摘要

中 華 民 國 第 五 十 一 屆 中 小 學 科 學 展 覽 會 作 品 說 明 書 科 別 : 生 物 科 組 別 : 高 中 組 作 品 名 稱 : 不 給 糖 就 搗 蛋 - 蛀 牙 細 菌 的 抑 制 關 鍵 詞 :Bacillus horikoshii 轉 糖 鏈 球 菌 蛀 牙 編 號 :

摘 要 : 本 實 驗 的 目 的 是 希 望 能 找 出 人 類 牙 齒 上 的 主 要 菌 種 牙 齒 的 疾 病, 是 由 某 些 細 菌 會 形 成 難 以 破 壞 的 生 物 膜, 導 致 細 菌 能 長 期 滋 長, 並 破 壞 牙 齒 的 琺 瑯 質, 使 牙 齒 中 的 鈣 質 流 失, 最 後 導 致 蛀 牙 的 情 形 ; 本 實 驗 主 要 內 容 是 採 取 牙 齒 上 的 垢 物 進 行 培 養, 然 後 加 以 定 序 找 出 細 菌 種 類 與 名 稱, 再 以 拮 抗 菌 的 概 念, 希 望 能 找 出 能 有 效 抑 制 導 致 蛀 牙 細 菌 的 菌 種, 以 菌 種 間 互 相 制 衡 的 方 式, 抑 制 其 生 長, 進 而 研 發 菌 劑, 使 服 用 後 可 減 少 蛀 牙 發 生 機 率 壹 研 究 動 機 : 牙 痛 不 是 病, 痛 起 來 要 人 命, 相 信 很 多 人 對 於 牙 痛, 都 有 著 不 堪 回 首 的 經 驗 ; 齲 齒 ( 蛀 牙 ) 是 目 前 國 人 從 老 到 少 皆 常 見 到 的 口 腔 疾 病, 每 當 看 牙 醫 時, 那 高 頻 的 鑽 牙 器 具 所 發 出 的 聲 音 也 往 往 令 人 對 看 牙 齒 敬 而 遠 之, 也 因 此 讓 很 多 人 就 算 蛀 牙 也 不 願 意 去 看 牙 醫, 導 致 蛀 牙 情 況 惡 化, 最 終 甚 至 要 抽 神 經 或 拔 牙 記 得 之 前 看 過 一 則 恐 佈 的 新 聞, 一 位 四 十 多 歲 的 壯 年 男 子, 因 為 忍 住 牙 痛, 遲 遲 不 肯 就 醫, 導 致 細 菌 流 入 血 液 胸 腔, 引 發 敗 血 症 而 身 亡 蛀 牙 不 治 療, 小 心 出 人 命, 因 為 小 看 或 害 怕 而 不 去 看 牙 醫, 很 容 易 讓 自 己 曝 入 在 危 險 之 中, 蛀 牙 絕 非 小 事, 但 治 療 時 的 疼 痛 卻 也 讓 許 多 人 無 法 忍 耐 減 少 蛀 牙 最 常 使 用 的 方 法 就 是 飲 食 過 後 立 即 的 刷 牙 漱 口, 但 是 週 遭 同 學 中 有 些 人 就 算 不 常 刷 牙 也 依 然 有 一 口 好 牙 齒, 沒 有 蛀 牙 的 困 擾 ; 但 是 有 些 人 卻 是 飯 後 立 即 刷 牙, 卻 依 然 有 蛀 牙 產 生 ; 我 們 對 於 這 種 情 形 相 當 好 奇, 於 是 開 始 去 尋 找 蛀 牙 的 成 因 與 機 制 在 查 詢 相 關 的 資 料 後, 我 們 得 知 蛀 牙 主 要 是 受 到 轉 糖 鏈 球 菌 ( streptococcus mutans) 的 影 響, 它 會 形 成 一 種 生 物 膜 而 使 牙 齒 開 始 蛀 蝕, 由 於 不 清 楚 它 的 作 用 機 制 及 形 成 的 原 因, 我 們 開 始 深 入 的 研 究, 後 來 我 們 從 台 大 微 生 物 學 研 究 所 張 家 瑜 的 碩 士 論 文 中, 得 知 轉 糖 鏈 球 菌 可 代 謝 多 種 糖 類 產 生 乳 酸, 而 使 得 牙 菌 斑 (dental plaque) 局 部 環 境 ph 值 降 到 4 以 下, 因 而 造 成 牙 釉 質 的 脫 鈣 而 造 成 齲 齒 另 外 在 一 篇 江 俊 斌 副 教 授 的 文 章 中 我 們 也 得 知 會 引 起 人 類 牙 齒 蛀 牙 之 細 菌, 主 要 是 突 變 型 鏈 球 菌 ( 或 稱 轉 糖 鏈 球 菌 ) 黏 性 放 線 菌 和 乳 酸 桿 菌 血 鏈 球 菌 緩 鏈 球 菌 糞 腸 球 菌 和 乳 酸 桿 菌 等 因 此, 我 們 決 定 以 我 們 的 牙 齒 為 樣 本, 找 出 是 否 存 在 著 這 些 細 菌, 及 是 否 有 其 他 的 細 菌 能 抑 制 這 些 造 成 蛀 牙 的 細 菌 我 們 決 定 以 各 自 的 牙 齒 為 實 驗 對 象, 分 析 其 上 可 能 附 著 生 長 的 微 生 物, 實 驗 進 行 以 本 組 同 學 狀 態 不 同 的 牙 齒 來 分 析, 當 中 有 一 個 人 一 個 禮 拜 沒 刷 牙, 希 望 藉 此 能 保 留 下 更 完 整 的 細 菌 菌 相 若 能 在 我 們 的 牙 齒 上 找 到 能 拮 抗 造 成 蛀 牙 的 細 菌 的 結 抗 菌, 表 示 這 可 能 此 細 菌 可 能 附 著 或 存 在 於 日 常 食 物 當 中, 進 而 可 以 將 此 類 食 物 推 薦 給 大 眾, 或 是 針 對 蛀 牙 菌 的 拮 抗 菌 製 成 生 物 製 劑, 讓 預 防 齲 齒 不 再 費 神 困 難 貳 研 究 目 的 : 一 比 對 找 出 口 腔 中 常 見 的 細 菌 二 找 出 抑 制 蛀 牙 菌 拮 抗 菌 種 三 檢 測 此 拮 抗 菌 可 否 對 其 它 次 要 的 蛀 牙 菌 產 生 抑 制 四 瞭 解 轉 糖 鏈 球 菌 的 作 用 機 制 1

