年 月 第 卷 第 期! "!!!#$ 生物破乳剂产生菌 @" 的发酵动力学 侯 宁 李大鹏 马 放 $ 李春燕 东北农业大学资源与环境学院 黑龙江哈尔滨 # $ 哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点试验室 黑龙江哈尔滨 # 摘要 为了优化生物破乳剂生产的发酵过程 提高生物破乳剂的产量 对破乳剂产生菌!+ 9"++@" 的分批发酵过程进行了研究 根据破乳剂产生菌 @" 发酵过程的特点 在. 方程和 85D. 方程的基础上 建立了菌株 @" 发酵过程中菌体生长 基质消耗和蛋白类破乳剂形成的动力学方程 采用!# 软件对试验数据进行处理 得到了破乳菌 @" 的分批发酵动力学模型参数 结果表明 模型预测值和试验值吻合较好 所建立的方程能较好地预测其实际发酵过程 具有很好的适用性 对生物破乳剂的发酵生产具有一定的指导意义 关键词 破乳剂产生菌 分批发酵 蛋白类破乳剂 发酵动力学 动力学模型中图分类号 @!$ 文献标志码 文章编号! "!!!#$ "## "# #-4"-"##$ # >8 # $ $ - 0/(.... /.# $+... -. 0/(....- # #.(.-(..-(-.9(/@". 6...6/....-(.. 8.9... -.@".. 85D...8.(6...-(.. -.-. 6...(.. (-5.(..6 6.!# -.6... -(.. 85.((.(.-. /6..(..6... 8.(.-...-(.. # 5(-. -5. -(... (- -(.5. 8. 8.( 在当今石油工业中 伴随原油的开采 每年有数以百万吨成分复杂的原油乳状液形成 这会对原油的产出率造成影响 如果处理不当会给生态环境带来严重的危害 因此油田乳状液的破乳已成为目前各国研究的热点 目前对于乳状液的破乳包括物理破乳法 $ 化学破乳法及生物破乳法 生物破乳剂是生物表面活性剂的一种 它与化学破乳剂相比 不但具有环境兼容性强 无毒 生物降解性强的特点 且在极端环境条件下 生物破乳剂具备更加出色的破乳性能 近年来 对生物破乳剂的研究日益增多 至今已发现的破乳菌种包括 气单胞菌属 0 + 产碱杆菌属 0!+ # 和微球菌属 $!!!+ 等 然而目前对生物破乳剂的研究大多数停留在产破乳剂菌株的筛选 廉价培 收稿日期 $$ "$ " 基金项目 国家自然科学基金资助项目 $!# 中国博士后基金资助项目 $! 黑龙江省青年基金资助项目 $$ 作者简介 侯 宁 女 黑龙江哈尔滨人 博士 #!( 主要从事环境微生物制剂的研究 李大鹏 男 内蒙古林西人 博士 ( 主要从事农业固体废弃物资源化的研究
第 卷 养基选择 破乳活性测定 破乳适宜条件等方面! 对生物破乳剂发酵动力学研究甚少 发酵动力学是对微生物生长和产物形成过程的定量描述 动力学模型主要的用途之一是利用小试得出的数据设计大型工艺 发酵动力学的研究可以提高生产过程控制水平及产品质量 发酵过程建立的数学模型可分为机理模型 半经验模型和经验模型等 生化反应由于过程极为复杂 多采用半经验模型或经验模型 相关动力学机制研究成果较多 而对生物破乳剂产生菌细胞生长及代谢过程动力学的研究未见报道 针对这种情况 笔者在进行生物破乳剂产生菌的筛选及培养特性等研究的基础上 并在试验确定的最佳培养基和最佳培养条件下进行发酵培养 对产生物破乳剂的菌株进行发酵动力学研究 发酵动力学模型一般包括菌体生长动力学模型 底物消耗动力学模型和产物生成动力学模型 本试验所用菌株 @" 筛选自大庆油田受石 $ 油污染土壤 在前期研究中发现 其 $ 破乳率为 # 以上 破乳率可达 该菌所产生物破乳剂为胞外分泌的多种蛋白类物质 其破乳效果随蛋白质量浓度的增加而升高 在本研究中 选择合适的经验模型 根据试验所测数据利用!