药 第 周 末 对 照 -.2±. **.8±.2 **.2±.27 **.3±.7 **.7±. **.±. ** 模 型 - 2 2.99±.36 2.69±.2.83±.2.2±.89 3.8±2.92±. 山 楂 总 黄 酮.3 2.76±. 2.77±.2.8±.3.±2. 3.86±.8.8±. 2.8±.7 2.78±.2.8±.2 *.7±.99.76±.3.±.33 *.2 2 3.±.6 2.6±.26.±.29 *.9±.78 2.67±.89.7±.3 ** 东 宝 甘 泰 3.± 2.9±.2 *.8±.33.38±2.8 3.67±.88.8±.32 与 模 型 组 比 较 : * P<. ** P<. * P <. ** P <. vs model group 表 3 山 楂 总 黄 酮 对 复 合 因 素 致 脂 肪 肝 大 鼠 肝 脏 TC TG 的 影 响 ( x ± s ) Table 3 Effects of TFCF on TC and TG contents in liver of rats with fatty liver induced by complex factors ( x ± s ) 剂 量 / 动 物 / TC/ TG/ (g kg ) 只 (mmol L ) (mmol L ) 对 照 -.9±.77 ** 2.37±.9 ** 模 型 - 2.29±.9 3.96±.7 山 楂 总 黄 酮.3 3.8±.8 3.8±8 3.36±.6 ** 3.3±.77 *.2 2 3.6±.99 ** 3.±.9 ** 东 宝 甘 泰 3.6±.8 2.87±.3 ** 与 模 型 组 比 较 : * P<. ** P<. * P <. ** P <. vs model group 3.6 山 楂 总 黄 酮 对 脂 肪 肝 模 型 大 鼠 肝 组 织 LDL-R mrna 和 蛋 白 表 达 的 影 响 由 表 6 和 图 2 可 见,RT-PCR 和 免 疫 组 化 结 果 显 示, 模 型 组 与 对 照 组 比 较,LDL-R mrna 和 蛋 白 表 达 显 著 降 低 各 给 药 组 大 鼠 肝 脏 LDL-R mrna 和 蛋 白 表 达 与 模 型 组 比 较 有 所 增 加, 高 剂 量 组 和 东 宝 甘 泰 组 与 模 型 组 比 较 有 显 著 性 差 异 提 示 山 楂 总 黄 酮 对 复 合 因 素 致 脂 肪 肝 模 型 大 鼠 肝 脏 LDL-R mrna 和 蛋 白 表 达 的 降 低 有 升 高 作 用 讨 论 脂 蛋 白 受 体 的 发 现 被 誉 为 脂 代 谢 研 究 的 里 程 碑, 脂 蛋 白 受 体 决 定 了 各 种 脂 蛋 白 的 代 谢 去 路, 其 表 山 楂 总 黄 酮 对 复 合 因 素 致 脂 肪 肝 大 鼠 血 液 流 变 学 指 标 的 影 响 ( x ± s ) Table Effects of TFCF on blood viscosity and indexes in rats with fatty liver induced by complex factors ( x ± s ) 剂 量 / 动 物 / 全 血 黏 度 /(mpa s) 血 浆 黏 度 / 红 细 胞 红 细 胞 红 细 胞 红 细 胞 (g kg ) 只 2 s 3 s (mpa s) 压 积 聚 集 指 数 变 形 指 数 刚 性 指 数 对 照 - 3.88±.26 ** 8.7±.82 **.9±.9.2±. ** 7.2±.98 **.88±..8±.8 * 模 型 - 2.3±. 9.69±.7.8±..6±.3 8.9±.9.92±. 6.7±.2 山 楂 总 黄 酮.3.3±.9 9.3±.83 *.±.2.38±. ** 8.3±..6±.2 ** 6.97±..±.8 9.3±.96.2±.7.2±.3 ** 8.29±.7.96±.9 6.3±.2.2 2 3.92±.9 ** 8.6±.7 **.7±..±.2 ** 7.±.96 **.93±..66±.3 东 宝 甘 泰.±. * 9.2±.73 *.9±.3.±.3 ** 7.8±.83 **.96±..97±. 与 模 型 组 比 较 : * P<. ** P<. * P <. ** P <. vs model group
