用 于 聚 集 体 分 析 的 Agilent AdvanceBio SEC 色 谱 柱 : 仪 器 兼 容 性 技 术 概 述 前 言 Agilent AdvanceBio SEC 色 谱 柱 是 体 积 排 阻 色 谱 柱 (SEC) 产 品 系 列 中 的 最 新 成 员, 填 充 有.7 µm 的 独 特 低 结 合 性 聚 合 物 涂 层 硅 胶 颗 粒 固 定 相 此 项 技 术 可 最 大 限 度 降 低 非 特 异 性 结 合 或 相 互 作 用, 并 能 改 善 分 析 单 克 隆 抗 体 (mab) 和 抗 体 药 物 偶 联 物 (ADC) 等 生 物 治 疗 性 分 子 时 得 到 的 峰 形 同 时, 建 议 将 Agilent 16 Infinity 生 物 惰 性 液 相 色 谱 系 统 与 该 色 谱 柱 配 合 使 用, 高 度 均 一 的.7 µm 填 料 提 供 的 出 色 柱 效 可 在 任 意 HPLC 系 统 允 许 的 运 行 压 力 下 实 现 蛋 白 质 回 收 率 的 最 大 化 压 力 范 围 包 括 从 老 式 仪 器 的 bar 到 UHPLC 仪 器 的 1 bar AdvanceBio SEC 3Å 色 谱 柱 专 为 单 克 隆 抗 体 聚 集 体 分 析 设 计, 可 在 目 标 分 析 中 实 现 最 佳 性 能 以 及 优 异 的 单 体 与 二 聚 体 分 离 度 AdvanceBio SEC 13Å 色 谱 柱 同 样 具 有 高 孔 隙 体 积, 但 适 用 于 更 小 分 子 量 蛋 白 质 和 多 肽 色 谱 柱 尺 寸 的 可 选 范 围 广, 可 满 足 所 有 应 用 需 求 : 传 统 的 7.8 -.6 mm 内 径 色 谱 柱 适 合 灵 敏 度 较 高 或 样 品 量 有 限 的 应 用 柱 长 3 cm 的 色 谱 柱 适 合 进 行 传 统 高 分 离 度 分 离, 而 15 cm 色 谱 柱 则 适 用 于 需 要 更 高 样 品 通 量 的 高 速 应 用 同 时 还 有 5 cm 保 护 柱 可 供 选 择
Agilent 11 HPLC ( bar) Agilent 16 Infinity (6 bar) Agilent 19 Infinity (1 bar) 1 15 1 1 5 1 15 1 1 5 1 15 1 1 5 6 8 1 1 1 6 8 1 1 1 6 8 1 1 1 图 1. 不 同 HPLC 仪 器 进 行 蛋 白 质 分 离 的 直 观 示 例 ( 蓝 色 迹 线 :BioRad 蛋 白 质 混 标 ; 红 色 迹 线 :γ- 球 蛋 白 ) 注 : 以 上 样 品 为 不 同 实 验 室 的 不 同 批 次 蛋 白 质 条 件 参 数 值 洗 脱 液 15 mm 磷 酸 钠 缓 冲 液,pH 7. 流 速 1. ml/(7.8 mm 色 谱 柱 ) 或.35 ml/(.6 mm 色 谱 柱 ) 温 度 样 品 仪 器 波 长 室 温 蛋 白 质 浓 度 1 mg/ml Agilent 11 HPLC 仪 器 ( 老 式, bar) Agilent 16 Infinity 四 元 生 物 惰 性 系 统 (6 bar) Agilent 19 Infinity 二 元 液 相 色 谱 系 统, 配 有 G1315D DAD 和 生 物 惰 性 流 通 池 (1 bar) nm
选 择 合 适 的 色 谱 柱 内 径 运 行 内 径 不 同 的 色 谱 柱 时 需 调 节 流 速 ( 以 确 保 相 同 线 速 度 ) 和 进 样 量 7.8 mm 色 谱 柱 的 常 规 运 行 流 速 为 1. ml/, 因 此 使 用.6 mm 色 谱 柱 时 的 适 宜 流 速 应 为.35 ml/ 进 样 量 也 应 按 类 似 比 例 减 少 以 保 持 检 测 器 响 应 相 当, 因 此 7.8 mm 色 谱 柱 的 6 µl 进 样 量 应 在 改 用.6 mm 色 谱 柱 时 减 少 至 µl 由 于 仪 器 的 柱 外 体 积 不 同, 因 此 保 留 时 间 可 能 会 略 有 差 异 同 样, 在 运 行 流 速 为 1. ml/ 的 仪 器 上 观 察 到 的 反 压 也 会 稍 高 于 运 行 流 速 为.35 ml/ 的 相 同 仪 器 上 所 观 察 到 的 结 果, 这 一 现 象 在 采 用 低 死 体 积 毛 细 管 的 仪 器 中 尤 为 明 显 图 所 示 为 填 充 同 批 次 固 定 相 的 7.8 mm 和.6 mm 内 径 3 cm 色 谱 柱 在 相 同 的 Agilent 