连接A

J South Med Univ, 2014, 34(6): 837-842 doi 10.3969/j.issn.1673-4254.2014.06.17 837 基 础 研 究 人 肝 细 胞 系 L-02 细 胞 单 纯 肝 脂 肪 变 性 细 胞 模 型 的 建 立 与 应 用 殷 锦 锦, 唐 外 姣, 曾 璐, 周 本 杰 南 方 医 科 大 学 珠 江 医 院 药 学 部, 广 东 广 州 510282 摘 要 : 目 的 探 讨 建 立 人 肝 细 胞 L-02 单 纯 肝 脂 肪 变 性 细 胞 模 型 的 方 法 与 模 型 的 应 用 方 法 体 外 用 1640 培 养 基 培 养 L-02 细 胞, 分 为 模 型 组 和 正 常 组 当 细 胞 融 合 达 到 70%~80%, 正 常 组 换 用 新 鲜 1640 培 养 液, 而 模 型 组 改 为 含 有 游 离 脂 肪 酸 ( 油 酸 和 棕 榈 酸 ) 混 合 物 的 1640 培 养 基 诱 导 培 养 24 h 以 油 红 O 染 色 定 性 观 察 细 胞 内 脂 滴 并 通 过 显 色 比 较 各 组 间 总 脂 质 差 别, 模 型 鉴 定 采 用 观 察 细 胞 内 脂 滴 形 态, 检 测 细 胞 内 甘 油 三 酯 和 细 胞 培 养 上 清 丙 二 醛 含 量, 并 检 测 细 胞 凋 亡 情 况 ; 同 时 利 用 此 模 型 观 察 护 肝 清 脂 片 对 脂 肪 变 性 肝 细 胞 内 脂 滴 的 影 响 结 果 模 型 组 L-02 细 胞 内 脂 滴 大 量 形 成, 且 甘 油 三 酯 明 显 升 高, 而 培 养 液 中 肝 酶 释 放 量 及 丙 二 醛 较 正 常 组 没 有 明 显 升 高, 且 凋 亡 率 没 有 明 显 增 加 ; 护 肝 清 脂 片 含 药 血 清 两 次 给 药, 可 以 使 细 胞 内 脂 滴 和 甘 油 三 酯 明 显 减 少 结 论 采 用 油 酸 和 棕 榈 酸 混 合 物 ( 油 酸 棕 榈 酸 =2 1) 可 以 成 功 诱 导 L-02 细 胞 脂 肪 变 性, 该 模 型 适 用 于 治 疗 脂 肪 肝 药 物 的 研 究 关 键 词 : 脂 肪 肝 ; 脂 肪 变 性 ;L-02 细 胞 ; 细 胞 模 型 Establishment of a L-02 cell model of hepatic steatosis YIN Jinjin, TANG Waijiao, ZENG Lu, ZHOU Benjie Department of Pharmacy, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, China Abstract: Objective To establish an in vitro cell model for investigating hepatic steatosis in non-alcoholic fatty liver disease. Methods L-02 cells cultured in 1640 containing 10% fetal bovine serum were divided into control group and model group. At 70%-80% confluency, L-02 cells in the model group were exposed to a long-chain mixture of free fatty acids (FFA, oleate and palmitate ) for 24 h, and cells in control group were treated with fresh medium. Lipid droplets in the cells were observed and total lipid content was determined with Oil Red O staining. The morphology of lipid droplets, trilyceride level, malonaldehyde content and cell apoptosis rate were evaluated to verify the cell model, and the effect of Huganqingzhi tablet on the lipid droplets was observed. Results A large number of lipid droplets were found in the cell model, which showed markedly increased level of triglyceride without significant changes of malonadehyde content or cell apoptosis rate. Intervention with two doses of Huganqingzhi tablet significantly decreased the number of