第 16 卷第 6 期 生命科学研究 灾燥造援员 6 晕燥援 6 圆园 12 年 12 月 蕴蚤枣藻杂糟蚤藻灶糟藻砸藻泽藻葬则糟澡 Dec. 圆园 12 两株以亚硝态氮为氮源的异养硝化细菌的分离及鉴定 陈薇, 刘清术, 许丽娟, 陈莉, 王震, 贺月林 * ( 湖南省微生物研究所, 中国湖南长沙 419) 摘 要院通过富集尧分离和纯化等步骤, 从活性污泥中分离筛选了两株能以亚硝酸盐为唯一氮源生长的异养硝 化细菌 53 和 N419. 通过对其形态尧生理生化尧 16 SrDNA 基因序列尧 (G+C) mol% 含量的测定及 DNA 鄄 DNA 杂交 分析, 初步鉴定 53 为施氏假单胞菌 (Pseudomonas stutzeri), N419 为芽孢杆菌属的一种 (Bacillus sp.). 并验证了这 两株菌的硝化能力, 结果表明, 当液体培养及初始亚硝态氮浓度为 2.3 g/l 左右时, 经振荡培养 27 h, 菌株 53 和 N419 对亚硝态氮的去除率分别达到 87.9% 和 9.8%, 总氮的去除率为 54.7% 和 63.5%. 关键词 : 亚硝酸盐 ; 异养硝化细菌 ; 分离鉴定 ;16 SrDNA 序列 ;DNA 鄄 DNA 杂交 中图分类号 : Q936 文献标识码 : A 文章编号 : 17 鄄 7847(212)6 鄄 489 鄄 7 Isolation and Identification of Two Stains of Heterotrophic Nitrifier Which Using Nitrite as Nitrogen Source CHEN Wei, LIU Qing 鄄 shu, XU Li 鄄 juan, CHEN Li, WANG Zhen, HE Yue 鄄 lin * (Hunan Institute of Microbiology, Changsha 419, Hunan, China) Abstract:Two strains of heterotrophic nitrifiers designated as 53 and N419, capable of utilizing nitrite as sole nitrogen source were isolated from the activated sludge through the procedure of enriching, separating and purifying. Based on their morphological and biochemical characters, 16 SrDNA sequence, (G+C) mol% and DNA 鄄 DNA hybridization, strain 53 and N419 were identified as Pseudomonas stutzeri and Bacillus sp., respectively. Results showed that when the initial nitrite 鄄 nitrogen concentration was 2.3 g/l, the nitritenitro 鄄 gen removal rates of 53 and N419 within 27 hwere 87.9% and 9.8% respectively, and the removal rates of total nitrogen were 54.7% and 63.5% respectively. Key words: nitrite; heterotrophic nitrifier; isolation and identification; 16 SrDNA sequence; DNA 鄄 DNA hy 鄄 bridization (Life Science Research,212,16(6):489 耀 495) 亚硝酸盐是氨转化为硝酸盐过程中的中间产物, 近年来对亚硝酸盐中毒的病理学研究较多. 水体中亚硝酸盐超过一定浓度会导致鱼类缺氧 [1 耀 4] 甚至窒息死亡. 据长期在各地养殖塘的监测, 发现有 5% 以上的养殖鱼塘会出现亚硝酸盐含量超标, 国外也有报道亚硝酸盐积累是常见的水质败坏现象. 目前, 水中亚硝酸盐含量超标已成为鱼虾养殖水质调控最棘手的问题之一. 亚硝酸盐的去除途径主要有两个, 一是在亚硝酸盐氧化菌的作用下将亚硝酸盐氧化成硝酸盐, 二是经反硝化细菌的作用, 转变成氮气进入 [5] 大气. 亚硝酸盐氧化菌主要有硝化杆菌属 (Nitrobac 鄄 ter sp.) 硝化螺菌属(Nitrospira sp.) 和硝化球菌属 [6 耀 8] (Nitrococcus sp.) 等类群, 这类细菌大多数是无机化能自养菌, 它们具有世代时间长 生物量小 [9] 等特点. 自 19 世纪末和 2 世纪初, 异养硝化现 收稿日期 : 212 鄄 9 鄄 1; 修回日期 : 212 鄄 11 鄄 15 基金项目 : 湖南省农业科技项目 ( 湘农业计 [29]76 号 ); 湖南省生猪产业技术体系生猪产业规模养殖与环境控制岗位项目作者简介 : 陈薇 (198 鄄 ), 女, 湖南宁远人, 湖南省微生物研究所助理研究员, 主要从事环境微生物学研究 ; * 通讯作者 : 贺月林 (1963 鄄 ), 男, 湖南益阳人, 湖南省微生物研究所教授级工程师, 主要从事环境微生物学研究,E 鄄 mail: txj921@163.com.
