山东科学 SHANDONGSCIENCE 第 28 卷第 5 期 2015 年 10 月出版 Vol.28No.5Oct.2015 DOI:10.3976/j.isn.1002-4026.2015.05.008 生物传感器 生物传感器对柠檬酸发酵过程中生化参数的快速测定 马耀宏, 孟庆军, 杨艳, 杨俊慧, 郑岚, 史建国 ( 山东省科学院生物研究所, 山东省生物传感器重点实验室, 山东济南 250014) 摘要 : 应用发酵过程控制专用生物传感器总糖 还原糖和柠檬酸测定仪实现了对柠檬酸发酵过程中的关键生化参数总糖 还原糖及柠檬酸含量的快速测定, 为柠檬酸发酵过程的优化控制提供了关键生化参数分析手段 关键词 : 柠檬酸 ; 总糖 ; 还原糖 ; 发酵过程优化控制中图分类号 :TP212 3;TS202 3 文献标识码 :A 文章编号 :1002 4026(2015)05 0049 06 Rapidmeasurementofbiochemicalparametersincitricacid fermentationprocessbybiosensors MAYao hong,meng Qing jun,yang Yan,YANG Jun hui,zheng Lan,SHIJian guo (ShandongProvincialKeyLaboratoryofBiosensors,BiologyInstitute,ShandongAcademyofSciences,Jinan250014,China) Abstract Weappliedfermentationprocesstothecontrolovertotalsugar,reducingsugarandcitricacidmeasurement instruments.wefurtherimplementrapidmeasurementforsuchkeybiochemicalparametersastotalsugar,reducingsugar andcitricacidcontent.thisprovidesananalyticmethodofkeybiochemicalparametersforoptimizationcontrolofcitric acidfermentationprocess. Keywords citricacid;totalsugar;reducingsugar;optimizedfermentationcontrol 柠檬酸 (citricacid) 是一种天然三元羧酸, 即 3 羟基 3 羧基戊二酸, 是三羧酸循环途径中的关键成员 [1] 在自然界中, 柠檬酸主要存在于柑橘 柠檬等水果中 [2] 在食品 医药 化工和纺织等行业中, 柠檬酸都有着重要的应用价值 [3] 特别是在食品加工领域, 柠檬酸是世界总消耗量位居第一的有机酸类添加剂 [4-5] 柠檬酸的工业化发酵生产主要有 3 种, 即表面发酵法 深层液体发酵法和固体发酵法 [6] 其中采用黑曲霉柠檬酸产生菌作为菌种进行深层液体发酵的方法为迄今世界柠檬酸生产的主流技术 [7] 目前, 我国柠檬酸发酵生产的原料主要来自淀粉质原料 [8] 我国柠檬酸产业发展历史较长, 特色鲜明, 是柠檬酸生产大国, 产量占全球产量的 60% 以上 [9] 随着产业的发展, 目前我国柠檬酸生产技术水平已有长足的进步 但随着我国对节能 降耗和减排要求的不断提高, 对柠檬酸生产提出了更高的要求 [10], 发酵过程优化控制是柠檬酸工业发展方向之一 [11] 由于生化参数 收稿日期 :2015 06 08 基金项目 : 山东省自主创新重大专项 (2014ZZCX02602) 作者简介 : 马耀宏 (1970-), 男, 副研究员, 研究方向为生化分析与生物传感器
50 山东科学 2015 年 测量的困难性和发酵过程的复杂性, 生物发酵过程大多以人工控制为主, 影响了工艺水平和管理水平的提高, 造成生产不稳定 发酵水平低 能耗大以及成本高等问题 [12] 山东省科学院生物研究所研制的总糖 还原糖和柠檬酸测定仪是发酵过程控制的专用生物传感器, 采用了补色光度滴定技术, 避免了样品中颜色的干扰, 恒定了测定条件, 测定结果准确, 并且操作简单, 测定成本低 [13-14], 为柠檬酸发酵过程中关键生化参数的测定提供了新的方法 本文应用总糖 还原糖和柠檬酸测定仪, 实现了对柠檬酸发酵过程中总糖 还原糖及柠檬酸的快速测定 1 材料 仪器与试剂 1 1 材料菌种 : 黑曲霉 (Aspergilusniger)UH 01, 由潍坊英轩实业有限公司菌种室筛选和保存 原料 : 玉米粉, 由潍坊英轩实业有限公司原料车间提供, 其他原料均为市售工业品 1 2 仪器 TS I 总糖测定仪 SGD IV 全自动还原糖测定仪和 SBD CAA 柠檬酸测定仪, 均为山东省科学院生物研究所研制 1 3 试剂药品 :AR 级五水合硫酸铜 次甲基蓝 氢氧化钠 亚铁氰化钾 酒石酸钾钠 一水柠檬酸 