lipid droplets and trilyceride content in the cell model. Conclusion hepatic steatosis L-02 cell model can be established by long-chain mixture of free fatty acids (oleate spalmitate=2 1) for therapeutic drug studies. Key words: fatty liver; steatosis; L-02 cells; cell model; Huganqingzhi tablet 非 酒 精 性 脂 肪 肝 (non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 是 一 种 无 过 量 饮 酒 史 肝 实 质 细 胞 脂 肪 变 性 和 [1] 脂 肪 堆 积 为 特 征 的 临 床 病 理 综 合 征 疾 病 谱 随 病 程 的 进 展 而 表 现 不 一, 包 括 单 纯 性 脂 肪 肝 非 酒 精 性 脂 肪 [2] 性 肝 炎 肝 硬 化 甚 至 肝 细 胞 癌 它 与 肥 胖 胰 岛 素 抵 抗 高 血 压 以 及 高 脂 血 症 密 切 相 关, 并 被 认 为 是 代 谢 综 [3] 合 征 在 肝 脏 的 表 现 当 前, 为 研 究 NAFLD 的 发 病 机 制,NAFLD 动 物 模 型 多 被 采 用, 但 其 具 有 复 制 时 间 长 个 体 差 异 大 实 验 条 件 不 好 控 制 以 及 影 响 因 素 众 多 且 稳 收 稿 日 期 :2014-02-11 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 (81274160); 广 东 省 自 然 科 学 基 金 (S2012010009380) Supported by National Natural Science Foundation of China (81274160). 作 者 简 介 : 殷 锦 锦, 硕 士,E-mail: yinjinjinsunny@163.com 通 信 作 者 : 周 本 杰, 博 士, 主 任 药 师, 硕 士 生 导 师,E-mail: zhoubj163@163. com 定 性 差 等 缺 点 体 外 脂 肪 变 性 细 胞 模 型 由 于 影 响 因 素 少 实 验 条 件 可 控, 因 而 得 以 快 速 发 展, 并 被 广 泛 用 于 研 [4-5] 究 NAFLD 病 变 过 程 中 的 肝 细 胞 脂 质 沉 积 目 前, 脂 肪 变 性 细 胞 模 型 多 以 肝 癌 细 胞 株 HepG2 为 对 象, 通 过 施 加 不 同 比 例 与 浓 度 的 游 离 脂 肪 酸 ( 油 酸 和 棕 榈 酸 混 合 [6] 物,free fatty acids, FFA) 诱 导 造 模 但 因 HepG2 细 胞 株 毕 竟 来 源 于 肿 瘤 细 胞, 与 正 常 生 理 条 件 下 肝 细 胞 存 在 [7] 很 大 的 差 异 因 此, 本 文 探 索 采 用 人 正 常 肝 细 胞 株 L-02, 以 油 酸 和 棕 榈 酸 (2 1) 的 混 合 物 诱 导 细 胞 脂 肪 变 性, 并 利 用 该 模 型, 观 察 护 肝 清 脂 片 防 治 脂 肪 肝 的 作 用, 旨 在 建 立 一 种 更 接 近 于 临 床 的 肝 细 胞 脂 肪 变 性 模 型, 并 应 用 于 NAFLD 药 物 的 体 外 研 究 1 材 料 和 方 法 1.1 动 物 及 细 胞 株 SD 雄 性 大 鼠,SPF 级, 体 质 量 250~280 g, 购 自 南 方 医

838 http://www.j-smu.com J South Med Univ, 2014, 34(6): 837-842 科 大 学 动 物 中 心 [ 合 格 证 号 :SCXK( 粤 )2011-0015] 用 于 制 备 药 物 血 清 L-02 细 胞 株 购 自 中 国 科 学 院 上 海 细 胞 生 物 学 研 究 所 细 胞 库, 本 实 验 室 自 行 保 存 传 代 备 用 1.2 试 剂 胎 牛 血 清 (Hyclone);1640 培 养 基 (Hyclone); 油 酸 钠 (OA, 07501, Sigma); 棕 榈 酸 钠 (PA, P9767, Sigma); 无 脂 肪 酸 BSA(Sigma); 油 红 O 试 剂 盒 ( 南 京 建 成 生 物 制 品 研 究 所 ); 甘 油 三 酯 试 剂 盒 ( 南 京 建 成 生 物 制 品 研 究 所 ); 丙 二 醛 试 剂 盒 ( 南 京 建 成 生 物 制 品 研 究 所 );RIPA 裂 解 液 ( 南 京 凯 基 生 物 科 技 有 限 公 司 );BCA 蛋 白 浓 度 测 定 试 剂 盒 (Pierce) 1.3 药 物 护 肝 清 脂 片 ( 由 泽 泻, 山 楂, 蒲 黄, 三 七, 荷 叶 等 组 成 ), 由 南 方 医 科 大 学 珠 江 医 院 药 学 部 制 剂 室 生 产 提 供 ( 批 号 :20121012) 1.4 设 备 和 材 料 CO 2 培 养 箱 (HERAcell 150i); 相 差 显 微 镜 (Olympus IX); 流 式 细 胞 仪 (BD influx); 酶 标 仪 (BIO RAD); 0.22 μm 微 孔 滤 膜 (Millpore);25 cm 2 培 养 瓶 (Corning) 2 方 法 2.1 肝 细 胞 培 养 取 正 常 人 L-02 肝 细 胞 株, 用 含 10% 胎 牛 血 清 的 1640 培 养 基 传 代 培 养 待 细 胞 呈 对 数 生 长 时 即 开 始 实 验 将 离 体 培 养 的 肝 细 胞 分 为 对 照 组 和 6 个 实 验 组, 细 胞 培 养 24 h 后, 对 照 组 加 入 含 1%BSA 的 1640 培 养 液, 模 型 组 加 入 不 同 浓 度 的 OA 与 PA 的 混 合 液 (OA PA=2 1) 2.2 药 物 血 清 制 备 SD 大 鼠 适 应 性 饲 养 1 周 后 按 体 质 量 随 机 分 为 空 白 组 和 护 肝 清 脂 片 高 中 低 剂 量 组, 每 组 3 只 护 肝 清 脂 片 高 中 低 剂 量 组 分 别 按 10.8 5.4 2.7 g/kg 体 质 量 剂 量 灌 胃 给 药, 空 白 组 按 10 ml/kg 灌 服 等 量 蒸 馏 水,2 次 /d, 连 续 3 d, 于 第 4 天 上 午 给 药 2 h 后 再 给 药 1 次,1 h 后 腹 主 动 脉 取 血, 室 温 静 置 3~4 h,3000 r/min 4 离 心, 超 净 台 上 分 离 血 清,56 恒 温 水 浴 灭 活,0.22 μm 滤 膜 过 滤,-70 保 存 备 用 2.3 单 纯 肝 脂 肪 变 性 细 胞 模 型 最 佳 造 模 条 件 的 确 定 2.3.1 FFA 作 用 浓 度 的 确 定 2.3.1.1 MTT 实 验 确 定 FFA 无 毒 性 浓 度 范 围 肝 细 胞 培 养 液 96 孔 板 中, 分 别 加 入 含 不 同 浓 度 的 FFA(OA PA= 2 1), 诱 导 24 h, 用 MTT 比 色 法 测 定 细 胞 增 殖 情 况 ( 以 吸 光 度 OD 值 表 示 ), 筛 选 FFA 无 毒 性 浓 度 范 围 2.3.1.2 细 胞 内 脂 滴 的 定 性 观 察 光 镜 观 察 : 细 胞 以 1 10 5 /ml 种 植 于 96 孔 板, 每 孔 100 μl, 待 贴 壁 后 加 入 不 同 浓 度 的 FFA(OA PA=2 1) 干 预, 培 养 24 h 后,PBS 漂 洗, 4% 多 聚 甲 醛 固 定, 采 用 油 红 O 染 色 观 察 细 胞 内 的 脂 滴 2.3.1.3 细 胞 内 脂 质 的 定 量 测 定 细 胞 以 1 10 5 /ml 种 植 于 96 孔 板, 每 孔 100 μl, 待 贴 壁 后 加 入 不 同 浓 度 的 FFA [4] 干 预, 培 养 24 h 后, 采 用 油 红 O 染 色 法 测 定 脂 质 含 量 2.3.2 FFA 作 用 时 间 的 确 定 重 复 上 述 方 法, 将 细 胞 分 为 对 照 组 及 模 型 组, 对 照 组 加 入 含 1%BSA 的 无 血 清 培 养 基, 模 型 组 加 入 含 1 mmol L -1 FFA(2.3.1 确 定 的 最 佳 FFA 浓 度 ) 的 培 养 基, 干 预 12 h 24 h 48 h 后, 采 用 油 红 O 染 色 法 对 脂 肪 变 性 细 胞 计 数, 结 果 判 定 标 准 : 以 细 胞 质 内 出 现 橘 红 色 的 脂 滴 为 脂 质 变 性 细 胞 结 果 按 以 下 标 准 记 录 : 随 机 选 择 6 个 高 倍 视 野, 每 个 视 野 计 数 100 个 细 胞, 然 后 计 算 平 均 脂 变 率 选 择 脂 变 率 最 大 ( 脂 质 变 性 最 高 状 态 ) 的 干 预 时 间 为 FFA 作 用 的 最 佳 作 用 时 间 2.4 单 纯 肝 脂 肪 变 性 细 胞 模 型 的 建 立 与 鉴 定 2.4.1 单 纯 肝 脂 肪 变 性 细 胞 模 型 的 建 立 将 正 常 人 L-02 肝 细 胞 以 5 10 5 /ml 种 植 于 6 孔 板, 每 孔 1 ml, 分 为 对 照 组 和 模 型 组, 每 组 3 孔 待 细 胞 贴 壁 后, 对 照 组 加 入 含 1%BSA 的 无 血 清 培 养 基, 模 型 组 加 入 1 mmol/l FFA, 培 养 24 h(2.3 确 定 的 FFA 最 佳 作 用 浓 度 及 时 间 ) 2.4.2 单 纯 肝 脂 肪 变 性 细 胞 模 型 的 鉴 定 2.4.2.1 电 镜 观 察 细 胞 内 脂 滴 将 2.4.1 培 养 的 细 胞 进 行 收 集,PBS 洗 两 次, 用 10% 戊 二 醛 室 温 固 定 1 h, 再 移 置 4 冰 箱 放 置 3 h 后 电 镜 检 测 并 拍 照 2.4.2.2 甘 油 三 酯 (TG) 丙 氨 酸 氨 基 转 移 酶 (ALT) 天 门 冬 氨 酸 氨 基 转 移 酶 (AST) 的 测 定 按 