医用细胞生物学实验指导说明

医 用 细 胞 生 物 学 实 验 指 导 医 用 细 胞 生 物 学 教 研 室

医 用 细 胞 生 物 学 实 验 指 导 说 明 一 实 验 室 规 则 1. 学 生 应 按 规 定 的 上 课 时 间 提 前 5 分 钟 进 入 实 验 室 做 好 实 验 前 的 准 备 工 作 2. 在 实 验 室 内 严 禁 谈 笑 喧 闹, 保 持 良 好 的 实 验 秩 序 在 实 验 过 程 中 不 得 擅 自 离 开 实 验 室, 有 事 向 老 师 请 假, 获 得 批 准 后 方 可 离 去 3. 每 次 实 验 课, 学 生 应 认 真 听 老 师 讲 述, 注 意 黑 板 上 对 本 次 实 验 的 提 示 4. 观 察 及 绘 图 务 必 求 精 细 准 确, 独 立 思 考, 独 立 完 成 5. 每 次 实 验 课 的 实 验 报 告 应 当 堂 完 成, 或 在 教 师 指 定 时 间 内 完 成 6. 实 验 结 束, 在 离 开 实 验 室 前, 应 清 理 自 己 的 实 验 台, 并 把 用 过 的 物 品 及 实 验 椅 放 归 原 处 7. 爱 护 实 验 室 的 一 切 物 品, 避 免 损 坏 和 浪 费 物 品 损 坏 或 丢 失 时, 应 主 动 向 认 可 老 师 报 告, 原 价 或 折 价 赔 偿, 或 由 教 师 处 理 二 学 生 应 自 备 的 物 品 8. 笔 记 本 一 册, 作 实 验 记 录 用 9. 白 色 绘 图 纸 (16 开 )5 张 10. 绘 图 用 具,HB 铅 笔 及 2H 铅 笔 各 一 支 11. 白 大 衣 意 见 每 次 实 验 必 须 穿 三 校 提 供 的 物 品 实 验 指 导 一 本, 显 微 镜 一 台, 标 本 盒 一 套, 各 种 公 用 设 备 四 应 如 何 进 行 实 验 a) 每 次 实 验 前 应 把 该 次 实 验 指 导 细 心 地 阅 读 一 遍, 明 确 实 验 目 的, 实

验 内 容 和 操 作 方 法, 把 必 需 的 实 验 用 品 带 到 实 验 室 b) 提 前 进 入 实 验 时, 准 备 好 实 验 用 的 材 料 和 用 具 c) 实 验 开 始 时, 应 认 真 听 教 师 的 讲 解 d) 严 格 根 据 实 验 指 导 工 作 注 意 教 师 在 黑 板 上 的 提 示 实 验 的 主 要 目 的 之 一 在 于 培 养 学 生 的 独 立 工 作 能 力, 因 此 每 个 学 生 在 实 验 工 作 中 要 做 的 尽 量 不 依 赖 别 人, 只 有 当 自 己 努 力 仍 不 明 白 时 才 请 教 师 帮 助 e) 在 实 验 中 绘 图 是 一 项 重 要 工 作, 每 个 学 生 应 认 真 对 待 但 绘 图 并 不 是 实 验 的 唯 一 目 的, 它 只 是 观 察 的 记 录, 观 察 若 不 准 确, 绘 图 也 不 可 能 正 确, 一 般 绘 图 的 时 间 占 实 验 时 间 的 1/4-1/3, 大 部 分 时 间 应 用 于 实 际 观 察 和 操 作 f) 每 次 实 验 课 之 前 应 把 本 次 实 验 的 内 容, 进 行 合 理 的 计 划 安 排, 做 到 既 节 省 时 间, 又 有 条 不 紊 每 次 实 验 最 后 的 10-20 分 钟 应 当 留 做 写 笔 记 或 总 结 用 五 图 应 注 意 的 几 个 问 题 a) 生 物 绘 图 的 原 则 是 真 实 性 和 典 型 性, 首 先 绘 图 必 须 是 真 实 观 察 到 的, 不 得 照 抄 书 和 图 谱 