# 软件对经验模型进行非线性拟合 回归得到生物破乳剂产生菌的细胞生长动力学模型 基质消耗动力学模型和产物生成动力学模型 根据模型计算出预测值 并与实测值进行比较 试 验 0 试验菌种及培养条件 试验菌种 破乳菌株 @" 分离自大庆油田受石油污染的土壤 经生理生化及 + 鉴定为芽孢杆菌属莫海威芽孢杆菌!+9"++ 其在 8 的登录序号为 >#$# 菌种保藏编号为 4 # $ 培养基 斜面种子培养基 牛肉膏 # 蛋白胨 # 琼脂粉 $ 葡萄糖 # 去离子水 (! 于 $ J 下灭菌 $ ( $ 种子 发酵培养基 $ D $ D 4+! $ $ 微量元素溶液 ( 液体石蜡体积分数为 酵母膏 葡萄糖 去离子水 ( 于 $ J 下灭菌 $ ( 葡萄糖单独灭菌 0 试验方法 $ 生物破乳剂产生菌的培养过程取 $ 组 $# ( 锥形瓶 内含 ( 发酵培养基 在无菌操作条件下以体积分数为 # 的接种量接种种子液 编号 $ 每组做 个平行样 置 J ( " 的摇床培养 每隔 按编号顺序取出 组样品检测 $$ 生物量的测定取破乳菌全培养液 在转速为 ( " 温度为 J 下离心 $ ( 弃去上清液 用磷酸盐缓冲液冲洗 $ 次 弃去上清液 以除去残留的培养液有机物 在离心管中沉淀 温度为 # J 干燥至恒重 称重 $ 葡萄糖质量浓度的测定葡萄糖质量浓度的测定采用 # " 二硝基水杨酸比色 + 法 $ 破乳菌胞外蛋白质质量浓度的测定取各培养时段破乳菌 @ " 的全培养液 $ ( 在转速为 ( " 温度为 J 下离心 ( 后去除菌体保留上清液 按照 # 的比例加入冷丙酮 "$ J 在 "$ J 放置 ( 后 ( " 离心 ( 弃上清 使沉淀风干 用 $ (! ( 的磷酸缓冲液溶解沉淀后采用. 9D. 试剂盒测 $ ( 全培养液中蛋白质量浓度 计算待测培养液中蛋白质质量浓度 结果与讨论 0 生物破乳剂产生菌发酵过程代谢动力学根据生物破乳剂产生菌培养过程中所测定的细胞生长 基质消耗和产物生成的试验数据所构建的生物破乳剂产生菌发酵过程代谢动力学曲线如图 所示 由图 可以看出 菌体生长缓慢 为 个比较明显的延滞期 后 菌体生长迅速进入对数生长期 $ 后菌体生长开始有减慢的趋势 # 后进入稳定期 从葡萄糖消耗情况来看 $ 菌体耗糖较少 $ 后耗糖加快 进入快速耗糖期 后耗糖减慢 发酵至 时 残糖约为 # " 从胞外蛋白产物合成情况来看 $ 产物生成速度缓慢 $ 后产物生成速度开始加快 #
第 期 侯 宁等 生物破乳剂产生菌 @" 的发酵动力学 后进入快速产物生成期 后产物生成速度减慢 趋于稳定 由菌体生长曲线和胞外蛋白合成曲线可知 在菌体生长的同时即有产物生成 胞外蛋白产物的生成与破乳剂产生菌细胞生长过程密切相关 因此 推测破乳剂产生菌合成胞外蛋白的发酵过程属于生长偶联型发酵 图 破乳菌株 @" 发酵过程曲线 0 菌体生长动力学模型描述菌体生长最常用的模型为 4 方程 该模型为典型的决定论均相非结构模型 它是基于假设 菌体生长为均衡型非结构式生长 细胞成分只需要用 个参数即菌体质量浓度表示 培养基中只有 种底物是生长限制性底物 其它营养成分不影响微生物生长 将微生物生长视为简单反应 并假设菌体得率为常数 没有动态滞后 显然 与破乳剂的发酵过程有冲突 而且由于破乳剂发酵采用较高质量浓度的葡萄糖 发酵液比较黏稠 存在严重的扩散限制 因此不宜使用 4 模型来描述菌体生长过程. 模型是典型的 + 型曲线 能很好地反映分批发酵过程中因菌体质量浓度增加对自身生长存在的抑制作用 能较好地拟合分批发酵过程的菌体生长规律 本研究采用. 方程描述破乳剂产生菌菌体的生长规律 4 模型 @. 