期王桂芹等 : 饲料蛋白对翘嘴鲌生长和内分泌激素的影响 长 代谢和内分泌参数的影响还缺乏较为系统的研究 同时激素作为营养分配的调控角色还不十分清 楚, 而在翘嘴鲌的研究中也没有该方面的报道 为 此, 本试验研究饲料蛋白水平和豆粕替代鱼粉对翘 嘴鲌生长和血清 和 - 的影响, 为探讨蛋白代谢的调控机制

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1 第 卷第 期水生生物学报.,. 年 月., 号 :. /.... 王桂芹 饲料蛋白对翘嘴鲌生长和内分泌激素的影响 周洪琪 陈建明 潘茜 叶金云 王友慧 赵朝阳 周辉 (. 吉林农业大学动物科技学院, 长春 ;. 上海水产大学生命学院, 上海 ;. 浙江省淡水水产研究所, 湖州 ) 闫大伟 摘要 : 选择健康的翘嘴鲌 ( ) 为试验鱼, 以红鱼粉为蛋白源, 配制 个蛋白水平的等能 等必需氨基酸 () 平衡关联度的半精制饲料, 又以豆粕替代鱼粉, 大豆蛋白分别替代不同水平的鱼粉蛋白, 配制 个 关联度的等蛋白 等能的半精制饲料, 探讨饲料蛋白对鱼类生长和内分泌激素等的影响 结果表明 : 饲料蛋白水平对翘嘴鲌的特定增重率 () 具有显著影响 (<. ),. % 饲料蛋白组的 显著高于. %. % 饲料蛋白组 (<. ), 但与. % 和. % 饲料蛋白组没有显著性差异 (>. ) 血清 水平与饲料蛋白水平正相关 (<. ) 血清 水平与饲料蛋白水平和生长负相关 (<. ), 血清 - 水平与饲料蛋白水平和生长正相关 (<. ) 适宜蛋白水平通过提高翘嘴鲌血清 和 - 的水平来调控生长 当大豆蛋白分别替代. % 的鱼粉蛋白时, 翘嘴鲌的 与对照组差异显著 (<. ) 翘嘴鲌血清 与饲料大豆蛋白对鱼粉蛋白的替代量负相关 (<. ). % 和. % 替代组的血清 显著高于对照组 (<. ), 且与饲料中豆粕对鱼粉替代水平正相关 (<. ), 与生长负相关 (<. ) 血清 - 与饲料中大豆蛋白对鱼粉蛋白替代量负相关 (<. ), 与生长正相关 (<. ) 大豆蛋白的替代亦通过对内分泌激素的影响来调控生长 关键词 : 翘嘴鲌 ; 饲料蛋白水平 ; 大豆蛋白 ; 甲状腺激素 ; 生长激素 ; 类胰岛素生长因子 - 中图分类号 :. 文献标识码 : 文章编号 : - ( ) - - 激素是内分泌腺所分泌的一类具有生物活性的物质, 虽然含量极低, 却对鱼类的生长 发育等生命 活动起着重要作用 调节生长发育的内分泌激素主 要有生长激素 甲状腺激素 类固醇 胰岛素 糖皮质激素等 鱼类内分泌系统对营养摄入的变化非常敏 感, 激素在调控鱼类生长的营养利用中亦发挥重要作用 其中, 在动物神经内分泌生长轴中, 甲状腺 轴 -- 轴是调节机体生长的中心环节, 如 -- 在鱼类生长调控和营养分配中扮演重要 角色, 它对饲料摄食率 饲料蛋能比 蛋白水 [ ] 平 环境条件的变化反应非常灵敏 许多研究表明, 饲料蛋白的数量和质量通过影响鱼类激素的 分泌而调控生长 有关饲料蛋白摄入数量对其影响的研究主要集中在饥饿 摄食率 饲料蛋白水平 [ ] 等 随饲料蛋白水平的提高, 金头鲷 ( ) 血浆 - 升高, 但 却下降 黄鲟 ( ) [ ] 血浆 下降 也有饲料蛋 白水平对北极红点鲑 ( ) 的甲状腺激素 鲤 ( ) 血清 肝胰脏 - 没有显著影响的报道 有关饲料蛋白质量对鱼类激素影响的研究主要 [ ] 集中在饲料蛋白替代上 虹鳟 ( ) 饲料中菜籽饼替代鱼粉通过降低 的活性 而影响生长 金头鲷饲料中植物蛋白 ( 玉米面筋 粉 小麦粉和豌豆粉 ) 替代鱼粉蛋白, 随着替代量的增加, 生长下降, 血浆生长激素上调, 但血浆 - [ ] 和肝 - 和 受体数量下降 可见, 饲料氨基酸组成对内分泌调控生长功能的发挥有着 重要的影响 有关植物蛋白替代鱼粉的研究, 因植物蛋白含有抗营养因子 缺乏必需氨基酸等而影响 鱼体健康 干扰中间代谢, 所以研究多集中在氨基酸 [ ] 的补饲对生产性能的影响上, 有关对调节鱼类生 收稿日期 : - - ; 修订日期 : - - 基金项目 : 浙江省重大科技攻关项目 ( ); 浙江省湖州市科技重点项目 ( ) 资助作者简介 : 王桂芹 ( ), 女, 吉林辽源人 ; 博士, 副教授 ; 主要从事鱼类营养和饲料学的研究 - 通讯作者 : 周洪琪 ( ), 女, 上海市人 ; 博导 ;- :@..

