第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'&!& 技术方法研究 试验检测碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的临床应用 李渊婷 金凤玲 兰州大学第一医院检验科 甘肃兰州 摘要 目的 探讨 #$%$&' 试验检测碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的临床应用 方法 收集碳青霉烯类抗生素耐药的 株肠杆菌科细菌 法药敏试验检测常规药物敏感性 " 法检测试验菌株对碳青霉烯类抗生素的最低抑菌浓度 ()# 值 分别用改良 *+,"#$%$&' 试验筛选碳青霉烯酶表型 然后用 #$%$&' 试验进行碳青霉烯酶表型分类 " 法测定金属酶 用 '#- 检测耐药基因 结果. 株 #$%$&' 试验阳性且经 #$%$&' 试验证实为产 类金属酶菌株 '#- 均证实携带 &/( 基因型 结论 #$%$&' 试验方便快捷 结果易于判断 与耐药基因检测符合程度高 适合实验室常规开展 关键词 碳青霉烯酶 #$%$&' 试验 肠杆菌科 耐药基因中图分类号 -..0 文献标志码 1 0!"#$%!! )!$,)&",, #$$+%$+%"%*+$+2$3+!45"%$3+!#$ &'$& ### ' "##() ##&*("+""" (## ",)- +#"#"# #()##" "#(# # &.)+""# ((( ##!/#(&!"" 0"!0"' +"##(# & '+"# #(+#+'/&.)+" "#(1 (& (## *+""##&.+'"#"-)# '& + (1 (.)"#" '!) *& '#" # ## +* ("" "(&#" ("& % $ #( '##") 近年来 由于抗菌药物的不合理使用 耐碳青霉烯抗生素肠杆菌科细菌 $%$""7%"$""% +$"%$"$"#- 检出日益增多 使临床不能再单以碳青霉烯类抗菌药物治疗此类细菌的感染 中国 #*)&9 细菌耐药性监测显示 肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的总耐药率从 年的 0: 逐年增加到. 年 : #- 主要耐药机制为产碳青霉 0 烯酶 美国临床和实验室标准化协会 #;)6 年推荐使用改良 *+," 试验筛查产碳青霉烯酶肺 炎克雷伯菌 但此试验耗时长 结果不易判读 年 #;) 药敏试验指南提出用 #$%$&' 试验检测碳青霉烯酶 本研究就 #$%$&' 试验在临床实验室检测碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的应用进行探讨 材料与方法 菌株来源 收集兰州大学第一医院 年 月 年 月从住院患者标本中分离的肠杆菌科细菌 碳青霉烯类抗生素耐药菌株按照 年 #;) 收稿日期 0 修回日期 06 通讯作者 金凤玲 7$280+7 优先出版 8"87"$066-6.07!"!
期 李渊婷 金凤玲 #$%$&' 试验检测碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的临床应用 ; 药敏试验指南筛选 即厄他培南抑菌环 77 亚胺培南和美罗培南抑菌环 677 满足任一条件即为可疑菌株 剔除同一患者重复分离株后 共计 株作为试验菌株 阳性对照菌株为 年 月我院分离的第 株产 &/( 产酸克雷伯菌 已经卫生部细菌耐药监测网复核鉴定 阴性对照菌株为大肠埃希菌 19##6 ( 主要试剂和仪器 药敏纸片为 + 公司产品 包括阿米卡星 氨苄西林 舒巴坦 氨曲南 环丙沙星 头孢吡肟 左氧氟沙星 头孢他啶 头孢西丁 复方磺胺甲 唑 哌拉西林 他唑巴坦 四环素 阿莫西林 克拉维酸 头孢噻肟 氯霉素 庆大霉素 头孢哌酮 舒巴坦 头孢呋辛 头孢唑啉 头孢哌酮 头孢曲松 美罗培南 厄他培南 亚胺培南 美罗培南 厄他培南 亚胺培南及金属酶 " 试纸条 法国 + (%"! 