49 生命科学研究圆园 12 年 [1] 象被首次发现以来, 有关异养硝化的重要性逐 [11 耀 15] 渐受到关注, 而且研究者发现异养硝化细菌 [16] 同时具有好氧反硝化功能. 国内对于异养硝化的研究起步较晚, 相关的研究报道主要集中在处 [17 耀 2] 理氨氮的菌种分离及硝化性能研究, 但针对养殖废水中亚硝酸盐处理的异养硝化细菌几乎未见报道. 本研究以对虾养殖水塘的污泥为主要分离源, 通过富集 分离和纯化等步骤, 分离到两株高效亚硝酸盐去除能力的异养硝化细菌, 命名为菌株 53 和 N419. 根据其形态 生理生化特性和 16 S rdna 基因序列探讨了两株菌株的分类学地位, 旨在为养殖水体亚硝态氮处理的实际应用提供有效菌源. 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 样品来源样品来源于湖南省长沙市某小龙虾养殖基地, 采集点为塘边 3cm 潮湿污泥. 1.1.2 培养基富集培养基 : 葡萄糖 5g, NaCl 1g, NaNO 2 1~ 2 g, MgSO 4.2 g, KH 2 PO 4 4g, K 2 HPO 4 6g, 蒸馏水定容至 1L, ph 7.2; 亚硝酸盐去除测定培养基 : 葡萄糖 1g, NaNO 2 1 g, MgSO 4.2 g, 柠檬酸钠.1 g, K 2 HPO 4.1 g, 蒸馏水定容至 1L, ph 7.2~7.5; LB 培养基 : 牛肉膏 3g, 蛋白胨 1 g, NaCl 5g, 蒸馏水定容至 1L( 固体加 2.% 的琼脂 ), ph 7.2. 1.1.3 试验菌株 Escherichia coli K12, 为本实验室保存 ; Pseu 鄄 domonas stutzer ACCC2243 Bacillus cereus AC 鄄 CC1119 Bacillus subtilis ACCC1619 均购于中国农业微生物菌种保藏管理中心. 1.2 异养硝化细菌的分离尧纯化及筛选 1.2.1 菌株的富集和驯化将 1 ml 活性污泥接种于 9 ml 富集培养基中, 在 3 益 18 r/min 的条件下恒温震荡培育, 同时每日用格利斯试剂跟踪检测亚硝酸盐的降解情况. 当滴加格利斯试剂不显红色时, 取上清液 5mL 加至 1 ml 新鲜富集培养基中相同条件培养, 如此反复 5 次. 每次逐渐提高培养液中 NaNO 2 的浓度, 其中 NaNO 2 初始浓度为 1g/L, 然后提高至 5 1 15 g/l, 最终浓度为 2 g/l. 1.2.2 菌株的筛选与纯化富集驯化完成后, 利用梯度稀释法分离单个菌株. 挑取分离菌株的单个菌落用生理盐水制成终浓度为 1. 伊 1 9 cfu/ml 的菌悬液, 以 3% 接种量接种于 1 ml 亚硝酸盐去除测定培养基中, 同时以空白亚硝酸盐去除测定培养基作为对照, 于 3 益 18 r/min 摇床震荡培养 48 h. 菌液在离心机中 (5 r/min) 离心 3min 除菌体后测定亚硝酸盐的含量. 将富集培养物通过多次平板涂布分离, 获得两株亚硝酸盐降解效果较好的菌株, 接种于 LB 斜面上, 分别编号为 53 和 N419, 4 益冰箱中保存. 1.3 菌株生长曲线和亚硝酸降解趋势从 LB 斜面挑取一接种环的菌苔, 用生理盐水制成终浓度为 1. 伊 1 9 cfu/ml 的菌悬液, 以 3% 接种量接种于 1 ml 亚硝酸盐去除测定培养基中, 于 3 益 18 r/min 恒温摇床震荡培养 48 h. 培养期间每隔 3h 取液态样品测定菌体生长吸光原度 (OD 6 ), 并同时测定菌体生长过程中 NO 2 N 原 NO 3 N 和 TN 的变化, 确定菌株的硝化能力. 1.4 分析方法原原 NO 2 N: 盐酸萘乙二胺分光光度法 ;NO 3 N: 麝香草酚分光光度法 ; 总氮 : 过硫酸钾氧化紫外分光光度法 ; 菌体生长量 : 光电比浊计数法, 即用分光光度计测定微生物悬浮液 OD 6 值. 所有样品测定 3 次, 取平均值. 1.5 异养硝化细菌的鉴定 1.5.1 菌株的形态观察及生理生化鉴定降解菌采用平板涂布法接种,3 益培养. 