2 期王桂芹等 : 饲料蛋白对翘嘴鲌生长和内分泌激素的影响 长 代谢和内分泌参数的影响还缺乏较为系统的研究 同时激素作为营养分配的调控角色还不十分清 楚, 而在翘嘴鲌的研究中也没有该方面的报道 为 此, 本试验研究饲料蛋白水平和豆粕替代鱼粉对翘 嘴鲌生长和血清 和 - 的影响, 为探讨蛋白代谢的调控机制奠定基础 材料与方法. 材料试验材料及试验鱼与饲养管理参照文 献 [ ]. 方法.. 取样试验鱼饲养 周后, 分别在早上 : 投喂后, 每组取 尾鱼, 用一次性注射器从尾静脉 取血, 放置, / 离心, 取血 清 - 保存 待测.. 血清 和 的测定采用 放射免疫 分析 () 法测定翘嘴鲌血清 含量, 检测试剂 盒购自上海放射免疫分析技术有限公司 ( 中国, 上 海 ) 分别配制 标准液 ( 和. /) 和 标准液 (.... 和 /), 建立 和 标准曲线.. 血清 的测定 - 的标记由上海同济大学医院放射免疫 研究室标记, 采用氯胺 - 法标记 μ 生长激素 中加入 μ. /. 的 后, 再加入 的 ( 英国 产品, /); 摇 匀后加入 μ 新配制的氯胺 -( μ/μ), 在室温下 震荡反应, 加入 μ 含偏焦亚硫酸钠 μ 的 终止反应, 即为标记反应液 将上述标记反应液过葡聚糖凝胶柱 (-, ), 然后用./. 洗脱, 流速 μ/, 每管收 集 进行 γ 计数, 收集放射峰, 每管取 μ 适量 稀释加抗体和抗原测试, 其中 - 比放射性为 μ/μ, 的利用率为 % 样品的放免测定用人血清稀释标准品, 兔抗 血清用. /. 的 缓冲液稀释成 工作浓度, 用 将 - 稀释成 / μ 的标记液, 分别取 μ 的标准 品, 加入抗体 μ, 水浴, 再加 μ 的 - 标记液, 室温孵育, 加入分离剂 ( 羊抗兔 血清 ) μ, 室温静置, / 离心, 测沉淀的放射性 配制不同浓度的 标准液 ( 和. μ/), 建立 标准曲线 的抗体和标准品由黄海水产研究所陈 松林赠送.. 血清 - 的测定翘嘴鲌血清用酸醇处 理, 去除结合蛋白 取 μ 血清, 加入 μ 酸醇 液, 混匀, 放置, / 离心, 取上清., 加入. 混匀 离心, 取上清液待测 翘嘴鲌血清 - 含量采用 - 平衡饱和竞争放射免疫分析 () 法进行测定, 试 剂盒购自中国九鼎医学生物工程有限公司 ( 中国天津 ) 用 - 型智能放免 γ 测量仪进行 γ 计数, 检测范围为. /. 统计分析采用 (. ) 软件进行单因素方差分析, 用 氏多重比较分析组间差异显 著性程度, 采用双变量相关分析 结果. 饲料蛋白水平对翘嘴鲌生长和血清 和 - 水平的影响 如表 所示, 饲料蛋白水平对翘嘴鲌的 具 有极显著影响 (<. ), 随着饲料蛋白水平的升高呈先升高后稳定的趋势, 当饲料蛋白水平从. % 升到. % 时, 随之升高 ; 然而饲料 蛋白水平在. %. % 饲料蛋白组之间差 异不显著 (>. ) 表 饲料蛋白水平对翘嘴鲌生长和血清激素水平的影响. 饲料蛋白水平 (%) 初始体重 () 末体重 () ±.. ±.. ±.. ±.. ±.. ±.. ±.. ±.. ±.. ±.

