中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,203,33(5):62 67 抗肠炎沙门氏菌单链抗体制备及其特异性分析 王报贵 2 武晓丽 董素琴 甘 敏 陈星星 陈 飞 明 星 徐 锋 ( 南昌大学生命科学与食品工程学院中德联合研究院南昌 330047 2 江西中医学院基础医学部南昌 330004) 摘要目的 : 利用基因工程技术制备抗肠炎沙门氏菌的单链抗体 方法 : 从抗肠炎沙门氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞中纯化 RNA, 反转录后扩增出抗体的重链可变区 (VH) 和轻链可变区 (VL) 基因片段, 采用重叠延伸的方法, 用柔性多肽 Linker 接头 (Gly 4 Ser) 3 按 VL Linker VH 方式将 VH 基因和 VL 基因拼接成单链抗体基因片段后, 连接到 pgex 4T 载体上, 进行重组转化 挑取阳性克隆, 经 IPTG 诱导后, 通过 GST 柱进行亲和层析, 最后利用 ELISA 检测抗体的活性 结果 : 成功构建了表达抗肠炎沙门氏菌单链抗体的基因工程菌株, 经 SDS PAGE 和 ELISA 检测结果表明, 诱导表达的单链抗体 scfv 分子量约为 60kDa, 其能特异与肠炎沙门氏菌结合, 但与副甲伤寒沙门氏菌 鸭沙门氏菌 鼠伤寒沙门氏菌有轻度交叉反应 结论 : 成功构建了抗肠炎沙门氏菌单链抗体的表达菌株, 表达的单链抗体 scfv 可作为沙门氏菌的检测的候选抗体分子 关键词沙门氏菌单链抗体重链可变区轻链可变区中图分类号 Q5 沙门氏菌是一种重要的食源性致病菌, 广泛分布于自然界, 至今已有 2523 种血清型被发现 [], 可引起人类伤寒 副伤寒和食物中毒等许多疾病, 直接影响工农业和畜牧业发展, 使全球遭受巨大的经济损失 国内外沙门氏菌食物中毒多年来一直位居细菌性食物中毒的首位 [2] 在中国细菌性食物中毒中,70% ~80% 是由沙门氏菌引起的 [3] 因此, 中国疾病预防控制中心将沙门氏菌作为食品中要求控制的两项细菌指标之一 [4],2000 年 WHO 食品安全工作计划也把它列为重点检测的食源性致病菌之一 针对沙门氏菌的检测, 免疫学方法一直是必不可少的, 尤其是在快速简便的方面,ELISA 免疫磁珠 免疫层析试纸条等技术已经成为目前的主流方向 传统的培养和生理生化检测, 费时费力, 不利于在沙门氏菌暴发时, 进行准确 快速地朔源和和控制 [5], 已经在很收稿日期 :202 2 修回日期 :203 0 24 十二五 国家科技支撑计划 (20BAK0B06 20BAK0B0 20BAK0B02), 国家自然科学基金 (3000048 37009 3260363 860494), 食品科学与技术国家重点实验室目标导向课题 (SKLF MB 20002), 自由探索课题 (SKLF TS 20096), 赣鄱英才 555 工程人才计划 (202 年 ) 资助项目 通讯作者, 电子信箱 :ziwu2@26.com 多领域逐渐被免疫学的技术方法所替代, 但这必须建立在高效的抗体基础上 当前有关沙门氏菌抗体的文献报道和商品, 主要是多克隆抗体和单克隆抗体 多克隆抗体由于被免疫动物受到外界环境污染等原因, 通常都有较多的交叉反应, 用多克隆抗体做免疫检测时, 容易造成背景, 例如在 Westenblot 中有杂带, 在 IHC 中背景染色较深等 另外由于多克隆抗体的识别表位是未知的, 制备的不同批次之间差异较大, 所以每次都需要实验优化 单克隆抗体的特异性好, 可因为杂交瘤细胞的不稳定性及对培养环境要求较高使得单克隆抗体制备的风险性及成本较高 单链抗体 (single chainvariablefragment,scfv) 是把抗体分子的 V 区部分重组表达而成的一种小分子抗体, 具有与天然抗体分子相似的抗原亲和力及特异性, 但生产方法比单克隆 [6 7] 抗体简单 自 988 年,Huston 和 Bird 等首次获得单链抗体后, 随着研究的不断深入,ScFv 已在生物学 医学研究及疾病的诊断 治疗 预防方面取得了极大的进步 抗体的轻 重链 V 区基因扩增出来, 通过铰链偶联, 再插入到适当的表达载体中, 就可通过细菌 酵母菌或丝状真菌等进行大规模发酵生产 [8] 因为只有抗体的 V 区, 比原先的单抗免疫原性小得多, 不容易引起
