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1 化学品毒性鉴定技术规范 2005 年 6 月

2 目录 一 总则 3 二 试验方法 ( 一 ) 第一阶段试验 15 1 急性吸入毒性试验 16 2 急性经皮毒性试验 20 3 急性经口毒性试验 23 4 急性眼刺激性 / 腐蚀性试验 26 5 皮肤刺激性 / 腐蚀性试验 32 6 皮肤变态反应试验( 皮肤致敏试验 ) 36 ( 二 ) 第二阶段试验 54 1 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames 试验 ) 55 2 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 62 3 体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 68 4 体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验 75 5 哺乳动物精原细胞/ 初级精母细胞染色体畸变试验, 或 79 精子畸形试验 87 6 啮齿类动物显性致死试验 90 7 免疫毒性评价试验方法 95 8 亚急性吸入(14/28 天 ) 毒性试验 亚急性经皮(21/28 天 ) 毒性试验 亚急性经口(28 天 ) 毒性试验 115 ( 三 ) 第三阶段试验 亚慢性吸入毒性试验 亚慢性经皮毒性试验 亚慢性经口毒性试验 130 1

3 4 致畸试验 两代繁殖毒性试验 迟发性神经毒性试验 147 ( 四 ) 第四阶段试验 慢性吸入毒性试验 慢性经皮毒性试验 慢性经口毒性试验 致癌试验, 或 172 慢性毒性 / 致癌性合并试验 毒物代谢动力学试验 接触人群调查与观察( 参考国内外有关专著或教科书 ) ( 五 ) 参考试验 皮肤变态反应试验- 局部淋巴结法 大肠杆菌回复突变试验 酵母菌基因突变试验 体外哺乳动物细胞正向基因突变试验 果蝇伴性隐性致死试验 枯草杆菌基因重组试验 体外哺乳动物细胞程序外 DNA 合成 (UDS) 试验 体内哺乳动物外周血细胞微核试验 体外哺乳动物姊妹染色单体交换 (SCE) 试验 体内哺乳动物骨髓细胞姊妹染色体交换(SCE) 试验 繁殖 / 生长发育毒性筛选试验 亚急性毒性合并繁殖 / 发育毒性筛选试验 一代繁殖试验 神经毒性筛选组合试验 274 2

4 总则 General Principles 3

5 1 依据根据 中华人民共和国职业病防治法 作业场所使用有毒物品劳动保护条例 危险化学品安全管理条例 职业卫生技术服务机构管理办法 化学品毒性鉴定管理规范 制定本规范 2 范围本规范规定了化学品毒性鉴定的毒理学检测程序 项目和方法, 适用于化学品毒性鉴定和评价 3 规范性引用文件 GB 实验动物与饲料标准 GB 实验动物环境及设施 OECD Guideline for Testing of Chemicals (1981 ~ 2002) USA Code of Federal Regulations, Title 40, Volume 28 USEPA OPPTS Health Effects Test Guidelines (1996 ~ 2000) 4 术语解释化学品 (Chemicals): ):): 本规范所称化学品, 系指工业用和民用的化学原料 中间体 产品等单分子化合物 聚合物以及不同化学物组成的混合剂与产品 不包括法律 法规已有规定的食品 食品添加剂 化妆品 药品等 急性吸入吸入毒性 (Acute Inhalation Toxicity): ):): 实验动物短时间 (24h 内 ) 持续吸入一种可吸入性受试样品后, 在短期内出现的健康损害效应 半数致死浓度 (Median Lethal Concentration,LC 50 ):): 指在一定时间内经呼吸道吸入受试样品后引起受试动物发生死亡概率为 50% 的浓度 以单位体积空气中受试样品的质量 (mg/m 3 ) 来表示 急性经皮毒性 (Acute Dermal Toxicity): ):): 实验动物短时间 (24h 内 ) 经皮肤接触受试样品后, 在短期内出现的健康损害效应 急性经口毒性 (Acute Oral Toxicity): ):): 一次或在 24h 内多次经口给予实验动物受试样品后, 动物在短期内出现的健康损害效应 半数致死剂量 (Median Lethal Dose,LD 50 ):): 在一定时间内经口或经皮给予受试样品后, 使受试动物发生死亡概率为 50% 的剂量 以单位体重接受受试样 4

6 品的质量 (mg/kg bw 或 g/kg bw) 来表示 皮肤刺激性 (Dermal Irritation): ):): 皮肤涂敷受试样品后局部产生的可逆性炎性变化 皮肤腐蚀性 (Dermal Corrosion): ):): 皮肤涂敷受试样品后局部引起的不可逆组织损伤 眼刺激性 (Eye Irritation): ):): 眼球表面接触受试样品后产生的可逆性炎性变化 眼腐蚀性 (Eye Corrosion): ):): 眼球表面接触受试样品后引起的不可逆性组织损伤 皮肤致敏 ( 过敏性接触接触性皮炎 )(Skin Sensitization,Allergic Contact Dermatitis): 皮肤对一种物质产生的免疫源性皮肤反应 对于人类这种反应可能以瘙痒 红斑 丘疹 水疱 融合水疱为特征 动物的反应不同, 可能只见到皮肤红斑和水肿 亚急性经口毒性 (Subacute Oral Toxicity): 实验动物在 14~28 天内, 每日经口接触受试样品后所引起的健康损害效应 亚急性经皮毒性 (Subacute Dermal Toxicity): ):): 实验动物在 14~28 天内, 每日经皮接触受试样品后所引起的健康损害效应 亚急性吸入毒性 (Subacute Inhalation Toxicity): ):): 实验动物在 14~28 天内, 每日经呼吸道接触受试样品后所引起的健康损害效应 致突变性 (Mutagenicity): 受试样品引起原核或真核细胞 或实验动物遗传物质发生结构和 / 或数量改变的效应 免疫毒性 (Immunotoxicity): 受试样品引起机体免疫功能抑制或异常增强的效应 神经毒性 (Neurotoxicity): ):): 受试样品对神经系统功能或结构的损害效应 亚慢性经口毒性 (Subchronic Oral Toxicity): 实验动物在其部分生存期 ( 不超过 10% 寿命期 ) 内, 每日经口接触受试样品后所引起的健康损害效应 亚慢性经皮毒性 (Subchronic Dermal Toxicity): ):): 实验动物在其部分生存期 ( 不超过 10% 寿命期 ) 内, 每日经皮接触受试样品后所引起的健康损害效应 亚慢性吸入毒性 (Subchronic Inhalation Toxicity): ):): 实验动物在其部分生存期 ( 不超过 10% 寿命期 ) 内, 每日经呼吸道接触受试样品后所引起的健康损害效应 5

7 蓄积毒性 (Cumulative Toxicity): 受试样品在体内蓄积引起的有害效应, 蓄积有两种形式 :(1) 物质蓄积, 即长期反复接触受试样品时, 由于吸收速度超过消除速度导致的该物质在体内逐渐增多 ;(2) 功能蓄积, 即受试样品虽然在体内的代谢和排出速度较快, 但其造成的损伤恢复慢, 在前一次的损伤未恢复前又发生新的损伤, 如此残留损伤的累积称为功能蓄积 致畸性 (Teratogenicity): 受试样品在胚胎发育期引起胎仔永久性结构和功能异常的效应 生殖毒性 (Reproduction Toxicity): 受试样品对亲代繁殖功能或能力的影响和 / 或对子代生长发育的损害效应 生长发育毒性 (Developmental Toxicity): 妊娠动物接触受试样品而引起的子代在出生以前 围产期和出生以后所显现出的机体缺陷或功能障碍 无可见有害作用水平 (No Observed Adverse Effect Level,NOAEL): ):): 在规定的试验条件下, 用现有的技术手段或检测指标未观察到任何与受试样品有关的毒性作用的最大染毒剂量或浓度 最低可见有害作用水平 (Lowest Observed Adverse Effect Level,LOAEL): ):): 在规定的试验条件下, 受试样品引起实验动物形态 功能 生长发育等发生有害改变的最低染毒剂量或浓度 慢性毒性 (Chronic Toxicity): ):): 实验动物在其正常生命期的大部分时间内接触受试样品所引起的健康损害效应 致癌作用 (Carcinogenesis): 受试样品引起肿瘤发生率和 / 或类型增加 潜伏期缩短的效应 基线剂量 (Benchmark Dose, BMD): 由于 NOAEL 和 LOAEL 都是实验中的具体剂量值, 易受每组样本含量大小和组间距宽窄等因素影响, 故设定基线剂量, 可选择 ED 1 ( 概率为 1% 的受试个体出现效应的剂量 ), 或选择 ED 5 ( 概率为 5% 的受试个体出现效应的剂量 ) 或 ED 10 ( 概率为 10% 的受试个体出现效应的剂量 ) 的 95% 可信限下限 毒物代谢动力学 (Toxicokinetics): ):): 定量研究毒物在体内吸收 分布 生物转化 排泄等过程随时间变化的动态规律的学科 安全系数 (Safety Factor,SF): 在以动物试验数据外推到人, 或以小范围人群调查结果判断所评价的化学品对大范围人群的有害作用时, 为排除所涉及的不确定因素而设定的系数, 用于制定化学品控制标准, 以保证接触人群的安全 6

8 危险性参考剂量 (Risk Reference Dose,RfD): 危险度达到可接受程度的剂量 危险性参考浓度 (Risk Reference Concentration,RfC): 危险度达到可接受程度的浓度 日允许摄入量 (Acceptable Daily Intake,ADI): 终身每日摄入化学物而不引起可检出的健康损害效应的剂量, 一般以 mg/kg bw.d 表示 ( 致癌物的 ) 实际安全剂量 (Visual Safe Dose,VSD): 化学品引起致癌率有 99% 的把握低于 10-6 的剂量水平 职业接触限值 (Occupational Exposure Limit,OEL): 是职业性有害因素的接触限制量值, 指劳动者在职业活动过程中长期反复接触对机体不引起急性或慢性有害健康影响的容许接触水平 最高容许浓度 (Maximal Allowable Concentration,MAC): 指工作地点 在一个工作日内 任何时间均不应超过的有毒化学物的浓度 5 化学品毒性鉴定程序和方法化学品毒性鉴定分为 4 个阶段 (1) 第一阶段 ( 急性毒性试验 眼刺激试验和皮肤刺激试验 ) 主要是急性毒性参数的测定和了解受试样品对皮肤 粘膜的刺激性以及致敏性, 为毒性分级和标签管理提供依据 同时, 可了解受试样品对机体造成急性损害的可能性和严重程度, 并为第二阶段各项试验的剂量设计提供依据 在测定 LD 50 时, 一般要求用两种动物, 染毒途径应包括所有人体可能的接触途径 急性吸入毒性试验 急性经皮毒性试验 急性经口毒性试验 急性眼刺激性 / 腐蚀性试验 皮肤刺激性 / 腐蚀性试验 皮肤变态反应试验 ( 皮肤致敏试验 ) (2) 第二阶段 ( 亚急性毒性试验和致突变试验 ) 主要是了解受试样品的亚急性毒性和遗传毒性, 为第三阶段各项试验剂量设计和观察指标的选择提供依据, 并对受试样品的致癌性进行预测 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验 (Ames 试验 ) 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 7

9 体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验 哺乳动物精原细胞 / 初级精母细胞染色体畸变试验, 或 精子畸形试验 啮齿类动物显性致死试验 免疫毒性评价试验方法 亚急性吸入 (14/28 天 ) 毒性试验 亚急性经皮 (21/28 天 ) 毒性试验 亚急性经口 (28 天 ) 毒性试验 (3) 第三阶段 ( 亚慢性毒性试验 致畸试验 繁殖试验 ) 通过亚慢性试验进一步确定多次重复染毒的毒作用性质和靶器官, 初步确定 NOAEL 或 LOAEL, 为第四阶段各项试验的剂量设计和观察指标的选择提供依据 ; 通过致畸试验判断受试样品的胚胎毒性及其是否有致畸性 通过繁殖试验, 可判断受试样品对生殖过程的损害作用 通过迟发性神经毒性试验, 可判断受试样品是否具有迟发性神经毒作用 亚慢性吸入毒性试验 亚慢性经皮毒性试验 亚慢性经口毒性试验 致畸试验 两代繁殖毒性试验 迟发性神经毒性试验 (4) 第四阶段 ( 慢性毒性试验和致癌试验 ) 通过慢性毒性试验可确定受试样品的 NOAEL 和 LOAEL, 为推算受试样品的安全接触限值提供依据 通过致癌试验可以确定受试样品对受试实验动物的致癌性 通过代谢动力学试验可以了解受试样品的吸收 分布 代谢和排泄特点, 了解蓄积毒性作用及其可能的靶器官和毒作用机理 慢性吸入毒性试验 慢性经皮毒性试验 慢性经口毒性试验 致癌试验或慢性毒性试验合并致癌试验 毒物代谢动力学试验 参考方法 皮肤变态反应试验 - 局部淋巴结法 8