3 水生生物学报 卷 续表 饲料蛋白水平 (%) 特定生长率 (% /) ±.. ±.. ±.. ±.. ±. (/). ±.. ±.. ±.. ±.. ±. (/). ±.. ±.. ±.. ±.. ±. (/). ±.. ±.. ±.. ±.. ±. -(/). ±.. ±.. ±.. ±.. ±. 注 : 表中同行不同小写字母表示差异显著 (<. ) 下表同 : <.. 饲料蛋白水平对翘嘴鲌血清 水平具有显著 的影响 (<. ) 血清 水平随着饲料蛋白水平 的升高而升高, 当饲料蛋白水平从. % 升到. % 时, 血清 水平没有显著差异 (>. ),. % 与. % 饲料蛋白组的血清 水平分别 为. /. /, 二组之间没有显著差异 (>. ), 但显著高于其余三个组 (<. ) 血清 水平与饲料蛋白水平正相关 (<. ), 相关 系数. 翘嘴鲌血清 水平较 水平高, 血清 水平虽 然随着饲料蛋白水平的提高而升高, 但组间没有显著差异 (>. ) 饲料蛋白水平与翘嘴鲌血清 水平显著正相关 (<. ), 相关系数为. 饲料蛋白水平对翘嘴鲌血清 含量具有显著影响 (<., 表 ) 血清 水平随着饲料蛋白 水平的升高而降低 ( <. ), 然而. %. %. % 饲料蛋白组的生长激素水平差异 不显著 ( >. ) 翘嘴鲌血清 含量与饲料蛋 白水平和生长负相关 (<. ), 相关系数分别为 -. 和 -. 饲料蛋白水平对翘嘴鲌血清 - 水平具有显 著的影响 (<. ). %. % 饲料蛋白 组的血清 - 显著高于. % 饲料蛋白组 血清 - 水平与饲料蛋白水平和生长呈正相关 (<. ), 相关系数分别为. 和.. 饲料中豆粕替代鱼粉对翘嘴鲌生长和血清 和 - 水平的影响如表 所示, 当饲料中大豆蛋白分别替代. %. %. % 的鱼粉蛋白时, 翘嘴鲌 与对照组差异不显著 (>. ) 然而饲料大豆蛋白对鱼粉蛋白替代量为. % 时, 翘嘴鲌的 显 著低于对照组 (<. ) 表 饲料豆粕替代鱼粉对翘嘴鲌生长和血清激素水平的影响. 大豆蛋白对鱼粉蛋白的替代量..... (% ) 初始体重 (). ±.. ±.. ±.. ±.. ±. 末体重 (). ±.. ±.. ±.. ±.. ±. 特定生长率 (% /). ±.. ±.. ±.. ±.. ±. (/). ±.. ±.. ±.. ±.. ±. (/). ±.. ±.. ±.. ±.. ±. (/). ±.. ±.. ±.. ±.. ±. -(/). ±.. ±.. ±.. ±.. ±. 翘嘴鲌血清 水平较 水平高, 但饲料中豆粕 替代鱼粉对血清 水平没有显著影响 ( >., 表 ) 血清 水平受到饲料豆粕替代鱼粉的显著影 响 (<. ) 血清 随着饲料大豆蛋白对鱼粉蛋 白替代量的增加而降低, 当饲料中大豆蛋白对鱼粉蛋白替代量达到. % 和. % 时, 血清 水平显

4 期王桂芹等 : 饲料蛋白对翘嘴鲌生长和内分泌激素的影响 著低于对照组 (<. ), 翘嘴鲌血清 水平与饲料大豆蛋白对鱼粉的替代量负相关 (<. ), 相 关系数为 -. 饲料大豆蛋白替代鱼粉蛋白对翘嘴鲌血清 水平具有显著影响 (<. ) 血清 水平随着 饲料中大豆蛋白对鱼粉蛋白替代量的增加而升高, 当饲料中大豆蛋白对鱼粉蛋白替代量达到. % 和 % 时, 血清 显著高于对照组 (<. ) 翘嘴鲌血清 水平与饲料中豆粕对鱼粉替代量正 相关, 但与生长负相关 (<. ), 相关系数分别为. 和 -. 