203,33(5) 王报贵等 : 抗肠炎沙门氏菌单链抗体制备及其特异性分析 63 宿主的排异反应, 而且穿透力强 体内半衰期短 [9] 目前关于沙门氏菌单链抗体方面研究较少, 在国内尚未发现有相关的报道 研究采用分子克隆技术, 利用 pgex 4T 载体成功构建了抗肠炎沙门氏菌单链抗体的表达菌 材料与方法. 细胞 试剂及菌株 抗肠炎沙门氏菌的杂交瘤细胞 (G4 F5) 克隆载体 pgex 4T 甲型副伤寒沙门氏菌 (ATCC950) 鼠伤寒沙门氏菌 (ATCC33) 猪霍乱沙门氏菌 (ATCC0708) 肠炎沙门氏菌 (ATCC3076) 鸭沙门氏菌 (ATCC9270) 大肠杆菌 O57 H7(PELI0480) 单核增生李斯特 (CMCC5400) 副溶血性弧菌 (PVPA 046), 均为本实验室保存 RMPI 640 培养基购自 Thermo 公司, 胎牛血清购自 Invitrogen 公司,TRNzol 试剂 cdna 反转录试剂盒 羊抗鼠 Ig HRP 均购自天根公司, 限制性内切酶 EcoR Ⅰ NotⅠ 购于 TaKaRa 公司, 抗 GST 标签单抗购自上海闪晶分子生物科技有限公司.2 主要仪器 二氧化碳培养箱, 低速离心机 ( 湘仪离心机 ), 倒置光学显微镜购自 Thermo 公司 ;DNM 9026 全自动酶标仪购自北京普朗新技术有限公司 ; 凝胶成像分析系统, 电泳仪购自美国 Bio RAD 公司产品.3 杂交瘤细胞的培养 RNA 提取及 cdna 的合成 从液氮罐中取出抗肠炎沙门氏菌杂交瘤细胞的冻干管, 迅速投放到已经预热的 40 的水浴锅中, 并不断地搅拌, 使其在 ~2min 内完全溶解, 迅速加入含有 0% 的胎牛血清及双抗 ( 青霉素 链霉素 ) 的 RMPI 640 培养基于 37 5% CO 2 的培养箱中进行细胞复苏 细胞复苏 2d 后将其接种到 6 孔板中继续培养, 长到满孔时轻轻吸尽培养基, 按照 TRNzol 试剂盒说明书指导, 进行细胞总的 RNA 的提取后用 % 的琼脂糖凝胶电泳检测 提取成功的 RNA 按照 cdna 反转录试剂盒的说明书进行一链的合成.4 VH 和 VL 的克隆及序列的测定 [9] 参照沈倍奋等进行 VH 和 VL 引物的合成 连接载体用的引物为 ( F:GAATTCGCCATGGCGGA CTACAAAG; R: GGCGGCCGCGGCCCCCGAG) 以 cdna 为模版分别用 LB LF 及 HB HF 为引物进行轻链及重链基因的克隆 PCR 反应体系 : 上下游引物各 μl,pfumix30μl,ddh 2 O26μl,cDNA3μl 扩增反应程序为 :95 预变性 5min;95 变性 30s 45 退火 30s 72 延伸 min, 共进行 30 个循环 ;72 延伸 0min 扩增后的 PCR 产物用 % 的琼脂糖凝胶电泳检测 切胶回收得到的轻 重链进行重叠延伸 反应体系 :pfu mix5μl, 轻链 7.5μl, 重链 7.5μl 扩增反应程序为: 95 预变性 5min;95 性 30s 63 退火 30s 58 延伸 min, 共进行 7 个循环 ;72 延伸 min 92 min 63 30s 72 min 23 个循环 在无引物条件下起始装配 VH 和 VL 用限制性内切酶进行消化后, 连接到 pgex 4T 载体上, 并转化到大肠杆菌 挑选菌落进行 PCR, 获得阳性克隆子, 进行 DNA 测序 轻链及重链序列的测定由上海英俊生物技术有限公司完成, 使用 DNAMAN BLAST 完成序列的比对.5 ScFv 的表达及 SDS PAGE 分析 挑选阳性克隆子接种到 5mlLB( 含 Amp) 液体培养基中,37,80r/min 培养 0h, 按 % 的接菌量接种到 50ml 的 LB( 含 Amp) 液体培养基中, 培养 2.5h 后 (OD =0.4~0.6), 加入 IPTG( 终浓度为 0.2mmol/L) 继续培养 3h 诱导后的培养液进行离心 (8000r/min,5 min) 后用 5ml 的 PBS(PH=7.4) 溶解后, 冰浴超声 (200 W, 工作 3s, 间隙 5s) 破碎 30 次至菌悬液澄清透明 [0] 离心后取上清, 参照刘怀田方法, 利用 GST 蛋白纯化柱纯化后进行 2% SDS PAGE 分析, 检测目的蛋白.6 ScFv 与抗原 ( 沙门氏菌 ) 反应测定 沙门氏菌新鲜菌液用终浓度 % 的福尔马林灭活 24 后, 用无菌的 PBS 洗涤 3 次, 离心收集菌体既为所制备的抗原 在 96 空酶标板中, 抗原 (mg/ml) 按 00μl/ 孔的量,37 包被抗原 2h, 用 PBS 洗涤 3 次后, 按照 300μl/ 孔加入 3% BSA(w/v)37 封闭 h 后, 用 PBST ( 含 0.05% 的 Tween 20) 洗涤 3 次, 将纯化得到的单链抗体溶液 ( 不同浓度 :2,,0.5,0.25,0.25μg/ml) 按照 00μl/ 孔的量,37 孵育 h,pbst 洗涤 3 次, 加入 00μl 5000 稀释的抗 GST HRP 抗体,37 孵育 h,pbst 洗涤 3 次, 按照 00μl/ 孔的量加入新鲜配制的显色液,37 避光孵育 5min 后加入 50μl 的 0% 的 H 2 SO 4 终止反应, 于 450nm 的波长下测吸光值 以转化空质粒的菌株超声波破碎后上清夜作为阴性对照 按照上述方法制备分别制备 4 株沙门氏菌 大肠杆菌 O57 H7 单核增生李斯特的抗原 在 96 空酶标板中, 抗原 (mg/ml) 按 00μl/ 孔的量,37 包被抗原 2h, 用 PBS 洗涤 3 次后, 按照 300μl/ 孔加入 3% BSA