2.4.1 方 法 培 养 细 胞 造 模, 收 集 培 养 液 和 细 胞 培 养 液 1000 r/min 离 心 5 min, 取 上 清, 采 用 全 自 动 生 化 检 测 仪 检 测 ALT AST 含 量 ; 采 用 RIPA 裂 解 液 裂 解 细 胞,3000 r/min 离 心, 取 上 清,BCA 蛋 白 浓 度 试 剂 盒 检 测 蛋 白 含 量 2.4.2.3 脂 质 过 氧 化 丙 二 醛 (MDA) 的 测 定 按 2.4.1 方 法 培 养 细 胞 造 模, 取 细 胞 上 清 液, 试 剂 盒 测 定 MDA 含 量 2.4.2.4 AV/PI 双 染 后 流 式 检 测 细 胞 凋 亡 按 2.4.1 方 法 培 养 细 胞 造 模, 将 对 照 组 和 1 mmol/l FFA 处 理 组 的 L-02 细 胞 收 获, 加 入 Annexin V 和 PI 染 色 液,4 避 光 孵 育 30 min, 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 情 况 2.5 模 型 应 用 为 了 确 定 上 述 所 建 立 的 模 型 适 用 于 NAFLD 的 体 外 研 究, 选 用 珠 江 医 院 院 内 制 剂 护 肝 清 脂 片 作 为 实 验 药 物, 运 用 2.4.1 建 立 的 脂 肪 变 性 模 型, 采 用 血 清 药 理 学 方 法, 观 察 其 对 该 模 型 脂 质 堆 积 的 影 响 将 L02 细 胞 分 为 5 组 : 空 白 对 照 组, 模 型 组 和 护 肝 清 脂 片 药 物 血 清 高 中 低 剂 量 组, 每 组 各 3 皿 空 白 对 照 组 模 型 组 分 别 加 入 10% 正 常 大 鼠 血 清, 护 肝 清 脂 片 药 物 血 清 高 中 低 剂 量 组 分 别 添 加 10% 相 对 应 的 药 物 血 清 除 空 白 对 照 组 外, 各 组 均 采 用 上 述 实 验 确 定 的 模 型, 含 药 血 清 提 前 干 预 24 h, 然 后 与 含 油 酸 和 棕 榈 酸 的 混 合 物 的 诱 导 液 共 同 培 养 细 胞, 培 养 24 h 后, 采 用 2.3.1.2 所 述 的 油 红 O 染 色

J South Med Univ, 2014, 34(6): 837-842 http://www.j-smu.com 839 法 观 察 细 胞 内 脂 滴 变 化 以 及 试 剂 盒 测 定 细 胞 内 TG 的 变 化 2.6 数 据 处 理 数 据 以 均 数 ± 标 准 差 表 示, 计 量 资 料 组 间 比 较 用 SPSS13.0 软 件 进 行 t 检 验 分 析 3 结 果 3.1 单 纯 肝 脂 肪 变 性 细 胞 模 型 最 佳 造 模 条 件 的 确 定 3.1.1 FFA 作 用 浓 度 的 确 定 对 培 养 细 胞 进 行 形 态 观 察 发 现,FFA 浓 度 在 1 mmol/l 以 下, 漂 浮 细 胞 较 少 MTT 实 验 结 果 显 示, 当 FFA 浓 度 超 过 1 mmol/l 时 的 吸 光 度 显 著 降 低, 细 胞 增 殖 影 响 较 大 细 胞 经 油 红 O 染 色 后 光 学 显 微 镜 观 察 可 见, 对 照 组 细 胞 边 缘 清 晰, 胞 浆 丰 富, 核 膜 完 整, 细 胞 内 未 见 红 色 脂 滴 ; 实 验 组 则 随 着 FFA 浓 度 的 增 加, 细 胞 内 脂 滴 呈 递 增 趋 势, 当 FFA 浓 度 大 于 1 mmol/l 时, 细 胞 数 量 大 幅 度 减 少 ( 图 1) 经 FFA 处 理 的 细 胞 组 其 细 胞 内 脂 质 含 量 也 随 着 FFA 浓 度 的 增 加 而 增 加, 在 1 mmol/l 时 达 到 最 大 值, 继 续 加 大 浓 度, 脂 质 含 量 出 现 下 降 趋 势 ( 图 2) 结 合 MTT 实 验 结 果, 选 取 1 mmol/l 作 为 FFA 的 最 佳 作 用 浓 度 A B C D E F 图 1 油 红 O 染 色 观 察 细 胞 内 脂 滴 Fig.1 Lipid droplets in the cells observed by Oil Red O staining (Original magnification: 200). A: Control; B: 0.25 mmol/l; C: 0.5 mmol/l; D: 0.75 mmol/l; E: 1 mmol/l; F: 1.5 mmol/l; G: 2 mmol/l. G 3.1.2 FFA 作 用 时 间 的 确 定 实 验 结 果 表 明, 细 胞 脂 变 率 随 着 诱 导 时 间 的 增 加 而 增 加,24 h 细 胞 脂 变 率 为 (81.0±2.85)%, 达 到 最 大 值,48 h 细 胞 脂 变 率 有 所 下 降, 为 (76.8±5.36)% 结 合 脂 滴 染 色 和 脂 变 率, 选 取 24 h 作 为 FFA 诱 导 L-02 细 胞 脂 肪 变 性 的 最 佳 作 用 时 间 3.2 单 纯 肝 脂 肪 变 性 细 胞 模 型 的 鉴 