16 Infinity 四 元 生 物 惰 性 仪 器 上 的 测 试 结 果 该 分 析 结 果 能 够 清 晰 表 明 两 种 色 谱 柱 在 性 能 上 的 相 似 程 度.6 mm 色 谱 柱 可 采 用 更 低 进 样 量, 因 此 非 常 适 用 于 样 品 量 有 限 的 分 析, 且 更 适 合 低 死 体 积 的 现 代 仪 器 而 对 于 需 要 较 低 灵 敏 度 检 测 器 的 应 用, 包 括 光 散 射 检 测 1 15 1 1 5 1 15 1 1 5 A Agilent AdvanceBio SEC 3Å 7.8 3 mm 1. ml/ B Agilent AdvanceBio SEC 3Å.6 3 mm.35 ml/ 1 3 5 器 示 差 折 光 检 测 器 或 更 长 波 长 的 紫 外 检 测 器 ( 例 如 需 要 使 用 在 低 波 长 下 具 有 较 高 背 景 的 洗 脱 液 时 ),7.8 mm 色 谱 柱 则 能 够 满 足 大 进 样 量 需 求 6 7 1.. 3. γ-. γ- 5. 6. 7. 8. B1 6 8 1 1 1 6 8 1 1 1 8 图. 蛋 白 质 标 准 品 在 7.8 mm 和.6 mm 色 谱 柱 上 的 分 离 结 果 对 比 3
分 析 时 如 采 用 高 浓 度 缓 冲 液 成 分, 流 动 相 中 存 在 氯 离 子 时 则 存 在 发 生 沉 淀 或 腐 蚀 的 风 险 不 含 防 腐 剂 的 水 相 缓 冲 液 中 还 有 可 能 滋 生 细 菌 因 此 要 定 期 进 行 预 防 性 维 护 并 坚 持 冲 洗 仪 器 以 确 保 无 缓 冲 液 残 留, 这 两 点 非 常 重 要 新 鲜 配 置 的 溶 液 ( 经. µm 滤 膜 过 滤 ) 是 可 靠 运 行 的 先 决 条 件 7 6 5 3 1.16.16 8. 8 1.19 1 1 鉴 于 上 述 原 因, 首 选 分 析 仪 器 为 Agilent 16 Infinity 四 元 惰 性 系 统 确 保 持 续 可 靠 性 监 测 色 谱 柱 性 能 是 确 保 体 积 排 阻 色 谱 稳 定 性 的 重 要 环 节 磷 酸 盐 缓 冲 液 易 使 硅 胶 型 固 定 相 变 质 AdvanceBio SEC 色 谱 柱 具 有 专 利 亲 水 性 聚 合 物 层, 有 助 于 最 大 限 度 降 低 非 特 异 性 结 合 或 相 互 作 用 常 规 测 试 表 明 AdvanceBio SEC 色 谱 柱 即 便 在 浓 缩 磷 酸 钠 缓 冲 液 中 也 具 有 稳 定 的 使 用 寿 命 ( 图 3 和 ) 但 如 果 在 更 高 温 度 或 更 高 流 速 条 件 下 运 行, 则 有 可 能 缩 短 色 谱 柱 寿 命 % 1 图 3. Agilent AdvanceBio SEC 3Å 7.8 3 mm 色 谱 柱 寿 命 实 验 ( 运 行 1 天, 进 样 1 次 ) 1 95 9 85 8 7 65 6 8 1 1 1 16 1 % % % 8 6 6 8 1 1 3 15 1 5 % 图. 单 体 / 二 聚 体 峰 面 积 % 在 持 续 1 天 的 Agilent AdvanceBio SEC 3Å 7.8 3 mm 色 谱 柱 寿 命 试 验 期 间 发 生 的 细 微 变 化
确 保 仪 器 与 仪 器 之 间, 以 及 实 验 室 与 实 验 室 之 间 分 析 结 果 的 一 致 性 对 高 效 方 法 转 移 至 关 重 要 只 有 定 期 使 用 蛋 白 质 混 标 进 行 分 析, 才 能 够 确 定 是 否 需 要 对 色 谱 柱 之 外 的 其 他 因 素 进 行 优 化 图 5 表 明 分 析 结 果 在 正 常 运 行 且 性 能 相 当 的 仪 器 间 具 有 出 色 的 重 现 性 Agilent 13Å AdvanceBio SEC 蛋 白 质 标 准 品 含 5 种 精 选 蛋 白 质 ( 卵 清 蛋 白 肌 红 蛋 白 抑 肽 酶 神 经 降 压 素 血 管 紧 张 素 II) 的 蛋 白 质 混 合 物, 适 用 于 校 准 Agilent 13Å AdvanceBio 体 积 排 阻 色 谱 柱 该 标 准 品 可 用 于 常 规 色 谱 柱 校 准, 以 确 保 涉 及 蛋 白 质 纯 化 与 分 析 的 多 种 应 用 可 在 理 想 的 系 统 性 能 下 进 行 Agilent 3Å AdvanceBio SEC 蛋 白 质 标 准 品 含 5 种 精 选 蛋 白 质 ( 甲 状 腺 球 蛋 白 