西 北 植 物 学 报 文 章 编 号 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 的 克 隆 及 表 达 特 性 分 析 袁 秀 云 许 申 平 宋 彩 霞 崔 波 魏 博 郑 州 师 范 学 院 生 物 工 程 研 究 所 郑 州 郑 州 师 范 学 院 生 命 科 学 学 院 郑 州 河 南 农 业 大 学 生 命 科 学 学 院 郑 州 摘 要 利 用 及 ( 技 术 克 隆 到 蝴 蝶 兰 个 几 丁 质 酶 基 因 )*+", 登 录 号 为 - 该 基 因 './( 全 长 0 包 含 0 的 10 开 放 阅 读 框 和 01 编 码 个 氨 基 酸 该 蛋 白 为 糖 苷 水 解 酶 第 家 族 成 员 兼 具 有 溶 菌 酶 活 性 生 物 信 息 学 分 析 显 示 该 蛋 白 具 / 端 信 号 肽 和 跨 膜 结 构 为 胞 外 分 泌 蛋 白 该 蛋 白 与 海 枣 谷 子 油 棕 和 拟 南 芥 的 几 丁 质 酶 类 似 蛋 白 相 近 并 且 在 系 统 进 化 树 上 与 甘 蔗 和 陆 地 棉 的 类 几 丁 质 酶 同 属 一 个 分 支 基 因 的 表 达 分 析 表 明 在 蝴 蝶 兰 营 养 器 官 和 生 殖 器 官 中 均 有 表 达 根 中 表 达 量 最 高 低 温 处 理 和 时 该 基 因 的 表 达 被 抑 制 低 温 处 理 和 表 达 量 升 高 研 究 表 明 基 因 能 够 响 应 短 期 的 冷 胁 迫 研 究 结 果 为 进 一 步 研 究 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 的 系 统 进 化 及 抗 性 育 种 奠 定 了 基 础 关 键 词 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 表 达 分 析 低 温 胁 迫 中 图 分 类 号 文 献 标 志 码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收 稿 日 期 修 改 稿 收 到 日 期 基 金 项 目 河 南 省 科 技 攻 关 项 目 作 者 简 介 袁 秀 云 女 博 士 教 授 主 要 从 事 植 物 生 物 技 术 研 究!"#$%"&%$%'! 通 信 作 者 崔 波 博 士 教 授 主 要 从 事 花 卉 育 种 研 究!"##"'%'!
西 北 植 物 学 报 卷 9%"89:9%:8*:8%$8*0$#*8'*#%89'8"*4**"8*8:*:*8"'*:**49 '!00'8"**&0:*0"8*:#8*!0*:"8%:*8:* 几 丁 质 酶 '8"* 是 一 种 降 解 几 丁 质 的 糖 苷 酶 具 有 / 端 信 号 肽 几 丁 质 结 合 区 和 催 化 区 等 个 典 型 的 结 构 域 在 植 物 中 几 丁 质 酶 由 多 基 因 家 族 编 码 根 据 氨 基 酸 序 列 的 差 异 及 结 构 域 的 有 无 几 丁 质 酶 被 分 为 个 家 族 家 族 和 家 族 共 类 #" 和 属 于 家 族 和 属 于 家 族 在 植 物 中 几 丁 质 酶 不 但 参 与 植 物 的 抗 病 防 御 反 应 还 能 对 环 境 中 的 各 种 非 生 物 胁 迫 做 出 响 应 参 与 植 物 发 育 及 机 械 损 伤 低 温 高 盐 干 旱 和 重 金 属 等 多 种 非 生 物 胁 迫 的 调 控 因 此 研 究 几 丁 质 酶 及 其 功 能 有 助 于 深 入 了 解 植 物 的 抗 病 及 逆 境 生 理 调 控 机 制 同 时 也 可 以 为 经 济 作 物 的 抗 性 品 种 培 育 提 供 理 论 依 据 几 丁 质 酶 在 植 物 中 是 一 种 主 要 的 病 程 相 关 蛋 白 多 年 来 的 研 究 主 要 集 中 在 抗 病 方 面 在 非 生 物 胁 迫 中 几 丁 质 酶 也 参 与 植 物 的 低 温 胁 迫 生 理 