參 研 究 設 備 及 器 材 : 一 實 驗 原 料 : 組 員 A 一 週 無 刷 牙 組 員 B 僅 白 天 刷 牙 組 員 C 日 夜 皆 刷 牙 牙 垢 牙 垢 牙 垢 二 實 驗 藥 品 : Genomic DNA Lysozyme buffer Extraction solution Proteinase K stock solution RNaseA Protein Precipitation solution Isopropanol Ethanol Ligatoin PEG 4000 solution TA vector DNA Ligase Extract plasmid Solution 1 Solution 2 Solution 3 Washing solution A Washing solution B ddh2o F'primer R'primer buffer dntp Taq ddh2o IPTG Xgal ddh2o Mgcl2 Cacl2 DFbuffer Wash buffer ddh2o PCR 藍 白 篩 Transform PCR elution 三 實 驗 設 備 器 材 : 微 量 吸 管 2µl 20µl 200µl 1000µl 2

一 高 壓 滅 菌 器 二 製 冰 機 三 -20 度 冰 箱 四 -80 度 冰 箱 3

五 37 度 培 養 箱 六 56 度 培 養 箱 七 大 型 離 心 機 八 PCR 機 器 4

九 電 泳 用 具 十 無 菌 操 作 台 肆 研 究 過 程 或 方 法 : 一 流 程 圖 : 摳 牙 垢 基 因 轉 殖 到 載 體 塗 盤 挑 菌 落 藍 白 篩 定 序 抽 genome DNA PCR 檢 測 是 否 對 次 要 蛀 牙 菌 產 生 抑 菌 圈 看 結 果 Ligation 5

實 驗 說 明 : 一 挑 選 細 菌 將 所 摳 下 的 牙 垢 已 序 式 析 列 分 別 塗 盤 由 其 中 挑 選 幾 個 獨 立 的 菌 落 以 液 態 培 養 在 Lb broth 內 二 抽 genome DNA 取 2.5ml 菌 離 心 13000rpm 2min 去 上 清 液 加 入 180μl Lysozyme buffer,vortex 培 養 37 30min 加 入 600μl Extract solution, vortex 加 入 20μl proteinase K stock solution, vortex 56 培 養 1-3 小 時 加 入 RNaseA 4μl 37 15-30min 加 入 200 μl Protein Precipitation solution, vortex 離 心 top speed 3min 取 上 清 液 到 tube, 再 加 入 600 μl isopopanol, 倒 轉 數 次 直 到 DNA 黏 稠 狀 離 心 top speed 1min 去 上 清 液 加 入 1ml 70% 酒 精 離 心 top speed 1min 去 上 清 液 晾 乾 pellet 5-10min 加 入 ddh 2 O 30μl 5min 回 溶 6

