目 次 前 言... IV 1 范 围... 1 2 规 范 性 引 用 文 件... 1 3 供 体 牛 选 择 标 准... 1 3.1 年 龄... 1 3.2 健 康 状 况... 1 3.3 生 殖 系 统... 1 4 供 体 牛 饲 养 管 理... 1 5 超 数 排 卵... 2

ICS 65.020.30 B 43 DB45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB 45/T 1001 2014 娟 姗 牛 X- 性 控 胚 胎 生 产 及 移 植 技 术 规 范 2014-5 - 25 发 布 2014-6 - 25 实 施 广 西 壮 族 自 治 区 质 量 技 术 监 督 局 发 布

目 次 前 言... IV 1 范 围... 1 2 规 范 性 引 用 文 件... 1 3 供 体 牛 选 择 标 准... 1 3.1 年 龄... 1 3.2 健 康 状 况... 1 3.3 生 殖 系 统... 1 4 供 体 牛 饲 养 管 理... 1 5 超 数 排 卵... 2 5.1 药 品... 2 5.1.1 促 卵 泡 素... 2 5.1.2 其 它 药 品... 2 5.2 超 排 程 序... 2 6 X- 性 控 冻 精 人 工 授 精... 2 6.1 X- 性 控 冻 精 质 量 要 求... 2 6.2 人 工 授 精... 3 6.2.1 发 情 鉴 定... 3 6.2.2 解 冻 与 检 查... 3 6.2.3 准 备 与 装 枪... 3 6.2.4 授 精... 3 7 胚 胎 采 集... 3 7.1 采 胚 时 间... 3 7.2 供 体 牛 保 定 和 麻 醉... 3 7.3 供 体 牛 后 躯 清 洗 和 消 毒... 3 7.4 供 体 牛 冲 胚... 3 8 胚 胎 检 查... 4 8.1 实 验 室 与 设 备 物 品 的 准 备... 4 8.1.1 实 验 室 的 准 备... 4 8.1.2 实 体 显 微 镜 准 备... 4 8.1.3 器 皿 物 品 准 备... 4 8.1.4 胚 胎 处 理 溶 液... 4 8.2 胚 胎 处 理... 4 8.3 胚 胎 洗 涤 要 求 和 步 骤... 4 8.4 胚 胎 评 价 与 分 级... 4 I

8.4.1 胚 胎 的 评 价... 4 8.4.2 胚 胎 的 分 级... 5 9 胚 胎 的 装 管... 5 9.1 鲜 胚 移 植 的 胚 胎 装 管... 5 9.2 冷 冻 保 存 的 胚 胎 装 管 ( 使 用 乙 二 醇 为 冷 冻 保 护 剂 )... 5 9.3 冷 冻 细 管 的 标 记... 5 10 胚 胎 的 冷 冻... 6 11 受 体 牛 选 择 标 准... 6 11.1 年 龄... 6 11.2 体 质... 6 11.3 生 殖 系 统... 6 12 受 体 牛 饲 养 管 理... 6 13 受 体 牛 同 期 发 情... 6 13.1 概 述... 6 13.2 PG 二 次 肌 注 法... 6 13.3 CIDR+PG 法... 6 14 胚 胎 解 冻 及 移 植... 6 14.1 胚 胎 解 冻 及 装 管... 7 14.2 胚 胎 移 植... 7 14.2.1 受 体 牛 在 发 情 后 6 d~8 d 之 间 均 可 进 行 移 植... 7 14.2.2 受 体 牛 实 行 1 尾 椎 ~2 尾 椎 间 硬 膜 外 腔 麻 醉 移 植 前 对 受 体 牛 进 行 直 肠 检 查, 检 查 到 有 黄 体 者 用 于 移 植... 7 14.2.3 对 照 冷 冻 胚 胎 记 录 和 合 格 受 体 的 发 情 记 录, 合 理 地 搭 配 受 体 和 胚 胎 即 胚 胎 质 量 好 的 胚 胎 移 给 黄 体 质 量 好 的 受 体 牛... 7 14.2.4 胚 胎 移 植 操 作 首 先 清 除 