EPA 方法 694: 使用 HPLC/MS/MS 检测水 土壤 沉积物和生物固体中的药物和个人护理用品的 Agilent 64A LC/MS/MS 解决方案 应用报告 环境分析 作者 Imma Ferrer and E. Michael Thurman Center for Environmental Mass Spectrometry University of Colorado Civil, Environmental, and Architectural Engineering ECOT 44, 428 UCB Boulder, CO 839 USA( 美国 ) 摘要使用 Agilent G64A 三重串联四极杆质谱仪 (QQQ) 建立了水样中 65 种药物的筛选和确认方法 该方法按照美国国家环保局 (EPA)694 号方法指南进行开发 根据不同药物的极性和提取方式, 使用了 4 种不同的色谱梯度和液相色谱条件 应用了正 负两种模式的电喷雾电离和两种裂解转变的多反应监测分析 (MRM)( 每个化合物有一个定量离子和一个定性离子 ), 这使得本方法比 EPA 方法拥有更多的结构确证信息 所有药物的响应值在三个数量级范围具有很好的线性 (r 2 >.99) 为评价本方法的分析性能, 对从 Boulder Creek(Colorado) 采集的污水样品进行了实样分析, 在该样品中检出了卡马西平和苯海拉明 Jerry Zweigenbaum Agilent Technologies, Inc. 285 Centerville Road Wilmington, DE 988 USA( 美国 )
引言 近 2 年来, 一项挑战性的分析任务 检测环境中出现的污染物, 已经成为科学家们的重要研究目标之一 药物和个人护理用品 (PPCPs) 是污染物中一组重要的检测目标, 近十年来尤其如此 在个人护理用品检测领域, 已经研发出一系列有关此类物质的分析方法, 包括最近发布的 EPA 方法 694(27 年 2 月 ) [] EPA 的这种方法使用固相萃取 (SPE) 进样水样的制备 [] 所得提取物直接用串联质谱仪分析, 每种化合物用到一种裂解转变 本应用报告阐述了应用这种方法的安捷伦解决方案, 通过 Agilent 64A LC/MS 三重串联四极杆质谱仪得到了验证 安捷伦对 EPA 方法 694 的初步应用涵盖了 PPCPs 混合物中的 65 种被分析物 ( 总共 75 种被分析物 ) 和 7 种标记内标物质 ( 总共 2 种 ), 每种化合物用一种 MRM 裂解转变进行分析 ( 说明 : 当时其他化合物和内标物质无法获得 ) 该方法中, 使用 Agilent C-8 柱和 HILIC 柱 ( 亲水性相互作用色谱柱 ) 对所有化合物进行分析 为了得到更多的结构确证信息, 对 65 种被分析物中的 6 种追加应用了第二种 MRM 裂解转变, 由此得到的鉴定结果比 EPA 方法更有保证 本文中研究的药物名称见表 表. 本文中研究的被分析物 EPA 694 中的第 组化合物 :46 种被分析物 对乙酰氨基酚 可待因 氟甲喹 青霉素 V 磺胺 氨苄青霉素 可天宁 氟西汀 罗红霉素 噻苯哒唑 阿奇毒素 脱氢硝苯地平 林可霉素 沙拉沙星 甲氧苄氨嘧啶 咖啡因 洋地黄毒苷 洛美沙星 磺胺氯哒嗪 泰乐菌素 卡巴多 地尔硫卓 咪康唑 磺胺嘧啶 维吉尼霉素 卡马西平,7- 二甲基黄嘌呤 诺氟沙星 磺胺二甲氧嘧啶 地高辛 * 头孢噻肟 苯海拉明 氧氟沙星 磺胺甲基嘧啶 环丙沙星 恩诺沙星 苯唑青霉素 磺胺二甲嘧啶 克拉霉素 红霉素 噁喹酸 磺胺甲二唑 邻氯青霉素 脱水红霉素 青霉素 G 磺胺甲恶唑 * 化合物在当前条件下生成无法分析的钠加合物 EPA 694 中的第 2 3 和 4 组化合物 :9 种被分析物 脱水四环素 (2) 强力霉素 (2) 二甲胺四环素 (2) 三氯卡班 (3) 三氯生 (3) 华法林 (3) 金霉素 (2) 4- 差向脱水四环素 (2) 四环素 (2) 沙丁胺醇 (4) 甲氯环素 (2) 西咪替丁 (4) 二甲双胍 (4) 去甲金霉素 (2) 4- 差向四环素 (2) 吉非罗齐 (3) 雷尼替丁 (4) 布洛芬 (3) 萘普生 (3) 标记内标物质 3 C 2-5 N- 对乙酰氨基酚 3 C 2 - 红霉素 3 C 6 - 磺胺甲嘧啶 3 C 3 - 甲氧苄氨嘧啶 3 C 3 - 莠去津氟西汀 -d 6 3 C 6 - 磺胺甲恶唑华法令 -d 5 3 C 3 - 咖啡因 吉布罗齐 -d 6 3 C 6-2,4,5- 三氯 - 卡马西平 -d 苯氧基乙酸 ( 不含于 EPA 清单 ) 3 C 3-5 N- 环丙沙星 3 C 3 - 布洛芬 3 C 6 - 三氯卡班 可天宁 -d 3 3 C- 萘普生 -d 3 3 C 2 - 三氯生 2