三 PCR ddh 2 O 36μl dntp 5μl 20-25cycl PCR buffer F primer R primer 4μl 2μl 2μl 94 94 55 72 72 5 分 30 秒 30 秒 30 秒 72 Taq 1μl DNA 0.5μl 以 此 方 法 將 所 需 的 DNA 片 段 放 大 數 倍, 始 較 不 易 受 到 汙 染 四 clean up 取 100μl PCR sample 加 入 5 倍 體 積 DF buffer vortex 去 除 濾 液 乾 轉 3min 換 column 到 加 入 40 μl ddh 2 O 靜 置 2min 離 心 架 column 加 入 上 步 驟 之 液 體 離 心 13000rpm 30sec 去 除 濾 液 加 入 wash buffer 600μl 靜 置 1min 離 心 13000rpm 30sec 7

五 Ligation 10X ligation 50% PEG4000 solution TA vector DNA ligase buffer 1μl 1μl 1μl 6μl 1μl 2. 放 室 溫 1 小 時 22 3. 以 4 度,overnight 培 養 六 transform 前 一 天 養 菌 1/100 取 200μl 至 20ml 錐 形 瓶 養 3 小 時 冰 上 放 5min 放 入 50ml 離 心 管 離 心 6000rpm 5min 倒 上 清 液 加 入 MgCl 2 大 力 搖 離 心 6000rpm 5min 倒 上 清 液 加 入 CaCl 2 100μl / 管 加 入 ligation 之 物 冰 上 放 20min 42 1min30sec 冰 上 放 20min 加 入 900μl LB 預 養 1 小 時 離 心 6000rpm 5min 去 上 清 液 塗 盤 加 入 CaCl 2 靜 置 20min 離 心 6000rpm 5min 倒 上 清 液 8

七 藍 白 篩 1. 預 養 再 37 度 培 養 箱 一 小 時 2. 1M IPTG 10μl Xgal ddh2o 20μl 70μl 塗 盤 ( 要 避 光 ) 將 轉 殖 完 的 菌 塗 到 PLATE 上 挑 選 白 色 的 菌 落 沒 有 轉 殖 成 功 不 要 轉 殖 成 功 才 取 9

八 Extract plasmid 菌 液 離 心 13000rpm 1min 600μl washing solution B 離 心 1min 200μl solution I, vortex 200μl solution II, 輕 搖 5 次 200μl solution III, 輕 搖 5 次 離 心 13000rpm 5min 600μl washing solution B 離 心 1min 去 除 濾 液 空 轉 5min column 換 到 新 tube 60μl ddh 2 O 3min 離 心 3min 架 column 取 上 清 液 並 離 心 1min 500μl washing solution A 離 心 1min 九 檢 測 是 否 對 次 要 蛀 牙 菌 產 生 抑 菌 圈 將 欲 抑 制 的 菌 200μl 塗 到 培 養 皿 上 將 可 能 為 拮 抗 菌 的 菌 液 10μl 滴 在 中 央 紙 片 上 培 養 overnight 若 可 拮 抗 中 央 紙 片 周 圍 會 有 一 圈 澄 清 的 區 域, 即 為 拮 抗 圈 10

拮 抗 環 中 央 紙 片 長 滿 菌 落 的 未 拮 抗 區 塊 預 抑 制 的 細 菌 分 為 四 種, 乳 酸 菌 A 乳 酸 菌 B 酵 母 菌 A 酵 母 菌 B 由 於 某 細 菌 許 以 其 最 適 合 的 生 長 環 境 為 準, 因 此 將 培 養 基 分 為 兩 種 1. MRS broth 加 Agar 2. LB broth 加 Agar 加 葡 萄 糖 Glucose 伍 研 究 結 果 : 一 抽 plasmid 後 電 泳 確 認 有 抽 到 plasmid, 表 示 定 序 出 來 之 細 菌 確 實 為 牙 垢 裡 取 出 的 圖 一 Bacillus horikoshii 11

二 以 細 菌 16S rrna 的 基 因 定 序 比 對 出 菌 種 : 圖 二 圖 二 將 培 養 的 細 菌 送 去 定 序, 再 到 NCBI 網 站 查 詢, 紅 框 處 的 細 菌 Bacillus horikoshii 根 據 論 文 為 能 抑 制 蛀 牙 菌 - 轉 糖 鏈 球 菌 streptococcus mutans 產 生 生 物 膜 之 拮 抗 菌 圖 三 三 刷 牙 時 間 不 同, 與 找 到 之 細 菌 比 較 Bacillus horikoshii 12

