" # $ % & ' ' ( "#$ ) #% * + &', + #% - 熊果酸通过 ()*+ 介导的信号通路激活自噬 改善油酸诱导的肝细胞脂肪沉积 '() *+, -. /0 "# 12, $ 34 "# 678 #"% "#$%&' "( )*+,&%-.*,%/0/ 1/2,34' #%,/$0,67 "'8 9: %"8;< "=>8 %#$ "9:;<=>?@ABCCD EF #$$%# &"9:;<=>?GH<?I$J #"9:;<=>?KLMN<CD '"9:;<=>COP<CD QRS,目的-揭示熊果酸改善油酸诱导的肝细胞脂质沉积的作用及其潜在分子机制,方法- 采用油酸诱导./01 肝细胞建立脂质沉积模型 给予 不同浓度熊果酸 #% % &%234 6# 进行干预 采用酶法检测细胞内甘油三酯含量 73890: 染色法观察胞内的脂滴 ;/<=/>? @43= 检测抗微管相关 蛋白 A 轻链 '7 29B>3=C@C4/6D<<3B9D=/8 0>3=/9? A 49EF= BFD9? '7 G'7 蛋白表达及腺苷酸活化蛋白激酶 ()*6DB=9HD=/8 0>3=/9? I9?D</ ()*+ 磷酸 化水平,结果- %JK2234 6A 油酸干预肝细胞 ALF 可建立肝脂质沉积体外模型 不同浓度熊果酸干预 ALF 可以显著减轻油酸导致的肝细胞脂质沉 积 "M%K %M%# 且保护作用呈剂量依赖关系 自噬激动剂雷帕霉素可显著降低油酸诱导后肝细胞甘油三酯含量 并抑制胞内脂滴的形成 %M%K 而自噬抑制剂氯喹显著加重油酸诱导的肝脂质沉积 %M%K 熊果酸干预可显著上调肝细胞内 G'7 的表达 %M%K %M%# 从而激活自 噬 而抑制自噬可显著阻断熊果酸对肝脂质沉积的减轻作用 熊果酸还可显著激活自噬调控开关 ()*+ 的磷酸化水平 %M%K,结论- 熊果酸通 过激活自噬改善油酸诱导的肝细胞脂质沉积 ()*+ 可能是熊果酸激活自噬的潜在分子靶点 TUVS熊果酸 自噬 油酸 ()*+ 肝细胞脂质沉积 ;WGXYS(## Z[\]^S) Z_`YS**%+%%*,a&*,b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`D<<3B9D=/8 0>3=/9? A 49EF= BFD9? '7ZG'7\ 0>3=/9? D?8 =F/ 0F3<0F3>:4D=93? 3Y ()*`DB=9HD=/8 0>3=/9? I9?D</Z()*+\ 0>3=/9? ]/>/ 8/=/B=/8 @: ;/<=/>? @43=M,a/<C4=<- )38/4 3Y F/0D=3B:=/ 49098 8/03<9=93? ]D< /<=D@49<F/8 DY=/> 9?=/>H/?=/8 Y3> ALF 9? H9=>3 ]9=F V( Z%MK2234 `A\M N9YY/>/?= B3?B/?=>D=93?< 3Y [( B3C48 <9E?9Y9BD?=4: >/8CB/ =F/ 49098 8/03<9=93? 3Y F/0D=3B:=/< 9?8CB/8 @: V(Z%M%KR %M%A\R D?8 =F/ 0>3=/B=9H/ /YY/B= ]D< 83</`8/0/?8/?=M (C=30FDE: DE3?9<= >D0D2:B9? B3C48 <9E?9Y9BD?=4: >/8CB/ =F/ B3?=/?= 3Y X1 D?8 =F/ Y3>2D=93? 3Y 9?=>DB/44C4D> 49098 8>304/=< 9?8CB/8 @: V(Z%M%K\R ]F94/ BF43>3bC9?/R DB=/8 D< DC=30FDE: 9?F9@9=3>R <9E?9Y9BD?=4: DEE>DHD=/8 =F/ DBBC2C4D=93? 3Y 49098 9? 49H/> 9?8CB/8 @: V(Z%M%K\M [( B3C48 <9E?9Y9BD?=4: C0`>/EC4D=/ =F/ /_0>/<<93? 3Y G'7 9? F/0D=3B:=/<Z%M%KR %M%A\R =FC< DB=9HD=9?E DC=30FDE:c ]F94/ 9?F9@9=9?E DC=30FDE: B3C48 <9E?9Y9BD?=4: @43BI =F/ /YY/B= 3Y [( 3? F/0D=3B:=/ 49098 8/03<9=93?M [( B3C48 D4<3 <9E?9Y9BD?=4: DB=9HD=/ =F/ 0F3<0F3>:4D=93? 