抄 袭, 所 以 学 生 要 认 真 进 行 观 察 再 者, 所 绘 图 必 须 具 有 该 绘 图 对 象 的 代 表 特 征 和 基 本 特 性, 通 过 图 能 对 结 构 或 内 容 的 基 本 特 点 有 所 表 现 b) 只 在 纸 的 一 面 绘 图, 铅 笔 应 经 常 保 持 尖 锐, 纸 面 力 求 整 洁, 全 部 字 迹 都 用 铅 笔 书 写 c) 所 绘 图 的 大 小 和 布 局 要 合 理, 图 的 各 部 分 结 构 必 须 按 要 求 表 示 清 楚 一 般 较 大 的 图 每 页 绘 一 个, 同 类 的 小 图 可 以 在 一 张 纸 上 绘 数 个, 但 应 在 只 的 适 当 位 置 上 安 排, 预 留 注 解 的 空 地 d) 绘 图 要 求 清 楚 明 了, 能 说 明 问 题 要 求 先 用 软 铅 笔 (HB) 轻 轻 勾 出 各 部 分 的 结 构 轮 廓, 在 与 标 本 比 较 其 形 态 大 小 比 例 各 部 分 的 位 置 关 系 是 否 正 确, 经 修 改 后, 最 后 用 硬 铅 笔 (2H 或 3H) 按 粗 稿 描 绘 出 正 图

六 关 于 实 验 报 告 a) 除 绘 图 外, 实 验 报 告 还 包 括 解 答 实 验 指 导 中 提 出 的 问 题 和 必 要 的 记 录 以 及 实 验 结 果 和 分 析 实 验 指 导 中 的 问 题 是 为 了 启 发 学 生 进 行 思 考 b) 实 验 报 告 需 用 钢 笔 书 写, 不 易 太 密, 两 行 之 间 应 留 空 隙, 以 便 教 师 批 改 c) 写 报 告 时 切 记 下 列 几 点 : i. 记 载 要 正 确 坚 铭 突 出 重 点 ii. 记 载 要 条 理 分 明 iii. 实 验 报 告 时 记 录 个 人 在 实 验 中 观 察 的 内 容 和 对 观 察 的 理 解, 不 可 抄 袭 实 验 指 导 和 教 材 上 的 材 料

实 验 一 细 胞 形 态 的 观 察 一 目 的 和 要 求 1. 练 习 和 巩 固 使 用 显 微 镜 的 基 本 方 法 2. 了 解 细 胞 的 基 本 形 态 和 结 构 3. 学 习 生 物 绘 图 法 二 仪 器 设 备 1. 普 通 光 学 显 微 镜 ( 每 人 一 台 ) 2. 同 学 用 制 片 : 平 滑 肌 细 胞 永 久 制 片 人 镜 子 图 片 永 久 制 片 猫 脊 髓 横 切 永 久 制 片 卵 巢 切 片 永 久 制 片 3. 蟾 蜍 三 实 验 内 容 1. 平 滑 肌 细 胞 平 滑 基 细 胞 切 片 表 本 地 背 景 下 观 察, 可 以 看 到 许 多 被 染 成 粉 色 的 平 滑 肌 纤 维, 平 滑 肌 纤 维 是 梭 型 的 细 胞, 细 胞 界 限 不 明 显, 被 染 成 兰 紫 色 的 椭 圆 形 的 细 胞 核 位 于 细 胞 的 中 央, 找 一 处 切 的 比 较 薄 而 染 色 均 匀 的 部 位 换 高 倍 镜 仔 细 观 察 注 意 平 滑 肌 纤 维 的 横 切 面 与 纵 切 面 的 区 别 2. 人 精 子 细 胞 取 人 精 子 涂 片 标 本 置 于 低 倍 镜 下 进 行 观 察, 找 出 目 标 后, 换 用 高 倍 镜 观 察, 可 以 见 到 椭 圆 形 的 精 子 细 胞 的 头 部 和 细 长 的 尾 部 醋 酸 洋 红 染 色, 头 部 和 尾 部 均 呈 粉 红 色 3. 神 经 细 胞 取 猫 脊 髓 横 切 制 片, 先 用 肉 眼 观 察, 分 出 灰 质 和 白 质, 而 后 放 在 低 倍 镜 下 观 察, 在 灰 质 中 有 许 多 被 染 成 棕 黄 色 的 多 极 神 经 元 (HE 染 色 的 片 子 中 多 级 神 经 元 被 染 成 紫 红 色 ) 细 胞 形 状 各 异, 细 胞 核 一 般 为 球 形, 染 色 较 浅, 核 仁 清

