第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!" #$# # %' 基础研究 钠通道 突变体 的构建及验证 胡培静 杜 媛 王 娅 王亭忠 王娟娟 陈春燕 马爱群 西安交通大学医学部第一附属医院心血管内科 陕西省分子心脏病学重点实验室 环境与疾病相关教育部重点实验室 陕西西安 摘要 目的 构建并验证 %#' 综合征相关钠通道 基因 突变体 方法 采用一步法 ( 突变技术 以 )*+(, 为模板 体外定点诱变构建 )*+(,, 突变体 进行基因测序 并用 -. /0$! 1."$ 脂质体转染法转入 ) 细胞 通过 $ $" 2/."' 和膜片钳记录检测蛋白质表达和电流加以验证 结果 测序结果显示, 突变体基因序列上第 其他序列碱基与野生型相比未发生改变 $, $" 2/."' 结果显示, 突变体蛋白表达量较野生型 降低 荧光显微镜下显示, 突变体蛋白位于胞质内, 突变体转染后膜片钳记录未能检测到钠电流 且 突变体对野生型通道有负显性抑制作用 结论 成功构建并验证 基因 突变体 关键词 钠通道 突变 %#' 综合征 定点诱变中图分类号 文献标志码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编码心脏电压依赖性钠通道 : 的 亚基 : 介导的内向电流 对心肌细胞动作电位的产生和传导有着重要的作用 决定着心脏电脉 冲的兴奋性和传导速度 基因突变与多种心律失常的发生有关 如功能获得性突变 引起 增 加 可以导致 型长 综合征 -, 而功能缺失性突变 引起 降低 可以导致多种心律失常 包括 %#' 综合征 %#' " /1$% 进行性心脏传导系统疾病 病态窦房结综合征及房颤 等 其中 是 基因的一种错义突 收稿日期,, 修回日期,, 基金项目 国家自然科学基金资助项目 / # / $ $./" 2 # 2!.$"!$+/#"./"/0." / 通讯作者 马爱群 ),1.21.9#"1$ 1.2!/1!" 杜媛为共同第一作者 优先出版!". "$!1 $.2 12,,
西安交通大学学报 医学版 第 卷 变 可以引起 %#' 综合征 此突变是由 8$/1$ 2 / 等人在一位 岁无症状的男性患者发现的 其有典型的 % 型心电图的表现 段抬高 导联 波扭转以及不完全性右束支传导阻滞 突变引起通道蛋白发生转运障碍 蛋白质过多滞留于内质网 导致 降低 并对野生型 有明显的负显性抑制作用 目前尚未有关于 突变纠正的研究 我们设计的本实验拟在野生型 的基础上 用一步法构建, 突变 并用分子生物学及电生理方法对其进行验证 为后续有关突变纠正措施的研究提供基础 材料与方法 + 材料 人胚胎肾细胞 ) 购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心 野生型人 )*+(, 质粒和 5 细菌来自于本实验室 5 ) 培养基 胎牛血清及 -. /0$! 1."$ 购自 ", :. /'$" 公司 #.! "'$ 定点突变试剂盒购自 3'.2$" 公司 去内毒素质粒提取试剂盒购自. '$" 公司 兔抗 : 单克隆抗体购自 32 1/"$ 公司 山羊抗兔 ( 标记二抗购自 " #7 公司 引物合成及测序由北京奥科生物技术有限公司提供 +, 突变体 -)./011 的构建 根据定点突变试剂盒要求 设计引物序列如下 <, **, ** 3 *33 *33*3 ** *,<<,**, 33*3 3 ** 3* * 3 3,< 引入突变点 按照试剂盒说明进行点突变操作 然后提取质粒并测序 + 基因转染 ) 细胞在含有 1-- 胎 牛血清的 5 ) 培养基培养 转染前 将细胞铺于 11 的培养皿中 后待细胞生长至密度约为 = = 时 采用 -. /0$! 1."$ 脂质体转染法 分别转入 )*+(,, ' )*+(,, ' 或 )*+(,, '> )*, +(,, ' 后在? 下继续培养 + # 检测蛋白质表达 转染 后 收集细胞提取蛋白质 进行蛋白定量并变性 然后进行 5,(3*) 电泳 按 的条件转膜 用 '1- 的 % 脱脂奶粉封闭 加入兔抗 : 单克隆抗体 @? 过夜孵育 然后吸去一抗 % 漂洗 次 每次 1." 再加入山羊抗兔二抗 @ 后室温孵育 吸去二抗 % 漂洗 次 每次 1." 然后用 $1.5/!, ; 发光仪上成像 + 全细胞膜片钳记录 采用 (, 微电极拉制仪 # $ 公司 拉制玻璃微电极 电阻为 电极内液成分为 11/2-2 2 )* 3 )() 采用 A 调节 至 电极外液成分为 11/2-2 2 2 ' 2 )() '2#!