实验部分 样品制备 药品标准品购自 Sigma (St. Louis, MO) 根据各种药物组分的溶解性, 用纯乙腈或甲醇制得单一组分的药品贮备液, 浓度约为, µg/ml, 在 8 C 保存 取这些贮备液, 用乙腈和水稀释制成工作标准溶液 水样从 Boulder Creek (Boulder, CO) 污水处理厂的排水口采得, 并按 EPA 方法提取 安捷伦介绍过的一种具有亲水 / 亲脂性的 SPE 聚合吸附剂可能也适合于这种样品的提取 用 空白 污水提取物制备基质相同的标准溶液用于验证 在污水提取物加入混合药物标准溶液, 制成不同浓度的加标溶液 ( 浓度范围为.~ 5 ng/ml 或 ppb), 然后用 LC/MS/MS 分析 LC/MS/MS 仪器条件 根据 EPA 的样品提取方法, 将被分析物分组, 各组的液相色谱分析分离条件如下 : 第 组的液相色谱条件 酸性提取, 电喷雾正离子化 (ESI+) 仪器条件 色谱柱 柱温 25 C Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8 2. mm, 3.5 µ ( 部件号 959793-92) 流动相乙腈 -.% 的甲酸水溶液 (:9) 流速.2.3 ml/min 梯度 t = % 乙腈,.2 ml/min t 5 = % 乙腈,.2 ml/min t 6 = % 乙腈,.3 ml/min t 24 = 6% 乙腈,.3 ml/min t 3 = % 乙腈进样量 5 µl 第 2 组的液相色谱条件 酸性提取, 电喷雾正离子化 (ESI+) 仪器条件 色谱柱 柱温 25 C Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8 2. mm, 3.5 µ ( 部件号 959793-92) 流动相 乙腈 -.% 的甲酸水溶液 (:9) 流速.2 ml/min 梯度 t = % 乙腈 t = % 乙腈 t 3 = % 乙腈 进样量 5 µl 第 3 组的液相色谱条件 酸性提取, 电喷雾负离子化 (ESI-) 仪器条件 色谱柱 柱温 25 C Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8 2. mm, 3.5 µ ( 部件号 959793-92) 流动相 甲醇 -5 mm 醋酸铵水溶液 (4:6,pH 5.5) 流速.2 ml/min 梯度 t.5 = 4% 甲醇 t 7 = % 甲醇 进样量 5 µl 第 4 组的液相色谱条件 酸性提取, 电喷雾负离子化 (ESI-) 仪器条件 色谱柱 柱温 25 C Agilent ZORBAX HILIC Plus 2. mm, 3.5 µm ( 部件号 959793-9 自 28 年 月 日起接受订购 ) 流动相 乙腈 - mm 醋酸铵水溶液 (98:2,pH 6.7) 流速.25 ml/min 梯度 t = 98% 乙腈 t 5 = 7% 乙腈 t 2 = 7% 乙腈 进样量 5 µl 3
所有各组通用的质谱条件如下 : Agilent G64A 三重串联四极杆质谱仪的质谱条件 模式 雾化器 干燥气流速 毛细管电压 电喷雾离子化器根据不同组别采用正离子模式或负离子模式 4 psig 9 L/min 4 V 干燥气温度 3 C 碰撞诱导解离电压 碰撞能量 7 3 V 5 35 V 多反应监测分析 (MRM) 每个化合物监测 2 种 transitions, 见表 驻留时间 msec 结果与讨论 LC/MS/MS 条件优化初步研究分两部分进行, 第一部分对各种药物的碰撞诱导解离电压进行优化, 以使前体离子产生最大的信号 通常选取质子化分子作为前体离子 使用一种自动程序 ( 安捷伦科技公司的 MassHunter 优化软件 ) 对每种化合物分别分析, 检查各种电压下的裂解情况, 根据数据选择最佳裂解信号 然后对各化合物再次进行自动测定, 确定各种碰撞能量对定性 定量离子的影响 最佳碰撞能量在 5~35 V 之间 MRM transitions 和最佳碰撞能量见表 2A~2D 表 2A. 第 组药物的 MRM transitions 和 MS 参数 ( 标记内标物质以粗体字表示 ) 化合物碰撞诱导解离电压 MRM transitions (m/z) 碰撞能量 (ev) 对乙酰氨基酚 9 52 5 52 65 35 3 C 2-5 N- 对乙酰氨基酚 9 55 5 55 93 25 氨苄青霉素 7 35 6 35 6 5 3 C 3 - 莠去津 2 29 77 5 29 98 25 阿奇毒素 3 749.5 59.4 3 749.5 58 35 咖啡因 95 38 5 95 25 3 C 3 - 咖啡因 98 4 5 98 2 25 卡巴多 8 263 23 5 263 3 35 卡马西平 237 94 5 237 79 35 卡马西平 -d 247 24 5 247 22 35 头孢噻肟 9 456 396 5 456 324 5 环丙沙星 332 34 2 332 23 35 3 C 3-5 N- 环丙沙星 336 38 5 336 235 35 4