公司 亚胺培南西司他丁钠 ("%8;$%/+7" #+% 他唑巴坦标准粉末 中国药品生物制品检定所 细菌蛋白提取试剂 *. 上海贝博生物 '#- 引物 上海生物科技 '#- 酶混合液 大连宝生物 ($%8"% 大连宝生物 '#- 基因扩增仪 美国 +-$ 公司 "8#+7$ 全自动细菌鉴定仪 法国 + (%"! 公司 <!$+" 型凝胶扫描成像系统 美国 +-$ 公司 /7 型电泳仪 北京六一仪器厂 微量天平 上海佑科仪器表有限公司 ) 方法 ) 菌种鉴定 用 "8#+7$ 全自动细菌鉴定仪及其配套革兰阴性细菌鉴定卡 =& 进行细菌鉴定 )( 药敏试验 用 法测定 种抗菌药物的表 试验结果判读标准 抑菌圈直径 结果按照 年 #;); 药敏试验指南判读 )) 碳青霉烯酶表型筛查 用 " 法测定美罗培南 厄他培南 亚胺培南的最小抑菌浓度 ()# 结果根据 年 #;); 标准判读 美罗培南.,7 亚胺培南.,7 厄他培南,7 满足任一条件即可判定碳青霉烯类耐药 *+ 试验 根据 年 #;) 配制试剂 #$%$&'1 试剂 *> 为每毫升, 酚红溶液中含 77+?;. 颜色为红色或者橘红色 #$%$&' 试剂 1 试剂 @ 亚胺培南 西司他丁钠 使得亚胺培南浓度为 07,7 颜色为红色或者橘红色 试验方法 用 接种环从 A > A 培养. 的血平皿上挑取菌落 个 加入 的细菌蛋白提取试剂中 涡旋 于摇床上震荡混匀 将 1 试剂 试剂分别加入每个待测菌对应的 $ 管中 涡旋 后置于 A >A 孵育 每 观察结果 结束 结果判断 得到的细菌蛋白酶粗提取物与亚胺培南反应 若细菌产碳青霉烯酶 则可作用于碳青霉烯类抗生素相应位点使其分解 同时会有 * @ 产生 当伴随产生的 * @ 浓度达到一定累积值时 检测液里的酚红会由红变成橙黄色或黄色即可判断为阳性 相比 之前 $ 试管仍为红色或橘红色 而 试管变为亮橘红 深黄色或者黄色为阳性反应 则可证实产碳青霉烯酶 试管不变色为阴性 橘色和其他颜色为无效结果 判读标准见表 9$;$$%2+%"%%",#$%$&' "%"! 试管 $ 试管 解释 试剂 1 试剂 红色或者橘红色 红色或者橘红色 阴性 不产碳青霉烯酶 红色或者橘红色 亮橘红 深黄色或者黄色 阳性 产碳青霉烯酶 红色或者橘红色 橘红 无效 橘红 亮橘红 深黄色或者黄色 其他颜色 无效 *, 试验 试剂配制 以 #$%$&') 试验所需的 #$%$&' 试剂为基础分别配制 试剂 试剂为 #$%$&' 试剂 试剂为 #$%$&' @ 他唑巴坦 他唑巴坦的终质量浓度为.7,7 试剂为 #$%$ &' @/91/91 终浓度为 7+) 试剂为 #$%$&'1 试剂 试验方法 提取细菌蛋白液的步骤同 #$%$&' 将细菌蛋白液加入 60 孔细胞培养板中 分别将 #$%$&' 试验试剂 加入相应的 $ 孔内 >A 孵育 每 观察记录 结束 结果判断 在 #$%$&' 试验原理上运用 1 类酶可被他唑巴坦等酶抑制剂抑制而不被 /91 抑制 酶能被 /91 抑制而不被他唑巴坦等酶抑制剂抑制 / 类酶只是轻微受酶抑制剂和 /91 抑制 相比 之前 $ 孔任意一孔变为亮橘红 深黄色!"!