粪 便, 擦 拭 外 阴 部 助 手 扒 开 阴 唇, 操 作 者 一 手 将 移 植 枪 插 入 阴 门, 至 子 宫 颈 外 口, 另 一 手 插 入 直 肠, 把 握 子 宫 颈, 顶 开 移 植 枪 塑 料 薄 膜 外 套, 将 移 植 枪 送 入 黄 体 侧 子 宫 颈 缓 慢 地 将 移 植 枪 送 至 子 宫 角 前 1/3 处 ~1/2 处 在 移 植 枪 前 端 留 下 富 余 的 空 间, 并 用 手 托 起 移 植 枪, 慢 慢 推 入 钢 芯, 然 后 缓 慢 地 抽 出 移 植 枪... 7 14.2.5 做 好 受 体 移 植 记 录... 7 15 妊 娠 诊 断... 7 16 妊 娠 受 体 牛 的 饲 养 管 理... 7 17 娟 姗 牛 X- 性 控 胚 胎 生 产 及 移 植 常 用 设 备 器 械 及 药 品...7 18 供 体 牛 超 排 记 录 表 及 受 体 牛 胚 胎 移 植 记 录 表... 7 附 录 A( 规 范 性 附 录 ) 娟 姗 牛 X- 性 控 胚 胎 生 产 及 移 植 常 用 设 备 器 械 和 药 品... 8 附 录 B( 规 范 性 附 录 ) 供 体 牛 超 排 / 胚 胎 生 产 记 录 表...9 II

前 言 本 标 准 按 照 GB/T 1.1 2009 给 出 的 规 则 起 草 本 标 准 由 广 西 壮 族 自 治 区 水 产 畜 牧 兽 医 局 提 出 本 标 准 起 草 单 位 : 广 西 壮 族 自 治 区 畜 牧 研 究 所 广 西 畜 禽 品 种 改 良 站 本 标 准 主 要 起 草 人 : 李 铭 吴 柱 月 秦 黎 梅 莫 柳 忠 滕 少 花 李 秀 良 王 启 芝 廖 晓 光 梁 云 斌 王 英 群 刘 德 玉 李 芳 芳 III

娟 姗 牛 X- 性 控 胚 胎 生 产 及 移 植 技 术 规 范 1 范 围 本 标 准 规 定 了 娟 姗 牛 供 体 牛 选 择 标 准 供 体 牛 饲 养 管 理 超 数 排 卵 X- 性 控 冻 精 人 工 授 精 胚 胎 采 集 检 胚 胚 胎 冷 冻 胚 胎 解 冻 受 体 牛 选 择 标 准 受 体 牛 饲 养 管 理 受 体 牛 同 期 发 情 胚 胎 移 植 妊 娠 检 查 本 标 准 适 用 于 广 西 境 内 娟 姗 牛 X- 性 控 胚 胎 生 产 及 移 植 技 术 操 作 2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件, 仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件, 其 最 新 版 本 ( 包 括 所 有 的 修 改 单 ) 适 用 于 本 文 件 GB 16548 畜 禽 病 害 肉 尸 及 其 产 品 无 害 化 处 理 规 程 GB 16568 奶 牛 场 卫 生 及 检 疫 规 范 DB45/T 597 青 贮 饲 料 制 作 技 术 规 范 NY/T 388 畜 禽 场 环 境 质 量 标 准 NY/T 1168 畜 禽 粪 便 无 害 化 处 理 技 术 规 范 NY 5027 无 公 害 食 品 畜 禽 饮 用 水 水 质 NY 5047 无 公 害 食 品 奶 牛 饲 养 兽 医 防 疫 准 则 NY 5048 无 公 害 食 品 奶 牛 饲 养 饲 料 使 用 准 则 NY 5049 无 公 害 食 品 奶 牛 饲 养 饲 养 管 理 准 则 中 华 人 民 共 和 国 农 业 部 令 第 67 号 (2006) 畜 禽 标 识 和 养 殖 档 案 管 理 办 法 3 供 体 牛 选 择 标 准 3.1 年 龄 青 年 母 牛 14 月 龄 以 上 ; 经 产 母 牛 3 岁 以 上 3.2 健 康 状 况 体 格 键 壮, 膘 情 在 中 上 等 ( 75 分 ) 无 遗 传 性 疾 病, 繁 殖 机 能 正 常 经 产 牛 无 流 产 病 史, 青 年 母 牛 连 续 正 常 发 情 2 次 以 上 产 犊 记 录 清 楚, 产 后 60 天 以 上, 有 两 次 正 常 发 情 记 录 3.3 生 殖 系 统 生 殖 器 官 正 常, 无 阴 道 炎 子 宫 炎 卵 巢 炎 卵 巢 囊 肿 和 卵 巢 静 止 等 子 宫 大 小 正 常 左 右 对 称 有 弹 性 4 供 体 牛 饲 养 管 理 1