晰 ( 在 HE 染 色 时 核 染 色 极 淡, 和 人 明 显, 被 染 成 兰 紫 色 ) 低 倍 镜 下 观 察 后 换 高 倍 镜 仔 细 观 察 4. 卵 细 胞 卵 巢 是 产 生 卵 和 分 泌 性 激 素 的 器 官 卵 巢 表 面 覆 有 单 层 扁 平 或 立 方 细 胞 构 成 的 表 皮 上 皮, 上 皮 下 方 位 致 密 结 缔 组 织 组 成 的 白 膜 卵 巢 分 为 外 周 的 皮 质 和 中 央 的 髓 质, 两 者 界 限 不 明 显 髓 质 狭 小, 为 疏 松 结 缔 组 织, 其 中 有 较 多 的 弹 性 纤 维 和 较 大 的 血 管 皮 质 较 厚, 含 有 不 同 发 育 阶 段 的 卵 泡, 卵 泡 间 富 有 梭 形 细 胞 和 网 状 纤 维, 胶 原 纤 维 较 少 卵 泡 是 由 卵 细 胞 和 围 绕 卵 细 胞 的 卵 泡 细 胞 组 成 卵 泡 生 长 发 育 过 程 中, 其 结 构 发 生 一 系 列 变 化 一 般 可 分 四 个 时 期 : 1 原 始 卵 泡 : 位 于 皮 质 浅 部, 数 量 多 由 中 央 一 个 初 级 卵 母 细 胞 及 包 围 它 的 单 层 扁 平 卵 泡 细 胞 组 成, 初 级 卵 母 细 胞 较 大, 核 大 而 园, 呈 空 泡 状, 核 仁 大 而 明 显 2 初 级 卵 泡 : 有 一 个 位 于 中 央 的 初 级 卵 母 细 胞 和 周 围 的 单 层 或 多 层 的 卵 泡 细 胞 组 成 初 级 卵 母 细 胞 已 经 逐 渐 变 大, 卵 泡 细 胞 表 面 的 基 膜 明 显, 在 卵 泡 细 胞 和 初 级 卵 母 细 胞 之 间 出 现 一 较 厚 的 富 含 糖 蛋 白 的 酸 性 膜, 称 为 透 明 带 3 次 级 卵 泡 : 当 卵 泡 细 胞 增 厚 至 6-12 层 时, 细 胞 间 出 现 一 些 腔 隙, 随 着 卵 泡 的 发 育 增 大, 小 腔 逐 渐 合 并 成 一 个 较 大 的 卵 泡 腔, 腔 内 充 满 卵 泡 液 由 于 卵 泡 液 增 多 和 卵 泡 腔 的 扩 大, 将 初 级 卵 母 细 胞 与 周 围 的 一 些 卵 泡 细 胞 挤 至 卵 泡 的 一 侧, 形 成 一 个 突 入 卵 泡 腔 的 隆 起, 为 卵 丘 此 时 的 初 级 卵 母 细 胞 体 积 更 大, 紧 靠 卵 细 胞 的 一 层 卵 泡 细 胞 也 长 大 成 柱 状, 并 整 齐 地 排 列 成 放 射 状, 称 放 射 冠 这 种 具 有 一 个 大 卵 泡 腔 的 次 级 卵 泡, 又 称 囊 状 卵 泡 4 成 熟 卵 泡 : 囊 状 卵 泡 急 需 增 大, 并 向 卵 巢 表 面 突 出, 为 成 熟 卵 泡, 成 熟 卵 泡 腔 大, 卵 泡 细 胞 停 止 增 殖 5 蟾 蜍 骨 骼 肌 : 取 蟾 蜍 腿 部 肌 肉 一 块, 置 于 载 玻 片 上, 加 以 低 生 理 盐 水, 用 小 镊 子 仔 细 分 离 成 极 细 的 丝, 将 多 余 的 组 织 取 掉, 该 上 盖 玻 片, 镜 下 观 察 到 长 形 的 及 细 胞 内 有 明 暗 相 间 的 横 纹 及 椭 圆 形 细 胞 和