模型 @ + ( @ + ( " @ @( @ 式中 ( 为最大比生长速率 " 为 4 饱和常数 (( " + 为基质质量浓度 " @( 为可得到的最大菌体质量浓度 " @ 为菌体质量浓度 " 分批发酵开始时 菌体质量浓度很低 即 @ 比 @( 小得多 @ 项可忽略不计 方程 表示菌体 @( 呈指数生长 对数生长期结束后菌体生长处于稳定期 @ @( 方程 表示菌体生长停止 在时间为 对方程 两边积分 整理后得 @ " @( " @( " @ $ 式中 @ 为初始菌体生物量 " @( 为最大菌体生物量 " 为时间 将试验平均值 @$ " @( $ # " 分别代入式 $ 整理后得 @ @( @( " @ $ #!$ " 应用!# 数学软件对菌体生长动力学模型式 进行非线性拟合 拟合结果如图 $ 所示 图 $ 菌体生长动力学模型与试验数据对比曲线 拟合后得! 由图 $ 可以得到 $ 在 前拟合相对误差较大 后的试验点数据拟合较好 其原因 细胞生长初期生物量 细胞干质量 较小 容易产生测量误差 因为. 方程主要反映菌体质量浓度的增加和营养物质的消耗对自身生长的抑制作用 在延滞期和加速生长期 菌体质量浓度不高 营养物质丰富 对自身生长的抑制作用不明显 从而导致相对误差较大 拟合情况不如稳定期理想 所建模型基本可以反映破乳菌合成破乳剂发酵过程的菌体生长规律 菌体生长过程的中后期拟合较好 0 产物生成动力学模型 细胞内的生物合成途径十分复杂 其代谢调节机制特点各异 目前还没有统一模型来描述代谢产
/ 第 卷 物生成动力学 按照产物生成速率与细胞生长速率之间的关系 细胞代谢产物生成规律可分为 类 产物形成与菌体生长偶联型 此类反应产物的生成与细胞生长过程相关 在菌体生长时才有产物生成 产物形成与菌体生长部分偶联型 此类反应产物的生成与基质消耗仅有间接的关系 大部分产物是在菌体处于生长稳定期形成的 产物形成与菌体生长非偶联型 此类反应产物的生成与细胞的生长无直接联系 当细胞生长停止后 产物大量生成 对于生长偶联型菌体发酵过程 胞外蛋白产物的生成与破乳剂产生菌细胞生长过程相关 描述这类反应的动力学方程为 @ @ 式中 为产物质量浓度 为动力学模型参数 为与非伴随菌体生长的产物形成率 @ 为与菌 体生长率相关的产物形成率 当 产物形成与细胞生长无关 当 时 产物形成与细胞生长部分耦联 当 时 产物形成为菌体耦联型 对式 两边求导得 @ $ #!$ "!$ " $ # 将式 # 分别代入式 得 $ #!$ " $ #!$ " 对方程 两边积分 得 $ # #!$ ""$!$ " 将! 代入式! 得 $ #!$ "! "!$!$ "!$ "! "!!$ "! 由于破乳剂产生菌合成胞外蛋白的发酵过程属于生长偶联型发酵 所以 式 可写为 $ #!$ "! 应用!# 软件对胞外蛋白合成生成动力学模型对式 进行非线性拟合 结果如图 所示 拟合后得到 $ 由图 可以得到 $ 在 $ 前拟合相对误差较大 最大为 $$ 后的试验点数据拟合较好 其原因为胞 外分泌蛋白合成初期产量较小 容易产生测量误差 从而导致相对误差较大 从拟合结果来看 所建模型基本上可以反映破乳菌发酵过程的胞外蛋白生成规律 胞外蛋白合成过程的后期拟合较好 图 产物合成动力学模型与试验数据对比曲线 0 底物消耗动力学模型 底物包括细胞生长所需各种营养成分 其消耗主要有 细胞生长消耗 用以合成新的细胞 细胞维持基本生命活动消耗 用于合成代谢产物 因此 用 85D. 方程表示的基质消耗速率为 " + @ $ @ 式中 + 为葡萄糖质量浓度 " 为碳源用于菌体生长的得率常数 $ 为碳源用于产物积累的得率常数 为微生物碳源的维持常数 " 在菌体生长与产物的大量生成是耦联的过程 菌体的生长和产物的积累主要依赖于基质葡萄糖消耗所提供的能量 而维持破乳剂产生菌自身正常基础代谢的能量消耗较小 故式 中的 @ 项可舍去 式 可整理为 " + @ $ 令 则式 可整理为 $ " + @ $ 将式 分别代入式 $ 在 区间对式 $ 两边积分得 $ # # + + "!$ ""$!$ " 将! + "$ 代入式 得 + " $$! $ #!$ "! "!$ "! 应用!# 软件对葡萄糖消耗动力学模型式 进行非线性拟合 拟合结果如图 所示