定 透 射 电 镜 下 观 察, 对 照 组 L-02 细 胞 核 大 而 圆, 核 内 染 色 质 丰 富, 核 仁 明 显, 胞 浆 内 未 见 明 显 脂 滴 ( 图 3); 模 型 组 细 胞 核 小 畸 形, 胞 浆 凝 聚 ; 胞 浆 内 线 粒 体 肿 大 甚 至 破 裂, 内 质 网 扩 张 成 囊 泡 样, 清 晰 可 见 数 目 不 一 大 小 不 等 电 子 密 度 中 等 的 均 质 性 脂 滴 弥 漫 散 在 分 布 ( 图 4) L-02 细 胞 培 养 24 h 后, 模 型 组 细 胞 内 TG 含 量 明 显 增 加, 与 对 照 组 比 较 有 显 著 性 差 异 (P<0.01),AST 与 ALT 无 显 著 变 化 (P>0.05), 符 合 脂 肪 肝 患 者 和 动 物 NAFLD 模 型 特 征 MDA 无 显 著 变 化 (P>0.05, 表 1), 对 照 组 细 胞 凋 亡 率 为 (14.75 ± 0.99)%, 模 型 组 细 胞 凋 亡 率 为 (16.03±0.30)%, 两 组 相 比, 差 异 没 有 统 计 学 意 义 (P> 0.05, 图 5), 符 合 单 纯 脂 肪 肝 脂 肪 变 性 模 型 特 征 3.3 护 肝 清 脂 片 对 脂 质 变 性 肝 细 胞 模 型 的 影 响 以 1 mmol/l 作 为 油 酸 与 棕 榈 酸 的 混 合 物 体 外 诱 导 L02 细 胞 脂 肪 变 性 模 型 的 刺 激 浓 度, 护 肝 清 脂 片 提 前 24 h 干 预, 然 后 在 造 模 的 同 时 继 续 给 药 24 h, 油 红 O 染

PI PI 840 http://www.j-smu.com J South Med Univ, 2014, 34(6): 837-842 D510 nm 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Oil red colorimetric assay ** ** * ** 色 结 果 如 图 6 所 示, 各 剂 量 护 肝 清 脂 片 含 药 血 清 组 细 胞 内 的 脂 滴 均 有 不 同 程 度 的 减 少, 其 中 高 剂 量 护 肝 清 脂 片 组 脂 滴 下 降 得 最 为 明 显 同 时, 通 过 检 测 各 组 细 胞 内 TG 的 变 化, 实 验 结 果 也 同 样 显 示 护 肝 清 脂 片 作 用 于 该 模 型 后, 中 高 剂 量 护 肝 清 脂 片 含 药 血 清 组 细 胞 内 TG 下 降 明 显 ( 表 2) 表 示 所 建 立 的 模 型 适 用 于 脂 肪 变 性 的 体 外 研 究 0 Control 0.25 0.5 0.75 1 1.5 2 FFA (mmol/l) 图 2 油 红 O 染 色 法 定 量 测 定 细 胞 内 脂 质 含 量 Fig.2 Lipid content in the cells measured by Oil Red colorimetric assay. *P<0.05, **P<0.01 vs Control group. 4 讨 论 目 前,NAFLD 研 究 多 采 用 高 脂 饲 养 建 立 的 动 物 模 型, 但 该 模 型 存 在 个 体 差 异 大 影 响 因 素 多 实 验 条 件 不 易 控 制 不 易 观 察 指 标 等 不 利 因 素, 并 且 高 脂 饲 料 造 模 时 间 一 般 都 要 8 周 以 上, 造 模 时 间 长, 费 用 较 高 与 之 3 4 图 3 对 照 组 L02 细 胞 内 脂 滴 Fig3 lipid droplets in L02 cells of control group (Electron microscopy, original magnification: 8000). 图 4 模 型 组 L02 细 胞 内 脂 滴 Fig4 lipid droplets in L02 cells of model group (Electron microscopy, original magnification: 8000). 表 1 对 照 组 和 模 型 组 TG AST ALT 和 MDA 的 比 较 Tab.1 Levels of TG, AST, ALT and MDA in the control and model groups Item Control group Model group 10 4 10 3 Control group 10 4 10 3 Model group TG (μg/mg protein) 76.75±14.99 363.52±72.87** 10 2 10 2 AST(U/L) ALT(U/L) 4.67±0.577 12.33±1.23 5.0±1.00 # 13.67±2.08 # 10 1 10 1 MDA (nmol/ml) **P<0.01, # P>0.05 vs Control group. 