供 体 牛 选 择 后 按 照 原 来 的 饲 养 方 式 饲 养, 不 要 转 移 栏 舍 及 更 换 饲 养 人 员, 以 保 持 饲 养 环 境 稳 定, 避 免 应 激 反 应 制 定 合 理 的 供 体 牛 日 粮 配 方, 保 证 正 常 的 营 养 状 况 和 营 养 平 衡, 提 高 超 数 排 卵 效 果 5 超 数 排 卵 5.1 药 品 5.1.1 促 卵 泡 素 推 荐 使 用 加 拿 大 生 产 的 F0llitropin-V( 加 拿 大 FSH) 和 国 产 的 FSH 5.1.2 其 它 药 品 孕 酮 栓 (CIDR) 孕 马 血 清 促 性 腺 激 素 (PMSG) 氯 前 列 烯 醇 (PG) 促 黄 体 素 释 放 激 素 A3(LHRH-A3) 5.2 超 排 程 序 在 供 体 牛 性 周 期 的 任 意 一 天 将 CIDR 放 入 供 体 牛 阴 道 之 日 定 为 0 天, 在 第 九 天 开 始 注 射 FSH 在 第 5 次 注 射 FSH 的 同 时, 肌 注 PG0.6 mg/ 头 在 第 7 次 注 射 FSH 的 同 时 抽 出 CIDR 将 加 拿 大 FSH 400 mg 用 20 ml 生 理 盐 水 稀 释 混 匀, 青 年 母 牛 和 成 年 母 牛 总 剂 量 分 别 为 280 mg~320 mg(14 ml~16 ml) 将 国 产 FSH10 mg 用 10 ml 生 理 盐 水 稀 释 混 匀, 青 年 母 牛 和 成 年 母 牛 总 剂 量 分 别 为 7 mg~9 mg 推 荐 或 参 考 具 体 超 排 程 序 见 表 1 表 1 供 体 牛 超 排 处 理 程 序 表 时 间 处 理 国 产 FSH(7 mg~9 mg) 加 拿 大 FSH(14 ml~16 ml) 第 0 天 阴 道 内 放 置 CIDR 阴 道 内 放 置 CIDR 第 9 天 9:00 am 注 射 FSH 注 射 FSH 9:00 pm 注 射 FSH 注 射 FSH 第 10 天 9:00 am 注 射 FSH 注 射 FSH 9:00 pm 注 射 FSH 注 射 FSH 第 11 天 9:00 am 注 FSH PG (0.6 mg/ 头 ) 注 FSH PG (0.6 mg/ 头 ) 9:00 pm 注 射 FSH 注 射 FSH 第 12 天 9:00 am 注 射 FSH 及 取 出 CIDR 注 射 FSH 及 取 出 CIDR 9:00 pm 注 射 FSH 注 射 FSH 第 13 天 下 午 输 精 2 支 第 14 天 上 午 输 精 2 支 第 20 天 回 收 胚 胎 (7 日 龄 ) 第 21 天 回 收 胚 胎 (8 日 龄 ) 6 X- 性 控 冻 精 人 工 授 精 6.1 X- 性 控 冻 精 质 量 要 求 6.1.1 剂 型 0.25 ml±0.03 ml 6.1.2 X- 精 子 纯 度 90 % 2

6.1.3 解 冻 后 的 精 子 活 力 0.3 6.2 人 工 授 精 6.2.1 发 情 鉴 定 建 立 发 情 预 报 制 度, 观 察 到 母 牛 静 立 反 应 为 发 情 时 间 可 采 用 外 部 观 察 法 和 直 肠 检 查 法 鉴 定 发 情 直 肠 检 查 滤 泡 波 动 感 明 显, 有 一 触 即 破 之 感 为 宜 6.2.2 解 冻 与 检 查 取 一 支 性 控 细 管 冷 冻 精 液 放 入 38 恒 温 水 浴 中, 轻 轻 摇 动 10 s~20 s 解 冻 将 解 冻 后 的 细 