4/H/4 3Y DC=30FDE: >/EC4D=/8 <]9=BF ()*+Z%M%K\M,G3?B4C<93?- [( 920>3H/< V( 9?8CB/8 49098 8/03<9=93? 9? F/0D=3B:=/ @: DB=9HD=9?E DC=30FDE:R ()*+ 2D: @/ D 03=/?=9D4 234/BC4D> =D>E/= 3Y [( =3 DB=9HD=/ DC=30FDE:M NCH P<;?61 C><349B DB98c DC=30FDE:c 34/9B DB98c ()*+c F/0D=3B:=/ 49098 8/03<9=93? 非酒精性脂肪性肝病?3?`D4B3F349B YD==: 49H/> " # $ % & 调 过食肥甘厚味 湿热毒邪侵入等 而久病体虚 气 89</D</ P(SN 是以肝脂质沉积为主要病理特征的 滞 食积和疫气等也与本病发生有关 有学者认为 慢性肝病 进一步可发展为非酒精性脂肪性肝炎 肝 本病的病机核心是痰瘀互结 蓄积于肝,&- 硬化 甚至肝细胞癌,A- 据估计全球约有 &d的成人,- [( 是一种五环三萜类化合 熊果酸 C><349B DB98,'- 患 P(SN 我国 P(SN 患病率约为 AKd"&%d 中 物 其广泛存在于苹果 蔓越莓 橄榄等多种植物中,K- 医学认为 P(SN 的主要病因包括过于肥胖 情志失 [( 已成为人类饮食的重要组成部分 前期研究表明. / 0 1 " 2 3 4 6 '. / 0 1 # eaff'& $ eakf'a' % & 7 8 9 : ; < 6 = >? 0 1 # %A$'A%L'% % & 2 3 @ & ' < A B C D E F >? 0 1 # %AeA%'&&%AL % & 7 8 & ' < G = C B H I >? J B K L M >? 0 1 # %Aea&A%%A% % SC?8 0>3W/B=<g PD=93?D4 PD=C>D4 hb9/?b/ S3C?8D=93? *>3W/B=ZeAff'&ReAKf'A'\c if/w9d?e )/89BD4 D?8./D4=F hb9/?b/ D?8 X/BF?343E: *>3W/B=Z%A$'A%L'%\c PD=93?D4 [?8/>E>D8CD=/ O??3HD=93? D?8 T?=>/0>/?/C><F90 X>D9?9?E *>3W/B=Z%AeA%'&&%AL\c if/w9d?e *>3H9?B9D4 [?8/>E>D8CD=/ hb9/?b/ D?8 X/BF?343E: O??3HD=93? (B=9H9=: D?8 j9?29d3 XD4/?=< *>3W/B=Z%Aea&A%%A%\ N O P Q " R S T ' T`2D94g49<3?E=D3kH90JALJB32 %*
能够改善高脂饮食诱导的, 而其改善肝细胞内脂质沉积的机制目前尚未完全明确 因此, 本研究以油酸 ( " #"$,%) 诱导 & ' 细胞建立肝细胞脂质沉积模型, 探究 对 % 诱导的肝脂质沉积的影响及其分子机制 细胞和试剂人肝癌细胞 (& ') 购于美国培养物集存库 ( "# (' )*+* ) "+, ))) % 棕榈酸 ('#+" #"$,,) -.- 培养基 氯喹 ("/0*,)1) 均购于 # 公司 ( 批号 :, )); 雷帕霉素 (# '#(",#') 购于 2 "3 公司 ( 批号 :4);$'( 6 染液购于 78+ 公司 ( 批号 :); 胎牛血清购于 "# $*2+ 2 公司 ( 批号 :949 4)); 抗微管相关蛋白 4 轻链 ("+*:* 9#22 "#+ $ '+ 4 /+ "/#,)) 抗磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶 ('/2'/9-,9#"+8#+ $ '+ 3#2,'9-,;) 抗腺苷酸活化蛋白激酶(-,9#"+ 8#+ $ '+ 3#2,-,;) 抗体均购于 ) # "/( 公司 ( 批号 : ); 甘油三酯 (+(" $,) 检测试剂盒购于北京普利莱基因技术有限公司 ( 批号 :.4);) 蛋白浓度检测试剂盒购于碧云天生物技术公司 ( 批号 :,4); 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗 7 购于 2+ 公司 ( 批号 :4) 主要仪器和设备酶标仪为美国 - 公司产品 ; 数字凝胶成像系统购于美国,+ ' 公司, 荧光显微镜购自 "# 公司 方法 细胞培养 & ' 细胞培养于含 4 胎牛血清的 -.