待长出菌落后, 观察菌落的颜色 形状 大小等特征. 同时将分离菌株进行革兰氏染色, 并进行扫描电镜观察. 生理生化鉴定方法参见 常见细菌系统鉴定手册 [21]. 1.5.2 分子鉴定用试剂盒提取各菌株基因组 DNA, 并进行 PCR 扩增. 引物为 27F: 5 忆鄄 AGAGTTTGATCCTG 鄄 GCTCAG 鄄 3 忆和 1492R: 5 忆鄄 TACGGCTACCTTGTTA 鄄 CGACTT 鄄 3 忆 ;5 滋 L 体系为 : 模板 1 滋 L, dntp (25 mmol/l) 1 滋 L, 引物 (1 mmol/l) 各 2 滋 L, 1 伊 Taq 缓冲液 5 滋 L, Mg 2+ (25 mmol/l) 3 滋 L, Taq 酶 (5 U/ 滋 L) 1 滋 L, 超纯水 35 滋 L. 聚合酶链式反应条件 : 94 益预变性 2min; 94 益变性 45 s, 58 益退火 45 s, 延伸 1.5 min, 循环 3 次,72 益延伸 1 min. PCR 产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测
第 6 期 陈薇等 : 两株以亚硝态氮为氮源的异养硝化细菌的分离及鉴定 491 序. 测序结果提交 GeneBank 进行 BLAST 比对. 1.5.3 构建系统发育树 提交菌株 53 的 16 SrDNA 基因序列在 NCBI 数据库中进行比对, 选取与之相似性最高的模式 种的 16 SrDNA 基因序列, 采用 MEGA5.5 软件 进行系统发育分析, 采用 Neighbor 鄄 Joining 法构建 系统发育树,Bootstrap1 次进行稳定性验证. 1.5.4 菌株 N419 DNA 的 (G+C) mol% 含量测定及 DNA 鄄 DNA 杂交分析 (G+C) mol% 含量测定采用热变性温度法 (T m 值法 ) [22],DNA 样品溶解在.1 伊 SSC 缓冲液中, 温 度变化率为 1 益 /min, 得到溶解温度 T m, 按照经 验公式 (1) 计算得出 (G+C) mol% 含量. 参照菌株为 Escherichia coli K12. (G+C) mol%=(g+c) 参比菌株 mol%+2.8 伊 (T m 未知菌株原 T m 参比菌株 ) (1) 参考文献 [23] 对菌株 N419 和参比菌株进行 DNA 杂交分析, 测定紫外吸光值减少速率, 依据 公式 (2) 得到杂交百分数 ( 其中 V 为吸光值减少速 率, a 为待测菌株, b 为参比菌株, m 为二者 DNA 等量混合后所得样品 ). 其中参比菌株分别为 P. stutzer ACCC2243 B. cereus ACCC1119 B. subtilis ACCC1619. 杂交百分数 D% = 4V m-(v a +V b ) 2 V a +V b 姨 2 结果与讨论 2.1 菌株的富集和分离 伊 1% (2) 经多次富集培养和分离, 获得两株异养硝化 细菌, 分别编号为 53 和 N419. 本文将选择因子 NaNO 2 作为富集培养过程中选择压力, 淘汰非目标菌群, 通过逐渐提高培养液 NaNO 2 浓度的方法进行富集, 其中 NaNO 2 初始浓度为 1g/L, 最终浓度为 2 g/l. 此方法可使污泥中的碳化菌等杂菌的生长明显受到抑制, 有利于硝化细菌成为优势菌群, 并耐受越来越高的亚硝酸盐浓度. 2.2 菌株生长曲线和亚硝酸降解趋势菌株 53 生长经过 9h 的延滞期进入对数生长期,27 h 后, 菌株 53 处于稳定生长期, OD 6 最大值为.499 9; 菌株 53 在 ~9 h 处于亚硝态氮降解的延滞期 ;9h 后亚硝态氮浓度迅速下降,27 h 降解率达 87.9%, 总氮降解率达 54.7% ( 图 1). 菌株 N419 生长经过 6h 的延滞期后进入对数生长期,24 h 后, 菌株 N419 处于稳定生长期, OD 6 最大值为.657 7. 