管 精 液 用 卫 生 纸 擦 干, 然 后 用 细 管 剪 刀 平 面 剪 去 细 管 的 封 口 端, 滴 一 滴 在 载 玻 片 上, 盖 上 盖 玻 片, 在 38 环 境 下 镜 检 精 子 活 力 精 子 活 力 在 0.30 以 上 方 可 使 用 6.2.3 准 备 与 装 枪 从 水 浴 锅 中 取 出 解 冻 后 的 细 管 精 液, 用 纸 巾 擦 干 细 管 壁 上 的 水 分 将 细 管 精 液 的 棉 塞 端 插 入 输 精 枪 内, 用 经 过 消 毒 的 细 管 剪 刀 在 距 输 精 枪 口 0.8 mm 处 平 面 剪 掉 细 管 精 液 前 端, 然 后 将 输 精 枪 套 上 外 套, 直 至 输 精 枪 与 套 卡 紧 为 止 6.2.4 授 精 在 供 体 牛 发 情 后 13 h~15 h 进 行 第 1 次 输 精, 第 2 次 输 精 间 隔 5 h~7 h, 每 次 使 用 2 支 X- 性 控 冻 精 输 精 位 置 在 两 侧 子 宫 角 大 弯 深 部 ( 即 子 宫 角 2/3 处 ) 7 胚 胎 采 集 7.1 采 胚 时 间 供 体 牛 超 排 发 情 后 第 一 次 授 精 后 的 第 7 天 7.2 供 体 牛 保 定 和 麻 醉 将 供 体 牛 在 保 定 架 保 定, 并 用 2 % 的 利 多 卡 因 行 尾 椎 硬 膜 外 腔 麻 醉 利 多 卡 因 剂 量 为 5 ml~10 m1 注 射 2 分 钟 后 摇 动 尾 巴 无 感 觉 即 为 麻 醉 成 功 7.3 供 体 牛 后 躯 清 洗 和 消 毒 先 掏 尽 直 肠 里 的 粪 便, 用 自 来 水 清 洗 整 个 后 躯 尾 根 外 阴, 再 用 1 的 高 锰 酸 钾 溶 液 清 洗 一 遍, 用 消 毒 毛 巾 擦 干 后 躯, 保 持 后 驱 不 受 到 粪 便 和 尿 液 的 污 染 7.4 供 体 牛 冲 胚 由 助 手 准 备 好 灭 菌 过 的 黏 液 祛 除 器 冲 卵 管 钢 芯 操 作 者 的 一 只 手 进 入 直 肠, 另 一 只 手 则 用 无 菌 纸 擦 拭 阴 户 和 周 围, 后 用 稍 干 酒 精 棉 消 毒 浅 部 阴 道 粘 膜 和 阴 户, 再 用 无 菌 生 理 盐 水 棉 球 ( 块 ) 擦 拭 掉 酒 精 助 手 用 双 手 向 后 向 上 拉 扯 阴 户, 使 阴 道 口 尽 量 张 开 操 作 者 将 带 钢 芯 的 冲 卵 管 插 入 阴 门, 达 到 子 宫 颈 口 用 直 肠 把 握 法 将 冲 卵 管 插 入 子 宫 颈 和 子 宫 角 当 冲 卵 管 到 达 子 宫 角 弯 曲 处 时, 拔 出 一 小 部 分 钢 芯, 再 将 冲 卵 管 往 前 送 当 钢 芯 再 次 到 达 子 宫 角 弯 曲 处 时, 再 拔 出 一 小 部 分 钢 芯, 将 冲 卵 管 往 前 送, 直 到 冲 卵 管 顶 部 到 达 子 宫 角 前 端 为 止 用 20m1 的 注 射 器 给 冲 卵 管 气 囊 充 气 约 12 ml~18 ml 拔 出 钢 芯, 联 结 50 ml 注 射 器 吸 取 冲 卵 液 (PBS) 进 行 冲 卵 ( 经 产 牛 使 用 PBS 溶 液 1000 ml 青 年 牛 使 用 600 ml 左 右 ) 当 冲 完 一 3

侧 子 宫 角 时, 冲 卵 管 放 气 后 插 入 钢 芯, 冲 卵 管 退 出 到 子 宫 体 内 时, 将 冲 卵 管 移 动 到 另 一 侧 子 宫 角 冲 胚 一 头 供 体 牛 冲 胚 回 收 到 的 冲 卵 液 集 中 到 同 一 个 集 卵 杯 中 保 存 并 及 时 检 胚 8 胚 胎 检 查 8.1 实 验 室 与 设 备 物 品 的 准 备 8.1.1 实 验 室 的 准 备 检 卵 室 要 求 无 菌 无 尘 在 检 卵 前, 打 开 紫 外 线 消 毒 灯 30 分 钟 以 上, 并 打 开 空 调, 保 持 室 温 