表 2A. 第 组药物的 MRM transitions 和 MS 参数 ( 标记内标物质以粗体字表示 ) 续 化合物碰撞诱导解离电压 MRM transitions (m/z) 碰撞能量 (ev) 克拉霉素 748.5 58 25 748.5 59 5 邻氯青霉素 9 436 6 5 436 277 5 可待因 3 3 25 25 3 65 35 可天宁 9 77 98 25 77 8 25 可天宁 -d 3 9 8 8 25 8 25 脱氢硝苯地平 3 345 284 25 345 268 25 洋地黄毒苷 9 39 355 5 39 337 5 地高辛 钠加合物, 无响应 地尔硫卓 3 45 78 25 45 5 25,7- 二甲基黄嘌呤 9 8 24 5 8 99 5 苯海拉明 7 256 67 5 256 52 35 恩诺沙星 3 36 36 5 36 342 5 红霉素 9 734.5 58 35 734.5 576 5 3 C 2 - 红霉素 9 736.5 6 25 736.5 578 5 脱水红霉素 9 76.5 58 25 76.5 6 25 氟甲喹 9 262 74 35 262 244 5 氟西汀 9 3 48 5 氟西汀 -d 6 9 36 54 5 林可霉素 47 26 25 47 359 5 洛美沙星 3 352 38 5 352 265 25 咪康唑 9 45 59 35 45 69 25 诺氟沙星 7 32 32 5 32 276 5 氧氟沙星 362 38 5 362 26 25 5
表 2A. 第 组药物的 MRM transitions 和 MS 参数 ( 标记内标物质以粗体字表示 ) 续 化合物碰撞诱导解离电压 MRM transitions (m/z) 碰撞能量 (ev) 苯唑青霉素 7 42 6 5 42 243 5 噁喹酸 9 262 244 5 262 26 25 青霉素 G 9 335 6 5 335 76 5 青霉素 V 7 35 6 5 35 4 25 罗红霉素 3 837.5 679 5 837.5 58 35 沙拉沙星 3 386 299 25 386 368 25 磺胺氯哒嗪 9 285 56 285 92 25 磺胺嘧啶 25 56 5 25 92 25 磺胺二甲氧嘧啶 8 3 56 2 3 92 35 磺胺甲基嘧啶 265 56 5 265 92 25 磺胺二甲嘧啶 9 279 56 5 279 86 5 3 C 6 - 磺胺二甲嘧啶 9 285 86 25 285 62 25 磺胺甲二唑 8 27 56 27 92 25 磺胺甲恶唑 254 56 5 254 92 25 3 C 6 - 磺胺甲恶唑 26 62 5 26 98 25 磺胺 7 73 56 5 73 92 5 噻苯哒唑 3 22 75 25 22 3 35 3 C 6-2,4,5- 三氯 - 苯氧基乙酸 259 2 5 259 65 25 甲氧苄氨嘧啶 29 23 25 29 26 25 3 C 3 - 甲氧苄氨嘧啶 294 233 25 294 264 25 泰乐菌素 96.5 74 35 96.5 772 35 维吉尼霉素 526 58 5 526 355 5 6
表 2B. 第 2 组药物的 MRM transitions 和 MS 参数 化合物碰撞诱导解离电压 MRM transitions (m/z) 碰撞能量 (ev) 脱水四环素 9 427 4 5 427 54 25 金霉素 479 462 5 479 97 35 去甲金霉素 3 465 43 25 465 448 5 强力霉素 445 428 5 445 54 25 4- 差向脱水四环素 (EATC) 9 427 4 5 427 5 35 4- 差向四环素 (ETC) 445 4 5 445 427 5 二甲胺四环素 9 458 44 5 四环素 (TC) 445 4 5 445 427 5 表 2C. 第 3 组药物的 MRM transitions 和 MS 参数 化合物碰撞诱导解离电压 MRM transitions (m/z) 碰撞能量 (ev) 吉非罗齐 249 2 5 吉非罗齐 -d 6 255 2 5 布洛芬 75 25 6 5 3 C 3 - 布洛芬 75 28 63 5 萘普生 75 229 69 25 229 7 5 3 C- 萘普生 -d 3 75 233 69 25 233 7 5 三氯卡班 33 6 33 26 25 3 C 6 - 三氯卡班 9 39 6 5 39 32 25 三氯生 75 287 35 5 3 C 2 - 三氯生 75 299 35 5 华法令 25 37 7 35 37 6 5 华法令 -d 5 9 32 6 5 32 255 25 7