菌株 N419 在 ~6 h 处于亚硝态氮降解的延滞期 ;6h 后亚硝态氮浓度迅速下降,24 h 降解率达 9.8%, 总氮降解率达 63.5%( 图 2). 两株菌株的亚硝酸盐降解率与其生长趋势同步, 在延滞期系统中总氮基本没有降低, 亚硝酸盐降解缓慢. 经历了延滞期的调整后, 菌体开始大量繁殖, 总氮和亚硝态氮浓度迅速降低. 到了稳定期, 总氮和亚硝态氮浓度基本维持平衡, 降解速率开始降低, 这是由于菌体可利用的亚硝酸盐底物减少, 酶的耐受性降低的结果. 2.4 分离菌株的鉴定结果 2.4.1 细菌形态及菌落特征菌株 53 菌落较大, 形状不规则, 黄褐色, 边.6 OD 6 Nitrite 鄄 N Nitrite 鄄 N TN 2.5.4.3.2.1 2 1.5 1 3 6 9 12 15 18 21 24 27 3 33 36 39 42 45 48 t/h Fig.1 图 1 菌株 53 生长曲线和亚硝酸降解趋势 Dynamics of strain 53 growth and removal of nitrite
492 生命科学研究圆园 12 年 OD 6 Nitrite 鄄 N Nitrite 鄄 N TN.7.6.4.3.2.1 3 6 9 12 15 18 21 24 27 3 33 36 39 42 45 48 t/h Fig.2 图 2 菌株 N419 生长曲线和亚硝酸降解趋势 Dynamics of strain N419 growth and removal of nitrite 2.5 2 1.5 1 缘呈卷曲状, 菌落表面干燥, 不易挑取. 菌体呈杆状, 末端钝圆, (.4~.8) 滋 m 伊 (1.6~2.8) 滋 m, 无芽孢, 无鞭毛, 无荚膜 ( 图 3). 革兰氏染色阴性. 菌株 N419 菌落较大, 圆形, 乳白色, 边缘整齐, 菌落表面湿润光滑 粘稠. 菌体呈杆状, 末端钝圆, (.8~1.2) 滋 m 伊 (1.8~3.8) 滋 m, 产芽孢, 无鞭毛, 无荚膜 ( 图 4). 革兰氏染色阳性. 2.4.2 生理生化特性菌株 53 的生理生化特征为 : 淀粉水解 柠檬酸盐利用 硝酸盐还原 接触酶 尿素试验 甲基红试验阳性 ; 石蕊牛奶试验 硫化氢试验 吲哚试 验 V 鄄 P 试验 明胶水解试验阴性 ; 利用蔗糖 葡萄糖 果糖 麦芽糖产酸 ; 不能利用半乳糖 乳糖 甘露醇产酸. 菌株 N419 的生理生化特征为 : 淀粉水解 柠檬酸盐利用 硝酸盐还原 接触酶 石蕊牛奶试验 吲哚试验 V 鄄 P 试验 甲基红试验 明胶水解试验.1% 溶菌酶抗性试验阳性 ; 尿素试验 硫化氢试验阴性 ; 利用蔗糖 葡萄糖 果糖 麦芽糖 乳糖产酸, 不能利用半乳糖 甘露醇产酸. 生长温度为 5~45 益. 图 3 菌株 53 的菌落和菌体形态 Fig.3 Colony and morphology characteristics of strain 53 图 4 Fig.4 菌株 N419 的菌落和菌体形态 Colony and morphology characteristics of strain N419
第 6 期 陈薇等 : 两株以亚硝态氮为氮源的异养硝化细菌的分离及鉴定 493 2.4.3 16 SrDNA 基因序列分析菌株 53 和菌株 N419 的 16 SrDNA 基因 PCR 模式种 16 SrDNA 全序列进行系统分析 ( 图 5), 结果也显示该菌株和施氏假单胞菌 (P. stutzer 扩增在 15 bp 处有特异性带, 对其序列测序并将该序列结果提交 GeneBank, 其登录号分别为 HQ68964 和 JN4121. 用 Blast 程序与数据库中的细菌核酸序列进行比对 : 菌株 53 与 P. stutzeri (GeneBank 登录号为 AF94748) 相似性为 99.72%. 目前, 细菌分类学家的共识是认为当某两个细菌的 16 SrRNA 相似性大于 95% 时, 可将其归为同 [21] 一属. 