0 西安交通大学学报 医学版 第 卷 或者黄色为阳性反应 不变色为阴性 橘色和其他颜色为无效结果 在当产 1 类酶时仅 1# 孔变橙黄色或黄色 产 类酶时仅 1 孔变橙黄色或黄色 若表 ( 试验结果的判读标准 1# 孔都变色 可能为产 / 类酶的菌株或同时产 1 类和 类酶 判读标准见表 9$;$$%2+%"%%",#$%$&')"%"! 1 孔 #$%$&' 试剂 孔 #$%$&' 试剂 @ # 孔 #$%$&' 试剂 @ 他唑巴坦.7,7 /917+ / 孔 #$%$&'1 试剂 解释 亮橘红 深黄色或者黄色 红色或者橘红色 亮橘红 深黄色或者黄色 红色或橘红色 1 类酶 亮橘红 深黄色或者黄色 亮橘红 深黄色或者黄色 红色或者橘红色 红色或橘红色 类酶 亮橘红 深黄色或者黄色 亮橘红 深黄色或者黄色 亮橘红 深黄色或者黄色 红色或橘红色 / 类酶 *- 改良."# 试验 按照 #;) 指南所述方法进行 用标准大肠埃希菌 19##6 调制 麦氏浊度单位 将其 B 稀释后均匀涂于 (* 琼脂平板上 在平板中间加贴厄他培南 9' 纸片, 片 自纸片外缘向平板边缘划线分别接种待检菌 阴性对照 阳性对照菌株 长度至少 77>A 培养. 观察结果 若阳性对照 待测菌株与大肠埃希菌 19##6 抑菌环交汇处出现大肠埃希菌生长增强 矢状生长 即为产碳青霉烯酶菌株 */%0! 法检测金属酶 将待测菌株调制为 麦氏浊度单位 用无菌棉签均匀涂抹于 (* 平板 将金属酶 " 试剂条加贴于平板中央 >A 表 ) 引物序列表 培养. 观察结果 若亚胺培南 亚胺培南 @ /91 的 ()# 比值 即为金属酶阳性 *1$ 及基因型鉴定 煮沸法提取细菌 /&1 6 按照参考文献设计引物 表 引物由上海生物科技公司合成 '#- 反应体系共 包括上 下游引物各 '#- 酶混合液 /&1 模板 加灭菌蒸馏水补足体积 '#- 扩增反应参数 6.A 预变性 7 6. A 变性 7 相应温度退火 7 相应条件延伸 共 个循环 A 延伸 7 '#- 扩增产物于 A 保存备用 制备浓度为, 的琼脂糖凝胶 然后电泳并用凝胶成像系统记录结果 9$'+7"%$"$ %"$+ %7"% 引物名称引物序列 CC 退火温度延伸温度产物长度 参考文献 &/( )(' )( ;'( #1=#1#1#99##919#9# -##=#11##19####9#99 9=1=#11=9919#9=9199# -991=99=#99==9999=19= 111=9919=##=#1#9#1## -9=#11#99#19=9919=##= ##91#119#911#==#=1## -9#=##=9=9##1==91911# A A 7 6 6 A A 7. 6A A 7.A 0A 7 0. ( 结 果 ( 试验菌株构成 株碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌中阴沟肠杆菌 株 6.: 肺炎克雷伯菌 株.6: 大肠埃希菌 株 : 弗劳地枸橼酸杆菌 0 株 0: 产酸克雷伯菌. 株 产气肠杆菌 株 60: 表. (( 试验菌株临床科室分布 重症监护室 株 0: 普外科 株 6: 儿科. 株.: 肾脏内科. 株.: 呼吸科 株 : 肿瘤科 株 6: 肝脏移植病房 株 60: () 试验菌株标本来源 痰 株 : 胆汁 0 株 : 血液 株 : 尿液 株 6: 吸痰 管 株 6: 引流液 株 6: 胸水 株 60: 脓液 株 60: 纤支镜洗液 株 60: (+ 药物敏感试验结果 法检测结果显示 全部试验菌株除对阿米卡星 左氧氟沙星 氯霉素 庆大霉素耐药率 : 外 其余抗生素几乎全部耐药 " 法测定美罗培南 亚胺培南 厄他培南 ()# 结果按 年 #;); 判读 均为碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌 (, 相关试验结果 改良 *+," 试验检测 株待测菌中.. 株阳性 阳性率 0: 图 表. 株待测菌中有. 株 #$%$&' 试验阳性 阳性率为 6: 图 表. 用. 株 #$%$&' 试验阳性菌株作为待测菌株进行 #$%$&' 试验. 株试验!"!