64 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.5203 (w/v)37 封闭 h 后, 用 PBST 洗涤 3 次, 将纯化得到的单链抗体溶液 (μg/ml) 按照 00μl/ 孔的量,37 孵育 h,pbst 洗涤 3 次, 加入 00μl 5000 稀释的抗 GST HRP 抗体,37 孵育 h,pbst 洗涤 3 次, 按照 00μl/ 孔的量加入新鲜配制的显色液,37 避光孵育 5min 后加入 50μl 的 0% 的 H 2 SO 4 终止反应, 于 450 nm 的波长下测吸光值 每株菌做三个平行.7 ScFv 与单克隆抗体竞争 ELISA 反应在 96 孔酶标板中, 免疫原 ( 肠炎沙门氏菌 ) 按 ( mg/ml)00μl/ 孔的量,37 包被抗原 2h,PBS 洗涤 3 次后, 按照 300μl/ 孔加入 3% BSA(w/v)37 封闭 h 后用 PBST( 含 0.05% 的 Tween 20) 洗涤 3 次, 每孔加入 00μl( 8000) 的抗肠炎沙门氏菌单克隆抗体, 然后在每孔中加入加入不同稀释度 ( 5ug) 的 ScFv, 以不加 ScFv 作为阴性对照,37 孵育 h 后用 PBST 洗涤 3 次后, 加入抗 GST 的酶标单抗,37 孵育 30min 后用 PBST 洗涤 3 次, 按照 00μl/ 孔的量加入新鲜配制的显色液, 37 避光孵育 5min 后加入 50μl 的 0% 的 H 2 SO 4 终止反应, 于 450nm 的波长下测格孔的吸光度值 检测 ScFv 抗体对单克隆抗体的抑制率, 抑制率 =[OD 450nm ( 阴性对照 )-OD 450nm ( 不同浓度的 ScFv)]/ 阴性对照 2 结果 图 2 VH 和 VL 基因的扩增 Fig.2 TheamplificationoftheVH andvlgenes M:DNAmarkerDL2000;:VLgene;2:VHgene 2.2 可变区基因的多样性分析 (DNA 测序分析 ) 把 VH 和 VL 分别与 pgex 4T 载体连接后, 挑出菌落 PCR 检测阳性的各 5 株克隆, 测定 VH 和 VL 的序列如图 3 所示,VL 片段经 BLAST 的序列分析后鉴定为 κ 链 2.3 ScFv 的表达及融合蛋白的纯化分析扩增的 VH 和 VL 基因片段, 采用重叠延伸将 VH 和 VL 与柔性多肽 Linker 接头 (Gly 4 Ser) 3 拼接起来, 经限制性内切酶 EcoRⅠ NotⅠ 酶切后, 与同样处理的 pgex 4T 连接并转化大肠杆菌 JM09, 筛选到的阳性克隆, 经 IPTG 诱导, 融合表达产物经 GST 蛋白纯化柱纯化后, 图 4 结果表明只有一条约为 60kDa 的条带, 说明 ScFv 被成功纯化, 将用于后面的实验 2. 杂交瘤细胞 RNA 的提取及轻链与重链部分序列的克隆从抗肠炎沙门氏菌杂交瘤细胞提取总 RNA 如图 所示, 表明提取的 RNA 无降解 经过反转录及重链与轻链可变区混合引物的扩增后, 从图 2 中可以看出分别扩增出 386~440bp 和 375~402bp 的片段 图 抗肠炎沙门氏菌杂交瘤细胞 RNA 提取 Fig. RNAextractionofAnti Salmonela enteritidishybridoma M:DNAmarkerDL2000;:RNAextractionof Anti Salmonelaenteritidishybridoma 图 3 抗肠炎沙门氏菌轻链 重链可变区的核酸序列及翻译后的氨基酸序列 Fig.3 AminoacidsequenceofAnti Salmonela enteritidislightchainandtheheavychainvariable regionwerededucedfrom nucleotidesequence
