2 2017,51(2):1~6/ 李伟杰, 等学调查中得到广泛应用 [5-7] 由于国内对禽源多究提供支持杀性巴氏杆菌的基因多样性和分子流行病学状况 1 材料与方法研究的不多, 因此本研究拟对分离和收集的禽源多 1.1 菌株 84 株分离株分离自国内的不同地区和杀性巴氏杆菌进行分型, 以便为

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庄能
5 years ago
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1 2017,51(2):1~6/ 李伟杰, 等 1 禽源多杀性巴氏杆菌多位点序列分型研究李伟杰, 田野, 岂晓鑫, 蒋颖, 魏财文, 蒋桃珍 ( 中国兽医药品监察所, 北京 ) [ 收稿日期 ] [ 文献标识码 ]A [ 文章编号 ] (2017) [ 中图分类号 ]S [ 摘要 ] 为了解国内禽源多杀性巴氏杆菌流行情况, 对分离自 18 省份的 84 株多杀性巴氏杆菌采用荚膜多重 PCR 分型和多位点序列分型对其血清型和基因型进行鉴定结果表明 : 禽源多杀性巴氏杆菌主要以血清 A 型为主, 占 96.4%(81/84); 多位点序列分型可将禽源多杀性巴氏杆菌分为 5 种 ST 型, 其中 ST129 为主要流行型, 占 94.0%(79/84) 本研究为我国禽源多杀性巴氏杆菌的流行病学监测和基因多样性提供了数据支持 [ 关键词 ] 多杀性巴氏杆菌 ; ; 多位点序列分型 Multi-locusSequenceTypingofPasteurelamultocidaIsolatedfrom Avian LIWei-jie,TIANYe,QIXiao-xin,JIANGYing,WEICai-wen,JIANGTao-zhen (ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Bejing100081,China) Abstract:ToinvestigatetheepidemicstatusofthePasteurelamultocidaisolatedfrom avian,eighty-four P.multocidaisolatescolectedfrom 18provincesweresubjecttoidentificationsoftheserotypesandgenotypes bycapsularmultiplexpcr andmulti-locussequencetyping.theresultsshowedthatp.multocidaisolated fromavianweremainlyclasified intoserotypea, accountingfor94.6%. Fivediferentsequencetypes includingst129,st122,st107,st62,st44wereidentifiedby,andthepredominategenotypewas ST129,accountingfor94.6%.Thepresentstudyprovidesdatasupportfortheepidemiologicalsurveilanceand geneticdiversityofp.multocidaisolatedfromavian. Keywords:Pasteurelamultocida;capsularserotyping;multi-locussequencetyping 禽霍乱是由多杀性巴氏杆菌 (Pasteurelamulto cida) 引起的鸡鸭和鹅等多种禽类的一种接触性败血性传染病 [1] 病禽康复禽或健康带菌禽是主要的传染源, 主要通过被污染的饲料饮水经消化道感染, 多发生于性成熟的禽类, 自然感染潜伏期为 2~ 9d 在潮湿多雨气温较高的季节时有发生本病是危害我国养禽业的重要细菌性传染病之一脉冲场凝胶电泳 (PFGE) [2] 肠道细菌基因间 [3] 重复序列 (ERIC-PCR) 指纹图谱技术和多位点序列分型 () [4] 等方法推动了对多杀性巴氏杆菌分子流行病学和基因多样性的研究现在已经成为病原菌基因分型的金标准, 在分子流行病基金项目 : 生物安全关键技术研发 (2016YFC ); 国家微生物资源平台 (NIMR-5) 作者简介 : 李伟杰, 副研究员, 从事兽医微生物和兽用生物制品研究通讯作者 : 蒋桃珍 jiangaozhen@ivdc.org.cn