10 大肠杆菌回复突变试验 酵母菌基因突变试验 体外哺乳动物细胞正向基因突变试验 果蝇伴性隐性致死试验 枯草杆菌基因重组试验 体外哺乳动物细胞程序外 DNA 合成 (UDS) 试验 体内哺乳动物外周血细胞微核试验 体外哺乳动物姊妹染色单体交换 (SCE) 试验 体内哺乳动物骨髓细胞姊妹染色体交换 (SCE) 试验 繁殖 / 生长发育毒性筛选试验 亚急性毒性合并繁殖 / 发育毒性筛选试验 一代繁殖试验 神经毒性筛选组合试验 6 化学品毒性鉴定项目的选择原则 6.1 试验项目的选择应当根据化学品的理化特性, 特别是通过对其化学结构与活性关系进行初步分析, 并尽量了解其使用范围 生产或使用过程 人体接触情况和现有文献资料, 根据具体情况选择系统的或补充的毒性试验 在化学品毒性鉴定过程中, 根据各阶段的试验结果, 有针对性地取舍进一步试验的项目和观察指标, 以完善对该化学品所做出的毒性鉴定资料的科学性和可靠性 6.2 受试样品的染毒途径应与人体可能接触的途径一致, 对人体有可能通过呼吸道 皮肤和消化道三种途径接触的化学品, 应进行吸入 经皮和经口三种染毒途径的各项试验 ; 常温下呈气态的化学品一般不进行经口染毒途径的各项试验 ; 20 蒸气压 Pa 的非粉末状化学品一般不需进行吸入染毒途径的各项试验 6.3 对有可能与皮肤或眼睛接触的化学品, 应进行皮肤或眼刺激性试验 ; 如化学品的 ph 2 或 11, 则不必进行皮肤和粘膜的刺激试验, 并认为其对皮肤和眼有腐蚀作用 6.4 对有可能与皮肤反复接触的化学品, 应进行皮肤致敏试验 ; 经皮毒性属高毒以及对皮肤有腐蚀作用的化学品则不进行皮肤致敏试验 6.5 我国首创或根据国内外文献报道首次生产的化学品, 原则上需进行 4 个阶段的毒理学试验 首先必须做急性毒性试验 亚急性毒性试验 亚慢性毒性试验 9

11 三项致突变试验 ( 包括基因水平和染色体水平的体外 体内试验 ) 致畸试验和繁殖试验 根据试验结果, 判断是否需继续做其它试验项目 6.6 引进国外的生产技术, 生产国外已登记生产和批准应用的化学品, 如国内的生产单位能证明所生产化学品的理化性质 纯度 主要杂质成分及含量均与国外同类化学品一致时, 可先进行第一阶段和两项致突变试验 ( 包括基因水平和染色体水平两种类型的试验 ) 如试验结果与国外同类化学品一致, 可不继续进行第三阶段和第四阶段试验 6.7 与国内已获批准生产的化学品属同类化学品的, 如国内的生产单位能证明所生产化学品的理化性质 纯度 主要杂质成分及含量均与国内同类化学品一致时, 可先进行急性毒性试验和一项致突变试验 如试验结果与国内同类化学品一致, 可不继续进行试验 6.8 凡将两种以上的化学品混配成新的制剂时, 除必须按相应要求对其成分分别进行试验外, 还应进行急性联合毒性试验, 如有明显的协同作用, 则根据具体情况对该制剂进行必要的其它毒性试验 6.9 致突变试验的选择原则 进行 3 项致突变试验的化学品, 如 2 项或 3 项试验结果为阳性, 应进行致癌试验 如仅 1 项试验结果为阳性, 应增做另一项同类型的致突变试验, 如结果仍为阳性, 应进行致癌试验 ; 如结果为阴性, 可不继续进行试验 如 3 项结果均为阴性, 可不继续进行试验 进行 2 项致突变试验的化学品, 如 2 项试验结果为阳性, 应进行第三阶段和第四阶段的相应试验 如仅 1 项试验结果为阳性, 应增做另一项同类型的致突变试验 如结果仍为阳性, 应进行第三阶段和第四阶段的相应试验 ; 如结果为阴性, 可不继续进行试验 如 2 项结果均为阴性, 可不继续进行试验 进行 1 项致突变试验的化学品, 如试验结果为阳性, 应增做另一项同类型的致突变试验 如结果仍为阳性, 应进行第三阶段和第四阶段的相应试验 如结果为阴性, 可不继续进行试验 7 受试样品的规定 7.1 受试样品必须是按照既定的生产工艺和配方进行规范化生产的产品, 其成分和浓度与实际生产 经营和使用的产品相同 7.2 提供与受试样品毒性有关的物理 化学性质资料 10

12 7.2.1 化学名称 CAS 编号 结构式 测定方法 纯度 所含主要杂质 光谱图 性状 气味 稳定性 ( 热 空气 光 ) 密度 熔点 ( ) 沸点 ( ) 闪点 蒸气压 (Pa ) 表面张力(N/M ) 水中溶解度(mg/L ) 脂溶性(mg/100g, 说明溶剂种类 ) 脂水分配系数 ( 说明溶剂种类 ) 膨胀系数 爆炸极限 ph 值 一定 ph 值下的水解情况 7.3 提供原料来源 生产工艺 人的可能摄入量 使用说明书等有关资料 7.4 对受试样品的处理 受试样品应新鲜配制 除非有资料表明以溶液 ( 或乳浊液 悬浊液等 ) 保存具有稳定性 固体受试样品应溶于或悬于适当的赋形剂 ( 溶剂或载体 ) 中, 并进行稀释 液体受试样品可直接使用或稀释后使用 根据受试样品的理化性质 ( 水溶性和 / 或脂溶性 ) 确定受试样品所用的赋形剂 所用赋形剂在使用剂量水平对实验动物 菌株或细胞应不产生毒作用, 且不与受试样品发生任何化学反应, 并能保持受试样品的稳定性 通常用蒸馏水 等渗盐水 植物油 食用淀粉 羧甲基纤维素等 如不是常用赋形剂, 应有参考资料说明其成份 对膨胀系数较高的化学品应考虑膨胀系数对试验结果的影响, 急性经口毒性试验中的最高剂量应为实验动物能够耐受的最大染毒剂量, 并根据试验结果确定其它试验的剂量设计, 如最大染毒剂量未观察到明显毒性效应, 则体内致突变试验 亚急性毒性试验 亚慢性毒性试验的最高剂量均应达到实验动物能够耐受的最大染毒剂量 如果将受试样品掺入饲料或溶于饮水中进行染毒, 受试样品在饲料或饮水中的含量应恒定并进行稳定性监测 受试样品的添加量不能破坏饲料中的营养平衡 实验动物应单笼饲养, 必须用减重法称量每周的食物摄入量 ( 如果受试样品是加入饮水中染毒的, 也应测量水的摄入量 ), 并通过食物或饮水的消耗情况计算动物对受试样品的摄入量 8 应客观评价动物试验的结果, 将其外推到人的意义是有限的 尽可能结合人群观察资料, 作出科学的综合性评价 8.1 在使用 NOAEL 或 LOAEL 等对化学品的安全性进行评价时, 可根据情况调整安全系数 ( 例如对于在试验或流行病学调查中发现有致癌或致畸作用的化学 11

13 品, 安全系数可增大至 100~1000 在制定工作场所空气中化学品职业接触限值 (OEL) 时, 应更注重流行病学调查资料, 参考动物试验数据, 一般以动物试验的 NOAEL 或 LOAEL 为基准, 安全系数可以小于 20 可按下列公式计算得出各种卫生限值 LOAEL或 NOAEL RfD SF1 SF2 SF3LL SF n 式中 SF 1 SF 2 SF 3 SF n 代表从各个角度考虑的安全系数, 在计算 ADI 时一般以 100 作为安全系数 (SF=10( 种属差异 ) 10( 个体差异 )) 8.2 在应用致突变试验结果筛选致癌物时, 应用下列计算式计算致突变性阳性结果预期致癌性的概率 : P( C ) P ( M / C ) 式 1: P ( C / M ) P( C ) P ( M / C ) P ( C ) P ( M / C ) 式 1 适用于对同一种致突变试验结果的推算, 式中 M + 和 M - 为致突变试验结果的 阳性数和阴性数 ;C + 和 C - 为致癌性的有和无 式 2: ( P( C ) P K ( M / C ) P N ( M / C ) P C / M ) P( C ) P ( M / C ) P ( M / C ) P ( C ) P ( M / C ) P ( M / C ) K N K N 式 2 适用于对多种致突变试验结果的推算, 要求各致突变试验是互相独立的, 一般认为反映不同遗传学终点的试验基本相互独立, 如多个试验的检测终点为同一遗传学终点, 只能将其中一个试验的结果纳入推算, 如检测终点相同的试验方法的结果既有阳性又有阴性, 则将呈阳性的试验方法的结果纳入推算 设阳性结果有 K 个, 相应的灵敏度为 a + 1,a + 2 a + K (a + =1-P(M + /C + )), 相应的特异度为 a - 1,a a K (a - =1-P(M - /C - )), 同时设阴性结果有 N 个, 相应的灵敏度为 d + 1, d + 2 d + K (d + =1-P(M + /C + )), 相应的特异度为 d - 1,d - 2 d - K (d - =1-P(M - /C - )) 式中 P K (M + /C + )= a + 1 a a K P K (M + /C - )= (1-a - 1 ) (1-a - 2 ) (1-a - K ) P N (M - /C - )= d + 1 d d K P N (M - /C + )= (1-d - 1 ) (1-d - 2 ) (1-d - K ) 12

14 当估算结果 P(C + /M + ) 0.5 时应考虑进行动物致癌试验, 概率越高, 进行动物致癌试验的必要性越大 当 P(C + /M + ) 0.03 时, 如没有理由认为该化学品属于非遗传致癌物, 可暂不考虑进行动物致癌试验 8.3 在对化学品的致畸性进行评价时, 我国常用致畸指数 ( 雌鼠 LD 50 / 最小致畸剂量 ) 和致畸危害指数 ( 最大不致畸剂量 / 最大可能摄入量 ), 并按照计算结果进行分级, 但由于不同化学品的急性致死剂量 - 反应关系曲线的情况不一, 所以, 可换用 LD 1 LD 5 或以雌鼠体重降低 ( 与对照组相比降低一定的百分比 ) 的剂量, 目前推荐以 BMD 和安全系数对化学品的致畸性进行评价 8.4 由于诱癌作用无阈值, 因此, 在对化学品的致癌危险度进行评定时采用实际安全剂量, 即化学品引起致癌率有 99% 的把握低于 10-6 的剂量水平 9 对化学品毒性鉴定机构的要求从事化学品毒性鉴定的机构应符合 化学品毒性鉴定管理规范 中 化学品毒性鉴定实验室条件及工作准则 (GLP) 的各项要求, 并根据获得资质的等级从事相应项目的化学品毒性鉴定工作 10 对实验动物及动物实验室的要求 10.1 对实验动物的要求 实验动物的基本选择原则 必须使用具有合格证的实验动物 ( 尚未实行等级管理的动物种属除外 ) 应尽量选用各项试验的首选动物, 如选择其他种属应说明原因并确定该种属对所检测的毒性作用敏感 动物试验的一般要求 ( 某些试验对实验动物有特殊要求, 则以试验方法中所列的要求为准 ): 用于同一项试验的同性别动物, 在进行试验前个体之间的体重相差最多不超过 20% 雌性动物一般应为未交配过的 实验动物在实验环境中需适应至少 3~5 天后才能开始染毒 在同一次试验中需多次进行经口染毒时, 至少每周对受试动物进行称重并根据体重调整每只动物的染毒体积 动物福利要求 13