- 培养基中, 放置在 )% 饱和湿度培养箱中进行培养 每天观察细胞生长情况, 隔天换液, 待细胞融合至 时进行传代, 取对数生长期细胞用于后续实验 细胞干预取对数生长期细胞, 以 4 个 6 的数量接种于 孔板内, 每孔体积 4, 置于培养箱中培养 / 后, 设未加药物的细胞为对照组, 其余组别细胞分别予 9 的 % 和 9 的, 干预 /, 检测肝细胞内脂质沉积情况 ; 再分别以 9 的 干预细胞 / 后检测相关蛋白表达水平 采用 9 自噬激动剂 #' 及 9 自噬抑制剂 )1 预处理细胞 / 后给予 % 干预 /, 检测肝细胞内脂质沉积情况 ; 采用 9 自噬激动剂 #' 及 9 自噬抑制剂 )1 预处理细胞 / 后, 再加入 干预 /, 随后给予 % 处理 /, 检测肝细胞内脂质沉积情况 脂质沉积检测通过测定细胞内 含量和脂质染色检测细胞内脂质沉积 分别采用 检测试剂盒和 ) 蛋白浓度检测试剂盒, 测定细胞内 和蛋白质的含量, 并依据蛋白质含量对 含量进行校正 脂质染色采用 $'( 法, 9 $'( 于 染色, 荧光显微镜下检测 2+ :+ 检测 ) ' 9-,; -,; 蛋白表达收集细胞, 以, 漂洗后, 加入适量蛋白裂解液, 冰上裂解, 充分涡旋震荡后, 于 下 6 离心, 收集上清液, 以 ) 法测定蛋白浓度, 蛋白定量后 9,. 电泳分离, 低温转移至, 膜, 用含 脱脂奶粉的 液室温封闭 4/, 加入相应的一抗 () '9-,; -,;), 孵育过夜 回收一抗, 洗膜 次, 每次 4, 再加入山羊抗兔二抗 7, 室温摇床孵育 4/, 回收二抗, 洗膜 次, 每次 4, 化学发光法成像, 采用数字凝胶成像仪对图像进行拍照分析 统计学方法采用, 统计软件进行统计学分析 计量资料以 2 表示, 先进行方差齐性检验, 满足方差齐性时组间比较采用单因素方差分析 以 为差异有统计学意义 不同脂肪酸对肝细胞脂质沉积的影响 分别采 用不同浓度的 % 和, 干预后, 与对照组比较,% 和, 均呈剂量依赖关系显著增加肝细胞内 含量 (,4) 见图 4 $'( 染色观察发现,% 和, 诱导的脂质沉积结果与 检测结论一致 见 图 4 随着 % 和, 的浓度增加, 胞内脂滴含量显 著增加, 且 % 诱导的肝脂质沉积效果明显高于相同 浓度的,, 因此后续实验中采用 94 % 作 为干预因素 各组细胞脂质沉积比较 采用不同浓度 预 处理细胞后, 再予 94 % 干预, 结果显示, 与对照组比较,% 组 含量增加明显 (4); 与 % 组比较, 94 组 含量减少 ( "#$ -,; %&'()*+,-.&'/01
相对含量 "##$ % & 8 & & & ##$ % & & & & 8 2.-$ " ##$ % & " ##$ % & " 8##$ % & "#$ ' %&'()*+,-.&'/01 # 注 : 不同浓度 " 和 对细胞内 含量的影响 ; 不同浓度 " 和 诱导的脂质沉积观察 ( 荧光染色,) 与对照组比较,, ( )**+, * **-. +.+.-/., * " /...-/+$$0$/- +..1 ",-/.. $,..0+ **-. +. +.-/., * " /. *$0-,+.+,/.. 2#/- 34 +.-$ -0 图 不同脂肪酸对 6 细胞脂质沉积的影响 7 )**+ * **-. */ /+,. $,. * 6 +$$,,), 随着剂量加大, 含量减少更明显 见图 同时用 染色进行观察, 提示 以剂量依赖关系显著改善 " 所诱导的脂滴堆积, 但与对 : :: " & ; ; ; ; #$ % & 相对含量 9 ##$ % & ##$ % & 8##$ % & 照组比较, 最大剂量 (#$ % & ) 本身对细胞内脂质沉积无明显影响 见图 #$ % & 自噬调控 " 诱导的肝细胞脂质沉积分别采 2.-$ # " "; #$ % & "; ##$ % & "; #$ % & 注 : 对 " 诱导的细胞内 含量的影响 ; 细胞内脂滴观察 ( 荧光染色,) 与对照组比较,, ; 与 " 组比较, :, :: ( )**+ *..-/+$$0$/- +...0+ "1 ",-/. *.-/+$$0$/- $ -$, 2#/- 34 +.-$ -0 1 +#/- 34 " -0 :, :: 图 各组细胞脂质沉积比较 7 2#/-,. * $,.. /+4-0 *$0-,+.+,/..