调 控 研 究 显 示 黑 麦 中 有 个 冷 诱 导 基 因 和 的 蛋 白 分 别 属 于 #" 和 几 丁 质 酶 具 有 抗 冻 活 性 无 芒 雀 麦 中 冷 诱 导 几 丁 质 酶 基 因 与 黑 麦 中 的 同 源 但 不 受 渗 透 胁 迫 脱 落 酸 和 乙 烯 利 等 胁 迫 的 影 响 其 在 具 有 抗 冻 活 性 在 具 有 轻 微 的 抗 冻 活 性 狗 牙 根 在 冷 驯 化 和 脱 水 过 程 中 其 #" 几 丁 质 酶 基 因 被 诱 导 表 达 甘 蔗 的 #" 和 几 丁 质 酶 基 因 能 响 应 多 种 生 物 胁 迫 和 非 生 物 胁 迫 其 中 包 括 低 温 胁 迫 除 此 之 外 植 物 中 还 存 在 一 些 几 丁 质 酶 类 似 蛋 白 '8"*#,*0:8* 也 具 有 几 丁 质 酶 的 功 能 例 如 在 桑 树 水 稻 和 拟 南 芥 等 植 物 中 均 克 隆 出 几 丁 质 酶 类 似 基 因 研 究 发 现 这 些 基 因 在 病 虫 害 防 御 环 境 胁 迫 和 植 物 发 育 等 方 面 具 有 重 要 作 用 通 过 生 物 工 程 技 术 将 几 丁 质 酶 基 因 转 入 不 同 植 物 其 抗 病 能 力 能 够 增 强 例 如 转 马 铃 薯 几 丁 质 酶 茶 树 增 强 了 抗 疱 状 疫 病 的 能 力 水 稻 几 丁 质 酶 基 因 在 转 基 因 番 茄 中 的 表 达 增 强 了 番 茄 对 枯 萎 病 和 早 疫 病 的 抗 性 水 稻 几 丁 质 酶 基 因 转 入 香 蕉 增 强 了 香 蕉 对 黑 叶 条 纹 病 的 抗 性 在 烟 草 中 过 表 达 几 丁 质 酶 基 因 不 但 具 有 较 高 的 真 菌 和 细 菌 抗 性 其 对 高 盐 和 重 金 属 胁 迫 的 抗 性 也 增 强 可 见 通 过 几 丁 质 酶 基 因 的 遗 传 转 化 提 高 抗 逆 能 力 为 作 物 抗 性 育 种 提 供 了 一 条 新 途 径 尽 管 目 前 在 很 多 植 物 中 都 克 隆 到 不 同 的 几 丁 质 酶 基 因 而 兰 科 植 物 中 几 丁 质 酶 基 因 及 其 研 究 还 未 见 报 道 蝴 蝶 兰 00 是 兰 科 植 物 中 常 见 的 观 赏 兰 花 具 有 很 高 的 观 赏 价 值 由 于 其 原 产 于 热 带 及 亚 热 带 地 区 正 常 生 长 需 要 较 高 的 温 度 和 湿 度 低 温 胁 迫 是 其 生 长 的 制 约 因 素 研 究 蝴 蝶 兰 低 温 胁 迫 下 调 控 基 因 的 功 能 有 助 于 理 解 其 低 温 胁 迫 的 调 控 机 制 本 研 究 以 蝴 蝶 兰 为 材 料 利 用 ( 和 方 法 克 隆 到 个 几 丁 质 酶 基 因 的 全 编 码 区 序 列 利 用 实 时 荧 光 定 量 的 方 法 分 析 其 在 蝴 蝶 兰 不 同 组 织 及 低 温 胁 迫 下 的 表 达 特 性 旨 在 进 一 步 理 解 该 基 因 在 植 物 中 的 调 控 作 用 并 为 蝴 蝶 兰 低 温 抗 逆 机 理 的 研 究 及 今 后 通 过 基 因 工 程 手 段 选 育 抗 逆 新 种 质 奠 定 理 论 基 础 材 料 和 方 法 试 验 材 料 与 处 理 以 蝴 蝶 兰 品 种 满 天 红 为 试 验 材 料 首 先 将 生 长 大 小 一 致 的 生 根 瓶 苗 放 在 的 昼 夜 温 度 光 暗 条 件 的 培 养 箱 中 分 别 于 培 养 和 时 取 第 二 叶 片 组 织 接 着 再 放 回 正 常 温 室 条 件 下 昼 夜 温 度 光 暗 条 件 下 恢 复 培 养 并 于 和 时 取 第 二 叶 片 组 织 另 外 将 蝴 蝶 兰 植 株 放 于 冰 箱 分 别 于 和 时 取 第 二 片 叶 组 织 材 料 除 此 之 外 取 温 室 中 盛 花 期 的 根 叶 花 葶 萼 片 花 瓣 唇 瓣 蕊 柱 和 子 房 授 粉 发 育 后 等 组 织 每 次 取 样 包 含 个 