实 验 二 细 胞 学 特 殊 染 色 技 术 细 胞 是 人 体 形 态 结 构 的 基 本 单 位, 是 一 切 生 物 新 陈 代 谢 生 长 发 育 繁 殖 分 化 的 形 态 基 础 细 胞 内 各 种 不 同 的 形 态 结 构, 呈 现 着 多 种 多 样 的 功 能 活 动 一 般 染 色 如 瑞 士 染 色 HE 染 色 Giemsa 染 色 都 因 固 定 后 不 能 将 活 细 胞 或 死 细 胞 区 分 开 来, 所 以, 用 特 殊 染 色 技 术 来 显 示 细 胞 内 形 态 结 构, 有 助 于 认 识 细 胞 的 生 命 活 动 和 生 理 功 能 一 内 容 1. 细 胞 分 裂 的 显 示 : 细 胞 分 裂 是 细 胞 繁 殖 的 方 法, 细 胞 分 裂 包 括 无 丝 分 裂 和 有 丝 分 裂 有 丝 分 裂 的 过 程 比 较 复 杂, 显 示 的 方 法 也 很 多, 如 可 显 示 染 色 体 中 心 粒 DNA 染 色 质 凝 集 等 2. 细 胞 器 的 显 示 : 在 光 镜 下 如 不 用 特 殊 染 色 一 般 是 看 不 到 细 胞 器 的 线 粒 体 : 除 了 成 熟 的 红 细 胞 外, 所 有 细 胞 都 有 线 粒 体 它 位 于 细 胞 质 内, 是 细 胞 内 物 质 氧 化 磷 酸 化 产 生 能 量 的 重 要 结 构 是 糖 脂 肪 酸 氨 基 酸 最 终 氧 化 并 生 成 ATP 的 场 所 其 形 态 多 样, 短 棒 状 圆 形 线 性 哑 铃 型 内 质 网 : 存 在 于 靠 近 细 胞 核 的 胞 质 中, 为 连 续 的 网 状 结 构 目 前 多 用 电 镜 来 观 察 内 质 网 的 结 构 近 年 来 发 展 了 一 些 活 细 胞 荧 光 染 料, 又 称 荧 光 探 针, 为 显 示 膜 性 结 构 提 供 了 新 的 途 径 溶 酶 体 : 广 泛 存 在 于 动 物 细 胞 中, 溶 酶 体 是 由 单 层 膜 包 围, 内 含 多 种 酸 性 水 解 酶, 能 催 化 分 解 各 种 重 要 的 生 物 大 分 子, 如 蛋 白 质 核 酸 脂 类 及 多 糖 等 主 要 以 细 胞 内 消 化 为 主 形 态 近 于 圆 形, 大 小 不 一, 直 径 约 0.05- 几 个 微 米 在 暗 视 野 显 微 镜 下, 和 线 粒 体 一 样, 呈 明 亮 的 小 颗 粒, 遍 布 在 细 胞 质 中 高 尔 基 氏 体 : 意 大 利 学 者 Golgi 于 1898 年 首 次 观 察 到 的 在 电 镜 下 是 一 些 堆 积 的 扁 平 囊 状 结 构 它 与 细 胞 分 泌 活 动 有 着 密 切 的 关 系 即 参 与 分 泌 的 动 态 过 程, 对 糖 蛋 白 糖 脂 进 行 加 工 分 选 运 输 细 胞 内 包 含 物 : 如 糖 原

二 方 法 ( 一 ) 死 活 细 胞 的 鉴 别 生 活 细 胞 近 似 无 色 透 明, 用 普 通 光 镜 无 法 观 察 其 形 态, 需 用 相 差 显 微 镜 来 观 察 染 色 排 除 法 : 组 织 培 养 中 检 查 死 活 细 胞 最 常 用 的 是 染 色 排 除 法 这 类 方 法 简 单 但 不 甚 严 格, 它 只 能 判 断 细 胞 的 代 谢 死 亡, 不 反 映 细 胞 能 否 增 殖 由 于 未 经 过 固 定 专 门 染 色, 所 以 看 不 到 死 活 细 胞 的 形 态 差 别 所 用 染 料 的 分 类 : 一 般 的 生 物 染 料 不 能 穿 过 活 细 胞 膜 只 有 细 胞 被 固 定 或 细 胞 膜 被 破 坏, 染 料 才 能 进 入 细 