百里香酚蓝和酚酞购自国药集团 其他药品皆为 AR 级 总糖测定仪 还原糖测定仪所需的斐林试剂 葡萄糖标准液以及所需的滴定液皆按照仪器配套试剂的配置要求进行配置 [15] 柠檬酸测定仪所需试剂的配置 : (1)10 00% 标准柠檬酸溶液配制准确称取 10 00g 一水柠檬酸, 先用少量蒸馏水溶解, 然后定容到 100mL (2)3 0% 6 0% 氢氧化钠溶液配制准确称取 3 0g 氢氧化钠, 先用少量蒸馏水溶解, 然后定容到 100mL 准确称取 6 0g 氢氧化钠, 先用少量蒸馏水溶解, 然后定容到 100mL (3) 百里香酚兰指示剂配制准确称取 0 1g 百里香酚兰, 先用 20mL 无水乙醇溶解, 然后定容到 100mL 准确量取 1 5mL 溶液加入 100mL 蒸馏水中, 摇匀, 作为指示剂溶液 (4) 酚酞指示剂配制准确称取 0 1g 酚酞, 先用 60mL 无水乙醇溶解, 然后定容到 100mL 量取配制好的酚酞溶液 50mL, 加入 450mL 蒸馏水中, 摇匀, 作为指示剂溶液 2 实验方法 2 1 发酵液样本采集及预处理每隔 4h 从实验室发酵罐中取出 20mL 柠檬酸发酵液, 直接或经定性滤纸简单过滤后作为待测样本 若样本中待测组分浓度超过仪器检测上限, 则以去离子水对其进行适当比例稀释 结果处理时, 将检测结果数值乘以样本对应的稀释倍数得到最终检测结果 2 2 还原糖测定 2 2 1 仪器操作将还原糖测定仪接通电源 (220V), 进入待机状态 按 开 / 关 键, 自动启动程序 仪器自动完成空白对照测定, 随后自动进入定标程序, 待试剂泵启动后, 以移液器将标准品溶液注入反应池, 仪器自动定标
第 5 期 马耀宏, 等 : 生物传感器对柠檬酸发酵过程中生化参数的快速测定 51 定标完成后, 仪器自动进入测定程序 待试剂泵启动后, 以移液器将待测样品注入反应池, 自动完成还原糖测定并打印 2 2 2 测试方法取发酵液待测样本, 以移液器精确量取 500μL 预处理后的柠檬酸发酵液, 待还原糖测定仪提示 样品进样 后将其迅速注入仪器反应池的进样口, 仪器自动完成检测并记录结果 每份样本进行重复测定, 记录其算术平均值作为该样本的实际检测结果 2 3 总糖测定 2 3 1 仪器操作仪器及其操作方法同 2 2 1 2 3 2 测试方法取发酵液待测样本, 采用总糖测定仪对其进行总糖测定, 得出实验结果 每份样本进行重复测定, 记录其算术平均值作为该样本的实际检测结果 2 4 柠檬酸测定 2 4 1 仪器操作将柠檬酸测定仪接通电源, 进入待机状态 按 开始 键, 仪器运行 自动进入稳定程序及定标值 T1 ( 空白 ) T2( 标准 ) 的确定, 并按照内存设定次数 ( 默认值为 10 次 ) 完成一组测定 若特殊设置需要调整参数设定, 需在打开电源开关后按 开始 键前, 重复按压 功能 键进行各参数值设定 ( 如不输入参数值, 各参数值则为仪器的初始默认值 ), 按 输入 键完成参数设置 一般不需要重新设定参数, 此步骤跳过 仪器打印机打印出 T1 值之后, 需手工进行 T2 值的标定 待液晶屏显示 定标进样 时, 用移液器吸取 500μL 定标用标准柠檬酸 10 00% 溶液注入反应池进行定标, 反应完成后仪器自动打印出定标值 T2 2 4 2 测试方法取发酵液待测样本, 待 T1 T2 值定标完成后, 仪器自动进入测定程序, 液晶屏显示 样品进样 时, 用移液器吸取 500μL 待测样品注入反应池, 仪器自动完成样品的测定, 计算并打印出测定结果 每份样本进行重复测定, 记录其算术平均值作为该样本的实际检测结果 3 结果与分析 3 1 柠檬酸发酵液还原糖平行测定将从实验室发酵罐中取出的柠檬酸发酵液, 以还原糖测定仪测试其还原糖含量 对同一样本重复测定 6 次, 测定结果见表 1 表 1 还原糖测定仪对柠檬酸发酵液的测定结果 Table1 Measurementresultsofcitratefermentationbrothwithreducingsugaranalyzer 次数 1 2 3 4 5 6 总糖含量 ( 质量分数 )% 2.03 2.00 2.05 1.99 2.01 2.02 由测试结果求得, 样本检测结果的平均值为 2 02%, 标准差为 0 022(n=6), 变异系数为 1 07% 3 2 柠檬酸发酵液总糖平行测定将从实验室发酵罐中取出的柠檬酸发酵液, 以总糖测定仪测试其总糖含量 对同一样本重复测定 5 次, 测定结果见表 2