一 週 無 刷 牙 僅 白 天 刷 牙 日 夜 皆 有 刷 找 到 可 抑 制 轉 糖 鏈 球 菌 形 成 生 物 膜 的 細 菌 Bacillus horikoshii 無 找 到 與 蛀 牙 相 關 之 細 菌 無 找 到 與 蛀 牙 相 關 之 細 菌 四 檢 測 此 拮 抗 菌 可 否 對 蛀 牙 菌 產 生 抑 制 照 成 蛀 牙 之 細 菌 : 主 要 轉 糖 鏈 球 菌 streptococcus mutans Bacillus horikoshii 抑 制 效 果 可 抑 制 其 生 物 膜 生 長 次 要 : 測 試 四 隻 會 產 酸 破 壞 琺 瑯 質 之 細 菌 細 菌 種 類 抑 制 效 果 酵 母 菌 A 無 效 圖 四 酵 母 菌 B 無 效 圖 五 乳 酸 菌 A 無 效 圖 六 乳 酸 菌 B 無 效 圖 七 圖 四 因 為 無 抑 菌 圈 的 產 生, 所 以 Bacillus horikoshii 無 抑 制 效 用 圖 五 因 為 無 抑 菌 圈 的 產 生, 所 以 Bacillus horikoshii 無 抑 制 效 用 13

圖 六 因 為 無 抑 菌 圈 的 產 生, 所 以 Bacillus horikoshii 無 抑 制 效 用 圖 七 因 為 無 抑 菌 圈 的 產 生, 所 以 Bacillus horikoshii 無 抑 制 效 用 14

五 轉 糖 鏈 球 菌 的 作 用 機 制 轉 糖 鏈 球 菌 是 一 株 經 常 在 人 類 口 腔 中 被 發 現 的 革 蘭 氏 陽 性 兼 性 厭 氧 菌, 含 有 乳 酸 脫 氫 酶, 能 將 焦 葡 萄 酸 (pyruvic acid) 轉 變 為 乳 酸, 乳 酸 進 而 傷 害 牙 齒 的 琺 瑯 質 它 又 具 有 一 種 glucosyltransferase 的 酶, 可 將 葡 萄 糖 聚 合 成 glucans glucans 是 一 種 細 菌 體 外 的 多 醣 類, 黏 性 很 大, 細 菌 可 藉 此 物 質 集 聚 一 起 並 且 依 附 在 牙 齒 表 面 繁 殖, 形 成 齒 斑 此 外 glucans 又 會 減 低 唾 液 清 洗 口 腔 的 能 力 在 酸 性 條 件 下,S.mutans 仍 然 可 以 生 存 它 還 可 製 造 細 菌 體 內 的 另 一 種 多 醣 類 (amylopectin 之 類 的 化 合 物 ), 這 些 多 醣 類 會 被 轉 化 為 有 機 酸 轉 糖 鏈 球 菌 須 在 固 體 上 才 能 生 長, 因 此 不 會 附 著 於 口 腔 黏 膜 繁 殖 葡 萄 糖 C 6 H 12 O 6 蔗 糖 C 12 H 22 O 11 焦 葡 萄 酸 C 3 H 4 O 3 乳 酸 C 3 H 6 O 3 果 糖 C 6 H 12 O 6 上 述 為 細 菌 將 蔗 糖 代 謝 為 乳 酸 的 過 程 陸 討 論 : 一 經 過 實 驗 之 後, 在 牙 垢 中 發 現 此 株 菌 -Bacillus horikoshii, 且 此 菌 可 能 與 抑 制 蛀 牙 有 關 二 經 過 抑 菌 圈 實 驗 後, 我 們 發 現 Bacillus horikoshii 對 於 引 起 蛀 牙 的 次 要 細 菌 並 無 明 顯 的 抑 制 效 果 三 轉 糖 鏈 球 菌 會 引 發 蛀 牙 的 發 生, 有 文 件 顯 示 本 組 在 牙 垢 中 發 現 的 Bacillus horikoshii, 可 能 可 以 抑 制 轉 糖 鏈 球 菌 的 生 物 膜 的 產 生, 在 日 後 可 能 會 對 防 治 蛀 牙 有 極 大 的 效 果 本 組 組 員 希 望 再 繼 續 進 行 實 驗, 了 解 轉 糖 鏈 球 菌 和 Bacillus horikoshii 之 間 的 抑 制 作 用 15