15 应尽量减少实验动物的使用量, 同时为实验动物提供足够的空间, 以供动物采取正常的适应姿势, 并且能够有适当的移动自由 ; 应提供足够的合格饲料和饮水 ; 在试验过程中应尽量减轻动物的痛苦, 不得虐待动物 10.2 进行各项动物试验的动物实验室应符合国家法律法规的有关规定并获得主管部门颁发的合格证 10.3 用于动物试验的饲料 饮水 垫料 笼具等应符合国家法律法规的有关规定 ( 饲料应具有主管部门颁发的合格证 ) 10.4 实验动物管理及从事动物试验的人员, 必须经培训 考核, 持证上岗 11 鉴定报告内容 11.1 受试样品名称 理化性状 配制方法 所用浓度 经口染毒需注明染毒体积 11.2 体内试验需注明 : 实验动物的种属 品系和来源 ( 注明合格证号和动物级别 ) 性别 体重范围 ( 周龄 ) 单笼喂养还是群饲 ; 实验动物饲养环境, 包括饲料来 源 ( 如非标准饲料, 应注明饲料的配方 ) 室温 相对湿度, 动物实验室和饲料 的合格证号 ; 剂量设计和动物分组方法, 每组所用动物性别 数量及初始体重范 围 11.3 体外试验需注明 : 使用的菌株或细胞种类 使用的培养基 培养浓度 培养 温度 培养时间 代谢活化系统 ; 剂量水平 对照组设置 阳性物种类和剂量 11.4 主要操作步骤 ( 如为吸入染毒应注明染毒设备中的气流速度等参数 ) 11.5 各项检测指标的测定方法及主要检测仪器的名称和型号 11.6 检测结果数据统计学处理方法以及各项参数的计算方法 11.7 体内试验需描述染毒后动物中毒表现及出现时间和恢复情况 死亡时间 大 体解剖和尸检所见, 进行病理组织学检查的需描述观察结果 11.8 列表报告各项指标测定结果 ( 一般以 X SD 的形式表达 ), 并列出经计算所 得的毒理学参数 11.9 结论 14

16 第一阶段试验 15

17 急性吸入毒性试验 Acute Inhalation Toxicity Test 1 范围本方法规定了动物急性吸入毒性试验的基本原则 技术和要求 本方法适用于评价气体 挥发性物质或气溶胶 / 颗粒物等化学品的急性吸入毒性作用 2 规范性引用文件 OECD Guideline for Testing of Chemicals ( No.403. Feb. 1981) OECD Guideline for Testing of Chemicals ( No.433. Feb. 2002) 3 试验目的 3.1 检测化学品对实验动物的急性吸入毒性作用和强度 3.2 为亚急 ( 慢 ) 性等吸入毒性试验提供剂量选择的依据 4 定义 4.1 急性吸入毒性 (Acute Inhalation Toxicity): 实验动物短时间 (24h 内 ) 持续吸入一种可吸入性受试样品后, 在短期内出现的健康损害效应 4.2 半数致死浓度 (Median Lethal Concentration,LC 50): 指在一定时间内经呼吸道吸入受试样品后引起受试动物发生死亡的概率为 50% 的浓度 以单位体积空气中受试样品的质量 (mg/m 3 ) 来表示 4.3 剂量 - 反应关系 (Dose-response Relationship): 表示化学毒物的剂量与某一群体中质效应的发生率之间的关系 5 试验基本原则各试验组动物在一定时间内吸入不同浓度的受试样品, 染毒浓度的选择可通过预试验确定 染毒后观察动物的毒性反应和死亡情况 试验期间死亡的动物要进行尸检, 试验结束时仍存活的动物要处死并进行大体解剖 6 试验方法 6.1 实验动物 16

18 首选健康成年小鼠 (18g~22g) 和大鼠 (180g~220g), 也可选用其它敏感动 物 同性别各剂量组个体间体重相差不得超过平均体重的 20% 试验前动物要在 试验环境中至少适应 3~5d 时间 6.2 剂量设计 根据所选方法的要求, 原则上应设 4~5 个剂量组, 每组动物一般为 10 只, 雌 雄各半 各剂量组间距大小以兼顾产生毒性大小和死亡为宜, 通常以较大组距和 较少量动物进行预试 如果受试样品毒性很低, 也可采用一次限量法, 即用 20 只动物 ( 雌雄各半 ),10000 mg/m 3 吸入 2h 或 5000 mg/m 3 吸入 4h, 如未引起动物 死亡, 则不再进行多个剂量的急性吸入毒性试验 6.3 染毒 染毒可采用静式染毒法或动式染毒法 静式染毒法 静式染毒是将实验动物放在一定体积的密闭容器 ( 染毒柜 ) 内, 加入一定量的 受试样品, 并使其挥发, 造成试验需要的受试样品浓度的空气, 一次吸入性染毒 2h 染毒柜的容积以每只染毒小鼠每小时不少于 3L 空气计, 每只大鼠每小时 不少于 30L 计 染毒浓度的计算 : 染毒浓度一般应采用实际测定浓度 在染毒期间一般可 测 4~5 次, 求其平均浓度 在无适当测试方法时 可用下式计算染毒浓度 式中 : 动式染毒法 C=(a d/v) 10 6 C-- 染毒浓度 (mg/m 3 ) a-- 加入受试样品的量 (ml) d-- 化学品密度 v-- 染毒柜容积 (L) 动式染毒是采用机械通风装置, 连续不断地将含有一定浓度受试样品的空气 均匀不断地送入染毒柜, 空气交换量大约为 12~15 次 /h, 并排出等量的染毒气 体, 维持相对稳定的染毒浓度 ( 对通过染毒柜的流动气体应不间断地进行监测, 并至少记录 2 次 ) 一次吸入性染毒 2h 当受试化合物需要特殊要求时, 应用 其它的气流速率 染毒时, 染毒柜内应确保至少有 19% 的氧含量和均衡分配的染 17

19 毒气体 一般情况下, 为确保染毒柜内空气稳定, 实验动物的体积不应超过染毒柜体积的 5% 且染毒柜内应维持微弱的负压, 以防受试样品泄露污染周围环境 同时, 应注意防止受试样品爆炸 受试样品气化 ( 雾化 ) 和输入的常用方法 气体受试样品, 经流量计与空气混合成一定浓度后, 直接输人染毒柜 易挥发液体受试样品, 通过空气鼓泡或适当加热促使挥发后输人染毒柜 若受试样品现场使用时采取喷雾法时, 可采用喷雾器或超声雾化器使其雾化后输入染毒柜 染毒浓度计算染毒浓度一般应采用动物呼吸带实际测定浓度, 每半小时一次, 取其平均值 各测定浓度值应在其平均值的 25% 以内 若无适当的测试方法, 也可采用以下公式计算染毒浓度 : C=[a d/(v 1+v 2)] 10 6 式中 : C-- 染毒浓度 (mg/m 3 ) a-- 气化或雾化受试样品的量 (ml) d-- 受试样品密度 v 1-- 输入染毒柜风量 (L) v 2-- 染毒柜容积 (L) 6.4 观察期限及指标 观察并记录染毒过程和观察期内的动物中毒和死亡情况 观察期限一般为 14d, 观察指标见附录 1-A,LC 50 的计算见附录 1-B 对死亡动物进行尸检 观察期结束后, 处死存活动物并进行大体解剖, 如有必要, 进行病理组织学检查 6.5 试验结果评价评价试验结果时, 应将 LC 50 与观察到的毒性效应和尸检所见相结合考虑,LC 50 值是受试样品急性毒性分级和标签标识以及判定受试样品经呼吸道吸入后引起动物死亡可能性大小的依据 引用 LC 50 值时一定要注明所用实验动物的种属 性别 染毒方式及时间长短 观察期限等 评价应包括动物接触受试样品与动物异 18

20 常表现 ( 包括行为和临床改变 大体损伤 体重变化 致死效应及其它毒性作用 ) 的发生率和严重程度之间的关系 急性吸入毒性分级见附录 1-C 7 鉴定报告鉴定报告应包括如下内容 : 7.1 受试样品名称 理化性状 配制方法 所用浓度 ; 7.2 动式染毒设备中的气流速度 ; 7.3 实验动物的种属 品系和来源 ( 注明合格证号和动物级别 ); 7.4 实验动物饲养环境, 包括饲料来源 室温 相对湿度 动物实验室合格证号 ; 7.5 所用染毒浓度和动物分组, 每组所用动物性别 数量及体重范围 ; 7.6 计算 LC 50 的方法 ; 7.7 染毒后动物中毒表现及出现时间和恢复情况 死亡时间 大体解剖所见 ; 7.8 列表报告结果 ( 建议的表格形式见附录 1-D), 计算的 LC 50 及其 95% 可信区间 ; 7.9 结论 8 试验结果的解释通过 LC 50 的测定, 可评价受试样品的急性吸入毒性及其毒性分级 ( 见附录 1-C), 但其结果外推到人类的有效性是有限的 19

21 急性经皮毒性试验 Acute Dermal Toxicity Test 1 范围本方法规定了动物急性经皮毒性试验的基本原则 技术和要求 本方法适用于评价化学品的急性经皮毒性 2 规范性引用文件 OECD GUIDELINE FOR TESTING CHENICALS(No ) USEPA OPPTIS Health Effects (Series June 1996) 3 试验目的确定受试样品能否经皮肤吸收和短期经皮染毒所产生的毒性作用和强度, 并为确定亚急 ( 慢 ) 性经皮毒性及其它试验的剂量设计提供试验依据 4 定义 4.1 急性经皮毒性 (Acute Dermal Toxicity): 受试样品一次或在 24 h 内多次经皮肤染毒所产生的健康损害效应 4.2 经皮半数致死剂量 (Dermal Median Lethal Dose): 一次或在 24 h 内多次经皮肤染毒受试样品引起 50% 实验动物死亡的剂量, 以 mg/kg bw 表示 4.3 剂量 - 反应关系 (Dose-response Relationship): 表示化学毒物的剂量与某一群体中质效应的发生率之间的关系 5 试验基本原则在试验前, 先去除实验动物受试部位的被毛 将实验动物分成若干剂量组, 每组涂布不同剂量的受试样品, 而后观察实验动物中毒反应和死亡情况, 计算 LD 50 对试验中死亡的动物做大体解剖和病理学检查, 对试验结束时的存活动物也应做大体解剖 注意排除受试样品引起的皮肤局部刺激或腐蚀作用所致的全身效应 20

22 6 试验方法 6.1 受试样品配制固体受试样品应研磨, 过 100 目筛 用适量无毒无刺激性赋形剂混匀, 以保证受试样品与皮肤良好的接触 常用的赋形剂有水 植物油 凡士林 羊毛脂等 液体受试样品一般不必稀释, 可直接用原液试验 6.2 实验动物首选大鼠, 也可选用豚鼠或家兔 实验动物体重要求范围分别为 : 大鼠 200~ 300g, 豚鼠 350~450g, 家兔 2000~3000g 试验期间, 为避免实验动物相互抓挠, 应采用单笼喂养 试验前 24h, 在动物背部正中线两侧剪毛或剃毛, 仔细检查皮肤, 要求完整无损, 以免改变皮肤的通透性 去毛面积不应少于实验动物体表面积的 10% 各类动物体表面积的数值和计算方法见附录 1-E 6.3 剂量和分组实验动物随机分为 4~5 个剂量组 若使用水 植物油 凡士林 羊毛脂外的赋形剂, 则需设赋形剂对照组 豚鼠或大鼠每一剂量组 ( 单性别 ) 不少于 5 只 ; 家兔每一剂量组 ( 单性别 ) 不少于 4 只 各剂量组间要有适当的组距, 可按等比或等差级设置剂量, 以使各剂量组实验动物产生的毒性反应和死亡率呈现剂量 - 反应 ( 效应 ) 关系 一般情况下, 如果剂量达到 2000mg/kg bw 仍不出现实验动物死亡时, 则不需要再进行高剂量试验 6.4 试验步骤选择适当方法固定好实验动物, 将受试样品均匀涂布于实验动物的去毛区, 并用油纸和两层纱布覆盖, 再用无刺激性胶布或绷带加以固定, 以保证受试样品和皮肤的密切接触, 防止脱落和动物舔食受试样品 涂布 4h 后取下固定物和覆盖物, 用温水或适当的溶剂洗去皮肤上残留的受试样品 6.5 观察期限及指标观察并记录染毒过程和观察期内的动物的中毒和死亡情况 观察期限一般为 14d, 全面观察中毒的发生 发展过程和规律以及中毒特点和毒作用的靶器官, 观察指标见附录 1-A,LD 50 的计算见附录 1-B 对死亡动物进行尸检 观察期结束后, 处死存活动物并进行大体解剖, 如有必要, 进行病理组织学检查 21