25 胚 胎 进 入 检 卵 室 后, 严 禁 打 开 紫 外 线 消 毒 灯 8.1.2 实 体 显 微 镜 准 备 所 用 的 显 微 镜 是 有 底 座 带 光 源 的 实 体 显 微 镜 显 微 镜 目 镜 为 10 倍 或 20 倍, 鉴 定 放 大 倍 数 为 60 倍 -80 倍 8.1.3 器 皿 物 品 准 备 巴 氏 吸 胚 管 胚 胎 细 管 连 接 胚 胎 细 管 的 1 ml 注 射 器 连 接 巴 氏 吸 胚 细 管 的 乳 胶 管 各 容 量 注 射 器 若 干 一 次 性 培 养 皿 若 干 酒 精 灯 打 火 机 手 术 剪 标 签 纸 铅 笔 与 记 录 笔 手 纸 等 8.1.4 胚 胎 处 理 溶 液 胚 胎 处 理 溶 液 主 要 是 保 存 液 和 冷 冻 液 溶 液 的 过 滤 灭 菌 在 超 净 工 作 台 中 进 行, 使 用 滤 孔 直 径 为 0.22 um 的 过 滤 器 8.2 胚 胎 处 理 用 带 14 号 针 头 的 20 ml 一 次 性 注 射 器 吸 取 冲 卵 液, 反 复 冲 洗 集 卵 杯 侧 壁 和 过 滤 膜, 静 止 几 分 钟, 用 注 射 器 除 去 上 层 的 泡 沫, 置 实 体 显 微 镜 按 集 卵 杯 底 部 的 方 格 逐 格 检 查 发 现 胚 胎, 用 胚 胎 微 吸 管 清 除 胚 胎 外 围 的 粘 液 杂 质 用 吸 管 将 胚 胎 移 至 装 有 保 存 液 的 培 养 皿 中 同 一 供 体 牛 的 胚 胎 放 在 同 一 液 滴 中 8.3 胚 胎 洗 涤 要 求 和 步 骤 8.3.1 来 自 同 一 供 体 的 胚 胎 才 能 放 在 一 起 洗 涤, 每 次 洗 涤 的 胚 胎 数 应 少 于 10 枚, 每 批 胚 胎 至 少 洗 涤 10 次 8.3.2 透 明 带 完 整 且 透 明 带 上 没 有 粘 附 物 的 胚 胎 才 能 洗 涤 8.3.3 将 胚 胎 从 前 一 培 养 液 移 入 下 一 培 养 液 时, 应 更 换 胚 胎 微 吸 管 8.4 胚 胎 评 价 与 分 级 8.4.1 胚 胎 的 评 价 根 据 胚 胎 发 育 阶 段 及 形 态 进 行 评 价, 具 体 见 表 2 表 2 胚 胎 评 价 表 胚 龄 ( 天 ) 发 育 阶 段 发 育 形 态 1 1- 细 胞 期 或 未 受 精 卵 透 明 带 内 只 有 一 个 细 胞, 表 面 较 圆 滑, 几 乎 占 满 整 个 卵 周 间 隙 2-4 2-16 细 胞 期 胚 胎 受 精 后 的 卵 母 细 胞 进 一 步 分 裂 成 2 个 细 胞 至 16 个 细 胞 体 积 占 满 卵 周 间 隙 4

表 2 ( 续 ) 胚 龄 ( 天 ) 发 育 阶 段 发 育 形 态 5-6 桑 葚 胚 (M) 发 情 后 第 5 d~6 d 回 收 的 卵, 只 能 观 察 到 球 状 的 细 胞 团, 分 不 清 分 裂 球, 占 据 透 明 带 内 腔 的 大 部 分 6-6.5 致 密 桑 葚 胚 (CM): 发 情 后 第 6 d~7 d 回 收 的 卵, 细 胞 团 变 小, 占 透 明 带 内 腔 60 %-70 % 6.5-7 早 期 囊 胚 (EB): 发 情 后 第 7d~8 d 回 收 的 卵, 细 胞 的 一 部 分 出 现 发 亮 的 胚 泡 腔 细 胞 团 占 透 明 带 内 腔 70 %~80 %, 难 以 分 清 内 细 胞 团 和 滋 养 层 7-7.5 囊 胚 (BL): 发 情 后 第 7d-8 d 回 收, 内 细 胞 团 和 滋 养 层 界 线 清 晰, 胚 泡 腔 明 显, 细 胞 充 满 透 明 带 内 腔 7.5-9 扩 张 囊 胚 (EXB): 发 情 后 第 8d~9 d 回 收, 胚 泡 腔 明 显 扩 大, 体 积 增 大 到 原 来 的 1.2 倍 ~1.5 倍, 与 透 明 带 之 间 无 空 隙, 透 明 带 变 薄, 相 