2 2 2017,51(2):1~6/ 李伟杰, 等学调查中得到广泛应用 [5-7] 由于国内对禽源多究提供支持杀性巴氏杆菌的基因多样性和分子流行病学状况 1 材料与方法研究的不多, 因此本研究拟对分离和收集的禽源多 1.1 菌株 84 株分离株分离自国内的不同地区和杀性巴氏杆菌进行分型, 以便为我国多杀性不同年代 ( 表 1), 由中国兽医微生物菌种保藏管理巴氏杆菌病暴发的流行病学监测和基因多样性研中心提供表 1 多杀性巴氏杆菌的血清分型和分型菌株分离源分离地分离 / 收集时间荚膜血清型 ST 型 458 鸡内蒙古不详 A 鸭广东 1982 A 鸭贵州 1980 A 鸭北京 1980 A 鸭陕西 1980 A 鸭青海 1980 A 鸡江苏 1980 A 鸡黑龙江 1980 A 鹅北京 1963 A 鸡陕西 1980 A 鸡广东 1980 A 鸡黑龙江 1983 A 鸭黑龙江 1983 A 鸭北京 1966 A 鸡河南 1983 A 鸡江苏 1983 A 鸡江苏 1983 A 鸭广东 1986 A 鸡四川 1986 A 鹅四川 1986 A 鸭四川 1986 A 鸡上海 1986 A 鸡江苏 1986 A 鸭上海 1986 A 鸭江苏 1986 A 鸭广西 1986 A 鸡广西 1986 A 鸭辽宁 1985 A 鸡辽宁 1986 A 鸡湖南 1986 A 鸭湖南 1986 A 鸡广东 1980 A 鸡河南 1980 B 鸡河南 1983 B 122

3 2017,51(2):1~6/ 李伟杰, 等 3 续表菌株分离源分离地分离 / 收集时间荚膜血清型 ST 型 1688 鸡广东 1986 A 鸭湖南 1986 A 鸡湖南 1986 A 鸭广东 1959 A 鸡四川 1965 A 鸡四川 1979 A 鸡河北 1979 A 鸡河北 1979 A 鸡河北 1979 A 鸡河北 1979 A 鸡河北 1979 A 鸡河北 1979 A 鸡河北 1979 A 鸭江苏 1983 A 鸡广西 1979 A 鸭四川 1983 A 鸭四川 1983 A 鸭四川 1983 A 鸭四川 1983 A 鸡江苏 1983 A 鸡江苏 1983 A 鸡江苏 1984 A 鸭北京 1984 A 鸡河南 1988 A 麻雀江苏 1982 A 鸡北京 1987 A 鸡黑龙江 1989 A 鸭黑龙江 1989 A 鸡北京 1989 A 鸡广东 1978 A 鸡江西 1979 A 鸡江西 1979 A 鸡北京 1979 A 鸡河北 1982 A 鸡海南 1978 A 鸡不详 1992 A 鸡江苏 1989 A 鸡甘肃 1989 A 鸡黑龙江 1980 A 鸡北京 1990 A 129

4 4 2017,51(2):1~6/ 李伟杰, 等续表菌株分离源分离地分离 / 收集时间荚膜血清型 ST 型 1787 鹌鹑河北 1988 A 鸡河北 1984 A 鸡河北 1984 A 鸡黑龙江 2005 B 鸡黑龙江 2005 A 大雁黑龙江 2005 A 鸡黑龙江 2005 A 鸡江苏 1953 A 鸡陕西 1964 A 鸡北京 1959 A 主要试剂胰蛋白胨大豆琼脂 (TSA) 和胰蛋白胨大豆肉汤 (TSB) 购自 OXOID 公司, 马血清购自 GIBCO 公司,ExTaq 酶 DL2000DNAMaker 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司, 琼脂糖购自 Biowest 公司,Goldview 购自北京赛百盛基因技术有限公司 1.3 菌株 DNA 的提取分离株在含 5% 马血清 [8] 的 TSA 培养基上,37 培养 24h 采用热裂解法提取基因组 DNA, 挑取纯培养菌落于 100μL 无菌蒸馏水中, 沸水浴 10min, 然后冰浴 10min,12000 r/min 离心 1min, 上清作为 PCR 扩增的模板 DNA 1.4 菌株 kmti 基因的扩增及序列分析按照文献 [9] 方法对分离株进行 kmti 基因的 PCR 扩增, 扩增产物测序后与 NCBI 核酸数据库进行 BLAST 序列比对 [9] 1.5 菌株血清型的鉴定按照 Townsend 等建立的多杀性巴氏杆菌荚膜多重 PCR 方法对分离株血清型进行鉴定, 引物见表 2,PCR 扩增产物用 1.5% 的琼脂糖凝胶进行电泳检测表 2 多杀性巴氏杆菌种鉴定荚膜血清分型和的引物基因检测目的引物序列 (5-3 ) 扩增片段大小 kmti 定种 ATCCGCTATTTACCCAGTGG GCTGTAAACGAACTCGCCAC 460 hyad-hyac TGCCAAAATCGCAGTCAG TTGCCATCATTGTCAGTG 1044 bcbd CATTTATCCAAGCTCCACC GCCCGAGAGTTTCAATCC 760 dcbf TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC CATCTACCCACTCAACCATATCAG 657 ecbj TCCGCAGAAAATTATTGACTC GCTTGCTGCTTGATTTTGTG 511 fcbd AATCGGAGAACGCAGAAATCAG TTCCGCCGTCAATTACTCTG 851 adk TTTTTCGTCCCGTCTAAGC GGGGAAAGGGACACAAGC 570 est GGGGAAAGGGACACAAGC CCAAATTCTTGGTTGGTTGG 641 pmi TGCCTTGAGACAGGGTAAGC GCCTTAACAAGTCCCATTCG 739 zwf-1 AATCGGTCGTTTGACTGAGC TGCTTCACCTTCAACTGTGC 808 mdh ATTTCGGGATCAGGGTTAGC GGAAAACCGGTAATGGAAGG 620 gdh ATCGACTTCTTCCGCAGACC GCGGGTGATATTGGTGTAGG 702 pgi ACCACGCTATTTTTGGTTGC ATGGCACAACCTCTTTCACC 784 zwf-2 TGTTAGGTGTGGCAAGAACG TTGCAACAAATGGTTTTGGA 614 在 zwf-1 对应的引物不能有效扩增的情况下使用