胞 膜 第 一 类 : 死 细 胞 着 色, 使 死 细 胞 着 色 的 大 部 分 是 酸 性 染 料 它 们 不 容 易 穿 透 活 细 胞 的 质 膜, 进 入 胞 内, 但 却 能 渗 透 死 亡 的 细 胞, 使 之 着 色 如 1 台 盼 兰 (Trypan blue):0.5-1% 的 台 盼 兰,pH7.0-7.2, 每 毫 升 细 胞 悬 液 加 0.1ml 染 液,2 分 钟 后 镜 检, 活 细 胞 没 有 染 上, 死 细 胞 全 部 被 染 成 蓝 色 2 苯 胺 兰 (Aniline black): 0.05% 的 苯 胺 黑 以 1:10 的 量 与 细 胞 悬 液 混 匀,1-2 分 钟 后, 死 细 胞 被 染 成 黑 色 3 伊 红 Y: 细 胞 悬 液 与 细 胞 悬 液 混 喝,2 分 钟 后 死 细 胞 被 染 成 桃 红 色 等 第 二 类 : 活 细 胞 着 色, 多 为 碱 性 染 料, 如 中 性 红 健 那 绿 亚 甲 蓝 甲 苯 胺 蓝 等 它 们 是 一 些 无 毒 或 毒 性 很 小 的 染 料, 由 于 电 性 吸 引 而 堆 积 在 细 胞 中 某 一 特 定 的 结 构 上 从 而 显 色, 即 它 们 解 离 后 带 正 电, 其 中 有 的 染 料 可 与 胞 内 某 些 结 构 专 一 性 的 结 合 11% 结 晶 紫 染 色 生 理 1% 结 晶 紫 盐 水 与 细 胞 悬 液 1:2 混 合, 立 即 镜 检, 或 细 胞 被 染 成 蓝 紫 色, 而 死 细 胞 不 着 色 属 于 活 细 胞 染 料 活 细 胞 染 料 无 毒, 无 物 理 化 学 变 化, 基 本 上 不 影 响 细 胞 的 生 命 活 动 2 用 呀 啶 橙 染 色 可 以 鉴 别 出 细 胞 固 定 前 的 死 活 状 态 丫 啶 橙 是 一 种 与 DNA 和 RNA 都 能 结 合 的 荧 光 染 料, 在 兰 光 或 紫 外 光 激 发 下,DNA 可 激 发 出 530nm 的 荧 光 发 射 峰,RNA 可 激 发 出 640nm 的 荧 光 发 射 峰, 它 与 双 链 DNA 的 结 合 方 式 是 潜 入 双 链 之 间, 而 与 单 链 DNA 和 RNA 则 由 静 电 吸 引 堆 积 在 磷 酸 根 上 在 蓝 光 的 激 发 下, 细 胞 核 发 亮 绿 色 荧 光, 核 仁 和 胞 质 RNA

发 桔 红 色 荧 光 因 此, 原 来 的 活 细 胞 经 固 定 染 色 后 细 胞 核 呈 亮 绿 色, 核 仁 和 散 布 在 细 胞 质 中 的 RNA 呈 桔 红 色, 胞 质 其 余 部 分 为 淡 红 褐 色 死 亡 的 细 胞, 因 物 质 发 生 变 形, 其 核 呈 暗 绿 色, 胞 质 整 个 呈 暗 绿 色 但 丫 啶 橙 的 阳 离 子 也 可 以 结 合 在 蛋 白 质 多 糖 和 膜 上 而 发 荧 光, 但 由 于 经 过 细 胞 固 定 抑 制 了 这 种 结 合, 从 而 主 要 显 示 出 的 是 DNA 和 RNA 两 种 核 酸 本 次 实 验 即 选 用 活 细 胞 染 料 健 那 绿 来 显 示 线 粒 体 ( 二 ) 细 胞 核 和 染 色 体 的 染 色 Giemsa 染 色 : 姬 姆 萨 是 常 用 的 染 料, 可 观 察 核 染 色 体 醋 酸 地 依 红 染 色 : 可 显 示 有 丝 分 裂 染 色 体 的 微 细 结 构, 如 次 缢 痕 染 色 质 丝 的 螺 旋 化 等 该 染 料 同 时 具 有 固 定 和 染 色 的 作 用, 因 此 也 可 用 来 坐 