柒 結 論 : 一 我 們 的 牙 垢 當 中 找 到 了 一 隻 能 抑 制 轉 糖 鏈 球 菌 的 細 菌, 證 明 它 應 該 是 藉 由 食 物 傳 入 口 中 的, 而 它 對 轉 糖 鏈 球 菌 的 抑 制 作 用, 能 讓 轉 糖 鏈 球 菌 的 生 物 膜 無 法 生 長, 進 而 使 轉 糖 鏈 球 菌 的 許 多 作 用 無 法 產 生, 讓 其 它 能 分 解 醣 類 的 細 菌 無 法 繼 續 代 謝 出 酸 來 破 壞 琺 瑯 質, 而 達 到 治 療 蛀 牙 的 效 用 二 Bacillus horikoshii 僅 僅 對 轉 糖 鏈 球 菌 有 用, 因 此 要 是 次 要 的 蛀 牙 菌, 有 了 其 他 的 醣 類 來 原, 便 又 能 產 生 破 壞 琺 瑯 質, 使 得 牙 齒 繼 續 蛀 牙 三 未 來 展 望 : 原 本 設 想 是 要 雙 管 齊 下 對 照 進 行 驗 證, 一 方 面 以 定 序 比 對 分 析, 另 一 方 面 是 以 DGGE 的 方 式 進 行 對 照 口 中 所 有 菌 種, 但 由 於 時 間 的 因 素 暫 時 未 能 得 到 結 果, 在 未 來 的 期 望 中, 希 望 能 將 DGGE 的 實 驗 流 程 執 行 完 畢, 就 能 更 有 效 率 的 分 析 出 牙 齒 上 的 菌 種 存 在, 到 時 或 許 就 能 發 現 出 更 多 牙 齒 上 的 秘 辛, 也 能 更 了 解 出 在 牙 齒 上 的 細 菌 戰 是 如 何 發 生 的 ; 而 我 們 的 第 一 部 分 實 驗 也 幸 運 的 篩 選 出 能 拮 抗 轉 糖 鏈 球 菌 的 拮 抗 菌 種, 經 由 口 中 常 見 的 產 酸 菌 種 進 行 拮 抗 實 驗, 以 兩 隻 乳 酸 菌 兩 隻 酵 母 菌, 採 取 五 循 環 的 實 驗 機 制, 卻 無 法 看 出 抑 菌 的 效 果, 抑 菌 圈 也 無 產 生 的 趨 勢 ; 但 我 們 在 論 文 中 有 找 出, 我 們 所 篩 選 出 來 的 Bacillus horikoshii 菌 確 實 能 有 效 抑 制 轉 糖 鏈 球 菌 的 生 物 膜 形 成 在 未 來 的 發 展 上, 正 著 手 於 Bacillus horikoshii 菌 的 生 長, 了 解 其 生 物 抑 制 的 機 制 且 是 否 使 用 過 量 會 危 害 人 類 口 腔 中 的 其 他 機 制 運 作, 位 於 哪 些 可 食 用 的 食 物 蔬 果 上 能 產 生, 要 是 能 查 詢 出 確 切 的 食 物, 或 許 加 以 推 廣 以 天 然 的 方 式 就 能 有 效 的 減 少 國 人 蛀 牙 的 發 生 機 率, 但 如 果 難 以 印 證 或 生 物 體 內 的 量 過 於 稀 少, 導 致 無 法 有 效 的 控 制 蛀 牙 菌 的 生 長, 最 後 的 步 驟 我 們 會 朝 生 物 製 劑 的 方 式 進 行 考 量, 對 於 上 段 所 說 明 的 蛀 牙 主 因 轉 糖 鏈 球 菌 的 菌 種 進 行 拮 抗 實 驗, 先 證 實 確 切 無 誤 的 拮 抗 作 用 能 順 利 產 生, 再 找 尋 出 較 能 符 合 經 濟 效 益 以 及 安 全 範 圍 的 使 用 量 進 行 實 驗, 讓 人 類 能 成 功 免 於 蛀 牙 菌 的 威 脅, 以 最 天 然 的 生 物 相 剋 的 概 念, 進 行 便 利 且 快 速 的 蛀 牙 治 癒 捌 參 考 資 料 : 一 http://www.bhp.doh.gov.tw/bhpnet/portal/them.aspx?no=200712250008 衛 生 署 國 民 健 康 局 婦 幼 及 生 育 保 健 組 二 碩 士 論 文 轉 糖 鏈 球 菌 酸 敏 感 突 變 株 的 選 殖 及 分 析 張 家 瑜 1998 三 http://www.hvl.com.tw/tw/news_info.asp?tmpid=40 四 Antibiofilm activity of coral-associated bacteria against different clinical M serotypes of Streptococcus pyogenes 五 http://210.60.226.25/science/content/1981/00070139/0006.htm 16