生 物 学 重 复 所 有 组 织 取 材 后 迅 速 用 液 氮 速 冻 于 冰 箱 备 用 方 法 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 全 长 的 克 隆 叶 片 组 织 总 /( 用 :# 试 剂 68:4* 提 取 经 < 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 判 断 其 完 整 性 利 用 核 酸 蛋 白 分 析 仪 美 国 %"*# 测 定 /( 的 浓 度 和 纯 度 采 用 ==> 反 转 录 酶 "-"" 以 处 理 的 叶 片 总 /( 为 模 板 合 成 单 链 './( 根 据 /+6 登 录 的 序 列 设 计 对 简 并 引 物?17 =)(=())-((1 和
期 袁 秀 云 等 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 的 克 隆 及 表 达 特 性 分 析 1)3(-)(()(()()-)=1 用 于 扩 增 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 的 中 间 片 段 扩 增 体 系 为 含 @%9*:'./( 模 板 4 种 / 各!# 每 条 引 物!# (./( 聚 合 酶 扩 增 程 序 为 预 变 性! 变 性 退 火 延 伸 个 循 环 延 伸! 回 收 目 的 片 段 连 接 到 0) = (3 载 体 上 转 入 大 肠 杆 菌. 菌 株 进 行 克 隆 和 测 序 根 据 几 丁 质 酶 基 因 的 中 间 片 段 序 列 设 计 对 1 端 特 异 引 物 )31()))())) )((())(1 和 )31))())) ()()(1 对 1 端 特 异 引 物 )3 1()))()(())(((())1 和 )3 1(()((())(1 按 #8*' 公 司 3=( = ( (!0#9'"8,8 操 作 说 明 进 行 扩 增 回 收 扩 增 产 物 克 隆 到 0) = (3 载 体 上 转 入 大 肠 杆 菌. 菌 株 鉴 定 后 进 行 测 序 并 与 中 间 片 段 进 行 拼 接 然 后 根 据 拼 接 序 列 设 计 对 引 物 65?? 1))(()(((())())1 和 6 51)))()(()(()())))1 进 行 开 放 阅 读 框 5? 扩 增 引 物 和 测 序 由 上 海 立 菲 生 物 技 术 有 限 公 司 完 成 氨 基 酸 同 源 性 分 析 在 /+6 上 进 行 保 守 结 构 域 及 功 能 域 在 /+6 的 蛋 白 保 守 区 数 据 库 中 搜 索 并 用 3'":8* 软 件 分 析 利 用 34"#":4*8 和 7?35 软 件 分 别 进 行 信 号 肽 和 亚 细 胞 定 位 预 测 蛋 白 理 论 分 子 量 和 等 电 点 采 用 :8":! 软 件 分 析 采 用 === 分 析 跨 膜 结 构 蛋 白 质 二 级 结 构 预 测 采 用 &(3$ 网 站 上 的 )5: 8* *'":$ 8:%'8%:* 0:*'8 分 析 使 用 = )( 软 件 的 /A 法 构 建 系 统 进 化 树 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 的 表 达 分 析 各 种 组 织 总 /( 用 :!*3':08:*"4*8-884. /( :"*:"-"" 反 转 录 成 单 链 './( 根 据 基 因 全 长 设 计 对 特 异 引 物 6?1)() (()))()))())1 和 61(( )())))(((1 产 物 长 度 0 以 'A/ 及 #)- 为 内 参 基 因 引 物 分 别 为 ('8?1)()()(()( (())))1 和 ('81)()((( (())1?? 1 )()1 和?1))() ((((1 采 用 3+:*!