203,33(5) 王报贵等 : 抗肠炎沙门氏菌单链抗体制备及其特异性分析 65 图 4 融合蛋白 scfv 的 SDS PAGE 检测结果 Fig.4 SDS PAGEanalysisofscFv M:molecularweightmakers;:PurifiedScFv 2.4 ScFv 与抗原结合的测定通过 ELISA 方法检测 ScFv 与肠炎沙门氏菌之间的识别能力, 如图 5a 所示, 随着 ScFv 抗体浓度的增加其 OD 值也逐渐增大, 对照组呈现阴性反应, 说明 ScFv 与肠炎沙门氏菌能发生特异性结合, 且结合能力 ScFv 浓度呈正相关 检测与其他四种沙门氏菌和属外的常见食源性治病菌的结合反应时发现, 此 ScFv 还能与甲型副伤寒沙门氏菌 鼠沙门氏菌结合, 但弱于肠炎沙门氏菌, 不与猪霍乱沙门氏菌和属外的其他菌结合, 结果如图 5b 所示 图 5 ScFv 的 ELISA 反应结果 Fig.5 TheELISAreactionresultsofScFv 2.5 竞争 ELISA 的测定为了检测单克隆抗体与 ScFv 抗体与抗原之间的竞争性结合, 采用竞争 ELISA 来检测不同浓度的 ScFv 抗体对单链抗体的竞争性结合, 从图 6 可以看出随着 ScFv 抗体浓度的增大其抑制率也越大 说明 ScFv 抗体能特异性结合肠炎沙门氏菌 图 6 竞争 ELISA 的测定 Fig.6 DeterminationofScFvbycompetitiveELISA 3 讨论 单抗的制备通常采用的是小鼠腹腔接种法, 将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去, 再一周后腹水, 或者将杂交瘤细胞在体外培养, 在培养液中分离单抗 无论哪种方法, 都比较费时费力, 而且产量有限, 成本较高 单链抗体的制备由传统的细胞表达转变为细菌发酵, 易于大量生产, 并可用基因工程方法构建与其他效应分子连接的多功能抗体 [], 大大提高了生产效率, 丰富了产品的种类 [2] 实验中采用的是 GST 融合表达抗沙门氏菌单链抗体, 这样不仅提供了纯化和检测的标签, 而且促进了单 [3] 链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达量 石凌超等表达的单链抗体基本是以包涵体的形式存在, 需要用尿素等进行变性和复性, 这样不仅造成产量减少, 对生物活性也有一定的影响 我们使用融合表达, 借助 GST 良好的可溶性表达特性, 使单链抗体的很大一部分处
66 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.5203 于水溶性上清中 如果进一步优化发酵条件, 或连接上信号肽, 可进一步增大产量 单链抗体有一个缺点是分子量小, 引发稳定性不够, 体内清除过快等缺点, 有时达不到治疗或诊断所需要的时间, 限制了其广泛应用 GST 分子量约 30kDa, 单链抗体融合 GST, 保留了亲本单抗的与沙门氏菌特异性结合的活性, 还可改进单链抗体不稳定的缺陷, 具有较好的应用价值 尽管单链抗体保持了完整的抗原结合位点, 但目前国内外报道的单链抗体的亲和力普遍低于亲本单抗, 本实验的单链抗体也存在类似的现象, 这可能与双链抗体的空间构象 二硫键结构等有关 但完整的免疫球蛋白一般具有较强的免疫原性, 能诱导较强的排异反应, 而单链抗体具有组织穿透力强 免疫原性低等优点, 是医药治疗等的重要工具 亲和力低的缺点可通过引入二硫键模拟天然状态来稳定其结构, 使 VH 和 VL 形成稳定的异聚体双链抗体, 也可以通过点突变或链更替的方法, 改进抗体的亲和力, 另外通过构建多价抗体来增加亲和性也是很有效的方法 本研究成功构建的抗肠炎沙门氏菌单链抗体的表达菌株, 表达的单链抗体 scfv 证明具有良好的特异性, 其可作为沙门氏菌的检测的候选抗体分子 融合表达抗沙门氏菌单链抗体的工程菌株, 为大规模制备检测沙门氏菌的特异性抗体制剂提供可能 参考文献 [] 杨保伟, 张秀丽, 曲东, 等.2007 2008 陕西部分零售畜禽肉沙门氏菌血清型和基因型. 微生物学报,200,(5):654 660. YangBW,ZhangX L,QuD,etal.Salmonelaserotypesand genotypesofretailpoultrymeatfromshanxiprovincein2007 2008. JournalofMicrobiology,200,(5):654 660. [2] 朱超, 许学斌. 沙门菌属血清型诊断. 上海 : 同济大学出版社, 2009,2 40. ZhuCh,XuX W.SalmonelaSerotypesDiagnosis.Shanghai: TongjiUniversityPres,2009,2 40. [3] 赵贵, 张华. 畜产品中沙门氏菌的危害及检测方法概述. 