5 2017,51(2):1~6/ 李伟杰, 等 5 [4] 1.6 分型根据 Subaaharan 等建立的禽源多杀性巴氏杆菌分型方法, 对本研究中 84 株分离株的 7 个看家基因 ( 腺苷酸环化酶基因 adk 酯酶基因 est 6- 磷酸 - 甘露糖异构酶基因 pmi 葡萄糖 -6 磷酸脱氢酶基因 zwf 苹果酸脱氢酶基因 mdh 谷氨酸脱氢酶基因 gdh 磷酸葡萄糖异构酶基因 pgi) 进行扩增及测序, 引物见表 2 序列经 MEGA7 软件编辑后, 提交到 RIRDC 在线数据库进行比对, 获得菌株的序列型, 并利用 MEGA7 软件对 RIRDC 数据库中的部分 ST 型进行序列比对, 构建系统发育树, 分析其分子进化关系 2 结果与分析 2.1 分离株的 kmti 鉴定通过对 84 株分离株进行 kmti 基因的扩增和测序, 提交 GenBank 进行 BLAST 比对, 结果显示与多杀性巴氏杆菌的相似性均达 99% 以上表明本研究中收集和分离的 84 株分离株均为多杀性巴氏杆菌 2.2 血清分型利用荚膜多重 PCR 方法将 84 株多杀性巴氏杆菌分为 A 和 B 共 2 种血清型, 其中 81 株为 A 型, 占 96.4%; 其余 3 株为 B 型, 且均分离自霍乱鸡 ( 表 1) 2.3 分型对 84 株多杀性巴氏杆菌分别进行 adk est pmi zwf mdh gdh 和 pgi7 个看家基因的扩增和测序, 结果显示可以将其分为 ST129 ST122 ST107 ST62 和 ST445 种 ST 型, 其中禽源多杀性巴氏杆菌主要以 ST129 型为主, 占 94% (79/84) 具体见表 1 利用 MEGA7 对本研究确定 [10] 的 5 个 ST 型和国内报道的其他 ST 型进行序列分析, 结果表明 : 国内分离株 ST122 和 ST44 亲缘关系最近,ST62 和 ST58 亲缘关系最近 ; 主要流行的 ST-129 型与 ST122 ST44 ST62 ST58 具有较近的亲缘关系, 在同一大的分支上 ;ST8 和 ST107 与其他的 ST 型亲缘关系较远 ( 图 1) 图 1 84 株禽源多杀性巴氏杆菌的多位点序列系统进化树 3 讨论与小结多杀性巴氏杆菌根据荚膜抗原可分为 A B D E 和 F5 种血清型, 本研究通过荚膜多重 PCR 方法对 84 株禽源多杀性巴氏杆菌 ( 主要分离收集自 1953 年至 1990 年 ) 进行血清分型, 结果有 81 株为 [11] 荚膜 A 型程安春等对从年分离自四川省不同地区的 256 株鸭源多杀性巴氏杆菌进行血清分型, 其中 254 株为荚膜 A 型,2 株未定 [12] 型 ; 程龙飞等收集年福建及邻近省份分离的 95 株禽源多杀性巴氏杆菌, 经鉴定荚膜 [5] 型全为 A 型 ;Wang 等对年分离自江苏省不同地区的 40 株禽源多杀性巴氏杆菌流调结果显示全部为荚膜 A 型以上研究都表明多年来国内引起禽霍乱的优势血清型为 A 型多杀性巴氏杆菌的是由多位点酶电泳 (MLEE) 衍生出来, 主要通过看家基因序列的多态