& &( =,8"-"" 进 行 反 应 反 应 体 系 为 反 应 条 件 为 预 变 性 变 性 退 火 个 循 环 反 应 在 00*:9 ="8*:'$'#*: 荧 光 定 量 仪 上 进 行 次 重 复 引 物 特 异 性 分 别 通 过 溶 解 曲 线 分 析 并 测 序 相 对 表 达 量 按 照 8 法 计 算 结 果 与 分 析 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 全 长 的 克 隆 以 蝴 蝶 兰 处 理 叶 片 的 './( 为 模 板 以 简 并 引 物 6? 和 6 进 行 中 间 片 段 的 扩 增 得 到 个 0 保 守 片 段 图 ( 此 片 段 经 +#"82 分 析 包 含 个 家 族 几 丁 质 酶 结 构 域 表 明 该 片 段 为 几 丁 质 酶 片 段 根 据 该 片 段 序 列 采 用 ( 技 术 利 用 )3 和 )3 引 物 扩 增 获 得 1 端 目 的 片 段 为 0 图 + 利 用 )3 和 )3 引 物 扩 增 获 得 1 端 目 的 片 段 为 0 图 将 中 间 片 段 1 和 1 端 片 段 序 列 拼 接 然 后 在 开 放 阅 读 框 区 域 设 计 引 物 进 行 扩 增 得 到 了 预 期 的 片 段 图. 最 终 得 到 该 基 因 全 长 './( 为 0 通 过 5? 查 找 具 有 完 整 的 开 放 阅 读 框 其 中 包 含 010 开 放 阅 读 框 和 01 图 编 码 个 氨 基 酸 其 核 苷 酸 序 列 通 过 +#"8/ 分 析 发 现 其 与 野 芭 蕉 和 甜 菜 的 几 丁 质 酶 基 因 分 别 具 有 < 和 < 一 致 性 将 该 基 因 命 名 为 提 交 )*+", 登 录 号 为 - 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 的 生 物 信 息 学 分 析 利 用 /+6 的 蛋 白 保 守 区 数 据 库 '*:*!""8""*.. 对 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 编 保 守 片 段 1( 1( 开 放 阅 读 框 片 段 =. 图 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 的 扩 增 *:*:*41( 1( 5?=.?4(!0#9'"89'8"*4**00
西 北 植 物 学 报 卷 码 蛋 白 的 保 守 区 进 行 预 测 结 果 表 明 该 蛋 白 在 第 氨 基 酸 残 基 之 间 有 一 个 几 丁 质 酶 糖 苷 酶 家 族 结 构 域 ' 值 * 在 此 结 构 域 内 有 个 催 化 残 基 位 点 和 个 糖 结 合 位 点 图 说 明 该 结 构 域 包 含 催 化 区 该 结 构 域 还 是 一 个 溶 菌 酶 相 似 超 家 族 基 因 的 保 守 结 构 域 推 测 该 蛋 白 兼 具 溶 菌 酶 活 性 利 用 3'":8* 软 件 分 析 该 蛋 白 不 具 有 几 丁 质 酶 结 合 区 和 家 族 几 丁 质 酶 特 异 的 序 列 标 签 :8":! 软 件 预 测 结 果 表 明 该 蛋 白 分 子 量 为,. 等 电 点 为 为 酸 性 蛋 白 34"# 的 预 测 结 果 显 示 该 蛋 白 在 / 端 的 第 氨 基 酸 残 基 之 间 有 一 信 号 肽 区 域 第 位 丙 氨 酸 (#"( 和 位 赖 氨 酸 $- 之 间 为 信 号 肽 切 割 位 点 从 位 氨 基 酸 以 后 为 成 熟 蛋 白 利 用 ":4*8 和 7?35 种 软 件 对 该 蛋 白 的 亚 细 胞 定 位 进 行 预 测 ":4*8 的 预 测 显 示 该 蛋 白 是 分 泌 途 径 蛋 白 可 能 性 为 <7?35 的 预 测 显 示 该 蛋 白 位 于 胞 外 可 能 性 是 < 推 测 该 蛋 白 属 于 胞 外 分 泌 蛋 白 跨 膜 结 构 分 析 表 明 在 第 氨 基 酸 残 基 之 间 有 一 个 跨 膜 信 