γ- 球 蛋 白 卵 清 蛋 白 肌 红 蛋 白 血 管 紧 张 素 II) 的 蛋 白 质 混 合 物, 适 用 于 校 准 Agilent 3Å AdvanceBio 体 积 排 阻 色 谱 柱 该 标 准 品 可 用 于 常 规 色 谱 柱 校 准, 以 确 保 涉 及 蛋 白 质 纯 化 与 分 析 的 多 种 应 用 可 在 理 想 的 系 统 性 能 下 进 行 1 15 1 8 1 1 5 3 5 6 8 1 1 1 1 15 1 1 5 A Agilent 11 HPLC B Agilent 16 Infinity 6 8 1 1 1 图 5. Agilent 11 系 列 HPLC 仪 器 和 Agilent 16 Infinity 四 元 生 物 惰 性 系 统 中 Agilent AdvanceBio SEC 3Å 7.8 3 mm 色 谱 柱 上 的 蛋 白 质 混 标 分 析 结 果 对 比 Agilent AdvanceBio SEC 蛋 白 质 标 准 品 6 7 描 述 规 格 部 件 号 13Å 1.5 ml 样 品 瓶 519-916 3Å 1.5 ml 样 品 瓶 519-917 5
根 据 等 度 分 离 基 质, 保 留 时 间 存 在 差 异 的 最 可 能 原 因 是 流 速 不 准 确 ( 可 能 由 于 泵 疏 于 维 护 或 常 规 磨 损 ) 或 柱 外 死 体 积 存 在 差 异 ( 毛 细 管 长 度 / 直 径 或 样 品 定 量 环 体 积 的 变 化 ) 在 向 其 他 供 应 商 的 液 相 色 谱 仪 器 进 行 方 法 转 移 时 这 个 问 题 尤 为 重 要 ( 图 6 和 7) AU.3...15.1.5 AU.5..3..1 A B 1 1 3 5 6 Agilent AdvanceBio SEC 3Å.6 15 mm Waters H-Class (.35 ml/) % 1.8 1. 3.3 87.8 Agilent AdvanceBio SEC 3Å 7.8 3 mm Waters Alliance (1. ml/) % 1 6.39 1.5 7.63 87.5 6 8 1 1 1 图 6. 采 用 不 同 规 格 色 谱 柱 和 不 同 仪 器 时 的 γ- 球 蛋 白 分 离 结 果 对 比 AU.7 3.6.5. 1.. 3. % = 86.6%. 5..3..1 5 1 6 8 1 1 1 图 7. γ- 球 蛋 白 在 Waters Alliance HPLC 系 统 中 的 四 次 重 复 进 样 分 析 结 果 6
温 度 控 制 测 定 方 法 稳 定 性 时 分 离 温 度 是 一 个 常 被 忽 略 的 因 素 分 离 操 作 通 常 在 室 温 下 进 行, 但 具 体 环 境 下 的 常 温 可 能 取 决 于 时 间 和 季 节 变 化, 并 会 受 到 制 热 或 制 冷 设 备 的 影 响 进 行 水 相 分 离 时, 反 压 将 随 温 度 发 生 明 显 变 化, 某 些 蛋 白 质 也 会 受 到 影 响 温 度 上 升 虽 有 可 能 带 来 分 离 度 的 改 善, 但 同 时 也 有 可 能 改 变 聚 集 水 平 ( 图 8 和 9) 因 此, 强 烈 建 议 在 分 离 时 将 色 谱 柱 放 置 在 恒 温 柱 温 箱 中 并 将 样 品 同 样 置 于 恒 温 环 境 中 结 论 为 使 所 有 仪 器 均 实 现 最 佳 SEC 性 能, 安 捷 伦 开 发 出 了 Agilent AdvanceBio SEC 色 谱 柱 本 技 术 概 述 重 点 介 绍 了 不 受 地 点 与 操 作 者 限 制, 在 老 式 bar 仪 器 乃 至 可 进 行 UHPLC 分 析 的 现 代 仪 器 上 获 得 相 当 结 果 所 要 注 意 的 几 方 面 问 题 1 15 1 1 5..5 5. 5.5 6. 6.5 7. 7.5 8. 8.5 图 8. 分 析 温 度 对 γ- 球 蛋 白 的 影 响 % 85 83 81 79 77 73 71 69 67 65 图 9. 分 析 温 度 对 γ- 球 蛋 白 单 体 / 二 聚 体 / 聚 集 体 含 量 的 影 响 15 C 167.5 bar Rs 1.8 % = 7.8% C 1.6 bar Rs 1.8 % = 73.9% % % % 15 C C C 3 C 35 C C 5 C 5 C 55 C 18 16 1 1 1 8 6 % 7
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