当 于 正 常 厚 度 的 1/3 9-11 孵 育 胚 : 一 般 在 发 情 9 d~11 d, 由 于 胚 泡 腔 继 续 扩 张, 致 使 透 明 带 破 裂, 卵 细 胞 脱 出 8.4.2 胚 胎 的 分 级 根 据 胚 胎 的 发 育 形 态 进 行 分 级, 具 体 见 表 3 表 3 胚 胎 分 级 表 胚 胎 级 别 胚 胎 发 育 形 态 胚 胎 形 态 完 整, 轮 廓 清 晰, 呈 球 形, 分 裂 球 大 小 均 匀, 结 构 紧 凑, 色 调 和 透 明 度 适 中, 无 附 着 的 细 A 胞 核 液 泡 B 轮 廓 清 晰, 色 调 及 细 胞 密 度 良 好, 可 见 到 一 些 附 着 的 细 胞 和 液 泡, 变 性 细 胞 约 占 10%~30% C 轮 廓 不 清 晰, 色 调 发 暗, 结 构 较 松 散, 游 离 的 细 胞 或 液 泡 较 多, 变 性 细 胞 达 30%~50% D 胚 胎 形 态 有 碎 片 卵 裂 球 细 胞 团 不 规 则, 透 明 带 破 裂 注 :A 级 B 级 胚 胎 可 用 于 鲜 胚 移 植 和 冷 冻 保 存,C 级 胚 胎 只 能 用 于 鲜 胚 移 植,D 级 胚 胎 为 不 可 用 胚 胎 9 胚 胎 的 装 管 9.1 鲜 胚 移 植 的 胚 胎 装 管 用 0.25 ml 的 专 用 细 管 按 以 下 三 段 液 体 夹 二 段 气 泡 顺 序 装 管 : 保 存 液 气 泡 保 存 液 及 胚 胎 气 泡 保 存 液 9.2 冷 冻 保 存 的 胚 胎 装 管 ( 使 用 乙 二 醇 为 冷 冻 保 护 剂 ) 用 0.25 ml 的 专 用 细 管 装 管 顺 序 为 : 吸 入 约 3 cm 保 存 液 0.5 cm 气 泡 0.5 cm 冷 冻 液 0.5 cm 气 泡 适 量 冷 冻 液 及 一 枚 或 数 枚 胚 胎 0.5 cm 气 泡 0.5 cm 冷 冻 液 0.5 cm 气 泡 适 量 保 存 液 即 五 段 液 体 四 个 气 泡, 边 上 两 段 液 体 为 保 存 液, 中 间 三 段 为 冷 冻 液 9.3 冷 冻 细 管 的 标 记 在 胚 胎 细 管 上, 标 记 生 产 单 位 品 种 公 母 牛 号 胚 胎 编 号 冷 冻 方 法 胚 胎 发 育 期 与 级 别 胚 胎 数 量 和 生 产 日 期 一 般 制 作 一 个 标 签, 贴 在 细 管 封 口 塞 上 5

10 胚 胎 的 冷 冻 将 冷 冻 仪 的 冷 冻 室 预 冷 至 植 冰 温 度 ( 乙 二 醇 冷 冻 液 为 5.5 度 ), 将 装 有 胚 胎 的 细 管 放 入 冷 冻 室, 平 衡 5 分 钟 ~10 分 钟, 植 冰, 再 平 衡 5 分 钟 ~10 分 钟, 然 后 以 0.3 / 分 钟 的 降 温 速 率 降 温 至 -35, 平 衡 10 分 钟 后, 将 细 管 投 入 液 氮 保 存 11 受 体 牛 选 择 标 准 11.1 年 龄 青 年 母 牛 16 月 龄 以 上, 并 有 两 次 的 正 常 发 情 记 录, 体 重 达 到 成 年 母 牛 体 重 的 70 % 经 产 母 牛 3 岁 ~ 7 岁 之 间 11.2 体 质 体 格 键 壮, 膘 情 在 中 上 等 ( 75 分 ) 无 繁 殖 机 能 疾 病 经 产 母 牛 分 娩 在 60 d 以 上, 产 犊 性 能 和 泌 乳 性 能 良 好, 无 流 产 病 史, 产 犊 记 录 清 楚, 产 后 60 天 以 上, 有 两 次 正 常 发 情 记 录 11.3 生 殖 系 统 生 殖 器 官 正 常, 无 阴 道 炎 子 宫 炎 卵 巢 炎 卵 巢 囊 肿 和 卵 巢 静 止 子 宫 大 小 正 常 左 右 对 称, 子 宫 弹 性 厚 薄 正 常 者, 黄 体 达 到 A 级 B 级 12 受 体 牛 饲 养 管 理 受 体 牛 在 移 植 前 45 天 开 始 补 饲, 保 持 