期 李渊婷 金凤玲 #$%$&' 试验检测碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的临床应用 菌 $ 孔均变为亮橘红 深黄色或者黄色 则碳青霉烯酶分型结果均为产 类碳青霉烯酶 图 表. " 法测定. 株试验菌株 金属酶阳性率为 : (*-$ 检测结果 扩增结果显示. 株菌只在 6 处有 $&/( 目的基因条带 与阳性对照产 &/( 产酸克雷伯菌扩增条带一致 图. 其余目的基因扩增结果均为阴性 ) 讨 论现有资料显示 #- 主要的耐药机制为产碳青霉烯酶 其次是伴有质粒介导 ; 和 或 质粒介导或染色体介导的 17# 酶产生 同时合并膜孔蛋 图 改良."# 试验阳性结果,'+5"%"!+27+2"*+,"" 0 白缺乏 较少产生外排泵 碳青霉烯酶按照 17 "% 分子分类分为 1/ 类 1 类为丝氨酸蛋白质酶 可分为 '#=;'-;( 基因型 类为金属酶 常见基因型为 )(')(;'(&/(/ 类为 D1 酶 由 $D1 等位基因编码 此 类酶在质粒介导下均易引起水平或垂直传播的耐药性 造成 耐药菌株的流行 本次试验 采用 #$%$&' 和 试验检测碳青霉烯酶表型 株试验菌株中. 株阳性且证实为产 类酶 采用 '#- 方法检测 类碳青霉烯酶基因型 其结果显示. 株 #- 均携带 &/( 图 ( 试验部分结果,;+7"%"!+2#$%$&' " 图 ) 试验部分结果,;+7"%"!+2#$%$&' "!"!
西安交通大学学报 医学版 第 卷 图 +$ 检测结果,.;+7"%"!+2'#-" @ 阳性对照菌 为阴性对照菌 表 +$% 菌种构成及其相关试验结果 9$.#+7++ +2#-%$$%"$""%"! 序号 缩写 #- 改良 *+," #$%$&') #$%$&') 金属酶 '#- "+ @ 8 @ 2% @ @ @ 类 @ &/(. 8 @ "$" @ 0 "+ @ @ @ 类 @ &/( 8+ @ @ @ 类 @ &/( 2% @ @ @ 类 @ &/( 6 2% @ @ @ 类 @ &/( 8+ @ @ @ 类 @ &/( 2% @ @ @ 类 @ &/( 8 @ @ @ 类 @ &/( 8 @ @ @ 类 @ &/(. 8+ @ @ @ 类 @ &/( 2% @ @ @ 类 @ &/( 0 8 @ @ @ 类 @ &/( 8 @ @ @ 类 @ &/( " @ @ @ 类 @ &/( 6 8 @ @ @ 类 @ &/( 2% @ @ " @ @ @ 类 @ &/( " @ 8 @ @ @ 类 @ &/(. 8 @ @ @ 类 @ &/( "+ @ @ 0 8 @ @ @ 类 @ &/(!"! 序号 缩写 #- 改良 *+," #$%$&') #$%$&') 金属酶 '#- 8 @ @ @ 类 @ &/( " @ @ @ 类 @ &/( 6 8 @ @ 8+ @ @ @ 类 @ &/( " @ @ @ 类 @ &/( "+ @ @ @ 类 @ &/( "+ @. "+ @ @ @ 类 @ &/( "+ @ @ @ 类 @ &/( 0 "+ @ @ @ 类 @ &/( "+ @ @ @ 类 @ &/( "+ @ @ @ 类 @ &/( 6 8 @ @ @ 类 @ &/(. " @ @ @ 类 @ &/(. " @ @ @ 类 @ &/(. " @ @ @ 类 @ &/(. " @ @ @ 类 @ &/(.. " @ @ @ 类 @ &/(. " @ @ @ 类 @ &/(.0 " @ @ @ 类 @ &/(. " @ @ @ 类 @ &/(. " @ @ @ 类 @ &/(.6 " @ "+ @ @ @ 类 @ &/( "+ @ @ @ 类 @ &/( @ 阳性 阴性 未试验 + 大肠埃希菌 8 肺炎克雷伯菌 " 阴沟肠杆菌 2% 弗劳地柠檬酸杆菌 "$" 产气肠杆菌 8+ 产酸克雷伯杆菌