23 7 试验结果评价按附录 1-B 计算 LD 50, 按附录 1-C 进行急性经皮毒性分级 8 鉴定报告鉴定报告应包括以下内容 : 8.1 实验动物种属品系 来源 饲养环境 饲料和饮水 ; 8.2 按剂量组列表 ( 见附表 1-D) 说明每组动物数 性别状况 出现毒效应的动物数 死亡动物数 ; 8.3 染毒时间 染毒持续时间 染毒后动物中毒的主要表现 ; 8.4 LD 50 计算方法 ; 8.5 LD 50 值及其 95% 可信区间 ( 包括雌 雄实验动物各自的 LD 50); 8.6 病理组织学检查结果 ; 8.7 结论 9 试验结果的解释经皮 LD 50 是评价化学物急性毒性的重要参数之一, 也是急性毒性分级的依据 但 LD 50 仅表示受试样品经皮吸收引起实验动物死亡 50% 的剂量, 并不能全面反映受试样品经皮吸收的所有急性毒性特征, 因此, 评价一受试样品经皮急性毒性既要考虑其对某一品系实验动物的经皮 LD 50 值, 又要考虑其中毒症状表现及反应出现的早晚和持续时间的长短, 并结合体重变化与病理学检查结果等, 经综合分析才能得出经皮急性毒性较为全面的评价 22

24 急性经口毒性试验 Acute Oral Toxicity Test 1 范围本方法规定了动物急性经口毒性试验的基本原则 技术和要求 本方法适用于评价化学品的急性毒性作用 2 规范性引用文件 OECD Guideline for Testing of Chemicals (No Feb ) OECD Guideline for Testing of Chemicals (No Feb ) USEPA OPPTIS Health Effects Guideline (Series June 1996) 3 试验目的 3.1 检测化学品对实验动物的急性毒性作用和强度 3.2 为亚急 ( 慢 ) 性等毒性试验提供剂量选择的依据 3.3 试验结果可作为化学品急性毒性分级和标签标识 4 定义 4.1 急性经口毒性 (Acute Oral Toxicity): 一次或在 24h 内多次经口给予实验动物受试样品后, 动物在短期内出现的健康损害效应 4.2 经口半数致死剂量 (Oral Median Lethal Dose): 经口一次或 24h 内多次经口给予受试样品后, 引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量 以单位体重接受受试样品的质量 (mg/kg bw 或 g/kg bw) 来表示 4.3 剂量 - 反应关系 (Dose-response Relationship): 表示化学毒物的剂量与某一群体中质效应的发生率之间的关系 5 试验基本原则以经口灌胃法给予各试验组动物不同剂量的受试样品, 每组用一个剂量, 染毒剂量的选择可通过预试验确定 染毒后观察动物的毒性反应和死亡情况 试验期间死亡的动物要进行尸检, 试验结束时仍存活的动物要处死并进行大 23

25 体解剖 本方法主要适用于啮齿类动物的研究, 但也可用于非啮齿类动物的 研究 6 试验方法 6.1 受试样品的处理受试样品应溶解或悬浮于适宜的赋形剂中,( 不溶性固体或颗粒状物质研磨 过 100 目筛 ) 建议首选水或食用植物油 ( 如玉米油 ) 作溶剂, 也可考虑使用其它赋形剂 ( 如羧甲基纤维素 明胶 淀粉等 ) 等配成混悬液 ; 不能配制成混悬液时, 可配制成其它形式 ( 如糊状物等 ), 但不能采用具有明显毒性的有机化学溶剂 如采用有毒性的溶剂应单设溶剂对照组观察 6.2 实验动物首选健康成年小鼠 (18g~22g) 和大鼠 (180g~220g), 也可选用其它敏感动物 同性别实验动物个体间体重相差不得超过平均体重的 20% 试验前动物要在试验环境中至少适应 3~5d 时间 6.3 剂量设计根据所选方法的要求, 原则上应设 4~5 个剂量组, 每组动物一般为 10 只, 雌雄各半 各剂量组间距大小以兼顾产生毒性大小和死亡为宜, 通常以较大组距和较少量动物进行预试 如果受试样品毒性很低, 也可采用最大限量法, 即用 20 只动物 ( 雌雄各半 ), 采用 5000mg/kg bw 剂量, 如未引起动物死亡, 可不再进行多个剂量的急性经口毒性试验 6.4 试验步骤 试验前实验动物应禁食 ( 一般 16h 左右 ), 不限制饮水 若采用代谢率高的其它动物, 禁食时间可以适当缩短 正式试验时, 称量动物体重, 随机分组, 然后对各组动物用经口灌胃法一次染毒 各剂量组的灌胃体积应相同, 小鼠常用容量为 20ml/kg bw, 大鼠常用容量为 10ml/kg bw 若一次给予容量太大, 也可在 24h 内分 2~3 次染毒 ( 每次间隔 4h~6h), 但合并作为一次剂量计算 染毒后继续禁食 3h~4h 若采用分批多次染毒, 根据染毒间隔长短, 必要时可给动物一定量的食物和水 观察期限及指标观察并记录染毒过程和观察期内的动物的中毒和死亡情况 观察期限一般为 14d, 观察指标 LD 50 的计算及试验记录形式分别见附录 1-A 1-B 1-D 24

26 对死亡动物进行尸检 观察期结束后, 处死存活动物并进行大体解剖, 如有必要, 进行病理组织学检查 6.5 可采用多种方法测定 LD 50, 建议采用霍恩氏法 寇氏法 概率单位 - 对数图解法 最大耐受量试验和上 - 下法等 ( 见附录 1-B) 7 鉴定报告鉴定报告应包括如下内容 : 7.1 受试样品名称 理化性状 配制方法 所用浓度 ; 7.2 实验动物的种属 品系和来源 ( 注明合格证号和动物级别 ); 7.3 实验动物饲养环境, 包括饲料来源 室温 相对湿度 动物实验室合格证号 ; 7.4 所用剂量和动物分组, 每组所用动物性别 数量及体重范围 ; 7.5 染毒后动物中毒表现和死亡情况及出现时间, 大体解剖及病理所见 ; 7.6 计算 LD 50 的方法及其 LD 50 和 95% 可信限 ; 7.7 列表报告结果 ( 建议的表格形式见附录 D); 7.8 结论 8 试验结果的解释通过急性经口毒性试验和 LD 50 的测定可评价受试样品的急性经口毒性 急性经口毒性分级, 其结果外推到人类的有效性很有限 25

27 急性眼刺激性 / 腐蚀性试验 Acute Eye Irritation/Corrosion Test 1 范围本规范规定了动物急性眼刺激 / 腐蚀性试验的基本原则 要求和方法本规范适用于检测化学物的眼睛刺激性 / 腐蚀性 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No 405,Feb.1987) USEPA OPPTS Health Effects Test Guidelines (Series , Aug.1998) 3 试验目的确定评价化学物对哺乳动物眼睛是否有刺激作用 / 腐蚀作用及其程度 4 定义 4.1 眼睛刺激性 (Eye Irritation): 指眼球表面接触受试样品后产生的可逆性炎性变化 4.2 眼睛腐蚀性 (Eye Corrosion): 指眼球表面接触受试样品后引起的不可逆性组织损伤 5 试验基本原则 5.1 受试样品以一次剂量滴入每只实验动物的一侧眼睛结膜囊内, 以未作处理的另一侧眼睛作为自身对照 ; 5.2 在规定的时间间隔内, 观察对动物眼睛的刺激和腐蚀作用程度并评分, 以此评价受试样品对眼睛的刺激作用 观察时间应能足以评价刺激效应的可逆性和不可逆性 观察时间最少 72h, 但一般不超过 21d; 5.3 当动物出现严重和持久的痛苦迹象时, 以适当的方式将动物处死 ; 5.4 强酸或强碱物质如 ph 2 或 ph 11.5, 由于其可预见的腐蚀特性, 不必做本试验 ; 5.5 已在皮肤试验中证实具有腐蚀或严重刺激毒性的物质不必进行眼刺激试验, 可以推测该物质对眼睛将会引起相似的严重结果 ; 5.6 在充分并公认的体外试验结果中确定可能产生刺激性或腐蚀性的物质不必进行体内试验 26

28 6 试验方法 6.1 受试样品 : 液体 固体或半固体 颗粒物 6.2 实验动物和饲养环境 动物种属首选健康成年白色家兔, 体重 2~3kg 如果使用其它的哺乳动物做试验, 试验者应提供选择的依据 动物数量如果受试样品的显著效应是可预见的, 可以考虑用一只动物 如果用一只动物试验得出的结果提示受试样品有严重的刺激性和腐蚀性, 则不必进行进一步的试验 如果结果相反, 则至少需要 3 只家兔 有时, 在增加动物的进一步试验中应该适当的阐明可疑反应 饲养环境动物实验室应符合国家相应规定 常规饲料喂养, 自由饮水 6.3 剂量设计对于液态受试样品, 一般不需稀释, 可直接使用原液, 染毒量为 0.1ml 若受试样品为固态或颗粒状, 应将其研磨成细粉状, 过 200 目筛, 染毒量应为 100mg 气溶胶产品需喷至容器中, 收集其液体再使用 对挥发性物质, 剂量可以通过使用前后称量容器质量进行估计 6.4 试验步骤 试验前眼睛的检查试验前动物要在动物实验室环境中至少适应 3d 时间 试验前 24h, 要对实验动物的两只眼睛进行常规检查 有眼睛刺激症状 角膜缺陷或结膜损伤的动物不能用于试验 染毒 轻轻拉开实验动物一侧眼睛的下眼睑, 将受试样品 0.1ml(100mg) 滴入 ( 或放入 ) 结膜囊中, 使上 下眼帘被动闭合 1s, 以防止受试样品丢失 未处理的另一侧眼睛作为自身对照 滴入受试样品 24h 内不冲洗眼睛, 如果认为必要, 在 24h 时可进行冲洗 如果受试样品有明显的刺激征象, 另选 3 只动物进行冲洗试验 在滴入受试样品 30s 后, 用生理盐水冲洗 5min, 水的流量和流速都不应导致眼损伤 观察周期观察时间最少要 72h, 也不能严格固定不变, 但必须足够以充分评估观察到的可逆或不可逆效应 通常观察时间一般不超过 21d 27

29 6.4.4 临床检查和评分 在滴入受试样品后的第 1h,24h,48h,72h 和 96h 对眼睛进行检查, 如 果 72h 时未出现刺激反应, 可终止试验 如果发现累及角膜或有其它眼刺激作用, 7d 内不恢复者, 为确定该损害的可逆性或不可逆性需延长观察时间, 一般不超 过 21d 除了对角膜 虹膜 结膜进行观察外, 其它损害效应都应记录并报告 在 24h 观察和记录结束后, 可使用荧光素钠对所有动物的眼睛作进一步检查 在 每次检查中均应按表 1 记录眼的刺激反应, 并按表 2 进行眼刺激强度评价 在进行检查时, 可使用放大镜 手持裂隙灯, 并按表 3 记录 表 1 眼各部位损伤评分表 部位及损伤情况 积分 角膜 A. 混浊程度 ( 以最致密部位为准 ) 无混浊 0 散在或弥漫性混浊, 虹膜清晰可见 1 半透明区易分辨, 虹膜轻度模糊不清 2 出现灰白色半透明区, 虹膜模糊不清, 瞳孔大小勉强可见 3 角膜混浊, 虹膜无法辨认 4 B. 角膜受损范围 <1/4 1 1/4~l/2 2 1/2~3/4 3 3/4~1 4 积分 A B 5 最高积为 80 虹膜 正常 0 皱褶明显加深 充血 水肿 角膜周围有充血 ( 出现任何一项或任何 1 二项 ), 对光反应迟钝 对光反应消失 出血 肉眼可见严重损伤 ( 出现其中一项或全部 ) 2 积分 5 最高积分为 10 结膜 A. 充血, 指睑结膜 ( 包括角膜 虹膜的球结膜部分 ) 血管正常 0 血管充血, 呈鲜红色 1 血管充血, 呈深红色, 个别血管难以辨认 2 弥漫性充血, 呈深紫红色 3 B. 水肿 无水肿 0 轻微水肿伴部分眼睑外翻 1 明显水肿伴部分眼睑外翻 2 水肿至眼睑近半闭合 3 水肿至眼睑超过半闭合 4 C. 分泌物 无 0 少量分泌物 ( 不包括动物内眦少量分泌物 ) 1 分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着 2 分泌物使整个眼区潮湿或粘着 3 积分 (A+B+C) 2 最高积分为 20 角膜 虹膜和结膜反应累加最高积分为