第> 期 > #侯#宁等! 生物破乳剂产生菌 dm4+ 的发酵动力学 ( 江苏大学学报!自然科学 OL8W乳状液的稳定性 ] 版#65#6. ".!55 4556 (\ # M U D #J OD N @ @Q D / T / @ D @@ @N @ " OL8W N@ ] ( / #" 7/ "#$ # 4!J" " OD # @ ##65#6. ".!55 4556"! ( #M d # \R # \ \ 0 # i 图 "#底物消耗动力学模型与试验数据对比曲线 D Q T N D @ " $ # Q @ N H 拟合后得 _"n-!.## _6n+6. "0由图 " 可以 得到#O6 _n--! -# 在 6+ D 时# 相对误差稍大# 其余 大部分试验点数据拟合较好0所建模型可以较好地 d] + T D N ]( Z # $ # 6+6# +"! 5! 45!. " ( # D 8# M @]P# J jh @ 反映破乳剂产生菌胞外分泌蛋白合成发酵过程的葡 N N D! Q 6 QQ 萄糖消耗规律0 Q ] ( Z # $H@4 "# # 6# 65! -- 4 通过对发酵过程中菌体干质量 破乳剂产量及 葡萄糖质量浓度与时间进行拟合# 在 _"n-!.# # _6n+6. " 时得到! 个发酵动力学方程#即 破乳剂产生菌生长动力学模型!!n96+ 5 d+ _ n 6-4n!9 " $ + ^ 胞外蛋白产物合成动力学模型! n+66 + _ n 6-4n!9 " $ + ^ 葡萄糖基质消耗动力学模型! n.5 9 9n+6. + 4 + _ n 6-4n!9 "4 n 6-4n!9 " 0 + ^ + ^ +6+ 5 ( #M d # \ ] # \ \ 0 # H @ D @ N D Q Q Q N @ Q NH " $ # Q ] ( Z # $ # 6-# +! +!59 4+!.5. ( #M d # X J # \ ] # OD QD N @ ( Z # $ # 6+# Q N ] ++!!+ 4!6! ( #U h # \ R # U g # j @ D @ Q N Q @ #" ]( Z # $ # 6+6# ++.! 6" 469 9 ( #余龙江发酵工程原理与技术应用 R( 北京!化学工 $结论 业出版社#6.! 个发酵动力学方程较好地拟合了发酵过程中 菌体生长产物合成 底物消耗与时间的关系# 可以 - ( #陈#坚#堵国成#李#寅#等发酵工程实验技术 R( 北京!化学工业出版社# 6!! ++ 4+" +( #8N (# M Z H# O N \OD @ 描述生物破乳剂产生菌 dm4+ 的细胞生长动力学 Q D 过程及底物消耗情况#解释其动力学规律#具有很好 ( # 6+# T N N ] 的适用性#可为实际发酵过程中细胞生长产物合成 及底物消耗情况的预测与控制提供理论依据0 +"+!+5! 4+. ++( #戚以政# 汪叔雄生化反应动力学与反应器 R( 北 京!化学工业出版社# +--- 参考文献" 4 5. # + ( #侯#宁#马#放#李大鹏# 等高效破乳菌的破乳效能 及活性成分 ] ( 石油学报! 石油加工#6-# 65"!! "!5 4""+ M ( # Rb # \P Q # P @ +6( #\d#\8 #\ OD # OD D N @ Z" W "4 # dm+ D D @ @ N Q @ DQ @ @ @Q ]( Z # 6+6# """!.6. 4.!" D @Q N ] ( H " # "! #$ ## 6-# 65"!! "!5 4""+" OD 水/ 6 ( #倪 # 良# 胡莹海# 吴春笃电导法研究环己烷 / " 责任编辑#贾国方