/ $ 采用 A 调节 至 选择状态良好的单个细胞建立 * 封接 再给予负压破膜形成全细胞模式 然后记录, 结 果,+ 测序证实突变位点成功建立 5 3 测序结果显示 与野生型 )*+(, 相比 )*+(,, 突变体第 位由 变为 对应 位氨基酸由 转变为 而其他碱基序列未发生改变 提示 突变体构建成功 图 图 测序图显示 突变体第 位由 变为 +.' 5 3 $9#$"!."'$ #2 / $ $ $/"! "'$ 0/1 / /0 1#./",+,1 突变体蛋白质表达降低 $ $" 2/."' 结果显示 无论是转染 )*+(,, 还是转染 )*+(,, 突变体后 ) 细胞均表达钠通道蛋白 但转染 )*+(,, 突变体后 表达量显著降低 图 符合钠通道转运障碍型突变的蛋白 表达特征,+ 1 突变体蛋白质表达于胞质 荧光显微镜观察结果显示 )*+(,, 转染后主要表达于细胞膜上 而 )*+(,, 突变体转染后主要表达于胞质 细胞膜上不表达 将 )*+(,, 和 )*+(,, 共转
期 胡培静 杜 媛 王 娅 等 钠通道 突变体 的构建及验证 染细胞后可见既表达于胞质 也表达于细胞膜上 但是与单纯转染 )*+(,, 相比 细胞膜上表达量显著降低 图 这也进一步证实, 突变体符合转运障碍型突变特征,+1 突变体不表达 膜片钳记录结果显示转染 )*+(,, 的 ) 细胞表达特征性 而转染 )*+(,, 突变体的 ) 细胞不能记录到 将 )*+(,, 和 )*+(,, 共转染细胞后 同样可以记录到与 )*+(,, 转染后形 态相似的 但是其峰值电流明显降低 说明, 突变体对, 通道有负显性抑制作用 图 图, # 结果显示 通道 突变体蛋白表达降低 +.' $ $" 2/."'$ #2 / $ / $."$ $,./"/0 $ 1#./" $ #!$ )*+(,, )*+(,, 讨 论 编码的电压依赖性钠通道 : 主要参与心肌细胞动作电位快速去极化过程 同时在平台 图 荧光显微镜观察结果显示 -)./011 和 -)./011 的表达定位 +.' -/! 2.7./"/0 )*+(,, " )*+(,, $ $./" 左列图显示 )*+(,, 主要表达于细胞膜上 中列图显示 )*+(,, 突变体主要表达于胞质 细胞膜上不表达 右列图显示 )*+(,, 和 )*+(,, 共转染后胞质及细胞膜上均可见表达 但细胞膜上表达量显著降低 箭头指向细胞膜 图 膜片钳结果显示 突变体不表达 且对野生型通道有负显性抑制作用 +.' (!!2 1."'$ #2 / $ "/ /.#1!#$" $!/ $ 0/1 $!$2 $ $."', 1# "! ""$2 ", $$ $ /1." ","$'.:$$0$! /",! ""$2
西安交通大学学报 医学版 第 卷 期也发挥部分作用 基因突变与 型长 综合征 - %#' 综合征 病态窦房结综合征及房颤等心律失常的发生有关 - 综合征共有 - - 个亚型 其中 - 的发生与 突变有关 - 综合征是一种心脏动作电位复极延长 体表心电图表现为 间期延长 易发生室性心动过速 室颤 特别是 ( 尖端扭转型室性心动过速 等恶性心律失常的 疾病 %#' 综合征是 年由 %#' 兄弟首先发现并命名的 其特点是反复发生的心脏骤停 非典型的右束支传导阻滞以及体表心电图, 导 联持续性 段抬高而心脏的结构正常 目前发现了 个可以导致 %#' 综合征的基因 其中 基因上有 多个可以引起 %#' 综合征 的突变位点 根据 突变位点不同可以分为 类 错义突变 约占 = 如 - * 移码突变 约占 = 包括缺失 插入突变等 如 $2 2 无义突变 约占 = 如 ; ; 剪接突变 约占 = 其他突变 约占 = 突变位置主要集中在钠通道的跨膜区 约占 %#' 综合征基因突变病例的 = 对引起 %#' 综合征的 突变进行外源表达研究后发现 钠通道呈现不同程度的功能下降 其机制包括 钠通道表达减少 通道蛋白合成障碍或细胞内蛋白转运障碍 导致细胞膜表面功能性钠通道表达减少 钠通道电流动力学异常 钠电流激活 失活 恢复的电压依赖性和时间依赖性改变 如激活延迟 失活加快 复活减慢 或进入缓慢恢复的中间失活状态 这些改变均可导致钠离子通道功能失调 既有钠通道表达下降 又存在通道动力学特征的改变 钠通道功能降低 电流减小 导致心脏特别是右心室及右心室流出 道传导速度减慢 从而诱发折返性心律失常 %#' 综合征的治疗方法主要包括药物治疗和心律转复除颤器的植入 药物治疗中主要应用的是奎尼丁 其通过减小 / 电流而减少 %#' 综合 征患者心律失常的发生 尚未有药物能治愈 %#, ' 综合征 尤其是针对突变类型的治疗方法 心律转复除颤器植入是唯一已证实对 %#' 综合征治疗有效的方法 此外射频消融术也是一种新的治疗 方法 错义突变 * 可以导致 %#', 综合征 研究发现抗心律失常药美西律可以在细 胞水平纠正 * 突变 