30 表 2 眼刺激强度评价标准 染毒后前 4 天 刺激反应持续时间 刺激强度 最高总积分平均值 ( 总积分平均值 ) 0~ 第 1d 0 无刺激性 2.5~ 第 2d 0 轻刺激性 15~ 第 4d=0 轻刺激性第 4d>0 中度刺激性 第 7d 20, 半数以上动物第 7d 10 中度刺激性 25~ 第 7d 20, 半数以上动物第 7d>10, 但是无任何一只动物 7d>30 中度刺激性第 7d 20, 半数以上动物第 7d>10, 而且有一只动物 7d>30 重度刺激性 第 7d>20 重度刺激性 50~ 重度刺激性 表 3 裂隙灯观察眼刺激反应评分标准 角膜损伤 积分 虹膜 积分 1. 水肿 1. 前房 (auterior Chamber) A. 区域 A. 细胞数 <1/4 1 很少量 1 1/4~1/2 2 中等数 2 1/2~3/4 3 很多 3 3/4~1 4 B. 闪光 (flare) 轻微 1 B. 致密度 中等 2 上皮水肿加上基质轻微水肿 1 明显 3 正常角膜的 1.5 倍厚 2 2. 虹膜 正常角膜的 2 倍厚 3 A. 虹膜充血 整个角膜不透明 4 轻度 1 中度 2 2. 角膜荧光素钠着色 明显 3 A. 散点状着色 B. 瞳孔对光反应 <1/4 1 迟钝 1 1/4~1/2 2 消失 2 1/2~3/4 3 虹膜总分 11 3/4~1 4 眼睑和结膜损伤 积分 1. 充血 轻度 1 B. 融合着色 中度 2 <1/4 1 明显 3 1/4~1/ 水肿 轻度 1 1/2~3/4 3 中度 2 3/4~1 4 明显 3 3. 着色 轻 (1/3) 1 3. 角膜血管化 疤痕 色素沉着 中等 (1/3-2/3) 2 A. 范围 ( 环状面 ) 大范围 (2/3-1) 3 <1/ 溃疡 轻度 1 1/4~1/2 2 中度 2 1/2~3/4 3 明显 3 3/4~ 疤痕 轻度 1 中等 2 4. 角膜穿孔 4 明显 3 角膜总分 20 眼险和结膜总分 15 29

31 结果统计与评价 数据汇总 数据应以表格形式汇总, 记录观察期内每只动物的刺激评分, 直到症状消失 或 21d 试验结束 详细描述刺激的程度和性质, 严重损害的出现, 以及观察到的 除眼以外的任何效应 按表 4 进行统计 表 4 部位动物编号1h 24h 48h 72h 第 4d 第 7d 结膜 虹膜 角膜 总分 结膜 虹膜 角膜 总分 结膜 虹膜 角膜 总分 结膜 虹膜 角膜 总分 * 家兔眼刺激试验结果眼刺激性反应积分 样品对照样品对照样品对照样品对照样品对照样品对照 总积分平均值 * 实验条件 : 不冲洗 /30 秒后冲洗 结果的评价眼刺激评分应与观察到的反应的性质和可逆性或其它方面结合进行评价 单独的积分值不能作为受试样品的刺激性质的最后评判, 应将所有观察结果及各种因素进行综合评价 7 鉴定报告除一般鉴定报告的内容外, 还应包括以下方面 : 7.1 表格记录每只动物每个时间点 ( 如 1h, 24h, 48h,72h 和 4d,7d) 的刺激反应 ; 30

32 7.2 具体描述除眼部以外的其它作用 ; 7.3 刺激 / 腐蚀程度和性质的描述 ; 7.4 描述在各观察时点积分时的检查方法 ( 如裂隙灯 生物显微镜 荧光素染色 ); 7.5 结论 8 试验结果的解释急性眼刺激试验结果从动物外推到人的可靠性很有限 白色家兔在大多数情况下对有刺激性或腐蚀性的物质较人类敏感 若用其它品系动物进行试验时也得到类似结果, 则会增加从动物外推到人的可靠性 31

33 皮肤刺激性 / 腐蚀性试验 Dermal Irritation/Corrosion Test 1 范围本规范规定了动物皮肤刺激 / 腐蚀性试验的基本原则 要求和方法 本规范适用于检测化学品对皮肤的刺激性 / 腐蚀性 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No. 404,July.1992) USEPA OPPTS Health Effects Test Guidelines (Series ,Aug.1998) 3 试验目的确定化学物对哺乳动物皮肤局部是否有刺激作用或腐蚀作用及其程度, 为制定防护化学物对皮肤的刺激保护措施提供依据 4 定义 4.1 皮肤刺激性 (Dermal Irritation): 皮肤涂敷受试样品后局部产生的可逆性炎性变化 4.2 皮肤腐蚀性 (Dermal Corrosion): 皮肤涂敷受试样品后局部引起的不可逆组织损伤 5 试验基本原则 5.1 将受试样品一次 ( 或多次 ) 涂 ( 敷 ) 于健康无破损的皮肤上, 并作自身对照 ( 除非怀疑有严重的刺激 / 腐蚀并逐渐发展 ); 5.2 在规定时间间隔内观察和评价刺激反应的程度, 并作详细的记录 观察时间应足够进行可逆或不可逆效应的观察, 以便进行完整的评价, 但一般不超过 14 天 ; 5.3 强酸或强碱物质如 ph 2 或 ph 11.5, 由于可预见其腐蚀特性, 不必做本试验 ; 5.4 若已知受试样品有很强的经皮吸收毒性 (LD mg/kg bw) 的物质不必进行本试验 ; 32

34 5.5 在充分并公认的体外试验结果中确定可能产生腐蚀或刺激毒性的物质不必 进行体内试验 如果从受试样品的结构活性构效关系可以预见潜在的腐蚀毒性, 则不必做本试验 6 试验方法 6.1 受试样品液态受试样品采用原液或人类实际应用浓度 固体受试样品经研磨粉碎, 过 100 目筛, 然后用水或适当的赋形剂 ( 如凡士林 阿拉伯树胶 乙醇和水 羧甲基纤维素 聚乙二醇 丙三醇 植物油和矿物油等 ) 按一定比例调制, 以保证与皮肤充分接触 当使用赋形剂时, 要考虑赋形剂对受试样品皮肤刺激效应的影响, 使用的赋形剂既不能改变受试样品的吸收 分布 代谢 蓄积或化学性质, 也不能增强 减弱或改变它的毒性特征 6.2 实验动物和饲养环境首选健康成年白色家兔, 其次为白色豚鼠 如果使用其他的哺乳动物做试验, 试验者应提供选择的依据 至少需要 4 只健康成年动物 ( 雄性和 / 或雌性均可 ), 除非提供选择较少动物的依据 推荐使用逐步接触法 ( 见 6.4.2), 以便阐明可疑反应 每只动物相邻的未处理的皮肤可作为对照 实验动物应单笼饲养, 试验前动物要在动物实验室中至少适应 3d 时间 实验动物和动物实验室应符合国家相应规定 常规饲料喂养, 自由饮水 6.3 剂量设计受试样品 0.5m1(g), 均匀涂布于受试部位 如受试样品难以获得, 或易产生全身毒性等原因, 用量可适当减少 但为了试验的一致性, 测试面积应力求相等 6.4 试验步骤 试验前准备试验前 24h, 将实验动物脊柱两侧毛剪去或剃掉, 不可损伤表皮, 去毛范围左右各 3cm 3cm 24h 后, 选择皮肤健康完整无损的动物进行试验 不应在长有浓密岛状毛的部位进行受试样品试验 染毒取受试样品 0.5ml(g) 直接涂布在皮肤上, 用二层纱布 (2.5cm 2.5cm) 和 33

35 一层玻璃纸或类似物覆盖, 再用无刺激性胶布和绷带加以固定 另一侧皮肤作为 对照 采用封闭试验, 敷用时间为 4h 试验结束后, 用温水或无刺激性溶剂清 除残留受试样品 如怀疑受试样品可能引起严重刺激或腐蚀作用, 可采用分段试验, 将三个涂 布受试样品的纱布块同时或先后敷贴于一只家兔背部脱毛区皮肤上, 分别于涂敷 后 3min 60min 和 4h 取下一块纱布, 皮肤涂敷部位在任一时间点出现腐蚀作用, 即可停止试验 观察期限 观察时间的确定应足以观察到可逆和不可逆刺激作用的全过程, 一般不超过 14d 于清除受试样品后的 h 分别观察给予受试样品部位的皮肤反 应, 按表 1 进行皮肤反应评分, 以受试动物积分的平均值进行综合评价, 根据 和 72h 各观察时点最高积分均值, 按表 2 判定皮肤刺激强度 表 1 皮肤刺激反应评分 皮肤反应 积分 红斑和焦痂形成 无红斑 0 轻微红斑 ( 仅仅可觉察到 ) 1 明显红斑 2 中等程度到重度程度红斑 3 严重红斑 ( 轻微的结痂 ) 至轻度焦痂 ( 深度损伤 ) 4 水肿形成 无水肿 0 很轻微水肿 ( 仅仅可觉察到 ) 1 轻微水肿 ( 肿起部位边界清楚 ) 2 中度水肿 ( 隆起约 lmm) 3 严重水肿 ( 隆起约 lmm, 超出染毒部位 ) 4 表 2 皮肤刺激强度分级标准 积分均值 * 0~ * 指观察时点的最高积分均值 6.5 结果统计与评价 : 强度分级 无刺激性 0.5~ 轻刺激性 2.0~ 中等刺激性 6.0~ 强刺激性 数据应以表 3 形式汇总 皮肤刺激评分应与观察到的反应的性质和可逆性或 其它方面综合进行评价 单独的积分值不能作为受试样品的刺激性质的最后评 34

36 判, 可以作为参考值, 在完整的观察描述和评价下具有一定意义 除根据皮肤红 斑 水肿形成的标准积分外, 还应结合刺激作用的性质 恢复程度等进行化学物 刺激作用的综合评价 表 3 家兔急性皮肤刺激 / 腐蚀实验结果记录表 1h 24h 48h 性样品对照样品对照样品对照动物编号别 体重 (kg) 红斑 水肿 总分 红斑 水肿 总分 红斑 水肿 总分 红斑 水肿 总分 红斑 水肿 总分 红斑 水肿 总分 总积分平均值 刺激强度分级 7 鉴定报告除一般鉴定报告的内容外, 还应包括以下方面 : 7.1 用表格记录每只动物每个时间点 ( 如第 和 72 小时, 直到损害逆转或试验终止 ) 的红斑 水肿以及其它皮肤损害 / 反应 ; 7.2 观察到的任何损伤和系统效应 ; 7.3 刺激 / 腐蚀程度和性质的描述 ; 7.4 结论 8 试验结果的解释急性皮肤刺激试验结果从动物外推到人的可靠性很有限 白色家兔在大多数情况下对有刺激性或腐蚀性的物质较人类敏感 若用其它品系动物进行试验时也得到类似结果, 则会增加从动物外推到人的可靠性 试验中使用封闭式接触是一种超常的实验室条件下的试验, 在人类实际接触化学品过程中很少存在这种接触方式 35

37 皮肤变态反应实验 ( 皮肤致敏试验 ) Skin Sensitisation Test 1 范围本规范规定了动物皮肤致敏试验的基本原则 要求和方法 本规范适用于检测化学品对皮肤的变态反应性 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No 406,July.1992) USEPA OPPTS Health Effects Test Guidelines (Series ,Aug.1998) 3 试验目的确定重复接触化学物对哺乳动物是否可引起皮肤变态反应及其程度 4 定义 4.1 皮肤致敏反应 / 过敏性接触性皮炎 (Skin Sensitization/Allergic Contact Dermatitis): 是皮肤对一种物质产生的免疫源性皮肤反应 对于人类这种反应可能以搔痒 红斑 丘疹 水疱 融合水疱为特征 动物的反应不同, 可能只见到皮肤红斑和水肿 4.2 诱导接触 (Induction Exposure): 指机体通过接触受试样品以达到诱导产生致敏状态目的的试验性暴露 ; 4.3 诱导期 (Induction Period): 指机体通过接触受试样品而诱导出过敏状态所需的时间 ; 4.4 激发接触 (Challenge Exposure): 机体接受诱导暴露后, 再次接触受试样品的试验性暴露, 以确定皮肤是否会出现过敏反应 5 试验基本原则实验动物通过多次皮肤涂抹诱导接触受试样品 10~14d( 诱导期 ) 后, 给予激发剂量的受试样品, 观察实验动物, 并与对照动物比较对激发接触受试样品的皮肤反应强度 36