号 区 域 表 明 蝴 蝶 兰 该 几 丁 质 酶 为 跨 膜 蛋 白 二 级 结 构 预 测 表 明 该 蛋 白 螺 旋 占 < 延 伸 链 占 < 转 角 占 < 随 机 卷 曲 占 < 将 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 编 码 的 蛋 白 进 行 +#"8 比 对 结 果 显 示 该 蛋 白 与 多 种 植 物 几 丁 质 酶 具 有 << 一 致 性 其 中 与 海 枣 油 棕 谷 子 拟 南 芥 等 几 丁 质 酶 类 似 蛋 白 具 有 < < 一 致 性 将 这 些 蛋 白 与 其 它 各 类 几 丁 质 酶 蛋 白 一 起 构 建 系 统 进 () 起 始 密 码 子 (( 终 止 密 码 子 阴 影 / 端 信 号 肽 图 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 核 苷 酸 序 列 和 推 测 的 氨 基 酸 序 列 ()38":8'((380'3"/8*:!"#4"#0*08*?4*%'#*8*"'*%*'*"*%'*"!*%*'*9'8"*4**00 图 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 预 测 蛋 白 的 结 构 域 分 析?4*:*!"""#$90:*'8*0:8*9'8"*4**00
期 袁 秀 云 等 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 的 克 隆 及 表 达 特 性 分 析 图 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 的 系 统 进 化 分 析?4$#4**8'""#$9'8"*4**00 化 树 包 括 小 麦 的 #" 和 陆 地 棉 的 #" 和 草 莓 的 #" 拟 南 芥 的 #" 和 美 洲 油 棕 的 #" 小 荨 麻 的 #" 甘 蔗 的 #" 水 稻 的 #" 和 烟 草 的 #" 和 可 可 的 #" 结 果 表 明 各 类 几 丁 质 酶 蛋 白 差 异 明 显 个 物 种 的 几 丁 质 酶 蛋 白 被 分 为 大 分 支 #" 和 为 一 大 分 支 属 于 家 族 几 丁 质 酶 #" 和 为 另 一 大 分 支 属 于 家 族 几 丁 质 酶 此 大 分 支 又 分 为 个 亚 组 #" 为 一 亚 组 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 与 拟 南 芥 海 枣 油 棕 谷 子 的 几 丁 质 酶 类 似 蛋 白 和 陆 地 棉 甘 蔗 的 #" 为 第 二 亚 组 其 中 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 蛋 白 在 第 二 亚 组 中 与 海 枣 油 棕 谷 子 和 甘 蔗 等 单 子 叶 植 物 的 关 系 最 近 图 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 的 表 达 模 式 以 ' 和 #) 两 种 内 参 基 因 对 其 转 录 表 达 进 行 分 析 结 果 表 明 该 基 因 在 各 种 组 织 中 均 有 表 达 其 中 在 根 中 表 达 量 最 高 萼 片 和 唇 瓣 中 次 之 在 蕊 柱 中 表 达 量 最 低 说 明 在 形 态 建 成 中 主 要 促 进 根 的 发 育 以 ' 和 #) 两 种 内 参 基 因 作 为 标 准 基 因 的 表 达 分 析 结 果 基 本 一 致 图 为 了 分 析 几 丁 质 酶 基 因 与 不 同 低 温 胁 迫 的 关 系 分 析 了 低 温 驯 化 温 度 和 冷 胁 迫 条 件 下 该 基 因 表 达 水 平 结 果 显 示 在 昼 夜 温 度 培 养 和 时 该 基 因 表 达 随 着 低 温 处 理 时 间 的 延 长 逐 渐 降 低 恢 复 正 常 温 度 培 养 和 时 