372 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 2 卷 第 7 期 2 年 7 月 东宝 山楂总黄酮/(g kg ) 模型 对照 M 肝泰 对照组 山楂总黄酮中剂量组 β-actin LDL-R 图2 东宝肝泰组 模型组 Fig. Effect of TFCF on pathomorphology of hepatic tissue in rats with fatty liver induced by complex factors 表 山楂总黄酮对复合因素致脂肪肝大鼠肝脏病理组织学的 影响 ( x ± s ) Table Effects of TFCF on the pathomorphology 山楂总黄酮对大鼠肝组织 LDL-R mrna 表达的影响 调节血浆脂蛋白水平 调节和决定周围组织摄取血 浆脂蛋白的量 LDL-R 广泛分布于全身各组织 特 别是肝脏 动脉壁细胞等细胞膜的表面 特异识别 与结合含 ApoE 和 ApoB 的脂蛋白 故又称为 ApoB E 受体[8] LDL-R 的主要功能是将胆固醇转 运到肝外组织细胞 用于细胞增殖和固醇类激素及 LDL-R pathway [9] induced by complex factors ( x ± s ) LDL-R 通过影响血浆 LDL 清除的快慢 调节 肝脏组织病理表现 动物/ 3 bp 2 bp 胆汁酸盐的合成 这种代谢过程称为 LDL 受体途径 of hepatic tissue in rats with fatty liver.3 of hepatic tissue 影响 剂量/ 3 bp 22 bp Fig. 2 Effect of TFCF on expression of LDL-R mrna 图 山楂总黄酮对复合因素致脂肪肝大鼠肝脏病理组织学的.2 (g kg ) 只 + ++ +++ 血浆脂蛋白水平 以维持细胞胆固醇浓度的动态平 对照 衡[] 在 LDL 代谢过程中 LDL-R 起双重作用[] 模型 2 第一 通过清除循环中的中间密度脂蛋白 IDL 山楂总黄酮.3 2 3 3 限制 LDL 的生成 第二 通过介导细胞摄取 LDL.2 2 2 东宝甘泰 表6 山楂总黄酮对复合因素致脂肪肝肝内 LDLR mrna 和蛋白表达的影响 ( x ± s ) Table 6 Effects of TFCF on expression of LDL mrna 增加 LDL 的降解 当 LDL-R 基因变异或 LDL-R 表 达下调 LDL-R 合成不足时 对 LDL 的分解 代 谢能力下降 将使血清 LDL 浓度增加 故 LDL-R 在脂代谢中起着重要作用 由于循环中的 LDL-C 主 要通过肝脏 LDL-R 途径清除 因此肝脏 LDL-R 表 and protein in liver tissue of rats with fatty 达的变化能够决定并反映血中胆固醇的代谢水平[2] liver induced by complex factors ( x ± s ) 研究表明 一些调脂药物如洛伐他汀 非诺贝特能 剂量/ LDL-R/ 动物/ LDL-R 增加 LDL-R 的数量以调脂 随着对调脂中药研究的 (g kg ) 只 蛋白表达 不断深入 发现有些单味中药 中药复方的降脂作 对照.27±.2 89.76±2.3 用机制为提高 LDL-R 的基因表达 解除 LDL-R 的 模型 2.896±.9ΔΔ 32.82±7.33ΔΔ 抑制状态 使肝中 LDL 减少 从而调控肝脂水平 山楂总黄酮.3.939±.97 7.8±2.9.±.3 69.7±2.* 如山楂及山楂酮能提高高脂血症大鼠肝 LDL-R.2 2.22±.** 77.93±9.2*.3±.9** 6.8±.9* 东宝甘泰 β-actin 与对照组比较 ΔΔP. 与模型组比较 *P. ΔΔ P<. vs control group; *P<. ** ** P<. vs model group P. mrna 水平[3] 姜传仓等[]利用 Northern 印迹杂交 法研究丹参 大黄对实验性高脂血症大鼠肝细胞 LDL-R mrna 水平的影响 发现两种药物均能升高 大鼠 LDL-R mrna 水平 且有量效依赖关系 调
中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 2 卷 第 7 期 2 年 7 月 373 肝 导 浊 中 药 能 升 高 实 验 性 高 胆 固 醇 大 鼠 肝 细 胞 LDL-R mrna 的 水 平 [] 山 楂 总 黄 酮 高 中 剂 量 组 大 鼠 血 清 中 脂 质 肝 TC 和 肝 TG 与 模 型 组 比 较 有 显 著 性 降 低 ; 山 楂 总 黄 酮 各 剂 量 组 ALT 和 AKP 的 活 性 与 模 型 组 比 较 有 显 著 降 低, 山 楂 总 黄 酮 高 低 剂 量 组 AST 的 活 性 与 模 型 组 比 较 有 显 著 性 降 低 ; 山 楂 总 黄 酮 中 剂 量 组 肝 脏 组 织 的 病 理 组 织 学 检 查 有 明 显 改 善, 山 楂 总 黄 酮 高 低 剂 量 组 在 肝 组 织 病 理 组 织 学 检 查 有 明 显 改 善 趋 势 同 时 山 楂 总 黄 酮 高 剂 量 组 能 明 显 降 低 复 合 因 素 脂 肪 肝 模 型 大 鼠 的 全 血 黏 度 ( 高 切 和 低 切 ) 和 红 细 胞 聚 集 指 数 ; 山 楂 总 黄 酮 各 剂 量 组 能 明 显 降 低 大 鼠 的 红 细 胞 压 积 ; 山 楂 总 黄 酮 低 剂 量 组 能 明 显 增 加 红 细 胞 变 形 指 数 提 示 山 楂 总 黄 酮 对 复 合 因 素 致 脂 肪 肝 模 型 大 鼠 有 一 定 的 活 血 化 瘀 作 用 从 RT-PCR 