38 6 试验方法 6.1 实验动物和饲养环境 动物种属首选健康 成年的白色豚鼠, 体重 250~300g 如选择其它种属, 试验者需提供选择的依据 动物实验室和饲养动物实验室应符合国家相应规定 动物自由饮食和饮水 需提供富含维生素 C 的食物 动物数量和性别动物数量和性别依赖于选择的试验方法 两种性别均可用于局部封闭敷贴法 (Buehler test) 和豚鼠最大反应试验 (GPMT) 雌性动物应该是未生育过和未怀孕的 Buehler 试验要求试验组至少 20 只豚鼠, 对照组至少 10 只 GPMT 要求试验组至少 10 只豚鼠, 对照组至少 5 只, 如果试验结果难以确定受试样品的致敏性, 应增加动物数, 试验组至少 20 只, 对照组至少 10 只 6.2 试验方法可靠性的检查使用已知的能引起轻度 / 中度致敏的阳性物每隔 6 个月检查一次 局部封闭涂皮法至少有 30% 动物出现皮肤过敏反应 ; 皮内注射法至少有 60% 动物出现皮肤过敏反应 阳性物一般采用 : 已苯乙烯醛 (CAS No ); 巯基苯并噻唑 (CAS No ); 氨基苯甲酸乙酯 (CAS No ); 二硝基氯苯 (CAS No ); 或 DER 331 环氧树脂 6.3 剂量设计试验剂量水平可以通过少量动物 (2~3 只 ) 的预试验获得 诱导剂量为能引起皮肤刺激反应的最高浓度, 激发剂量为不能引起皮肤刺激作用的最高剂量 水溶性受试样品可用水或无刺激性表面活性剂作为赋形剂, 其它受试样品可用 80% 乙醇 ( 诱导接触 ) 或丙酮 ( 激发接触 ) 作赋形剂 6.4 试验步骤 局部封闭涂皮法 (Buehler test) 动物数 : 试验组至少 20 只, 对照组至少 10 只 剂量水平 : 用 2~3 只动物进行预试验, 寻找能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度 ( 剂量 ) 37

39 在试验中设阴性对照组, 在诱导接触时该组仅涂以溶剂作为对照 ; 在激发接触时该组涂以受试样品 对照组动物必须与受试样品组动物为同一批 在实验室开展致敏反应试验初期 或使用新的动物种属或品系时, 需同时设阳性对照组 诱导接触 : 试验前 24h 实验动物背部左侧去毛, 去毛范围为 4cm 2 ~6cm 2 于第 d 分别将 0.4ml 新配制的受试样品 ( 最小刺激浓度 ) 涂布在背部左侧 2cm 2cm 的区域, 以二层纱布和一层玻璃纸覆盖, 再以无刺激胶带封闭固定 6h 后, 移去敷贴物, 清除残留受试样品 激发接触 : 末次诱导 2W 后, 即第 28d, 将 0.4ml 受试样品 ( 最大无刺激浓度, 建议为诱导浓度的 1/2) 敷贴于豚鼠右侧背部 2cm 2cm 的脱毛区 ( 试验前 24h 去毛 ), 然后用二层纱布和一层玻璃纸覆盖, 后者紧贴皮肤, 再以无刺激胶带封闭固定 6h 后, 移去敷贴物, 清洗方法同前 结果观察与评价 : 在 24 48h 后分别观察局部皮肤反应 用盲法观察对照组和试验组 按表 1 对局部皮肤反应评分 当受试样品组动物出现皮肤反应积分 2 时, 判为该动物出现皮肤致敏反应阳性, 并计算致敏率, 按表 2 判定受试样品的致敏强度 如果结果可疑, 该动物可以一周后重新激发, 用最初的对照组或新的对照组进行比较 表 1 皮肤致敏反应试验评分标准 反应 评分 红斑和焦痂形成 无反应 0 轻微的红斑 ( 勉强可见 ) 1 明显红斑 ( 散在或小块红斑 ) 2 中度 - 重度红斑 3 严重红斑 ( 紫红色 ) 至轻微焦痂形成 4 水肿形成 无水肿 0 轻微水肿 ( 勉强可见 ) 1 中度水肿 ( 皮肤隆起轮廓清楚 ) 2 严重水肿 ( 皮肤隆起约 1cm 或以上 ) 3 最高积分 7 注 : 皮肤致敏程度分级同表 2 38

40 表 2 皮肤致敏反应试验分级标准 致敏率 (%) 等级致敏程度 <9 Ⅰ 弱 9~ Ⅱ 轻度 29~ Ⅲ 中度 65~ Ⅳ 强 81 Ⅴ 极强 注 : 致敏率是反应评分为 1 或以上的动物数占该组动物总数的百分比,Ⅰ 级致敏度没有意义, 在实际使用下无致敏危险 豚鼠最大反应试验 (Guinea Pig Maximization Test, GPMT) 采用完全福氏佐剂 (Freund Complete Adjvant, FCA) 皮内注射方法检测致敏的可能性 动物数 : 试验组至少用 10, 对照组至少 5 只 如果试验结果难以确定受试样品的致敏性, 应增加动物数, 试验组 20 只, 对照组 10 只 剂量水平 : 诱导接触受试样品浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度, 激发接触受试样品浓度为不能引起皮肤刺激反应的最高浓度 试验浓度水平可以通过少量动物 (2~3 只 ) 的预试验获得 试验步骤 诱导接触 ( 第 0d): 受试样品组 : 将颈背部去毛区 (2cm 4cm) 中线两侧划定三个对称点, 每点皮内注射 0.1mL 下述溶液 第 1 点 1:1(V/V)FCA/ 水或生理盐水的混合物第 2 点耐受浓度的受试样品第 3 点用 1:1(V/V)FCA/ 水或生理盐水配制的受试物, 浓度与第 2 点相同对照组 : 注射部位同受试样品第 1 点 1:1(V/V)FCA/ 水或生理盐水的混合物第 2 点未稀释的赋形剂第 3 点用 1:1(V/V)FCA/ 水或生理盐水配制的浓度为 50%(w/v) 的赋形剂 诱导接触 ( 第 7d): 将涂有 0.5(mL) 受试样品的 2cm 4cm 滤纸敷贴在上述再次去毛的注射部 39

41 位, 然后用两层纱布, 一层玻璃纸覆盖, 无刺激胶布封闭固定 48h 对无皮肤刺激作用的受试样品, 可加强致敏, 于第二次诱导接触前 24h 在注射部位涂抹 10 % 十二烷基硫酸钠 (SLS)0.5mL 对照组仅用赋形剂作诱导处理 激发接触 ( 第 21d): 将豚鼠躯干部去毛, 用涂有 0.5g(mL) 受试样品的 2cm 2cm 滤纸片敷贴在去毛区, 然后再用两层纱布, 一层玻璃纸覆盖, 无刺激胶布封闭固定 24h 对照组动物作同样处理 如激发接触所得结果不能确定, 可在第一次激发接触一周后进行第二次激发接触 对照组作同步处理 观察及结果评价 : 激发接触结束, 除去涂有受试样品的滤纸后 和 72h, 观察皮肤反应, ( 如需要清除受试残留物可用水或选用不改变皮肤已有反应和不损伤皮肤的溶剂 ) 按表 3 评分 当受试样品组动物皮肤反应积分 1 时, 应判为皮肤致敏反应阳性, 按表 2 对受试样品进行致敏强度分级 表 3 皮肤致敏反应试验评分标准反应评分无反应 0 散在或小块红斑 1 中度弥漫的红斑 轻度水肿 2 严重的红斑 水肿 皮肤变态反应试验 - 局部淋巴结法 (Skin Sensitization-Local Lymph Node Assay,LLNA) 见参考方法 7 鉴定报告除一般鉴定报告的内容外, 还应包括以下方面 : 7.1 阳性试验信息, 包括阳性对照物 试验方法和试验时间 ; 7.2 评分等级系统的简要描述 ; 7.3 诱导和激发使用的赋形剂, 如果不是水和生理盐水, 说明使用的理由 任何可能与受试样品反应 或增强 或妨碍吸收的原料均应报告 ; 7.4 诱导和激发使用受试样品的总量, 每次使用的技术 ; 7.5 结论 8 试验结果的解释试验结果应能得出受试样品的致敏能力和强度, 这些结果只能在很有限的范围内外推到人类 40

42 规范性附录 附录 1-A 1-A 啮齿类动物中毒表现观察项目表 器官系统 观察及检查项目 中毒后一般表现 行为 改变姿势, 叫声异常, 不安或呆滞 动作震颤, 运动失调, 麻痹, 惊厥, 强制性动作中枢神经系统及躯体运各种刺激的反应易兴奋, 知觉过敏或缺乏知觉动大脑及脊髓反射减弱或消失 肌肉张力 强直, 驰缓 自主神经系统 瞳孔大小缩小或放大分泌流涎, 流泪 呼吸性质 鼻孔流鼻涕呼吸性质和速率徐缓, 困难, 潮式呼吸 心血管系统 心区触诊 心动过缓, 心律不齐, 心跳过强或过弱 胃肠系统 腹形气胀或收缩, 腹泻或便秘粪便硬度和颜色粪便不成形, 黑色或灰色 生殖泌尿系统 阴户, 乳腺阴茎会阴部 膨胀脱垂污秽 皮肤和毛皮 颜色, 张力发红, 皱折, 松弛, 皮疹完整性竖毛 粘膜 粘膜流粘液, 充血, 出血性紫绀, 苍白口腔溃疡 眼 其它 眼睑眼球透明度直肠或皮肤温度一般情况 上睑下垂眼球突出或震颤混浊降低或升高姿势不正常, 消瘦 附录 1-B 化学物急性毒性试验 LD 50(LC 50) 计算方法 1-B1 霍恩氏 (Horn) 法 1.1 预试验 : 可根据受试样品的性质和己知资料, 选用下述方法 : 一般多采用 和 10.0g/kg bw 的剂量, 各以 2~3 只动物预试验 根据 24h 内死亡情况, 估计 LD 50 的可能范围, 确定正式试验的剂量 也可简单地采用一个剂量, 如 215mg/kg bw, 用 5 只动物预试验 观察 24h 内动物的中毒表现 如症状严重, 估计多数动物可能死亡, 即可采用低于 215mg/kg bw 的剂量系列, 反之症状较轻, 则可采用高于此剂量的剂量系列 如有相应的文献资料时可不进行预试验 41

43 1.2 动物数 : 一般每组用 5 只 1.3 常用剂量系列 : t t=0,±1, ±2, ± 因为剂量间距较 1.0/3.16 t=0,±1, ±2, ±3 为小, 所以结果较 为精确 一般试验时, 可根据上述剂量系列设计 5 个组, 即较原来的方法 在最低剂量组以下或最高剂量组以上各增设一组, 这样在查表时容易得出 结果 1.4 正式试验 : 将动物在动物实验室饲养观察 3~5 天, 使其适应环境, 证明 其确系健康动物后, 进行随机分组 给予受试样品后一般观察 14 天, 必要时 延长到 28 天 记录死亡数, 查表 ( 附录 1-B) 求得 LD 50, 并记录死亡时间及中 毒表现等 1.5 该方法的优缺点 : 优点是简单易行, 节省动物 ; 缺点是所得 LD 50 的可信 限范围较大, 不够精确 但经多年来的实际应用与验证, 同一受试样品与寇 氏法所得结果极为相近 因此对其测定的结果应认为是可信与有效的 1-B-1.1 霍恩氏法 (Horn)LD 50 值计算 ( 剂量递增法测定 LD 50 计算用表 ) 剂量 1=0.464 剂量 1=1.00 剂量 1=2.15 组 1 组 2 组 3 组 4 剂量 2= t 剂量 2= t 剂量 2= t 或剂量 3=2.15 剂量 3=4.64 剂量 3=10.0 组 1 组 3 组 2 组 4 剂量 4=4.64 剂量 4=10.0 剂量 4=21.5 LD50 95% 可信限 LD50 95% 可信限 LD50 95% 可信限