因此, 根据上述相似性比较结果, 再结合生理生化特性将菌株 53 初步鉴定为假单胞菌属一种 (Pseudomonas sp.), 又选择了多种假单胞属的 ATCC17588 T ) 显示出更高的同源性. 经 NCBI Blast 检索, 菌株 N419 与 B.cereus(G 鄄 enebank 登录号为 FJ982654) 和 B. cereus(gene 鄄 Bank 登录号为 HQ91478) 相似性为 99.73%, 根据相似性比较结果, 再结合生理生化特性将该菌株初步鉴定为芽孢杆菌属一种 (Bacillus sp.). 同时又选择了多种芽孢杆菌属的模式种 16 SrDNA 全序列进行系统分析 ( 图 6), 结果显示该菌株与枯草芽孢杆菌 (B. subtilis NCIB361 T ) 显示出很高的同源性. 1 53 8 Pseudomonas stutzer ATCC17588 T Pseudomonas alcaligenes LMG1224 T 95 Pseudomonas aeruginosa LMG1242 T Pseudomonas mendocina LMG1223 T Pseudomonas putida DSM291 T 99 98 82 Pseudomonas cichorii LMG2162 T Pseudomonas syringae ATCC1931 T Pseudomonas fluorescens DSM59 T.5 图 5 Fig.5 菌株 53 基于 16 SrDNA 基因序列相似性构建的系统进化树 Phylogenetic tree based on 16 SrDNA gene sequence of strain 53 and its closely related type strains 1 N419 89 Bacillus subtilis NCIB361 T 1 Bacillus licheniformis ATCC1458 T 62 Bacillus pumilus ATCC761 T Bacillus firmus NCIMB9366 T Bacillus megaterium IAM13418 T 57 1 58 Bacillus thuringiensis ATCC1792 T Bacillus anthracis ATCC14578 T Bacillus cereus ATCC14579 T Bacillus coagulans IAM12463 T 图 6 Fig.6.5 菌株 N419 基于 16 SrDNA 基因序列相似性构建的系统进化树 Phylogenetic tree based on 16 SrDNA gene sequence of strain N419 and its closely related type strains 2.4.4 DNA 的 (G+C) mol% 含量及 DNA 鄄 DNA 杂交分析通过 T m 值法测得菌株 53 的 (G+C) mol% 含量为 63.5%, 这符合 P. stutzer 种的 (G+C) mol% 范围 (6%~64.4%). DNA 鄄 DNA 杂交实验显示, 菌株 53 与参比菌株 P. stutzer ACCC2243 的 DNA 鄄 DNA 杂交率为 88%, 显著高于 7% 的阈值, 说明 [24] 它们是同一物种的不同菌株. 测得菌株 N419 的 (G+C) mol% 含量为 42.2%, 介于 B. cereus 种的 (G+C) mol% 范围 (34.6%~ 36.8%) 和 B. subtilis 种的 (G+C) mol% 范围 (43.5%~ 43.8%) 之间.DNA 鄄 DNA 杂交实验显示, 菌株