该 基 因 表 达 量 没 有 回 升 图 ( 此 时 观 察 到 植 株 图 在 不 同 组 织 中 的 表 达?4**&0:*#**#99*:*8:4" 通 过 低 温 驯 化 后 能 恢 复 正 常 生 长 没 有 冻 伤 现 象 而 在 低 温 胁 迫 下 该 基 因 表 达 与 前 者 不 同 在 冷 胁 迫 和 时 几 丁 质 酶 基 因 的 表 达 量 均 比 处 理 前 高 呈 逐 渐 升 高 的 趋 势 在 处 理 时 表 达 量 达 到 最 高 随 后 其 表 达 量 下 降 在 表 达 量 最 低 和 维 持 在 处 理 前 的 表 达 水 平 分 析 认 为 低 温 驯 化 和 时 表 达 被 抑 制 当 恢 复 正 常 温 度 培 养 时 其 表 达 在 短 期 内 没 有 恢 复 对 短 期 的 低 温 胁 迫 能 够 及 时 做 出 响 应 但 是 随 着 冷 胁 迫 时 间 的 延 长 其 表 达 又 回 到 原 来 的 表 达 水 平 图 + 在 两 种 低 温 处 理 条 件 下 以 ' 和 #) 两 种 内 参 基 因 作 为 标 准 的 表 达 水 平 分 析 也 具 有 相 似 的 结 果
西 北 植 物 学 报 卷 族 几 丁 质 酶 特 异 的 序 列 标 签 还 有 一 些 几 丁 质 酶 类 似 蛋 白 其 序 列 与 和 家 族 几 丁 质 酶 蛋 白 同 源 但 不 包 含 几 丁 质 结 合 或 者 催 化 活 性 具 有 几 丁 质 酶 相 似 的 抗 病 原 体 活 性 拟 南 芥 一 个 几 丁 质 酶 类 似 蛋 白 (8 具 有 一 个 家 族 几 丁 质 酶 的 结 构 域 在 / 端 有 一 个 信 号 肽 属 于 分 泌 途 径 的 蛋 白 定 位 于 细 胞 壁 其 在 种 子 茎 和 花 中 均 有 表 达 在 成 熟 叶 片 和 根 中 表 达 较 低 该 基 因 不 被 机 械 损 伤 水 杨 酸 和 乙 烯 等 处 理 诱 导 其 转 录 水 平 在 机 械 损 伤 和 乙 烯 处 理 时 明 显 降 低 推 测 拟 南 芥 '* 基 因 不 是 胁 迫 诱 导 型 几 丁 质 酶 在 拟 南 芥 中 该 蛋 白 的 突 变 引 起 了 根 中 木 质 素 的 异 源 沉 淀 细 胞 形 状 的 改 变 和 过 剩 乙 烯 的 产 生 进 一 步 研 究 发 现 该 蛋 白 在 根 系 发 育 中 起 重 要 作 用 能 够 响 应 土 图 蝴 蝶 兰 基 因 在 不 同 低 温 条 件 下 的 表 达?4**&0:*#**#9%*: 9*:*8#8*!0*:"8%:* 讨 论 本 研 究 从 蝴 蝶 兰 叶 片 中 克 隆 到 个 几 丁 质 酶 基 因 其 生 物 信 息 学 分 析 表 明 该 基 因 属 于 家 族 几 丁 质 酶 基 因 包 含 一 个 催 化 区 在 / 端 有 一 个 信 号 肽 具 有 跨 膜 结 构 属 于 胞 外 分 泌 蛋 白 系 统 进 化 分 析 显 示 该 基 因 编 码 的 蛋 白 与 几 丁 质 酶 类 似 蛋 白 关 系 最 近 在 进 化 树 上 与 #" 几 丁 质 酶 在 同 一 分 支 上 表 达 特 性 分 析 结 果 表 明 该 基 因 在 蝴 蝶 兰 的 营 养 器 官 和 生 殖 器 官 中 均 有 表 达 但 表 达 水 平 有 差 异 低 温 驯 化 温 度 抑 制 其 表 达 能 够 响 应 短 期 的 冷 胁 迫 植 物 中 各 类 几 丁 质 酶 的 基 因 序 列 亚 细 胞 定 位 及 酶 活 性 存 在 较 大 差 异 #" 几 丁 质 酶 包 含 / 端 信 号 区 几 丁 质 结 合 区 和 催 化 区 个 功 能 结 构 域 有 的 #" 几 丁 质 酶 在 端 还 有 一 个 液 泡 定 位 区 #" 几 丁 质 酶 有 信 号 肽 和 催 化 区 #" 几 丁 质 酶 与 #" 和 #" 没 有 同 源 性 #" 与 #" 的 结 构 域 相 似 但 催 化 区 较 短 #" 几 丁 质 酶 在 氨 