44 B-1.2 此表用于每组 5 只动物, 其剂量递增公比为 10 1/2, 意即 /2 =31.6, /2 =100, 余此类推 此剂量系列排列如下 : t t=0,±1, ±2, ±3 43

45 1-B-1.2 霍恩氏法 (Horn)LD 50 值计算 ( 剂量递增法测定 LD 50 计算用表 ) 剂量 1=0.316 剂量 1=1.00 组 1 组 2 组 3 组 4 剂量 2= t 剂量 2= t 或组 1 组 3 组 2 组 剂量 3=3.16 剂量 4=10.0 剂量 3=10.0 剂量 4=31.6 LD50 95% 可信限 LD50 95% 可信限

46 B.2 寇氏 (Korbor) 法 2.1 预试验 : 除另有要求外, 一般应在预试中求得动物全死亡或 90% 以上死亡的剂量和动物不死亡或 10% 以下死亡的剂量, 分别作为正式试验的最高与最低剂量 2.2 动物数 : 除另有要求外, 一般设 5~10 个剂量组, 每组 6~10 只动物为宜 2.3 剂量 : 将由预试验得出的最高 最低剂量换算为常用对数, 然后将最高 最低剂量的对数差, 按所需要的组数, 分为几个对数等距 ( 或不等距 ) 的剂量组 2.4 试验结果的计算与统计 列试验数据及其计算表包括各组剂量 (mg/kg bw, g/kg bw), 剂量对数 (X), 动物数 (n), 动物死亡数 (r), 动物死亡百分比 (p, 以小数表示 ), 以及统计公式中要求的其它计算数据项目 LD 50 的计算公式根据试验条件及试验结果, 可分别选用下列三个公式中的一个, 求出 log LD 50, 再查其自然数, 即 LD 50(mg/kg bw, g/kg bw) 45

47 按本试验设计得出的任何结果, 均可用式 (1): logld 50= 1/2 (X i+x i+1)(p i+1-p i). (1) 式中 :X i 与 X i+1 及 P i+1 与 P i 分别为相邻两组的剂量对数以及动物死亡百分比 按本试验设计且各组剂量对数等距时, 可用式 (2): logld 50=XK-1/2 (P i+ P i+1). (2) 式中 : XK. 最高剂量对数, 其它同式 (1) 若试验条件同 且最高 最低剂量组动物死亡百分比分别为 100( 全死 ) 和 0( 全不死时 ), 则可用简便计算式 (3) logld 50=XK-d ( P-0.5). (3) 式中 : P. 各组动物死亡百分比之和, 其它同式 (2) 标准误与 95% 可信限 logld 50 的标准误 (S) S logld 50=d{[ P i(i-p i)]/n} 1/2. (4) % 可信限 (X) X=log -1 (log LD 50±1.96. S logld 50). (5) 此法易于了解, 计算简便, 可信限不大, 结果可靠, 特别是在试验前对受试样品的急性毒性程度了解不多时, 尤为适用 1-B-3 概率单位 - 对数图解法 3.1 预试验 : 以每组 2~3 只动物找出全死和全不死的剂量 3.2 动物数 : 一般每组不少于 10 只, 各组动物数量不一定要求相等 3.3 剂量及分组 : 一般在预试验中得到的两个剂量组之间拟出等比的六个剂量组或更多的组 此法不要求剂量组间呈等比关系, 但等比可使各点距离相等, 有利于作图 3.4 作图计算 根据各剂量组动物死亡率, 从附录 1-B-3 中查各组的概率单位 因死亡率为 0% 和 100% 的概率单位, 与所试动物数有关, 故需另在附录 1-B-4 中查找 例如 : 对死亡率为 45% 的概率单位, 可查附录 1-B-3 先在表的左侧纵标目上找到 40, 而后在表的上行横标目处找到 5, 两者交叉点处的 4.87, 即为 45% 的概率单位 又如 : 某组用 10 只实验动物, 如果全部存活 ( 死亡率为 0%), 查附录 1-B-4, 其概率单位为 用方格纸绘散点图, 横轴表示剂量的对数值 (X), 纵轴为概率单位值 (Y), 将各组数值点在图上 46

48 3.4.3 按各点的分布趋势, 用直尺绘出一条最适合于各点的直线, 使线上方的点 到线的总距离与线下方的点到线的总距离相近, 此线应尽量靠近概率单位为 5 的 点及附近的点 查出求概率单位 5 处的剂量对数, 其反对数即为 LD 按下列公式计算 LD 50 的 95% 可信限 S=(X 2 X 1)/(Y 2 Y 1) Sm=S/(Nˊ /2) -1/2 LD 50 对数值的 95% 可信限 =log LD 50±1.96Sm ( 上式结果, 经反对数变换后, 可得 LD 50 的 95% 可信限 ) [Sm 为 LD 50 的标准误 S 为标准差 X 1 X 2 分别为机率单位等于 4(Y 1) 和 6(Y 2) 时 相应的剂量对数值 N 为 Y 1(=4) 及 Y 2(=6) 相应的死亡率间所用的动物数 ] 1-B-4 最大限量试验 : 4.1 适宜条件 : 有关资料显示毒性极小的或未显示毒性的受试样品, 给予动物最 大使用浓度和最大灌胃容量的受试样品时, 仍不出现死亡 4.2 动物数 : 至少雌 雄各 5 只 4.3 剂量 : 受试样品最大使用浓度和灌胃容量 ( 一个剂量组 ) 4.4 方法 : 动物购买后观察 3-5 天, 给予最大使用浓度和最大灌胃容量的受试样 品 ( 一日内 1 次或多次给予, 一日内最多不超过 3 次 ), 连续观察 14 天, 动物不出 现死亡, 则认为受试样品对某种动物的经口急性毒性剂量大于某一数值 (mg/kg bw) 1-B-3 附录 1-B-3 反应率 概率单位表 反应率

49 1-B-4 附录 1-B-4 相当于反应率 0% 及 100% 的概率单位 每组动物数 反应率反应率每组动物数 0% 100% 0% 100% B.5 上 - 下法 (Up-and-Down Procedure UDP) 5.1 上 - 下法是所需实验动物数量最少的急性毒性试验方法 此方法适用于 1 或 2 天内引起动物死亡的受试样品 5 天以上引起动物死亡的受试样品不适用此方法 因严重的刺激性和腐蚀性引起明显疼痛的受试样品剂量不需进行该试验 濒死 的 有极其痛苦症状的动物要被处死, 对试验结果的解释时, 这些动物要与试验 中死亡的动物同样被考虑进去 5.2 试验方法 最大限量试验 按 5000mg/kg bw 剂量给一只动物染毒, 如动物死亡, 用后述的主试验测 LD 50 如动物存活, 增加两只动物继续染毒 如两只动物均存活,LD 50 高于限度剂量且 试验终止 ( 观察 14 天不进一步染毒 ) 如果一只或两只动物死亡, 则另增加两只动物染毒, 一次一只 如果试验中 一只动物出现未预料到的延迟死亡, 而其它动物存活, 恰当的方法是停止染毒并 观察所有动物在观察期中是否仍会出现死亡 结果评价如下 (O= 存活,X= 死亡, U= 不必 ) 当 3 只或以上的动物死亡时,LD 50 小于 5000mg/kg bw: OXOXX OOXXX OXXOX OXXX 当 3 只或 3 只以上动物存活时,LD 50 大于 5000mg/kg bw: OOO OXOXO OXOO OOXXO OOXO OXXOO 48

50 5.2.2 主试验 试验方法单个动物通常在 48h 时间间隔被连续染毒 然而, 两次染毒的时间间隔是由毒性作用的时间 耐受时间和毒性反应的严重性来决定 直到已染毒的动物确信存活, 才能对动物进行下一剂量染毒 时间间隔可适当调整 第一只动物的染毒剂量应在预计的 LD 50 之下 如此动物存活, 第二只动物接受更高一级剂量 如果第一只动物死亡或出现濒死, 第二只动物接受更低一级剂量 通常选择的剂量递增系数为 3.2(3.2 为估计的剂量 - 反应曲线斜率等于 2 的倒数 1/2 的反对数 ), 此系数在整个试验过程中是固定不变的 没有受试样品剂量 - 反应曲线斜率的信息时, 使用 3.2 为剂量递增系数 使用 3.2 为剂量递增系数时, 剂量序列为 1.75,5.5,17.5,55,175,550,1750,5000 如果没有受试样品致死性资料时, 起始染毒剂量为 175mg/kg bw 如果动物对受试样品的剂量 - 反应曲线斜率小于 2, 在开始试验前, 剂量递增系数应增加一个等级 ; 反之应降低一个等级 ( 附录 1-B-5 为起始剂量为 0.175mg/kg bw 斜率从 1-8 的递增剂量表 ) 染毒继续与否取决于所有动物固定时间间隔 (48h) 的结果 当下列终止标准中一个首先被满足时试验终止 a. 上限剂量 3 个连续的动物存活 b. 在试验的任何 6 个连续的动物中有 5 个出现相反反应 c. 首对相反反应出现后至少有 4 只动物进行试验并指定的可能性比例超过标准值 濒死动物与在试验中死亡的动物同样考虑 如果一个动物在研究中出现未预料的延迟死亡, 且在此剂量或剂量之上的其它动物存活, 应当停止染毒并观察所有已染毒动物在观察期中是否仍有死亡 如果存活的动物随后也出现死亡, 所用的剂量水平超过 LD 50, 最好是重新选择恰当的方法进行研究 如果在死亡的动物剂量水平或剂量之上后来的动物都存活, 没有必要改变剂量循进系数, 因为现在已死亡动物的信息按照比后来存活的动物低一个剂量级的剂量水平纳入计算 LD 50 将下移 因 LD 50 和斜率的结合, 在出现相反结果后 4-6 个动物满足终止标准 在某些情况下, 对剂量 - 反应曲线斜率低的化学品, 需要增加动物到总数 15 只 主试验 LD 50 和可信限区间的计算主试验 LD 50 和可信限区间的计算可以利用 OECD 推荐的 AOT425 计算机程序包完成 AOT425 计算机程序包可直接从 OECD 和 EPA 网页上下载 试验前应确定选用的 Sigma 值 是最大限量试验还是主试验及最大限量值, 每次试验的剂量 结果均应及时输入 AOT425 程序, 程序将自动给出下次试验的剂量及是否可以停止试验, 并计算出 LD 50 和 95% 可信限区间 49

51 1-B-5 附录 1-B-5 上 - 下法不同斜率各剂量表 斜率各剂量表 (mg/kg bw) 斜率 = * 0.175* 0.175* 0.175* 0.175* 0.175* 0.175* 0.175* * 如果需要更低的剂量, 应继续降低剂量级数 50

52 附录 1-C 表 1-C 急性毒性分级标准 毒性指标 剧毒 高毒 中等毒 低毒 经口 LD50 50(mg/kg) <5 5~ 50~ >500 吸入 LC50 50(mg/m 3 ) <20 20~ 200~ >2000 经皮 LD50 50(mg/kg) <20 20~ 200~ >2000 注 : 引用 工业化学品毒性鉴定规范及实验方法 浓度 ( 剂量 ) mg/m 3 (mg/kg) 表 1-D 动物性别 动物体重 (g) 动物编号 0d 7d 14d 附录 1-D 急性毒性试验记录表 染毒方式 中毒症状 中毒症状出现和消失时间 死亡时间 解剖所见 LD50(LC50) 95% 可信区间 51

53 附录 1-E 实验动物体表面积估算方法 1-E-1 家兔 S=K m 2/3 式中 :S- 体表面积,cm 2 ;K- 常数, 一般成年家兔为 10; m- 动物体重,g 例: 体重 2kg 成年家兔体表面积 :S= /3 lgs=lg10+2/3lg2000 = = = 查反对数表 :S=1588cm 2 1-E-1 家兔体表面积 (cm 2 ) 体重 (g) E-2 豚鼠 S=K m 2/3 式中 :S- 体表面积,cm 2 ;K- 常数,K=9.26;m- 动物体重,g 例 : 体重 438g 豚鼠的体表面积 :S= /3 lgs=lg9.26+2/3lg438= / = = 查反对数表 :S=534cm 2 1-E-2 豚鼠体表面积 (cm ) 体重 (g)

54 1-E-3 大鼠 S=K m 2/3 式中 :S- 体表面积,cm 2 ;K- 常数,K=0.0913; m- 动物体重,g 例 : 体重 200g 大鼠的体表面积 :S= (0.2) 2/3 lgs=lg /3lg0.2=( )+2/3 ( ) =( )+( )= 查反对数表 :S=312cm 2 1-E-3 大鼠体表面积 (cm 2 ) 体重 (g)