贵州畜牧兽医,2004,28(3):2 22. ZhaoG,ZhangH.OverviewofhazardsanddetectionofSalmonela inanimalproducts.animalhusbandryandveterinary,2004,28 (3):2 22. [4] 何晓青. 沙门氏菌检验技术进展. 中国公共卫生,2003,9 (0):260 262. HeXQ.AsayTechnicalProgresofSalmonela.ChineseJournal ofpublichealth,2003,9(0):260 262. [5] 黄金海, 孙跃辉, 陈瑞, 等. 食品中沙门氏菌 LAMP 快速检测方法的建立. 天津大学学报.202,45(5):468 472. HuangJH,SunYH,ChenR,etal.LAMPmethodforrapid detectionsalmonelainfood.learnedjournaloftianjinuniversity. 202,45(5):468 472. [6] HustonJS,LevinsonD,Mudget HunterM,etal.Protein engineeringofantibodybindingsites:recoveryofspecificactivityin ananti digoxinsingle chainfvanalogueproducedinescherichia coli.proceedingsofthenationalacademyofsciences,988,85 (6):5879 5883. [7]BirdR E,HardmanK D,JacobsonJW,etal.Single chain antigen bindingproteins.science(newyork,ny),988,242 (4877):423. [8] Joosten V, Lokman C, Van Den HondelC A, etal. The productionofantibodyfragmentsandantibodyfusionproteinsby yeastsandfilamentousfungi.microbialcelfactories,2003,2 ():. [9] 沈倍奋, 陈志南, 刘民培. 重组抗体. 北京 : 科学出版社,2005. 8 7,27 245. Chen B F, Chen ZH N, Liu M P. RecombinantAntibody. Beijing:SciencePres,2005.8 7,27 245. [0] 刘怀田, 黄策. 重组人宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型抗体重链可变区基因的高效表达及纯化. 中华微生物学和免疫学杂志,997,7(6):453 456. LiuHT,HuangC.Expresionandpurificationofanti idiotype antibodyheavy chain variable region gene from recombinant humanshigela sonneilipopolysaccharide. ChineseJournalof MicrobiologyandImmunology,997,7(6):453 456. [] Ward E S, Ggusow D, GgrifthsA D,etal. Bindingof arepertoireofsingleimmunoglbulinvariabledomainssecretedform schcerzchzacolz.natmre,989,34():544 546. [2] 秦丽莉, 张春明. 单链抗体研究进展及其在医学中的应用. 国外医学 : 放射医学核医学分册,2006,29(6):255 257. QinLL,ZhangCH M,ProgresinResearchonSingle chain Antibody and Its Medical Applications. Foreign Medical: RadiationMedicineandNuclearMedicine,2006,29(6):255 257. [3] 石凌超, 韩红辉, 唐? 伟, 等. 抗苏丹红单链 Fab 抗体的构建, 表达及功能鉴定. 现代免疫学,2009,(004):274 278. ShiLCh,HanHH,TangJW,etal.Anti-Sudansinglechain antibodyfabconstruction,expresionandidentification.modern Immunology,2009,(004):274 278.
