中华人民共和国国家标准 GB 4789.13 2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验 2012-05-17 发布 2012-07-17 实施 中华人民共和国卫生部 发布
前 言 本标准代替 GB/T 4789.13 2003 食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌检验 本标准与 GB/T 4789.13 2003 相比, 主要变化如下 : 修改了标准的中文名称 ; 修改了样品制备过程 ; 修改了培养基与试剂 ; 修改了操作步骤 ; 修改了菌数计算部分 ; 增加了附录 A I
食品安全国家标准 食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验 1 范围 本标准规定了食品中产气荚膜梭菌 (Clostridium perfringens) 的检验方法 本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下 : a) 恒温培养箱 :36 ±1 ; b) 冰箱 :2 ~5 ; c) 恒温水浴箱 :50 ±1,46 ±0.5 ; d) 天平 : 感量 0.1 g; e) 均质器 ; f) 显微镜 :10 ~100 ; g) 无菌吸管 :1 ml( 具 0.01 ml 刻度 ) 10 ml( 具 0.1 ml 刻度 ) 或微量移液器及吸头 ; h) 无菌试管 :18mm 180mm; i) 无菌培养皿 : 直径 90 mm; j) ph 计或 ph 比色管或精密 ph 试纸 ; k) 厌氧培养装置 3 培养基和试剂 3.1 胰胨 - 亚硫酸盐 - 环丝氨酸 (TSC) 琼脂 : 见附录 A 中 A.1 3.2 液体硫乙醇酸盐培养基 (FTG): 见附录 A 中 A.2 3.3 缓冲动力 - 硝酸盐培养基 : 见附录 A 中 A.3 3.4 乳糖 - 明胶培养基 : 见附录 A 中 A.4 3.5 含铁牛乳培养基 : 见附录 A 中 A.5 3.6 0.1% 蛋白胨水 : 见附录 A 中 A.6 3.7 革兰氏染色液 : 见附录 A 中 A.7 3.8 硝酸盐还原试剂 : 见附录 A 中 A.8 3.9 缓冲甘油 - 氯化钠溶液 : 见附录 A 中 A.9 4 检验程序 1
产气荚膜梭菌检验程序见图 1 检 样 25g(mL) 检样 +225 ml0.1% 蛋白胨水 均质 稀释 10-1 ~10-6 稀释液各 1mL + TSC 琼脂混合 厌氧培养,36 ±1 20h~24h, 黑色菌落计数 任选黑色菌落 5 个, 分别接种 FTG 培养基 确证试验 镜检形态 牛奶发酵 动力 - 硝酸盐 乳糖 - 明胶 报告 图 1 产气荚膜梭菌检验程序 5 操作步骤 5.1 样品制备 5.1.1 样品采集后应尽快检验, 若不能及时检验, 可在 2 ~5 保存 ; 如 8 h 内不能进行检验, 应以无菌操作称取 25 g(ml) 样品加入等量缓冲甘油 - 氯化钠溶液 ( 液体样品应加双料 ), 并尽快至于 -60 低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存 5.1.2 以无菌操作称取 25 g(ml) 样品放入含有 225 ml 0.1% 蛋白胨水 ( 如为 5.1.1 中冷冻保存样品, 室温解冻后, 加入 200 ml 0.1% 蛋白胨水 ) 的均质袋中, 在拍击式均质器上连续均质 1 min~2 min; 或置于盛有 225 ml0.1% 蛋白胨水的均质杯中,8 000 r/min~10 000 r/min 均质 1min~2 min, 作为 1:10 稀释液 5.1.3 以上述 1:10 稀释液按 1 ml 加 0.1% 蛋白胨水 9 ml 制备 10-2 ~10-6 的系列稀释液 2