55 第二阶段试验 54

56 鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验 (Ames 试验 ) Salmonella Typhimurium Reverse Mutation Assay 1 范围本规范规定了鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验 (Ames 试验 ) 的基本原则 要求和方法 本规范适用于检测化学品 ( 有杀菌作用的除外 ) 的致突变性 2 规范性引用文件 OECD Guideline for testing of chemicals(no.471,1997) USEPA OPPTS Health Effects Test Guidelines(Series ,1998) 3 试验目的检测化学物质的诱变性, 预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性 4 定义 4.1 回复突变 (Reverse Mutation): 细菌在化学突变物作用下由营养缺陷型回变到野生型 4.2 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验 (Salmonella Typhimurium Reverse Mutation Assay): 利用一组鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型试验菌株测定引起沙门氏菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的组氨酸缺陷型 (his - ) 回变到野生型 (his + ) 的试验方法 5 试验基本原理鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸, 故在缺乏组氨酸的培养基上, 仅少数自发回复突变的细菌生长 假如有致突变物存在, 则营养缺陷型的细菌回复突变成野生型, 因此能生长形成菌落, 据此判断受试样品是否为致突变物 某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变, 故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的 S 9 混合液 6 试验方法 6.1 样品处理选定受试样品的合适溶剂, 首选无菌双蒸水作为溶剂, 如果不溶于水的或水 55

57 溶性低的化学物, 首选二甲基亚砜 6.2 剂量设计决定受试样品最高剂量的标准是对细菌的毒性及其溶解度 自发回变数的减少, 背景变得清晰或被处理的培养物细菌存活数减少, 都是毒性的标志 每一受试样品检测时至少设五个剂量组, 可按 5~5000μg/ 皿剂量设定, 也可根据预试验结果按等比组距设定需要的浓度范围 6.3 试验方法 配制培养基和试剂 % 葡萄糖溶液称取 200g 葡萄糖, 加入蒸镏水至 1000ml,0.068MPa 高压灭菌 20min 贮于 4 冰箱 mmol/L 组氨酸 -0.5mmol/L 生物素溶液成分 : D- 生物素 ( 分子量 244) 122mg L- 组氨酸 ( 分子量 155) 78mg 无菌蒸馏水至 1000ml 不宜进行高压灭菌处理, 使用无菌玻璃器皿配制 贮于 4 冰箱 代谢活化系统肝混合功能氧化酶混合液 ( S 9 混合液 ), 配制方法见附录 2-A 盐溶液 (1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl 2) 成分 : 氯化钾 (KCl) 61.5g 氯化镁 (MgCl 2 6H 2O) 40.7g 蒸馏水至 500ml 0.103MPa 高压灭菌 30min 贮于 4 冰箱 mol/L 磷酸盐缓冲液 (PH7.4) 成分 : 磷酸二氢钠 (NaH 2PO 4.2H 2O) 2.965g 磷酸氢二钠 (Na 2HPO 4.12H 2O) g 蒸镏水至 500ml 0.103MPa 高压灭菌 30min 贮于 4 冰箱 mol/L 氯化钾溶液精确称取氯化钾 11.18g, 用蒸馏水稀释至 1000ml,0.103MPa 高压灭菌 30min 贮于 4 冰箱 氨苄青霉素碱性溶液 (8mg/ml) 称取氨苄青霉素 80mg, 加入 0.02mol/L NaOH 溶液 10ml 56

58 % 结晶紫溶液称取结晶紫 10mg, 加 10ml 无菌水 四环素溶液 (8mg/ml) 称取四环素 40mg, 加入 0.02mol/L HCl 溶液 5ml 溶解或稀释化学物质常用溶剂 : 蒸馏水 二甲基亚枫 (DMSO) 常用阳性对照及参考剂量 : 柔毛霉素 60μg/ml 叠氮化钠 (NaN 3) 50μg/ml 2- 氨基芴 (2-FA) 1000μg/ml 敌克松 (dexon) 1000μg/ml 丝裂霉素 C(mytomycin C,MMC) 10ug/ml Vogel-Bonner(V-B) 培养基 E 成分 : 枸椽酸 (C 6H 8O 7 H 2O) 100g 磷酸氢二钾 (K 2HPO 4) 500g 磷酸氢氨钠 (NaNH 4HPO 4.4H 2O) 175g 硫酸镁 (MgSO 4.7H 2O) 10g 蒸镏水至 1000ml 先将前三种成分加热溶解后, 再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中, 加蒸馏水稀释至 1000ml, 分装后 0.103MPa 高压灭菌 30min 贮于 4 冰箱 顶层培养基成分 : 琼脂粉 1.2g 氯化钠 1.0g 蒸馏水至 200ml 0.103MPa 高压灭菌 30min 后, 加入 0.5mmol/L 组氨酸 -0.5mmol/L 生物素溶液 底层培养基成分 : 琼脂粉 7.5g 蒸馏水 480ml V-B 培养基 E 10ml 20% 葡萄糖溶液 10ml 先将前两种成分于 0.103MPa 高压灭菌 30min 后, 再加入后两种成分, 充分混匀倒底层平板 按每皿 25~30ml 倒平皿, 冷凝固化后倒置于 37 培养箱中 24h, 备用 57

59 肉汤培养基 成分 : 牛肉膏 2.5g 胰胨 5.0g 磷酸氢二钾 (K 2HPO 4) 1.0g 蒸镏水 至 500ml 将上述成分混合后, 于 0.103MPa 高压灭菌 30min 贮于 4 冰箱 营养琼脂平板 6.4 菌株 成分 : 琼脂粉 7.5g 营养肉汤培养基 0.103MPa 高压灭菌 30min 后, 倒斜面或平板 500ml 一般使用鼠伤寒沙门氏杆菌 TA97a 或 TA97 TA98 TA100 TA102 菌株, 特 殊情况下选用 TA1535 TA1537 等菌株 分离 18-24h 将新获得的或经长期保存的试验菌株分别划线接种于主平板,37 培养 增菌 用接种环分别刮取主平板中分离好的单个菌落分别接种于 5ml 新鲜营养肉 汤内增菌,37 振荡 (100 次 /min) 培养 10h 该菌株培养物应每毫升不少于 1~ 活菌数 保存 取增菌液 0.8ml, 加高压灭菌 DMSO 0.07ml 置于 2ml 已灭菌 耐低温的带塞 小塑料试管内, 冷冻后贮存于盛有液氮的液氮罐内冷藏备用, 置 4 冰箱可保存 一个月 菌株鉴定 新获得的或长期保存的菌种, 在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定, 菌株 鉴定的判断标准如表 1 所示 表 1 试验菌株鉴定的判断标准 菌株组氨酸缺陷 脂多糖屏障氨苄青霉四环素切除修复缺损缺损素抗性抗性 自发回变菌落数 TA ~180 TA ~50 TA ~200 TA ~320 + 表示需 + 表示具 + 表示 + 表示具有 + 表示具 * 在体外代谢活化 注 要组氨酸 有 rfa 突变 具有 R 因子 uvrb 突变 有 paqi 质粒条件下自发回变菌落数略增 注 : 其他菌株生物特性鉴定参照有关文献 58

60 组氨酸依赖性组氨酸营养缺陷型菌株只能在有组氨酸的营养培养基中生长, 在不加组氨酸的培养基上则不生长 将组氨酸营养缺陷型菌株分别用划线法接种于含有和不含有组氨酸的培养基中,37 培养 24h, 观察细菌生长情况 组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长, 而在无组氨酸平板上则不能生长 脂多糖屏障丢失具有深粗糙 (rfa) 的菌株, 其表面一层脂多糖屏障缺损, 因此一些大分子物质如结晶紫能穿透菌膜进入菌体, 从而抑制其生长, 而野生型菌株则不受其影响 取 0.1ml 营养牛肉汤增菌液加到 2ml 45~46 已融化的顶层琼脂中, 摇匀, 立即倒在有营养肉汤的底层琼脂培养基上, 使其均匀分布 待琼脂凝固后, 在平皿中央放一直径为 6mm 的圆滤纸上, 然后将结晶紫水溶液 (1mg/ml)10μl 滴在滤纸上 37 培养 24h 假若待测菌在滤纸片周围有清晰透明的抑菌圈, 即表示结晶紫的分子已进入细菌体内, 说明该待测菌株具有 rfa 突变 紫外线损伤修复缺陷具有紫外线损伤修复缺陷 ( uvrb 突变 ) 的菌株对紫外线敏感, 当受到紫外线照射后, 不能生长, 而具有野生型切除修复酶的菌株, 则能照常生长 在营养牛肉汤琼脂培养基平皿的底部背面, 用红笔划一直线, 在培养基上沿红线用划线法接种细菌后, 用黑纸覆盖平皿的 1/2, 其余部分用紫外线灯照射 (15W), 距离 33cm, 照射 8 秒钟 紫外线照射部分不能生长, 而黑纸覆盖的那一半则能生长 具有 uvrb 突变的菌株对紫外线敏感, 经辐射后细菌不生长, 而具有完整的切除修复系统的菌株, 则照常生长 抗氨苄青霉素 R 因子鉴定含 R 因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性 因为 R 因子不太稳定, 容易丢失, 故用氨苄青霉素确定该质粒存在与否 在营养牛肉汤琼脂平皿背面中线, 用红笔划一直线, 再用微量注射器在培养基上沿红线涂 10μl 氨苄青霉素, 待其干后与红线垂直方向划线接种细菌,37 培养 24h 若待测菌在涂有氨苄青霉素的部位生长, 说明该菌具有抗氨苄青霉素作用, 表示含有 R 因子, 仍能生长 否则表示待测菌不含 R 因子或 R 因子丢失 抗四环素 PAQ1 质粒鉴定含 PAQ1 质粒的试验菌株对四环素有抗性 因为 PAQ1 质粒不太稳定, 容易丢失, 故用四环素确定该质粒存在与否 在营养牛肉汤琼脂平皿背面中线, 用红笔划一直线, 再用微量注射器在培养基上沿红线涂 10μl 四环素, 待其干后与红线垂直方向划线接种细菌,37 培养 59

61 24h 若待测菌在涂有四环素的部位生长, 说明该菌具有抗四环素作用, 表示含有 PAQ1 质粒, 仍能生长 否则表示待测菌不含 PAQ1 质粒或 PAQ1 质粒丢失 自发回变每一种试验菌株都以一定的频率自发地产生回变, 称为自发回变 将待测菌株增菌液 0.1ml 加到 2ml 含组氨酸 - 生物素的顶层琼脂培养基的试管内, 混匀后铺到底层琼脂平板上, 待琼脂固化后, 置 37 培养箱中孵育 48h 后记数每皿回变菌落数 每种标准测试菌株的自发回变菌落数应符合表 2 要求 经体外代谢活化后的自发回变菌落数, 要比直接作用下的略高 表 2 测试菌株的回变性 诱变剂 剂量 (μg/ 皿 ) S9 TA97 TA98 TA100 TA102 柔毛霉素 叠氮化钠 ICR 链霉黑素 inh inh inh 2230 丝裂霉素 C inh inh inh ,4,7- 三硝基 -9- 芴酮 硝基 -O- 次苯二胺 硝基喹啉 -N- 氧化物 甲基磺酸甲酯 氨基芴 苯并 (a) 芘 注 :inh 表示抑菌. 表中数值均已扣除溶剂对照的回变菌落数 ; 其他菌株对阳性物 的反应参照有关文献 6.5 试验方法 平板掺入法 倒平板 : 先将底层培养基在 45 时倒平板, 冷却凝固后放入 37 培养箱 内 24h 无菌落生长方可使用 接种 : 将含 0.5mmol/L 组氨酸 -0.5mmol/L 生物素溶液的顶层琼脂培养基 2.0ml 分装于试管中,45 水浴中保温, 然后每管依次加入试验菌株增菌液 0.1ml, 受试样品溶液 0.1ml 和 S 9 混合液 0.5ml( 需代谢活化时 ), 充分混匀, 迅速倾入底层 琼脂平板上, 转动平板, 使之分布均匀 水平放置待冷凝固化后, 倒置于 37 培 养箱里孵育 48h 每受试样品检测皿加或不加 S 9 混合液均作三个平行皿 对照 : 每一受试样品检测时必须设定阳性物对照, 操作过程将加入受试 样品溶液改换为阳性物, 其它操作完全相同 ; 同时, 每批受试样品检测必须设定 阴性对照, 观察自发回变菌落数 操作过程中不加入受试样品, 其余操作同 60