日 增 重 0.30 kg/d~0.40 kg/d 在 移 植 前 6 周 ~8 周 按 说 明 使 用 注 射 VA B D E 针 剂, 补 充 微 量 元 素, 如 硒 锌 等 受 体 牛 单 独 组 群 饲 养, 保 持 环 境 相 对 稳 定, 避 免 应 激 反 应 13 受 体 牛 同 期 发 情 13.1 概 述 受 体 牛 的 发 情 以 站 立 接 受 爬 跨 不 动 为 观 察 重 点, 并 以 此 为 发 情 标 准 13.2 PG 二 次 肌 注 法 进 行 直 肠 检 查 有 黄 体 的 采 用 PG 二 次 注 射 法, 经 产 牛 0.6 mg/ 头. 次, 育 成 牛 0.3 mg/ 头. 次 -0.6 mg / 头. 次 第 一 次 注 射 根 据 移 植 日 程 选 择 时 间, 第 二 次 注 射 在 第 一 次 注 射 后 11 天 在 第 二 次 注 射 后 的 2 天 内 观 察 发 情, 发 情 后 的 7 天 进 行 移 植 13.3 CIDR+PG 法 CIDR 放 入 受 体 牛 阴 道 之 日 定 为 0 天, 在 第 9 天 肌 注 PG0.6 mg 时, 相 隔 12 个 小 时 抽 出 CIDR 在 第 11 天 -12 天 观 察 受 体 牛 的 发 情 情 况, 受 体 牛 发 情 后 的 第 7 天 进 行 移 植 14 胚 胎 解 冻 及 移 植 6

14.1 胚 胎 解 冻 及 装 管 从 液 氮 罐 中 取 出 冷 冻 胚 胎 细 管, 垂 直 放 置 在 20 ~25 空 气 中, 静 止 10 s 不 要 摇 晃 细 管 垂 直 放 入 32 水 浴 中,15 s~20 s, 至 细 管 完 全 液 化, 用 无 菌 棉 擦 干 细 管, 拧 下 细 管 塞 再 用 推 杆 插 入 细 管 棉 塞 端, 轻 轻 把 细 管 里 的 胚 胎 推 入 平 皿 中, 置 显 微 镜 下 检 查, 按 照 8.3 的 要 求 和 步 骤 进 行 胚 胎 洗 涤 脱 毒, 并 选 用 可 用 胚 胎 按 照 8.5.1 鲜 胚 移 植 的 胚 胎 装 管 的 方 法 进 行 装 管 14.2 胚 胎 移 植 14.2.1 受 体 牛 在 发 情 后 6 d~8 d 之 间 均 可 进 行 移 植 14.2.2 受 体 牛 实 行 1 尾 椎 ~2 尾 椎 间 硬 膜 外 腔 麻 醉 移 植 前 对 受 体 牛 进 行 直 肠 检 查, 检 查 到 有 黄 体 者 用 于 移 植 14.2.3 对 照 冷 冻 胚 胎 记 录 和 合 格 受 体 的 发 情 记 录, 合 理 地 搭 配 受 体 和 胚 胎 即 胚 胎 质 量 好 的 胚 胎 移 给 黄 体 质 量 好 的 受 体 牛 14.2.4 胚 胎 移 植 操 作 首 先 清 除 粪 便, 擦 拭 外 阴 部 助 手 扒 开 阴 唇, 操 作 者 一 手 将 移 植 枪 插 入 阴 门, 至 子 宫 颈 外 口, 另 一 手 插 入 直 肠, 把 握 子 宫 颈, 顶 开 移 植 枪 塑 料 薄 膜 外 套, 将 移 植 枪 送 入 黄 体 侧 子 宫 颈 缓 慢 地 将 移 植 枪 送 至 子 宫 角 前 1/3 处 ~1/2 处 在 移 植 枪 前 端 留 下 富 余 的 空 间, 并 用 手 托 起 移 植 枪, 慢 慢 推 入 钢 芯, 然 后 缓 慢 地 抽 出 移 植 枪 14.2.5 做 好 受 体 移 植 记 录 15 妊 娠 诊 断 通 常 使 用 直 肠 检 查 法, 在 移 植 后 2 个 月 后 开 始 检 查 妊 娠 60 天 时, 两 侧 子 宫 大 小 相 差 明 显, 孕 侧 子 宫 增 大 似 排 球 大 小, 触 摸 光 滑 检 查 时 要 特 别 注 意, 防 止 动 作 过 重, 检 查 过 度, 以 免 引 起 流 产 16 妊 娠 受 体 牛 的 饲 养 管 理 对 已 妊 娠 的 受 体 牛 要 加 强 饲 养 管 理, 避 免 应 激 反 应 妊 娠 受 体 牛 在 产 前 3 个 月 要 补 充 足 量 的 维 生 素 微 量 元 素, 适 当 限 制 能 量 摄 入, 既 要 保 证 胎 儿 的 正 常 发 育, 又 要 避 免 难 产 17 娟 姗 牛 X- 性 控 胚 胎 生 产 及 移 植 常 用 设 备 器 械 及 药 品 按 附 录 A 执 行 18 供 体 牛 超 排 记 录 表 及 受 体 牛 胚 胎 移 植 记 录 表 按 附 录 B 执 行 7