和 免 疫 组 化 实 验 结 果 来 看, 选 用 SD 大 鼠 经 过 高 脂 和 酒 精 造 模 形 成 复 合 因 素 致 脂 肪 肝 模 型, 其 肝 脏 脂 肪 变 性 明 显 且 伴 炎 性 细 胞 浸 润, 而 且 LDL-R mrna 和 蛋 白 表 达 明 显 降 低 提 示 经 过 山 楂 总 黄 酮 治 疗 后 增 加 LDL-R 的 基 因 表 达, 解 除 LDL-R 的 抑 制 状 态, 从 而 提 高 肝 细 胞 LDL-R mrna 和 蛋 白 表 达 水 平, 调 控 肝 脂 水 平, 起 到 预 防 脂 肪 肝 的 作 用 综 上 所 述, 山 楂 总 黄 酮 可 能 通 过 调 节 脂 肪 代 谢 改 善 肝 脏 功 能 和 增 加 LDL-R mrna 和 蛋 白 的 表 达, 治 疗 酒 精 合 并 高 脂 饮 食 性 ( 复 合 因 素 ) 大 鼠 脂 肪 肝 参 考 文 献 [] 中 国 药 典 [S]. 一 部. 2. [2] 林 启 云. 广 西 大 果 山 楂 药 理 作 用 研 究 [J]. 广 西 中 医 药, 99, 3(3): -6. [3] 李 红, 张 爽, 纪 影 实, 等. 山 楂 叶 总 黄 酮 对 大 鼠 局 灶 性 脑 缺 血 再 灌 注 损 伤 的 保 护 作 用 [J]. 中 草 药, 2, (): 79-798. [] 李 贵 海, 孙 敬 勇, 张 希 林, 等. 山 楂 降 血 脂 有 效 成 分 的 实 验 研 究 [J]. 中 草 药, 22, 33(): -2. [] 刘 家 兰, 徐 晓 玉. 山 楂 的 药 理 作 用 研 究 进 展 [J]. 中 草 药, 29, ( 增 刊 ): 63-66. [6] 杨 宇 杰, 林 静, 王 春 民, 等. 山 楂 叶 总 黄 酮 对 大 鼠 高 脂 血 症 早 期 干 预 的 实 验 研 究 [J]. 中 草 药, 28, 39(2): 88-8. [7] 王 媛 媛, 李 琳 琳, 毛 新 民, 等. 酒 精 合 并 高 脂 饮 食 性 脂 肪 肝 大 鼠 模 型 的 建 立 [J]. 新 疆 医 科 大 学 学 报, 2, 28(2): 6-9. [8] Brown M S, Goldstein J L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis [J]. Science, 986, 232(76): 3-7. [9] Yacoub L K, Fogt F, Griniuviene B, et al. Apoptosis and bcl-2 protein expression in experimental alcoholic liver disease in the rats [J]. Alcohol Clin Exp Res, 99, 9(): 8-89. [] Kume N. Roles of oxidized low-density lipoprotein and its receptors in the pathogenesis of atherosclerotic diseases [J]. Geriatr Gerontol Int, 22, 2(): 72-78. [] Hill J M, Zalos G, Halcox J P, et al. Circulating endothelial progenitor cells ascular, function, and cardiovascular risk [J]. N Engl J Med, 23, 38(7): 93-6. [2] Libby P, Schoenbeck U, Mach F, et al. Current conepts in cardiovascular pathology: Therole of LDL cholesterol in plaque reputure and stabi lization [J]. Am J Med, 998, 2(2A): -8. [3] Stlning T M, Klocker H, Harwood H J. In vivo LDL receptor and HMG-CoA reductase regulation in human Iymphocytes and its alteration during aging [J]. Arteriosocler Thromb Vasc Biol, 99, (7): 872-878. [] 姜 传 仓, 蔡 海 江, 范 乐 明. 中 药 丹 参 及 大 黄 对 实 脸 性 高 脂 血 症 大 鼠 LDL 受 体 基 因 表 达 的 影 响 [J]. 中 国 病 理 生 理 学 杂 志, 993, 9(): 8-. [] 范 英 昌, 陆 一 竹, 马 东 明. 调 肝 导 浊 中 药 对 血 载 脂 蛋 白 含 量 及 肝 细 胞 膜 脂 蛋 白 受 体 的 影 响 [J]. 中 国 动 脉 硬 化 杂 志, 22, (3): 228-23.