5.2 培养 5.2.1 吸取各稀释液 1 ml 加入无菌平皿内, 每个稀释度做两个平行 每个平皿倾注冷却至 50 的 TSC 琼脂 ( 可放置于 50 ±1 恒温水浴箱中保温 )15 ml, 缓慢旋转平皿, 使稀释液和琼脂充分混匀 5.2.2 上述琼脂平板凝固后, 再加 10 ml 冷却至 50 的 TSC 琼脂 ( 可放置于 50 ±1 恒温水浴箱中保温 ) 均匀覆盖平板表层 5.2.3 待琼脂凝固后, 正置于厌氧培养装置内,36 ±1 培养 20 h~24 h 5.2.4 典型的产气荚膜梭菌在 TSC 琼脂平板上为黑色菌落 5.3 确证试验 5.3.1 从单个平板上任选 5 个 ( 小于 5 个全选 ) 黑色菌落, 分别接种到 FTG 培养基,36 ±1 培养 18 h~24 h 5.3.2 用上述培养液涂片, 革兰氏染色镜检并观察其纯度 产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌, 有时可见芽孢体 如果培养液不纯, 应划线接种 TSC 琼脂平板进行分纯,36 ±1 厌氧培养 20 h~24 h, 挑取单个典型黑色菌落接种到 FTG 培养基,36 ±1 培养 18 h~24 h, 用于后续的确证试验 5.3.3 取生长旺盛的 FTG 培养液 1 ml 接种于含铁牛乳培养基, 在 46 ±0.5 水浴中培养 2 h 后, 每小时观察一次有无 暴烈发酵 现象, 该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质, 通常会上升到培养基表面 5 h 内不发酵者为阴性 产气荚膜梭菌发酵乳糖, 凝固酪蛋白并大量产气, 呈 暴烈发酵 现象, 但培养基不变黑 5.3.4 用接种环 ( 针 ) 取 FTG 培养液穿刺接种缓冲动力 - 硝酸盐培养基, 于 36 ±1 培养 24 h 在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况, 判定有无动力 有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长, 无动力的菌株只沿穿刺线生长 然后滴加 0.5 ml 试剂甲和 0.2 ml 试剂乙以检查亚硝酸盐的存在 15 min 内出现红色者, 表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐 ; 如果不出现颜色变化, 则加少许锌粉, 放置 10 min, 出现红色者, 表明该菌株不能还原硝酸盐 产气荚膜梭菌无动力, 能将硝酸盐还原为亚硝酸盐 5.3.5 用接种环 ( 针 ) 取 FTG 培养液穿刺接种乳糖 - 明胶培养基, 于 36 ±1 培养 24 h, 观察结果 如发现产气和培养基由红变黄, 表明乳糖被发酵并产酸 将试管于 5 左右放置 1 h, 检查明胶液化情况 如果培养基是固态, 于 36 ±1 再培养 24 h, 重复检查明胶是否液化 产气荚膜梭菌能发酵乳糖, 使明胶液化 6 结果与报告 6.1 典型菌落计数选取典型菌落数在 20 CFU~200 CFU 之间的平板, 计数典型菌落数 如果 : a) 只有一个稀释度平板的典型菌落数在 20CFU~200CFU 之间, 计数该稀释度平板上的典型菌落 ; b) 最低稀释度平板的典型菌落数均小于 20 CFU, 计数该稀释度平板上的典型菌落 ; c) 某一稀释度平板的典型菌落数均大于 200 CFU, 但下一稀释度平板上没有典型菌落, 应计数该稀释度平板上的典型菌落 ; d) 某一稀释度平板的典型菌落数均大于 200 CFU, 且下一稀释度平板上有典型菌落, 但其平板上的典型菌落数不在 20 CFU~200 CFU 之间, 应计数该稀释度平板上的典型菌落 ; e)2 个连续稀释度平板的典型菌落数均在 20CFU~200CFU 之间, 分别计数 2 个稀释度平板上的典型菌落 6.2 结果计算 6.1 计数结果按公式 (1) 计算 : 3
( A B ) T = C ( n 0.1n ) d 1 + 2 (1) 式中 : T 样品中产气荚膜梭菌的菌落数 ; A 单个平板上典型菌落数 ; B 单个平板上经确证试验为产气荚膜梭菌的菌落数 ; C 单个平板上用于确证试验的菌落数 ; n1 第一稀释度 ( 低稀释倍数 ) 经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数 ; n2 第二稀释度 ( 高稀释倍数 ) 经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数 ; 0.1 稀释系数 ; d 稀释因子 ( 第一稀释度 ) 6.3 报告根据 TSC 琼脂平板上产气荚膜梭菌的典型菌落数, 按照 6.2 中公式计算, 报告每 g(ml) 样品中产气荚膜梭菌数, 报告单位以 CFU/ g(ml) 表示 ; 如 T 值为 0, 则以小于 1 乘以最低稀释倍数报告 4