203,33(5) 王报贵等 : 抗肠炎沙门氏菌单链抗体制备及其特异性分析 67 PreparationandSpecificityAnalysisofscFvAganinstSalmonelaenteritidis WANGBao gui WUXiao li 2 DONGSu qin GANMin CHENXing xing CHENFei MINGXing XUFeng (Jiangxi OAIJointResearchInstitute,NanchangUniversity,Nanchang 330047,China) (2JiangxiUniversityofTCM InternationalEducationColege,Nanchang 330004,China) Abstract Objective:ToobtainthespecificscFvagainstSalmonelaenteritidisusinggeneticengineering technology.methods:vh andvlgeneswereamplifiedbyreversetranscription(rt)pcr from hybridoma celssecretinganti Salmonelaenteritidismonoclonalantibody,scFvgene(VL Linker VH)wasobtainedby SpliceOverlapExtension(SOE)PCRwithflexiblepolypeptideLinkerconnector(Gly 4 Ser) 3.Subsequentlythe scfv pgex 4T recombinantplasmidwasconstructedandtransformedintoe.colibl2forexpresionusing IPTGasaninducer.TheexpresedrecombinantproteinwaspurifiedbyGSTchromatographyandidentifiedby SDS PAGEandELISA.Results:DNAsequencingdemonstratedthatscFvwassuccesfulyinsertedintopGEX 4T.SDS PAGEdemonstratedthatthemolecularweightoftheexpresedscFvwasabout60kDa,andELISA resultsconfirmedthattheobtainedscfvcanberecognizedbynotonlysalmonelaenteritidisbutalsos.enterica subspenterzca,s.anatumands.typhimurium.conclusion:specificscfvagainsts.enteritidiswasobtainedand canbeusedascandidateantibodymoleculesindetectionofsalmonela. Keywords Salmonelaenteritidis Single chainantibody(scfv) Variableregionofheavychain(VH) Variableregionoflightchain(VL) 广告索引 Abcam( 香港 ) 有限公司 ( 封面 ), 伯乐生命医学产品 ( 上海 ) 有限公司 ( 封面拉页 ), 通用电气医疗系统贸易发展 ( 上海 ) 有限公司 ( 封二 ), 英潍捷基 ( 上海 ) 贸易有限公司 ( 彩 ), 梅特勒 托利多国际贸易 ( 上海 ) 有限公司 ( 彩 2), 上海森松制药设备工程有限公司 ( 彩 3), 江苏省科海生物工程设备有限公司 ( 彩 4), 默克化工技术 ( 上海 ) 有限公司 ( 彩 5), 宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ( 彩 6), 必蔼贸易 ( 上海 ) 有限公司 ( 彩 7), 镇江东方生物工程设备技术有限责任公司 ( 彩 8 9), 利穗科技 ( 苏州 ) 有限公司 ( 彩 0), 上海派森诺生物科技有限公司 ( 彩 ), 第十三届世界制药原料中国展 ( 彩 2), 广州市生通生物科技有限公司 ( 彩 3),ATS 工业系统有限公司 ( 目次对页 ), 沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 ( 中插 ), 上海国强生化装备工程有限公司 ( 中插 2 3),Abcam( 香港 ) 有限公司 ( 中插 4 5), 上海派森诺生物科技有限公司 ( 中插 6), 路易企业有限公司 ( 中插 7), 艾本德 ( 上海 ) 国际贸易有限公司 ( 中插 8), 第 7 届中国生物产业大会 ( 后插 ),203 中国生物制品年会暨第十三次全国生物制品学术研讨会 ( 后插 2), 安琪酵母股份有限公司 ( 封三 ), 纽英伦生物技术 ( 北京 ) 有限公司 ( 封底 )