52 山东科学 2015 年 表 2 总糖测定仪对柠檬酸发酵液的测定结果 Table2 Measurementresultsofcitratefermentationbrothwithtotalsugaranalyzer 次数 1 2 3 4 5 总糖含量 ( 质量分数 )% 1.89 1.75 1.91 1.69 1.83 由测试结果求得, 样本检测结果的平均值为 1 814%, 标准差为 0 093(n=5), 变异系数为 5 14% 3 3 柠檬酸发酵液柠檬酸平行测定 将从实验室发酵罐中取出的柠檬酸发酵液, 以柠檬酸测定仪测试其柠檬酸含量 对同一样本重复测定 6 次, 测定结果见表 3 表 3 柠檬酸测定仪对柠檬酸发酵液的测定结果 Table3 Measurementresultsofcitratefermentationbrothwithcitricacidanalyzer 次数 1 2 3 4 5 6 总糖含量 ( 质量分数 )% 4.10 4.32 4.58 4.26 4.43 4.05 由测试结果求得, 样本检测结果的平均值为 4 29%, 标准差为 0 200(n=6), 变异系数为 4 65% 3 4 柠檬酸发酵过程中总糖 还原糖及柠檬酸的测定 用总糖测定仪 全自动还原糖测定仪及柠檬酸测定仪, 同时对 4 批次的柠檬酸发酵过程总糖 还原糖 柠 檬酸进行测定, 测定周期间隔 4h,4 个发酵罐中总糖 还原糖 柠檬酸发酵测定数据见表 4 表 4 柠檬酸发酵过程总糖 还原糖 柠檬酸测定结果的分析 Table4 Measurementresultsoftotalsugar,reducingsugarandcitricacidincitratefermentation 质量分数 /% 时间 /h 项目 1 号罐 2 号罐 3 号罐 4 号罐 0 发酵总糖 16.20 16.30 16.20 16.40 8 总糖 15.69 14.80 15.60 15.70 还原糖 14.80 13.30 14.50 14.30 产酸 1.11 1.38 1.23 1.30 16 总糖 12.90 12.60 12.74 12.60 还原糖 12.30 12.00 12.40 11.90 产酸 3.57 4.47 3.86 4.36 24 总糖 9.80 9.40 10.30 9.40 还原糖 9.10 9.00 9.40 8.90 产酸 6.64 7.68 7.07 7.75 32 总糖 8.10 7.90 8.30 7.80 还原糖 7.62 7.70 8.10 7.54 产酸 9.48 10.57 10.16 10.87 40 总糖 5.20 5.10 5.30 4.90 还原糖 4.90 4.50 4.50 4.20 产酸 12.61 13.18 12.98 13.65 48 总糖 4.10 4.00 3.90 3.80 还原糖 2.00 2.00 2.10 2.00 产酸 15.34 15.71 15.45 15.22 56 总糖 2.20 2.10 2.10 2.30 还原糖 0.20 2.50 3.00 4.00 产酸 16.71 17.32 17.64 17.98 转化率 /% 101.91 105.03 109.38 108.41
第 5 期 马耀宏, 等 : 生物传感器对柠檬酸发酵过程中生化参数的快速测定 53 图 1~4 分别为 4 个发酵罐柠檬酸发酵过程主要参数的测定曲线 图 1 1 号罐柠檬酸发酵过程主要参数曲线 Fig 1 Curvesofmajorparametersincitricacidfermentation procesforfermentationtank1 图 2 2 号罐柠檬酸发酵过程主要参数曲线 Fig 2 Curvesofmajorparametersincitricacidfermentation procesforfermentationtank2 图 3 3 号罐柠檬酸发酵过程主要参数曲线 Fig 3 Curvesofmajorparametersincitricacidfermentation procesforfermentationtank3 图 4 4 号罐柠檬酸发酵过程主要参数曲线 Fig 4 Curvesofmajorparametersincitricacidfermentation procesforfermentationtank4 从图 1~4 可以看出, 随着柠檬酸发酵过程的进行, 发酵液中总糖和还原糖的含量不断下降, 而柠檬酸的含量持续上升 发酵液中的还原糖及总糖不断转化为预期产物柠檬酸, 柠檬酸的生成与总糖 还原糖的消耗紧密相关 4 讨论用研制的柠檬酸测定仪 总糖测定仪和全自动还原糖测定仪, 同时对 4 批次的柠檬酸发酵过程总糖 还原糖和柠檬酸进行测定, 结果表明, 柠檬酸的生成与总糖 还原糖消耗紧密相关, 该参数同原料的利用率 产品的转化率及产品的成本等指标关系密切 可以通过对总糖 还原糖的测试建立柠檬酸发酵产酸模型并应用于工业实时监测控制 利用建立的快速分析方法和仪器, 可以进一步实现更多批次发酵实验中总糖 还原糖和柠檬酸等生化参数的积累, 从柠檬酸代谢全过程来分析柠檬酸的生成与总糖 还原糖的关系, 以期建立柠檬酸发酵过程的数学模型, 最终实现对柠檬酸发酵过程的优化和自动控制 ( 下转第 79 页 )
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