表 2D. 第 4 组药物的 MRM transitions 和 MS 参数 化合物碰撞诱导解离电压 MRM transitions (m/z) 碰撞能量 (ev) 沙丁胺醇 9 24 48 5 24 66 5 西咪替丁 253 59 253 95 25 二甲双胍 8 3 6 3 7 25 雷尼替丁 35 76 5 35 3 25 分别对各组化合物进行色谱分离, 且每个 MRM transitions 的驻留时间为 毫秒 图 A~D 为所有药物标准品的相应色谱图 ( 柱上浓度 ppb) 根据各个目标分析物相应的质子化分子及碎片离子的 MRM transitions 分别得到了提取离子色谱图 3 7. 2 23 3 6.5 6. 5.5 5. 4.5 4. 3.5 3. 2.5 2..5..5. 2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9 2 2 22 23 24 25 26 27 28 29 3 3 vs. 图 A. 第 组药物的 MRM 提取离子色谱图, 利用了色谱分离过程中的三个时间片段 8
3 2 2 3 3 3 图 B. 479 462 465 43 458 44 445 4 445 428 427 4 2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 5 6 7 8 9 2 2 22 23 24 25 26 27 28 29 3 3 vs. 第 2 组药物的 MRM 提取离子色谱图, 仅显示一种 transitions 化合物的鉴定结果见表 2B 4 2 3 2 3 图 C. 32 59.7 3 6.7 287 34.6 289 2.8 229 68.8 25 6.9.5.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5.5.5 2 vs. 第 3 组药物的 MRM 提取离子色谱图, 仅显示一种 transitions 化合物的鉴定结果见表 2C 9
4 3.2 3 2.8 2.6 2.4 2.2 2.8.6.4.2.8.6.4.2 图 D. 253 & 59 & 95 24 & 66 & 48 35 & 76 & 3 3 & 7 & 6 2 3 4 5 6 7 8 9 2 3 4 vs. 第 4 组药物的 MRM 提取离子色谱图 对污水样品的实际应用 为了证实本方法对实样分析的适用性, 用污水处理厂出口处的污水作为基质, 制备了 8 种浓度水平 (.,.5,, 5,, 5, 和 5 ng/ml 或 ppb) 的加标样品进行分析 以对乙酰氨基酚的标准曲线为例, 如图 2 所示 总之, 所有的化合物均显示了出色的灵敏度, 并且在三个数量级的浓度范围内表现出良好的线性, r 2.99
图 2. 污水基质中对乙酰氨基酚的 7 点校正曲线, 浓度范围为.~ ng/ml (ppb), 线性拟合不通过原点 最后, 对 空白 污水样品进行分析, 检出其中存在两种药物 卡马西平和苯海拉明, 用两种 MRM transitions 对其进行了结构确证 污水提取物中这两种化合物的定性离子比见图 3 如图 3 中两种 MRM 提取离子色谱图所示, 由于 MRM transitions 的选择性和仪器的高灵敏度, 尽管这两种化合物存在于如此复杂的基质中, 仍然能够方便地得到鉴定
卡马西平 苯海拉明 4 3.5 2 3 3. 2.5 2..5..5. 3 7 2 3 6 5 4 3 2 3 7 2 3 6 237 94 5 256 67 4 3 2 4 5 6 7 8 9 2 2 22 23 24 vs. 3 2 3 2.5 237 79 2. 256 52.5..5. 4 5 6 7 8 9 2 2 22 vs. 图 3. 污水样品中卡马西平和苯海拉明的两种 MRM transitions 色谱图 结论 本次研究的结果显示, 对于高通量方法在水样中药物研究的应用,Agilent 64A 三重串联四极杆质谱仪是一种稳健的 灵敏的和可靠的仪器 Agilent 64A 三重串联四极杆质谱仪能够确保 EPA 方法 694 的成功实施 参考文献. EPA Method 694: Pharmaceuticals and personal care products in water, soil, sediment, and biosolids by HPLC/MS/MS, December 27, EPA-82-R-8-2. www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料中出现的错误, 以及由于提供或使用本资料所造成的相关损失不承担责任 本资料中涉及的信息 说明和指标, 如有变更, 恕不另行通知 安捷伦科技公司,28 中国印刷 28 年 9 月 9 日 5989-9665CHCN