1.86±0.16 1.93±0.19 # 相 比, 细 胞 模 型 不 存 在 个 体 差 异 指 标 易 观 察 且 能 较 好 地 控 制 实 验 条 件, 因 而 NAFLD 相 关 细 胞 模 型 的 研 究 具 有 重 要 的 科 学 意 义 和 现 实 意 义 当 前, 已 报 道 的 NAFLD 细 胞 模 型 多 以 肝 癌 细 胞 株 为 对 象 [8-10], 但 因 其 毕 竟 与 临 床 NAFLD 的 病 理 过 程 不 一 致, 因 而 探 索 以 正 常 人 肝 细 胞 为 对 象 的 NAFLD 细 胞 模 型 更 有 意 义 然 而, 因 为 伦 理 问 题 人 肝 样 本 难 以 获 得, 因 而 选 择 正 常 人 肝 细 胞 系 为 造 模 对 象 则 更 为 可 能 对 于 FFA 的 应 用, 有 文 献 [11-13] 报 道 单 用 油 酸 或 棕 榈 酸, 但 Gomez-Lechon [6] 经 系 统 10 0 10 0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 annexinv-fitc annexinv-fitc Quad Events % Gated % Total Quad Events % Gated % Total LL 39 0.44 0.39 LL 50 0.59 0.50 LR 848 0.57 8.48 LR 598 7.04 5.98 LL 7234 81.67 72.34 LL 6805 80.13 68.05 LR 737 8.32 7.37 LR 1039 12.24 10.39 图 5 对 照 组 和 模 型 组 细 胞 凋 亡 Fig.5 Cell apoptosis in the control and model groups. 研 究 后 发 现, 油 酸 和 棕 榈 酸 以 2 1 比 例 混 合 所 组 成 的 FFA 混 合 物 较 单 用 一 种 更 适 合 用 来 建 立 单 纯 脂 肪 肝 脂 肪 变 性 模 型, 因 此, 本 文 选 用 人 正 常 肝 细 胞 系 L-02 细 胞

J South Med Univ, 2014, 34(6): 837-842 http://www.j-smu.com 841 表 2 护 肝 清 脂 片 对 游 离 脂 肪 酸 刺 激 后 L02 细 胞 内 TG 含 量 的 影 响 Tab.2 Effect of Huganqingzhi tablet on TG content in L02 cells after stimulation with free fatty acids (Mean±SD) Groups Normal control group Model group Low-dose Huganqingzhi tablet group Medium-dose Huganqingzhi tablet group High-dose Huganqingzhi tablet group *P<0.01 vs Normal control; Δ P<0.01 vs Model group. Doses (g/kg) - - 2.7 5.4 10.8 TG (μg/mg protein) 139.6±16.58 582.43±32.12* 539.39±21.79 428.07±16.07 Δ 381.97±12.87 Δ A B C D E 图 6 护 肝 清 脂 片 对 游 离 脂 肪 肝 刺 激 后 L02 细 胞 内 脂 滴 的 影 响 Fig.6 Effect of Huganqingzhi tablet on lipid droplets in L02 cells after stimulation with free fatty acids (Oil Red O staining, original magnification: 400). A: Blank control group; B: Model group; C: Low-dose Huganqingzhi tablet group; D: Medium-dose Huganqingzhi tablet group; E: High-dose Huganqingzhi tablet group. 为 造 模 对 象, 采 用 2 1 的 油 酸 和 棕 榈 酸 混 合 物 为 诱 导 手 段 来 建 立 肝 脂 肪 变 性 细 胞 模 型 该 模 型 一 方 面 可 克 服 整 体 动 物 模 型 的 缺 点, 又 较 以 往 以 肝 癌 细 胞 株 为 对 象 的 细 胞 模 型 更 接 近 于 临 床 为 探 求 FFA 的 最 佳 造 模 浓 度, 我 们 采 用 MTT 实 验 法 测 定 了 不 同 浓 度 FFA 对 L-02 细 胞 活 性 的 影 响, 同 时 结 合 油 红 O 染 色 镜 下 观 察 细 胞 内 脂 滴 形 成 情 况 及 定 量 检 测 L-02 细 胞 内 脂 质 含 量 的 方 法, 发 现 1 mmol/l 浓 度 以 下 的 FFA( 油 酸 : 棕 榈 酸 =2 1) 既 不 影 响 细 胞 的 正 常 增 殖, 且 经 其 诱 导 后 细 胞 内 的 脂 滴 数 量 及 脂 质 含 量 也 随 着 浓 度 增 加 而 增 加,1 mmol/l 浓 度 时 为 最 高 值, 当 高 于 此 