虽然在体内美西律是否同样能纠正此突变进而使患者的心电指标恢复正常还有待进一步研究 但此研究至少为 %#' 综合征的治疗提供了一种可能有效的新方法 目前尚无 关于 突变纠正方法的报道 因此 体外构建 突变载体 深入研究 引起 %#' 综合征的分子机制 进而探索其可能的特异性纠正方法 对于因该突变导致的 %#' 综合征的防治具有重要的理论及实际意义 定点诱变是分子生物学研究中常用的方法 本实验中应用的一步法基因诱变技术是以 ( 为基础的定点突变技术 以反向 ( 为基础 以含有目的基因的环状质粒为模板 用 个 端相邻且磷酸化的诱变引物进行反方向延伸 扩增产物再用 酶纯化 酶降解甲基化或半甲基化的只含有 条模板链的模板链 而在体外合成的突变链不受 酶的降解 与其他定点突变方法相比 一步法基因诱变法步骤简单 花费低 效率高且成功率高 本实验通过一步法基因诱变技术 成功将 基因序列上第 位的 诱变为 使其蛋白质序列上第 位的精氨酸 突变为色氨酸 $ $" 2/."' 法及膜片钳记录均证实 突变体符合转运障碍型突变的特征 与野生型 相比 的蛋白表达与电流均降低 原因可能是突变引起蛋白质的转运发生障碍 细胞膜上通道蛋白表达降低 从而降低了 并导致 %#' 综合征 本研究采用一步法成功构建 )*+(,, 突变体 为后续探索 突变体的纠正方法研究奠定了基础 参考文献 1!!1 / 1223'/ $" # "# "#" # " # ( 薛小临 廉姜芳 崔长琮 先天性长 4 综合征家系的临床特点 西安交通大学学报 医学版 20/'5 6 /'5 0/'5$ $ '/ / % # " ) # #" + # 4 " " $03 20/'566/'5 #" #" # ( "4 ( # " ),+( " + + #+# 4 #"# " "" ( "#" + " # "# """ 1+# 1 3'7 '/! 15$01/!/ " #" # * 0 / 7 236/.10(3$ 11! /!/ 51' 1$. ( # $ '/ '( # ' + (* " ( # 下转第 页
期 张杰波 刘映峰 缪 绯 等 促红细胞生成素对缺氧复氧心肌细胞! $, 表达及 A1. 3 转位变化和 A1. 3 沉默时对其的影响 参考文献 $7 3'5 7 (+ # " " # + /+" # # # # #, # 7 / 26! /'/ 0!!3 0/3 3.3$. 1 + +"!"$#! /( / / 21 % 2$.31 3 03. '/ +"# # " "( '/ + " '/ # # # ' # $01' 5 '/ #" # ++ # (!" ( 7! /.1 7! 7%/ $ $ 013 0/ 1 1 ( + ) +# * 3$0336$/ /./! / /!3 + # # + # + 8 ( + "'+. + / / /6!$$ 3!/' 0 7'1$ $ 1 ( + # # " * "#+"# # " # 邱炯 赵玉伟 李法琦 等 促红细胞生成素对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌的保护作用 吉林大学学报 医学版 ( /. /57%1 / / 61 7'.!1 ( + + # #" + 8 " # " ( /32$1!1'2/5 + " (( - " + ( " "# + # #" # + 8 # 3 $ 3'3%/$ /$! 0/3 $ # +(++ ## # " + 0 /7 ' $ #! $ 3'3%/$ /$!5 /$./ / 3 * ++ + * # " + 7 0 / ( 3 1' 3 6 3/23$ 5/$7 './ / /'.3/'!! 7 0 / + " # + ( "#" # " #/ ( 编辑 国 荣 上接第 页 5 3 1!!$ 3!1' /!!3 1 "# / 1. 701'313$'1. " ( ) ") " # #" # 8 * 9 /# 1 3'!57 7!05 ##" ## #" ( " ( 5/./ 5/./ *"*# *# +( $ """#" #" " ( # # #"# #" + #" / # + / " ( 3/$/ /!! 10 1 5 #* " "!" %/.3%3/ '/5/ 7!7!/ 31 $ 3 ' # # "* + * "* * #(,+ 01 #! " ( * # ) # " " " # "*" #+ ++ #31111!" $# 6/' 5/' 21 1%3 0 * " " " # # " ) $ ( #!/$0/! 7 / 3'.1 "( " " " " #!" ( /' 0%/.3%3/ $7'5,+ "# $ '/ 5 "+" + # *# "4"#*, / 0 # 0 ( 编辑 韩维栋