6 6 2017,51(2):1~6/ 李伟杰, 等性对细菌进行分类 [4] 由得到的分型结果可与数据库中已有的信息进行比对, 从而使不同地点和不同时间分离的菌株可以进行横向和纵向比较目前多杀性巴氏杆菌多位点序列分型的在线数据库有两个 (htp://pubmlst.org/pmultocida/): Multiplehost 由英国格拉斯哥大学开发, 针对不同宿主来源的多杀性巴氏杆菌 ;RIRDC 由澳大利亚动物研究所开发, 针对禽源多杀性巴氏杆菌截止 2016 年 11 月 18 日,RIRDC 数据库中已经鉴定有 329 种 ST 型本研究通过对 84 株多杀性巴氏杆菌的鉴定, 获得 5 个 ST 型, 主要以 ST129 为主, 占 94% (79/84), 与文献报 [5,10] 道的一致还鉴定到 ST122 ST107 ST62 和 ST44, 这在禽源多杀性巴氏杆菌中为国内首次报道由于能够区分亲缘关系较近的菌株, 能够对爆发的流行菌株进行溯源, 因此本研究中基因型相同的 79 株菌株可能来源于同一株多杀性巴氏杆菌考虑到 ST129 型已在斯里兰卡 [6] [7] 印度和丹麦等 (htp://pubmlst.org/pmultocida/) 许多国家被发现, 此基因型可能在全球都有分布同时它可以从发生禽霍乱的鸡鸭鹅和麻雀体内分离到, 说明它具有多动物宿主的特性综上所述, 本研究为禽源多杀性巴氏杆菌的流行病学提供了一些本底数据, 为今后多杀性巴氏杆菌的监测起到了支撑作用, 同时对于研制有效的疫苗预防和控制禽霍乱有一定的帮助参考文献 : [1] WilsonBA,HoM. Pasteurela multocida: from zoonosisto celularmicrobiology[j].clinicalmicrobiologyreviews,2013, 26(3): [2] BlackalPJ,MiflinJK.IdentificationandtypingofPasteurelamul tocida:areview[j].avianpathology,2000,29(4): [3] LoubinouxJ,LozniewskiA,LionC,etal.Valueofenterobacte rialrepetitiveintergenicconsensuspcr forstudyofpasteurela multocidastrainsisolatedfrommouthsofdogs[j].jclinmicro biol,1999,37(8): [4] SubaaharanS,BlackalL L, BlackalP J. Developmentof amulti-locussequence typing scheme foravian isolatesof Pasteurelamultocida[J].VetMicrobiol,2010,141(3/4): [5] WangY,ZhuJ,LuC,etal.Evidenceofcirculationofan epidemicstrainofpasteurelamultocidainjiangsu,chinaby multi-locussequencetyping()[j].infection,genetics andevolution,2013,20: [6] HotchkisEJ,HodgsonJC,LainsonFS,etal.Multilocus sequencetypingofaglobalcolectionofpasteurelamultocida isolatesfromcatleandotherhostspeciesdemonstratesnicheaso ciation[j].bmcmicrobiol,2011,11: [7] SarangiLN,ThomasP,GuptaSK,etal.Molecularepidemiology ofpasteurelamultocidacirculatinginindiabymultilocussequence typing[j].transboundemergdis,2016,63(2): [8] 李伟杰, 魏财文, 田野, 等. 猪源多杀性巴氏杆菌及外膜蛋白 H 基因序列分析 [J]. 中国畜牧兽医,2015,42(1): [9] TownsendKM.BoyceJD,ChungJY,etal.Geneticorganiza tionofpasteurelamultocidacaplocianddevelopmentofamulti plexcapsularpcrtypingsystem [J].JClinMicrobiol,2001, 39(3): [10] 王林柏, 孙久鹤, 郭东春, 等. 国内部分地区多杀性巴氏杆菌荚膜血清型和基因型的研究 [J]. 中国预防兽医学报,2016, 38(2): [11] 程安春, 汪铭书, 陈孝跃, 等.256 株鸭源多杀性巴氏杆菌血清学鉴定及病原特性研究 [J]. 中国兽医科技,1997,27(7): [12] 程龙飞, 许利娜, 林建生, 等. 福建及邻近省份禽源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定 [J]. 中国动物传染病学报,2014,22(4): ( 编辑 : 李文平 )

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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