浓 度 时, 一 方 面 细 胞 增 殖 受 到 明 显 抑 制, 另 一 方 面 其 细 胞 内 的 脂 滴 数 及 脂 质 含 量 也 呈 下 降 趋 势, 因 此 选 择 1 mmol/l 浓 度 的 FFA( 油 酸 棕 榈 酸 =2 1) 为 最 佳 造 模 浓 度 此 外, 在 观 察 1 mmol/l 浓 度 FFA( 油 酸 棕 榈 酸 =2 1) 不 同 作 用 时 间 点 L-02 细 胞 内 脂 肪 变 性 率 时 发 现, 作 用 24 h 后 细 胞 内 脂 肪 变 性 率 已 到 达 最 大 值, 超 过 24 h 后 细 胞 脂 肪 变 性 率 呈 下 降 趋 势, 因 此 我 们 选 用 24 h 作 为 FFA 的 最 佳 造 模 时 间 在 模 型 鉴 定 方 面, 本 文 采 用 电 镜 观 察 细 胞 内 脂 滴 的 数 量 位 置 以 及 测 定 细 胞 内 甘 油 三 酯 来 确 定 模 型 是 否 建 立 成 功 结 果 显 示, 经 1 mmol/l FFA 诱 导 24 h 后, 模 型 组 L-02 细 胞 核 小 畸 形, 胞 浆 凝 聚 ; 胞 浆 内 线 粒 体 肿 大 甚 至 破 裂, 内 质 网 扩 张 成 囊 泡 样, 包 浆 内 电 子 密 度 中 等 的 均 质 性 脂 滴 呈 弥 漫 散 性 分 布 ; 而 对 照 组 L-02 细 胞 核 大 而 圆, 核 内 染 色 质 丰 富, 核 仁 明 显, 胞 浆 内 未 见 明 显 脂 滴 同 时,L-02 细 胞 经 1 mmol/l FFA 诱 导 24 h 后, 模 型 组 细 胞 内 TG 含 量 明 显 增 加, 与 对 照 组 比 较 有 显 著 性 差 异 (P<0.01), 表 明 脂 肪 变 性 细 胞 模 型 造 模 成 功 此 外, 为 观 察 此 种 造 模 方 法 是 否 会 导 致 严 重 的 肝 损 害, 我 们 检 测 了 对 照 组 和 模 型 组 的 肝 酶 指 标, 发 现 模 型 组 与 对 照 组 的 各 项 肝 酶 指 标 无 显 著 性 差 异 (P>0.05), 说 明 该 模 型 不

842 http://www.j-smu.com J South Med Univ, 2014, 34(6): 837-842 会 导 致 严 重 的 肝 损 害 而 模 型 组 培 养 液 上 清 中 MDA 有 所 增 加, 但 与 对 照 组 比 较 无 显 著 性 差 异, 表 明 该 模 型 不 会 导 致 脂 质 过 氧 化, 符 合 单 纯 脂 肪 变 性 模 型 的 特 征 由 于 游 离 脂 肪 酸 有 较 强 的 脂 毒 性, 过 多 的 脂 肪 酸 进 [14-16] 入 细 胞 后 会 导 致 细 胞 凋 亡 因 此 本 研 究 在 利 用 FFA 诱 导 细 胞 脂 肪 变 性 的 同 时, 检 测 了 对 照 组 和 模 型 组 细 胞 凋 亡 率, 发 现 模 型 组 相 对 于 对 照 组, 细 胞 凋 亡 率 并 没 有 明 显 增 加, 从 而 进 一 步 确 定 了 采 用 1 mmol/l FFA 混 合 物 (OA PA=2 1) 诱 导 L02 细 胞 24 h 所 建 立 的 脂 肪 变 性 细 胞 模 型 用 来 研 究 单 纯 脂 肪 变 性 是 可 行 的 为 了 进 一 步 确 定 该 细 胞 模 型 适 用 于 脂 肪 肝 防 治 药 物 的 体 外 研 究, 本 实 验 选 用 中 药 复 方 护 肝 清 脂 片 作 为 实 验 药 物, 采 用 血 清 药 理 学 方 法, 观 察 药 物 对 模 型 细 胞 内 脂 质 堆 积 的 影 响 护 肝 清 脂 片 由 泽 泻, 山 楂, 蒲 黄, 荷 叶 等 中 药 组 成, 具 有 利 湿 化 痰, 活 血 散 瘀 的 作 用 前 期 的 [17] 动 物 实 验 显 示, 护 肝 清 脂 片 对 NAFLD 大 鼠 药 效 显 著 本 实 验 油 红 O 染 色 结 果 以 及 TG 测 定 结 果 显 示, 护 肝 清 脂 片 可 以 抑 制 细 胞 内 脂 质 堆 积, 表 明 该 模 型 应 用 于 脂 肪 肝 防 治 药 物 的 体 外 研 究 是 可 行 的 参 考 文 献 : [1] 中 华 医 学 会 肝 脏 病 学 分 会 脂 肪 肝 和 酒 精 性 肝 病 学 组. 非 酒 精 性 脂 肪 肝 病 诊 疗 指 南 [J]. 