附录 A 培养基和试剂 A.1 胰胨 - 亚硫酸盐 - 环丝氨酸 (TSC) 琼脂 A.1.1 基础成分胰胨 1 大豆胨 酵母粉 焦亚硫酸钠 柠檬酸铁铵 琼脂 1 900.0 ml ph 7.6±0.2 A.1.2 D- 环丝氨酸溶液溶解 1 gd- 环丝氨酸于 200 ml, 膜过滤除菌后, 于 4 冷藏保存备用 A.1.3 制法将基础成分加热煮沸至完全溶解, 调节 ph, 分装到 500 ml 烧瓶中, 每瓶 250 ml,121 高压灭菌 15 min, 于 50 ±1 保温备用 临用前每 250 ml 基础溶液中加入 20 ml D- 环丝氨酸溶液, 混匀, 倾注平皿 A.2 液体硫乙醇酸盐培养基 (FTG) A.2.1 成分胰蛋白胨 1 L- 胱氨酸 0.5g 酵母粉 葡萄糖 氯化钠 2.5g 硫乙醇酸钠 0.5g 刃天青 0.001g 琼脂 0.75g ph 7.1±0.2 A.2.2 制法将以上成分加热煮沸至完全溶解, 冷却后调节 ph, 分装试管, 每管 10 ml,121 高压灭菌 15 min 临用前煮沸或流动蒸汽加热 15 min, 迅速冷却至接种温度 A.3 缓冲动力 - 硝酸盐培养基 A.3.1 成分 蛋白胨 牛肉粉 3.0 g 硝酸钾 磷酸氢二钠 2.5g 5
半乳糖 甘油 5.0 ml 琼脂 3.0 g ph 7.3±0.2 A.3.2 制法将以上成分加热煮沸至完全溶解, 调节 ph, 分装试管, 每管 10 ml,121 高压灭菌 15 min 如果当天不用, 置 4 左右冷藏保存 临用前煮沸或流动蒸汽加热 15 min, 迅速冷却至接种温度 A.4 乳糖 - 明胶培养基 A.4.1 成分蛋白胨 1 酵母粉 10.0 g 乳糖 10.0 g 酚红 0.05g 明胶 120.0 g ph 7.5±0.2 A.4.2 制法加热溶解蛋白胨 酵母粉和明胶于 1000 ml 中, 调节 ph, 加入乳糖和酚红 分装试管, 每管 10 ml,121 高压灭菌 10 min 如果当天不用, 置 4 左右冷藏保存 临用前煮沸或流动蒸汽加热 15 min, 迅速冷却至接种温度 A.5 含铁牛乳培养基 A.5.1 成分新鲜全脂牛奶 硫酸亚铁 (FeSO4 7H2O) 50.0 ml A.5.2 制法将硫酸亚铁溶于中, 不断搅拌, 缓慢加入 1000 ml 牛奶中, 混匀 分装大试管, 每管 10 ml, 118 高压灭菌 12 min 本培养基必须新鲜配制 A.6 0.1% 蛋白胨水 A.6.1 成分蛋白胨 ph 7.0±0.2 A.6.2 制法加热溶解, 调节 ph,121 高压灭菌 15 min A.7 革兰氏染色液 A.7.1 结晶紫染色液 A.7.1.1 成分 结晶紫 1.0g 6
95% 乙醇 20.0 ml 1% 草酸铵水溶液 80.0 ml A.7.1.2 制法将结晶紫完全溶于乙醇中, 然后与草酸铵溶液混合 A.7.2 革兰氏碘液 A.7.2.1 成分碘 碘化钾 2.0 g 300.0 ml A.7.2.2 制法将碘与碘化钾先混合, 加入少许振摇, 待完全溶解后, 再加入至 300 ml A.7.3 沙黄复染液 A.7.3.1 成分沙黄 0.25 g 95% 乙醇 10.0 ml 90.0 ml A.7.3.2 制法将沙黄溶解于 95% 乙醇中, 然后用稀释 A.7.4 染色方法涂片在火焰上固定, 滴加结晶紫染液, 染色 1 min, 水洗 滴加革兰氏碘液, 作用 1 min, 水洗 滴加 95% 乙醇脱色约 15 s~30 s, 直至染色液被洗掉, 不要过分脱色, 水洗 滴加沙黄复染液, 复染 1 min, 水洗 待干 镜检 A.8 硝酸盐还原试剂 A.8.1 甲液 ( 对氨基苯磺酸溶液 ) 在 1 000 ml 5 mol/l 乙酸中溶解 8 g 对氨基苯磺酸 A.8.2 乙液 (α- 萘酚乙酸溶液 ) 在 1 000 ml 5 mol/l 乙酸中溶解 5 g α- 萘酚 A.9 缓冲甘油 - 氯化钠溶液 A.9.1 成分甘油 100.0 ml 氯化钠 4.2 g 磷酸氢二钾 ( 无水 ) 12.4 g 磷酸二氢钾 ( 无水 ) 4.0 g 900.0 ml ph7.2±0.1 A.9.2 制法将以上成分加热至完全溶解, 调节 ph,121 高压灭菌 15 min 配制双料缓冲甘油溶液时, 用甘油 200 ml 和 800 ml 7