快 速 检 查 有 丝 分 裂 指 数 ( 细 胞 涂 片,0.075 mol 的 KCI 低 渗 5-10 分 钟, 使 细 胞 膨 胀, 染 色 体 分 裂 ; 甲 醇 固 定 10 分 钟, 空 气 干 燥, 滴 加 2% 醋 酸 地 衣 红, 染 10-20 分 钟 后 即 可 观 察 ( 三 ) 细 胞 器 的 特 殊 染 色 1 内 质 网 的 显 示 早 在 1945 年, 有 人 用 电 子 显 微 镜 就 观 察 到 了 小 鼠 成 纤 维 细 胞 的 内 质 网 之 后, 观 察 内 质 网 基 本 是 采 用 电 子 显 微 镜 在 80 年 代 中 开 始 发 展 了 一 些 活 细 胞 荧 光 染 料, 又 称 荧 光 探 针, 为 显 示 细 胞 内 的 模 型 结 构, 包 括 内 质 网, 提 供 了 新 的 途 径 DiOC 6 (3): 是 一 种 亲 脂 性 的 阳 离 子 荧 光 染 料, 可 选 择 性 的 与 负 电 性 的 膜 结 构 结 合 在 低 浓 度 时 仅 能 染 出 线 粒 体, 细 胞 界 限 不 清, 较 高 浓 度 时 (0.5-2.5μg/ml) 内 质 网 染 色 最 佳, 而 容 媒 体 高 尔 基 体 等 均 然 浅 色 2 高 尔 基 体 的 显 示 在 光 镜 下 观 察 高 尔 基 体 可 用 景 点 的 固 定 染 色, 也 可 用 活 细 胞 荧 光 染 料 由 于 高 尔 基 参 与 分 泌 这 一 动 态 过 程, 对 糖 蛋 白 糖 脂 进 行 加 工 分 选 和 运 输, 所 以 在 活 细 胞 中 研 究 其 动 态 和 三 维 结 构 具 有 重 要 的 意 义 Baker 苏 丹 黑 染 色 法 : 可 用 于 组 织 块 体 外 培 养 的 单 层 细 胞 的 染 色 染 色 结 果 : 高 尔 基 体 呈 黑 色 囊 泡, 细 胞 核 呈 红 色

活 细 胞 中 高 尔 基 体 染 色 : 用 荧 光 探 针 NBD-hexanoic ceramide 进 行 染 色 溶 酶 体 的 显 示 : 观 察 溶 酶 体 可 以 用 电 子 显 微 镜, 也 可 以 采 用 细 胞 化 学 的 方 法 来 现 实 比 如, 酸 性 磷 酸 酶 是 溶 酶 体 的 标 志 酶 这 部 分 内 容 在 下 学 期 讲 3 线 粒 体 的 显 示 线 粒 体 (mitochondrin): 是 细 胞 内 一 个 极 为 重 要 的 细 胞 器, 是 细 胞 内 物 质 氧 化 磷 酸 化 产 生 能 量 的 重 要 结 构 线 粒 体 的 形 态 结 构 和 功 能 定 位 光 镜 : 多 为 粒 状 杆 状 线 状 不 同 的 细 胞 类 型, 不 同 的 生 理 状 况, 其 形 态 大 小 也 有 所 不 同 电 镜 : 是 由 二 层 单 位 膜 围 成 的 膜 性 囊, ⑴. 外 膜 与 内 膜 不 连 接 ⑵. 内 膜 是 皱 褶 的 ⑶. 内 膜 表 面 不 光 化 的 膜 结 构 向 内 凹 陷, 形 成 嵴 ⑷. 嵴 上 有 基 体 微 粒 ( 上 面 有 ATP 酶, 是 偶 联 磷 酸 化 的 关 键 装 置 ) ⑸. 嵴 间 为 基 质, 含 蛋 白 质 脂 类 DNA RNA 和 核 蛋 白 体 有 关 催 化 线 粒 体 内 各 种 生 命 活 大 过 程 所 需 的 酶 和 辅 酶, 都 分 布 在 线 粒 体 的 基 质 中 细 胞 生 命 活 动 中 需 要 的 大 约 95% 的 能 量 来 自 线 粒 体 所 以 说 线 粒 体 是 一 个 重 要 的 细 胞 器 细 胞 的 内 外 环 境 因 素 的 改 变, 可 引 起 线 粒 体 结 构 和 功 能 的 异 常 发 现 和 检 查 线 粒 体 就 显 得 十 分 重 要 了 但 线 粒 体 在 动 物 死 后 极 易 产 生 变 化, 故 取 材 必 须 新 鲜