A 附 录 A ( 规 范 性 附 录 ) 娟 姗 牛 X- 性 控 胚 胎 生 产 及 移 植 常 用 设 备 器 械 和 药 品 娟 珊 牛 X- 性 控 胚 胎 生 产 及 移 植 常 用 设 备 器 械 及 药 品 见 表 A.1 表 A.1 娟 姗 牛 X- 性 控 胚 胎 生 产 及 移 植 常 用 设 备 器 械 和 药 品 品 名 规 格 或 产 地 数 量 单 位 用 途 备 注 超 净 工 作 台 2 台 防 止 污 染 胚 胎 冷 冻 仪 CL6000 1 台 冷 冻 胚 胎 子 宫 扩 张 棒 2 条 扩 张 牛 子 宫 颈 钢 芯 2 条 冲 胚 使 用 液 氮 罐 5L 10L 30L 各 1 个 保 存 胚 胎 实 体 显 微 镜 50 倍 1 台 检 胚 \ 鉴 定 胚 胎 移 植 枪 3-6 把 受 体 牛 移 植 胚 胎 超 声 波 洗 涤 仪 1 台 洗 涤 冲 卵 管 \ 扩 张 帮 等 高 温 灭 菌 仪 1 台 扩 张 棒 \ 钢 芯 消 毒 灭 菌 高 压 灭 菌 锅 2 个 冲 卵 液 \ 微 吸 管 等 灭 菌 冲 卵 管 16# 18# 20# 各 3 条 供 体 牛 冲 胚 移 植 硬 外 套 法 国 卡 苏 800 支 胚 胎 移 植 集 卵 杯 富 士 平 5 个 收 集 供 体 牛 胚 胎 PBS 粉 头 次 / 份 20 包 制 作 冲 卵 液 保 存 液 AB 公 司 50ml 6 袋 检 胚 \ 保 存 胚 胎 等 乙 二 醇 冷 冻 液 AB 公 司 20ml 5 袋 冷 冻 胚 胎 CIDR 20 盒 供 体 牛 或 受 体 牛 使 用 FSH 加 拿 大 或 国 产 20 瓶 超 数 排 卵 孕 马 血 清 国 产 20 瓶 同 期 发 情 数 量 可 以 根 据 使 用 情 况 进 行 增 减 8

B B DB45/T 1001 2014 附 录 B ( 规 范 性 附 录 ) 供 体 牛 超 排 / 胚 胎 生 产 记 录 表 B.1 供 体 牛 采 胚 记 录 表 见 表 B.1 表 B.1 供 体 牛 采 胚 记 录 表 液 氮 罐 提 篓 号 国 产 / 进 口 冲 胚 时 间 畜 主 供 体 耳 号 品 种 注 册 号 精 液 编 号 公 畜 注 册 号 冷 冻 日 期 激 素 处 理 前 直 肠 检 查 记 录 : 子 宫 卵 巢 FSH 品 牌 批 号 孕 酮 处 理 日 期 FSH 备 注 上 午 mg 下 午 mg 上 午 mg 下 午 mg 上 午 mg 注 PG 量 : 下 午 mg 上 午 mg 下 午 mg 预 计 发 情 日 实 际 发 情 日 人 工 授 精 ( 日 期 次 数 ) 第 1 次 第 2 次 第 3 次 技 术 员 采 胚 时 间 黄 体 滤 泡 回 收 冷 冻 移 植 囊 胚 桑 葚 胚 退 化 未 受 精 卵 小 筒 编 号 细 管 号 和 颜 色 胚 数 和 质 量 解 冻 日 期 备 注 冷 冻 剂 : 甘 油 乙 二 醇 ( 直 接 移 植 ) 评 语 冷 冻 记 录 9

B.2 受 体 牛 移 植 记 录 表 见 表 B.2 表 B.2 受 体 牛 移 植 记 录 表 序 号 地 址 : 时 间 : 年 月 日 畜 主 同 期 发 情 ( 埋 牛 特 发 情 排 卵 黄 体 移 植 胚 胎 栓 药 物 注 征 日 期 时 间 发 育 时 间 等 级 射 ) 妊 娠 术 者 备 注 10