494 生命科学研究圆园 12 年 N419 与参比菌株 B. cereus ACCC1119 的 DNA 鄄 DNA 杂交率为 46%, 与参比菌株 B. subtilis AC 原 CC1619 的 DNA 鄄 DNA 杂交率为 61%, 均低于 7%, 所以菌株 N419 可能是芽孢杆菌属的一个新种. 3 讨论本研究从活性污泥中分离得到两株以亚硝酸盐为唯一氮源并能将其降解的细菌, 命名为 53 和 N419. 根据形态 生理生化特性 16 SrDNA 序列分析 DNA 的 (G+C) mol% 含量及 DNA 鄄 DNA 杂交分析, 初步鉴定菌株 53 为施氏假单胞菌 (P. stutzeri). 一般认为,16 SrDNA 序列相似性大于 [21] 99%, 认为属于同一种. 菌株 N419 与 B. cereus (GeneBank 登录号为 FJ 982654) 和 B. cereus (GeneBank 登录号为 HQ91478) 相似性为 99.73%, 似乎可以认为菌株 N419 为蜡状芽孢杆菌. 但菌株 N419 在系统发育树上与枯草芽孢杆菌 (B. subtilis NCIB361T) 显示出很高的同源性. 菌株 N419 的 DNA (G+C) mol% 含量介于蜡状芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌之间, 与参比菌株 B. cereus ACCC1119 和 B. subtilis ACCC1619 的 DNA 鄄 DNA 杂交率均低于 7%, 因此, 菌株 N419 可是蜡状芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌杂交的一个新种. Robertson 等首次分离了一株好氧反硝化菌 Thiosphaera pantotropha, 该菌株具有同步异养硝 [16] 化与好氧反硝化功能. 随后, 陆续有学者发现大多数异养硝化细菌同时具有好氧反硝化功能, 即通过不同酶系的协同作用完成硝化和反硝化两个过程, 将氨氮转化为气态产物, 从而完成脱氮 [25, 26] 过程. 菌株 53 和 N419 在初始亚硝酸钠浓度 1 g/l, 即亚硝态氮浓度 2.3 g/l 时, 经振荡培养 27 h, 亚硝态氮的去除率分别达到 87.9% 和 9.8%, 总氮的去除率为 54.7% 和 63.5%, 整个反应体系中仅有少量硝态氮的累积. 因此可以推测, 菌株 53 和 N419 异养硝化与好氧反硝化是同步的. 近年来, 异养硝化和好氧反硝化成为生物脱氮领域研究关注的一个热点. 有文献报道了施氏假单胞菌和芽孢杆菌的异养硝化和好氧反硝化 [27, 28] 能力.Su 等从猪场废水处理系统中分离得到一株施氏假单胞菌 (P. stutzeri SU2), 该菌株能在 92 h 内将硝态氮降解 99.24%, 整个过程中硝态 [27] 氮转化为氮气, 无亚硝酸盐的累积.Yan 等从粪便处理系统中分离得到一种芽孢杆菌 (Bacillus sp. LY), 该菌株在氨氧化反应体系下, 氨氮的降解率 为 74.8%, 最终脱氮率为 61.9% [28]. 但以上研究主 要集中在氨氮 硝态氮的降解研究, 有关施氏假 单胞菌和芽孢杆菌的亚硝盐降解能力鲜见报道. 亚硝酸盐是水产养殖中易产生的有害物质, 常使水产动物抵抗力下降, 易患各种疾病. 因此, 亚硝态氮是养殖管理中所关注的一个重要指标. 菌株 53 和 N419 在初始亚硝酸钠浓度 1 g/l, 即 亚硝态氮浓度 2.3 g/l 时, 经振荡培养 27 h, 亚 硝态氮的去除率分别达到 87.91% 和 9.77%, 总 氮的去除率为 54.7% 和 63.5%, 整个反应体系中 仅有少量硝态氮的累积. 因此菌株 53 和 N419 可 用来高效净化养殖水体中的亚硝酸盐, 但在实际 应用中的投放方式 使用量 维持时间和降解效 果等, 有待进一步的深入探讨和研究. 