实 验 三 健 那 绿 染 活 细 胞 线 粒 体 原 理 : 健 那 绿 (Janus green B) 是 对 线 粒 体 专 一 的 活 细 胞 染 料, 具 有 脂 溶 性, 能 跨 过 细 胞 膜, 解 离 后, 有 染 色 能 力 的 基 团 带 正 电, 结 合 在 负 电 性 的 线 粒 体 内 膜 上 内 膜 上 的 细 胞 色 素 氧 化 酶 使 染 料 保 持 氧 化 状 态, 呈 蓝 绿 色 而 在 胞 质 内 染 料 被 还 原 成 无 色 线 粒 体 浸 泡 在 染 液 中 能 维 持 活 性 数 小 时, 使 我 们 能 够 直 接 看 到 生 活 状 态 的 线 粒 体 的 外 形, 分 布 及 运 动 试 剂 :0.2%Janus green B 0.1g 加 温 到 30-40, 充 分 生 理 盐 水 50ml 溶 解 ( 需 新 鲜 配 置, 以 保 持 被 氧 化 的 能 力 ) 染 色 :1. 培 养 的 细 胞 或 用 牙 签 刮 下 口 腔 粘 膜 上 皮 细 胞 ; 2. 涂 在 干 净 的 载 玻 片 上 ; 2. 滴 加 0.2%Janus green 液, 室 温 染 10 分 钟, 盖 上 盖 玻 片 观 察, 注 意 在 盖 玻 片 下 放 两 根 头 发 丝, 避 免 细 胞 被 压 迫, 并 可 存 有 较 多 的 液 体 结 果 : 线 粒 体 呈 蓝 绿 色, 细 胞 质 接 近 无 色 实 验 四 过 氧 化 物 酶 的 显 示 微 体 : 早 在 50 年 代 初 有 人 发 现 在 动 物 的 细 胞 内 存 在 有 一 种 微 小 的 颗 粒, 它 多 见 于 肝 细 胞 和 肾 小 球 上 皮 细 胞 内, 但 也 广 泛 分 布 在 小 肠 心 肌 骨 骼 肌 肺 肾 上 腺 附 睾 神 经 脊 髓 脑 等 在 不 同 的 组 织 中 微 体 所 含 的 酶 也 不 同, 如 苹 果 酸 合 成 酶 过 氧 化 氢 酶 天 东 氨 酸 氨 基 转 移 酶 等, 过 氧 化 氢 酶 是 微 体 的 标 志 酶 在 过 氧 化 氢 酶 分 子 中, 有 两 种 酶 活 性, 即 过 氧 化 氢 酶 活 性 和 过 氧 化 物 酶 活 性 过 氧 化 物 酶 和 过 氧 化 氢 酶 两 者 具 有 相 似 的 化 学 性 质, 它 们 像 血 红 蛋 白 和 肌 红 蛋 白 一 样, 都 属 于 血 红 蛋 白 素 蛋 白, 具 有 相 同 的 辅 基, 即 铁 卟 啉 或 血 红 素 过 氧 化 氢 酶 可 使 过 氧 化 氢 分 解 成 水 和 氧,

2H 2 O 2 =2H 2 O+ O 2 这 个 分 应 称 为 过 氧 化 氢 酶 反 应, 过 氧 化 氢 酶 因 有 这 种 分 解 作 用 而 被 划 分 为 分 解 酶 类, 也 可 把 它 看 作 是 转 移 酶 或 岐 化 酶 过 氧 化 物 酶 对 纯 过 氧 化 氢 没 有 分 解 作 用, 但 如 果 有 合 适 的 受 体 存 在, 则 能 催 化 氧 转 移 到 受 体 上, 而 使 受 体 被 氧 化, H 2 O 2 +AH 2 =2H 2 O+A 这 个 反 应 称 为 过 氧 化 物 酶 反 应 过 氧 化 物 酶 : 又 称 过 氧 化 酶 (peroxidase) 过 氧 