用自噬激动剂 和自噬抑制剂 进行预处理, 检测自噬对 诱导的脂质沉积的影响 结果表明抑制自噬可显著加重 诱导的脂质沉积, 而激活自噬能显著改善脂质沉积情况 () 见图 通过 " # 染色观察得到一致的结论, 与 组比较, 预处理后细胞内脂滴含量增加, 预处理后细胞内脂滴含量显著降低 见图 抑制自噬对 $ 脂质沉积保护作用的影响给 予不同浓度 $ 作用后,%&'& 结果表明 $ 能以剂量依赖关系激活 的表达 (, () 见图 以 ) * 自噬抑制剂 预处理 + 后再予 ) * $ 处理 +, 随后添加 处理,+, 检测细胞内 -. 含量, 研究结果表明抑制自噬可显著阻断 $ 的保护作用 () 见图 "# 染色观察结果也得到一致结论 见图 提示自噬信号通路参与了 $ 抑制 诱导的脂质沉积 $ 激活 /01 磷酸化 $ 预处理 &. 肝细胞后,%&'& 检测提示 $ 能显著提高 /01 蛋白的磷酸化水平 () 见图 -. 相对含量 ( 注 : 和 对 诱导的细胞内 -. 沉积的影响 ; 细胞内脂滴观察 ( "# 荧光染色,) 与对照组比较, 4, 44 (, 与 组比较, &6 788&9' 8 "9&: -. & '"" ":9& # ; '&" 8 "9&: "" &' "# 8: &'9&9& '"" )& "+ 9 : 4 44 (; 9 )& "+ : 图 自噬调控 诱导的肝细胞脂质沉积 " : +# ) :&' *":9& "" & '"" " +& 9#&' 本研究发现,$ 可显著改善 诱导的肝细胞脂质沉积 机制研究表明 $ 可显著激活肝细胞自噬, 而抑制自噬可显著阻断 $ 所起到的保护作用, 说明 $ 通过激活自噬发挥抑制肝脂质沉积的作用 此外,$ 可显著提高自噬调控的上游靶点 /01 的磷酸化水平, 提示 /01 可能参与 $ 激活的自噬 我国历代医学典籍都记载着古代医家对 肝着 44 4 44 * < < < * * < * * * < < ) < < 肝癖 积聚 等论述, 其病因病机及治则治法与现代医学 十分相似 其病位主要在于肝, 最早相关记载见于 难经 : 肝之积名曰肥气 2 32 提示其与过食肥甘厚味有关 ; 丹波元坚所著 杂病广要 中也有 肝气被压 横行之则两胁痛 之说, 认为偏嗜肥甘厚腻也会导致 发病 由此可知, 脂质是由津液 水谷所化生的精微物质, 是人体新陈代谢不可或缺的, 然而其过剩的部分亦对机体造成损害 近代医家认为 的病机主要为肝失疏泄 2 肝血瘀滞等, 病理基础与肝脏功能关系密切 前期研究显示,$ 能够改善高脂饮食诱导的,2, 但是对 $ 影响脂质沉积机制并不清楚, 因此本研究通过建立脂质沉积模型, 探究 $ 改善肝细胞脂质沉积的作用机制 为探究 $ 对肝细胞脂质沉积的影响, 本研究分别使用 和 0 对 &. 细胞进行干预, 结果表明随着 和 0 的浓度升高,&. 细胞内 -. 含量增加, 两种脂肪酸均能促进肝细胞内脂质沉积, 而与 0 比较, 相同浓度的 诱导脂质沉积更为显著, 这 "#$ /01 %&'()*+,-.&'/01