中 华 肝 脏 病 杂 志, 2006, 14(3): 161-3. [2] Marchesini G, Brizi M, Bianchi G, et al. Nonalcoholic fatty liver disease-a feature of the metabolic syndrome[j]. Diabetes, 2001, 50 (8): 1844-50. [3] Torres DM, Williams CD, Harrison SA. Features, diagnosis, and treatment of nonalcoholic fatty liver disease[j]. Clin Gastroenterol Hepatol, 2012, 10(8): 837-58. [4] Hwang YP, Kim HG, Choi JH, et al. S-Allyl cysteine attenuates free fatty acid-induced lipogenesis in human HepG2 cells through activation of the AMP-activated protein kinase-dependent pathway [J]. J Nutr Biochem, 2013, 24(8): 1469-78. [5] Song CY, Shi J, Zeng X, et al. Sophocarpine alleviates hepatocyte steatosis through activating AMPK signaling pathway[j]. Toxicol In Vitro, 2013, 27(3): 1065-71. [6] Gómez-Lechón MJ, Donato MT, Martínez-Romero A, et al. A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis[j]. Chem Biol Interact, 2007, 165(2): 106-16. [7] Harris AJ, Dial SL, Casciano DA. Comparison of basal gene expression profiles and effects of hepatocarcinogens on gene expression in cultured primary human hepatocytes and HepG2 cells [J]. Mutat Res, 2004, 549(1/2): 79-99. [8] Wang GL, Fu YC, Xu WC, et al. Resveratrol inhibits the expression of SREBP1 in cell model of steatosis via Sirt1-FOXO1 signaling pathway[j]. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 380(3): 644-9. [9] Cui W CS, mechanisms of oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells[j]. Am J transl Res, 2010, 2(1): 95-104. [10]Ou TT, Hsu MJ, Chan KC, et al. Mulberry extract inhibits oleic acid-induced lipid accumulation via reduction of lipogenesis and promotion of hepatic lipid clearance[j]. J Sci Food Agric, 2011, 91 (15): 2740-8. [11] 潘 雪 丰, 温 彩 霞, 许 建 华. 两 种 细 胞 系 用 于 建 立 体 外 脂 肪 肝 模 型 的 比 较 [J]. 广 东 药 学 院 学 报, 2010, 26(1): 85-9. [12] 杨 林 辉, 陈 东 风. 油 酸 诱 导 培 养 肝 细 胞 脂 肪 变 性 模 型 的 建 立 [J]. 重 庆 医 学, 2007, 36(8): 698-700. [13] 曹 洁, 杨 朝 霞, 沈 薇, 等. 内 质 网 应 激 在 软 脂 酸 钠 诱 导 的 脂 肪 变 性 L02 肝 细 胞 凋 亡 中 的 作 用 [J]. 第 三 军 医 大 学 学 报, 2011, 33(18): 1935-8. [14]Feldstein AE, Werneburg NW, Canbay A, et al. Free fatty acids promote hepatic lipotoxicity by stimulating TNF-alpha expression via a lysosomal pathway[j]. Hepatology, 2004, 40(1): 185-94. [15] 王 伟, 田 福 宏, 严 六 狮, 等. 小 剂 量 氯 胺 酮 预 处 理 对 大 鼠 气 腹 所 致 小 肠 缺 血 再 灌 注 损 伤 的 保 护 作 用 [J]. 南 方 医 科 大 学 学 报, 2013, 33(11): 1123-4. [16] 叶 文 慧, 彭 湘 杭, 艾 雅 琴, 等. 血 清 脂 肪 细 胞 脂 肪 酸 结 合 蛋 白 与 社 区 人 群 2 型 糖 尿 病 的 相 关 性 研 究 [J]. 南 方 医 科 大 学 学 报, 2011, 31(3): 508-9. [17] 唐 外 姣, 周 本 杰, 周 华. 护 肝 清 脂 片 对 非 酒 精 性 脂 肪 肝 大 鼠 的 药 效 学 研 究 [J]. 中 药 药 理 与 临 床, 2013, 29(2): 169-72. ( 编 辑 : 孙 昌 朋 )