化 物 酶 是 一 种 氧 化 还 原 酶, 它 除 了 分 布 在 髓 性 白 细 胞 外, 还 广 泛 的 存 在 于 各 种 组 织 细 胞 中 它 的 种 类 很 多, 如 在 牛 奶 中 有 乳 - 过 氧 化 物 酶 红 细 胞 中 的 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶 酵 母 中 的 细 胞 色 素 c 过 氧 化 物 酶 等 过 氧 化 物 酶 的 功 能 : 是 机 体 中 的 抗 氧 化 酶, 在 防 止 氧 代 谢 物 的 损 伤 中 具 有 重 要 的 作 用 ⑴ 过 氧 化 氢 对 细 胞 有 毒 害 作 用, 通 过 过 氧 化 物 酶 的 作 用 可 清 除 过 氧 化 氢, 防 止 其 在 细 胞 内 聚 集 ⑵ 参 与 肝 肾 对 有 毒 物 质 的 解 毒 ⑶ 对 细 胞 的 氧 张 力 具 有 调 节 作 用 ⑷ 可 能 参 与 核 酸 脂 肪 和 糖 代 谢 反 应 原 理 : 过 氧 化 物 酶 在 分 解 H 2 O 2 的 过 程 中, 必 须 由 过 氧 化 物 而 来 的 氧 进 行 氧 化 作 用 的 在 反 应 中 有 两 种 底 物, 即 受 氢 体 与 供 氢 体, 前 者 的 代 表 是 过 氧 化 氢, 后 者 的 代 表 是 联 苯 胺 类 的 药 过 氧 化 物 酶 的 反 应 通 式 如 下 : AH 2 ( 供 氢 体 ) +H 2 O 2 受 氢 体 = A( 供 氢 体 的 氧 化 物 )+ 2H 2 O 过 氧 化 物 酶 可 将 底 物 中 的 H 2 O 2 分 解, 产 生 新 态 氧, 使 无 色 的 联 苯 胺 蓝 氧 化 为 蓝 色 的 联 苯 胺 蓝 实 验 : 过 氧 化 物 酶 的 显 示 原 理 : 同 上 材 料 和 方 法 : 材 料 :0.5% 硫 酸 铜 1% 联 苯 胺 ( 含 有 30% 的 H 2 O 2 ) 0.5% 藏 红 花 玻 片 滴 管 剪

子 小 鼠 操 作 方 法 : ⑴ 涂 片 : 剪 小 鼠 尾 部, 取 血 涂 片, 晾 干 备 用 ⑵ 在 晾 干 的 涂 片 上 滴 一 滴 0.5% 硫 酸 铜, 染 2 分 钟 ⑶ 倾 去 硫 酸 铜, 滴 加 联 苯 胺 冲 掉 硫 酸 铜, 在 加 一 滴 新 的 联 苯 胺, 染 2-5 分 钟 ⑷ 1% 的 藏 红 花 复 染 ⑸ 流 水 冲 洗, 晾 干 镜 下 观 察 结 果 : 粒 细 胞 的 过 氧 化 物 酶 反 应 阳 性, 呈 蓝 色 颗 粒, 细 胞 质 为 红 色 临 床 意 义 : 主 要 用 于 定 性 定 位 观 察 急 性 白 血 病 及 其 鉴 别 诊 断 在 正 常 血 骨 髓 中 : 过 氧 化 物 酶 阳 性 的 主 要 是 中 性 粒 细 胞 中 性 粒 细 胞 : 原 粒 时 POX 为 阴 性, 早 幼 粒 时 开 始 出 现 阳 性 反 应, 以 后 逐 渐 反 应 增 强 嗜 酸 性 粒 细 胞 :P0X 可 成 团 块 状 嗜 碱 性 粒 细 胞 : 反 应 多 为 阴 性 单 核 细 胞 : 阳 性 反 应 颗 粒 多 为 细 小 弥 散 病 理 : 在 急 粒 慢 粒 时 POX 增 强, 在 急 单 时 POX 减 弱 而 在 急 性 淋 巴 型 白 血 病 时,POX 是 阴 性, 因 此 可 以 与 急 性 粒 细 胞 性 白 血 病 和 单 核 细 胞 型 白 血 病 进 行 鉴 别 在 慢 性 粒 细 胞 性 白 血 病 中 嗜 碱 性 粒 细 胞 的 POX 反 应 呈 阳 性 反 应