期 李渊婷 金凤玲 #$%$&' 试验检测碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的临床应用 6 基因型 &/( 型碳青霉烯酶其耐药基因 $ &/( 转入质粒后 通过结合系统 )& 和广泛的宿主范围 ) 1# 通过共存质粒转移的移动能力 使其在不同菌 株中播散 这是使得其局部流行的重要原因之一 年 #;) 药敏试验指南提出 #$%$&' 试验不仅可以检测碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌 还能检测铜绿假单胞菌和不动菌属 有研究证实其在检测这 类细菌时的灵敏度 特异度均大于 6: 但对于产 D1. 型碳青霉烯酶敏感度仅为 : 且该试验 即可判断是否产碳青霉烯酶 方便快速 结果容易判读 同时可进行碳青霉烯酶分类 通过试验发现 待测菌在孵育 时即变色 间颜色基本无变化 大于 时阳性菌株会由原来的黄色变至淡橘黄色 比色效果不佳 本试验通过 '#- 证实 #$%$&' 试验准确性高 成本低 试验中有 株菌改良 *+," 试验阳性而 #$%$&' 试验为阴性 考虑可能是产 ; 或 17# 酶合并孔蛋白缺失 其 改良 *+," 试验出现假阳性 国外研究表明 #$% $&' 试验和分子试验结果高度相符是一个很实用 的检测方法 建议在临床实验室中常规使用 同时我国也有研究表明 #$%$&' 试验与 '#- 结果相符程度高 适合在临床微生物实验室 医院感染控制. 及疾病预防控制系统中普及应用 本次试验用 '#- 方法证实在 株碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌中检出. 株携带 &/( 基因 表明 &/( 是我院肠杆菌科细菌对碳青霉烯酶类耐药的主要机制 其余 株 #$%$&' 试验检测阴性菌株的耐药机制有待于进一步研究 参考文献 朱德妹 汪复 胡付品 等 & 年中国 0/'. 细菌耐药性监测 & 中国感染与化疗杂志 )6& 胡付品 朱德妹 汪复 等 & 年中国 0/'. 细菌耐药性监 测 & 中国感染与化疗杂志 )6& 汪复 朱德妹 胡付品 等 & 年中国 0/'. 细菌耐药性监测 & 中国感染与化疗杂志 )&. 胡付品 朱德妹 汪复 等 & 年中国 0/'. 细菌耐药性监测 & 中国感染与化疗杂志..0).& 胡付品 朱德妹 汪复 等 &. 年中国 0/'. 细菌耐药性监测 & 中国感染与化疗杂志.).& 0. -'! *&$#( #" #&. * /# 6)& #" $""/&(#$"" (#$# 6/($) (&$/&!)$6$&$""/6& #" $""/&(#$"" (#$# /($) (&$/&!)$$&$""/& 6/2/'3$ #) (.###"#" # #( 4 &!".)&!$%/'!*0/!3.0!&!#"# ())#(/!)%/!)"$!) (("("( ###(#1/&!) #)0& 杨莉 张红岩 & 碳青霉烯酶基因型的研究进展 & 中国微生态学杂志.000)0& 刘五高 丁友法 刘爱霞 等 & 质粒介导的耐药基因水平传播研究进展 & 中国卫生检验杂志 )6@60& $.*-!0,'.' %&. '#("#&(# (.)0&. 朱雄 袁敏 刘佳 龚林 等 &' 碳青霉烯酶检测方法在医院感染监测中的应用 & 中华医院感染学杂志.. ).& 冯娇 殷? 邱业峰 等 & 产 /! 酶. 种病原细菌的检测及其耐药性 & 中国兽医学报 )0& 编辑 邱 芬!"!