("01" " < ( ( <0$ ( 相对表达量 ("01" "#$ *+, %&'()*+,-.&'/01 相对含量 ("01" 3 < = = = < < = = () < < < = 注 :-./01 "0 检测 ( 的蛋白表达 ; 细胞内 含量检测 ;( 细胞内脂滴观察 ("#$% 荧光染色,) 与对照组比较, 2, ; 与 组比较, 3-2; 与 组比较, -2 &"04-00$" "6 ( 1"0$ 71//$" %./01 "08-00$" "6 $0191 "008 (- /1:0$" "6 $0191 $$# #1"0/- ;"#$% 69"1/ /0$$ ("1# $0 "01" 1"9 2 8 "1# $0 1"9 3 28 "1# $0 1"9 2 图 抑制自噬对 脂质沉积保护作用的影响 '$ 660 "6 $$$0$" "6 90"% " 1"00$: 660 "6 " $$# #"/$0$" ("01" <*+, *+, ( ("01" 2 = (" < ) ==() 注 :-./01 "0 检测 <*+, 和 *+, 的蛋白表达 ;- 各组 <*+, 相对表达量比较 与对照组比较, -2 &"04-01$0$" "6 1"0$ 71//$" "6 <*+, # *+, %./01 "08 - ("1$/" "6 10$: 71//$" "6 <*+, $ 1"9- ("1# $0 "01" 1"9-2 图 2 通过激活 *+, 磷酸化激活自噬 '$-2 0$:0/ 90"/ % 0$:0$" "6 *+, "/"1%0$" <*+, 相对表达量 -2 - -2 - -2 ("01" 与先前研究报道一致, 因此本研究使用 建立脂质沉积模型进行后续研究 为了验证 是否对 诱导的脂质沉积起到保护作用, 在 干预前给予不同剂量的 预处理 细胞, 细胞内 含量测定及 "#$% 荧光染色的结果表明, 能够显著降低 诱导的脂质沉积, 其作用呈剂量依赖关系 现有研究表明, 自噬在 &' 的发展和发病过程中起着至关重要的作用, 激活自噬可通过消除过度的肝脏脂滴和线粒体受损 ( 分别称为脂噬和有丝分 裂 ), 调节肥胖相关的 &' 患者的脂质代谢 本研究中使用自噬激动剂 及自噬抑制剂 () 分别对 细胞进行预处理, 提示自噬激动剂 能
有效减轻 诱导的肝细胞脂质沉积, 而自噬抑制剂 则会加重脂质沉积的现象, 这与目前研究一致 前期研究中已证实, 能够通过自噬改善脂毒性诱导 的肝细胞死亡, 因此进一步对 是否能够通过自噬减轻肝细胞脂质沉积进行验证 结果表明, 使用自噬抑制剂 进行预处理后, 对 诱导的脂质沉积的改善作用受到抑制, 该结果进一步提示 能够通过激活自噬改善 诱导的脂质沉积 本研究进一步对 激活自噬的机制进行了探 究 目前研究表明, 参与自噬调节的机制是多因素的 " 而 已被公认为自噬的正调节者, 可作为细胞存活或死亡的关键调节因子, 参与各种病理应激反应, # 包括氧化应激 内质网应激 缺氧和渗透应激等 此外, 它具有促分解代谢功能, 是细胞脂质代谢的主要调节剂, 一旦被激活, 能够降低脂质合成和相关过程中必需酶的活性 因此, 本研究通过 $%&'% ' 检测 是否能够激活, 结果显示, 能够提高 的磷酸化水平 该结果提示 激活自噬可能与促进 磷酸化有关, 表明 可能通过 调控自噬从而改善 诱导的肝细胞脂质沉积 综上所述, 本研究发现 可能通过调控 的磷酸化进一步激活自噬, 从而抑制 诱导的肝细胞脂质沉积, 该结果提示 可作为防治 ()* 的潜在药物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