基 酸 结 构 上 与 #" 相 似 但 其 序 列 与 小 荨 麻 凝 结 素 蛋 白 前 体 序 列 相 似 性 高 在 / 端 有 个 凝 结 素 保 守 域 #" 与 前 类 无 相 似 性 有 信 号 肽 个 几 丁 质 结 合 位 点 和 催 化 区 与 某 些 细 菌 的 几 丁 质 酶 具 有 较 高 的 相 似 性 #" 几 丁 质 酶 / 端 有 信 号 区 和 催 化 区 不 含 几 丁 质 结 合 位 点 其 催 化 区 不 含 家 壤 环 境 的 变 化 影 响 根 系 的 结 构 在 棉 花 中 有 个 几 丁 质 酶 类 似 蛋 白 与 拟 南 芥 (8 有 较 高 的 一 致 性 它 们 在 细 胞 壁 的 纤 维 素 合 成 中 发 挥 重 要 作 用 本 研 究 的 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 编 码 的 蛋 白 与 (8 有 较 高 的 同 源 性 二 者 具 有 相 似 的 功 能 结 构 域 如 具 有 / 端 有 信 号 肽 有 家 族 几 丁 质 酶 的 结 构 域 但 没 有 几 丁 质 酶 特 异 的 序 列 标 签 在 系 统 进 化 树 上 与 #" 属 于 同 一 分 支 由 此 判 断 该 研 究 中 的 几 丁 质 酶 类 似 蛋 白 可 能 属 于 #" 几 丁 质 酶 本 研 究 中 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 与 拟 南 芥 的 (8 具 有 相 似 的 组 织 表 达 特 性 均 在 营 养 器 官 和 生 殖 器 官 中 表 达 由 此 推 测 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 与 拟 南 芥 的 (8 有 相 似 的 功 能 在 热 带 和 亚 热 带 物 种 中 番 荔 枝 '" 的 果 皮 中 具 有 个 抗 真 菌 和 低 温 适 应 的 几 丁 质 酶 体 外 研 究 表 明 该 蛋 白 不 具 有 抗 冻 活 性 甘 蔗 的 #" 和 几 丁 质 酶 在 处 理 和 时 两 种 几 丁 质 酶 均 表 现 持 续 升 高 的 转 录 表 达 而 本 研 究 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 只 在 处 理 时 表 达 达 到 高 峰 处 理 以 后 其 表 达 下 降 到 处 理 前 的 水 平 分 析 原 因 可 能 与 几 丁 质 酶 的 种 类 和 物 种 差 异 有 关 蝴 蝶 兰 作 为 热 带 和 亚 热 带 物 种 适 宜 的 生 长 需 要 温 湿 的 环 境 低 温 会 抑 制 其 生 长 和 发 育 目 前 蝴 蝶 兰 低 温 胁 迫 下 的 响 应 机 制 还 不 明 确 研 究 报 道 也 较 少 最 近 的 研 究 表 明 蝴 蝶 兰 在 驯 化 低 温 条 件 下 有 一 个 几 丁 质 酶 肽 段 上 调 表 达 本 研 究 的 几 丁 质 酶 编 码 的 蛋 白 不 包 含 该 肽 段 说 明 二 者 不 是 一 个 蛋 白 同 时 也 表 明 蝴 蝶 兰 另 有 驯 化 低 温 诱 导 类 型 的 几 丁 质 酶 这 些 基 因 在 蝴 蝶 兰 的 生 物 胁 迫 和 非 生 物 胁 迫 中 如 何 调 控 生 理 代 谢 其 作 用 底 物 是 什 么
期 袁 秀 云 等 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 的 克 隆 及 表 达 特 性 分 析 这 些 研 究 结 果 将 有 助 于 蝴 蝶 兰 新 种 质 品 种 的 改 良 因 此 有 关 蝴 蝶 兰 几 丁 质 酶 基 因 的 种 类 酶 活 性 及 与 低 温 胁 迫 的 关 系 待 于 进 一 步 研 究 参 考 文 献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