参考文献 (References): [1] ALONSO A, CAMARGO JA. Toxicity of nitrite to three species of freshwater invertebrate[j]. Environmental Toxicology, 26, 21(1): 9 鄄 94. [2] FRANCES J, ALLAN GL, NOWAK BF. The effects of nitrite on the shorten growth of silver perch (Bidyanus bidyanus)[j]. Aquaculture, 1998, 163: 63 鄄 72. [3] GROSS A, ABUTBUL S, ZILBERG D. Acute and chronic ef 鄄 fects of nitrite on white shrimp, Litopenaeus vannamei, cul 鄄 tured in low 鄄 salinity brackish water[j]. Journal of the World Aquaculture Society, 24, 35(3): 315 鄄 321. [4] ALCARAZ G, CHIAPPA 鄄 CARRARA X, ESPINOZA V, et al. Acute toxicity of ammonia and nitrite to white shrimp Penaeus setiferus postlarvae[j]. Journal of the World Aquaculture Soci 鄄 ety, 1999, 3: 9 鄄 97. [5] 沈萍, 陈向东. 微生物学 [M]. 北京 : 高等教育出版社 (SHEN Ping, CHEN Xiang 鄄 dong. Mcrobiology[M]. Beijing: Higher Ed 鄄 ucation Press), 26. 298 鄄 3. [6] 布坎南, 吉本斯. 伯杰氏细菌鉴定手册 ( 第 8 版 )[M]. 北京 : 科学出版社 (BUCHANAN RE, GIBBONS NE. Bergey s Manu 鄄 al of Determinative Bacteriology (8 th ed.)[m]. Beijing: Science Press), 1984. 622 鄄 663. [7] 陈梅娟, 蒋进元, 周岳溪, 等. 自养硝化细菌的分离 鉴定及系统发育分析 [J]. 环境科学研究 (CHEN Mei 鄄 juan, JIANG Jin 鄄 yuan, ZHOU Yue 鄄 xi, et al. Separation identification and phylogenetic analysis of aototrophic nitrobacteria[j]. Research of Environmental Sciences), 21, 23(3): 34 鄄 345. [8] 琚姝, 周长林, 窦洁. 高硝化活性亚硝酸盐氧化细菌的培养和应用研究 [J]. 微生物学通报 (JU Shu, ZHOU Chang 鄄 lin, DOU Jie. Studies on the culture and application of anitrite 鄄 oxidizing bacterium with high nitrification activity[j]. Microbi 鄄 ology China), 25, 32(5): 56 鄄 6. [9] 王娟. 硝化细菌的筛选及其降解特性的初步研究 [D]. 四川 : 西南交通大学 (WANG Juan. Study on degradation character 鄄 istics and isolation of nitrifying bacteria[d]. Sichuan: South 鄄 west Jiaotong University), 26. [1] KILLHAM K. Heterotrophic Nitrification[M]. Oxford: IPL Press, 1986. 117 鄄 126. [11] KIM JK, PARK KJ, CHO KS, et al. Aerobic nitrification 鄄
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