饲料豆粕替代鱼粉对翘嘴鲌血清 - 水平具 有显著影响 (<. ) 血清 - 水平与饲料中大豆蛋白对鱼粉蛋白替代量负相关, 与生长正相关 (<. ), 相关系数分别为 -. 和. 当 饲料中大豆蛋白对鱼粉替代量达到. % 和. % 时, 血清 - 显著低于对照组 (<. ), 也显著低于. %. % 的替代组 (<. ) 讨论. 饲料蛋白与翘嘴鲌血清甲状腺激素水平甲状腺激素是生长 发育和繁殖的重要调控因 素, 甲状腺激素的分泌受到内分泌和营养 环境等因 素的影响和调控 甲状腺激素是以 两种形式释放入血 有报道表明, 甲状腺主要分泌, 进入 血液到肝脏, 通过肝脏 单脱碘酶脱碘转化为 甲状腺激素中 较容易进入细胞, 并与核受体结合, 且在体内的更新较 快 故 更能代表甲状 [ ] 腺的功能, 是体内发挥效能的主要甲状腺激素 饲料蛋白摄入的数量影响鱼类甲状腺激素的分 [ ] [ ] 泌 蛋白营养不足, 降低虹鳟 黑鲷 ( ) [ ] 血浆中的 和, 肝核受体数量 [ ] 减少, 但随蛋白摄食量的增加而增加 鲑鱼血浆 水平主要受饲料蛋白质的影响和调控 拟石首鱼 ( ) [ ] 的 对蛋白质的摄入反应要比 敏感 饲料蛋白的摄入能提高溪红点鲑 ( ) [ ] 脱碘酶活性, 促进 转化为 [ ] 而发挥作用 虹鳟 黄鲟 ( ) [ ] 循环 随饲料蛋白水平的提高而提高, 对 无影响 本试验饲料蛋白水平对翘嘴鲌血浆 含量有 显著影响, 但对 含量无显著影响, 这也同样表明饲料蛋白水平对甲状腺激素的影响是血清 要通 过转化 来发挥其生理效能的 饲料蛋白质量 ( 氨基酸组成 ) 对鱼类甲状腺功 能亦有影响 本试验随着大豆蛋白对鱼粉蛋白替代 量的增加, 对血清 影响显著, 对 亦没有影响 这表明翘嘴鲌血清 对饲料大豆蛋白的变化反应 [ ] 较 敏感 对虹鳟 拟石首鱼 大菱鲆 ( ) [ ] 的研究也有类似的报道 如饲料氨基 [ ] 酸组成对虹鳟 () 甲状腺激素 的分泌表明, 等氮 等能 氨基酸组成不同的饲料, 饲 养 时, 氨基酸不平衡组肝脏 脱碘酶的活性降 低, 但血浆 没有降低, 表明肝中线粒体转化 的 能力降低 但到 时 和脱碘酶活性都没有变 化, 说明饲料蛋白质量对甲状腺的影响是短期抑制, 长期却能够适应 甲状腺激素能通过促进蛋白代谢而影响生长 [ ] 外源甲状腺激素的引入可促进动物生长, 其中 [ ] 的促长作用要明显大于, 如对虹鳟 大西洋鲑 ( ) [ ] 的研究表明, 生长率和循环 水平 正相关,. [ ] 表明随着饲料蛋白水平的 提高, 通过增加血浆 含量间接提高 的含量, 提高蛋白质的合成和降解, 促进肌肉生长,. [ ] 认为 水平的适度提高, 可增加细胞内 和 聚合酶含量, 促进氨基酸的吸收, 从 而促进鱼体蛋白质的合成 虹鳟饲料中用菜籽 饼替代鱼粉, 因菜籽饼中有较高的葡萄糖碱, 通过血 清 的降低, 影响饲料蛋白利用 降低生长, 可能是 由于饲料较低的营养价值, 较高的抗营养因子等影 响甲状腺分泌甲状腺激素的结果 对虹鳟 拟石 [ ] 首鱼 大菱鲆 ( ) [ ] 的研究也有类 似的报道 也有报道, 甲状腺激素在体内和体外都 能提高罗非鱼 ( ) 肝脏 - [ ] 的表达而促进生长 但也有循环 与生 [ ] 长没有关系的报道, 本研究也没有发现二者显著 相关, 但和生长的趋势是一致的 可见, 甲状腺激素 的分泌和调控对生长的影响非常复杂, 可能还有其 他因素的参与. 饲料蛋白与翘嘴鲌血清生长激素水平本试验随饲料蛋白水平的增加, 翘嘴鲌血清 显著降低, 与饲料蛋白水平负相关 这表明循 环生长激素的分泌也与饲料蛋白水平密切相关 虹 鳟 鲤鱼研究表明, 随着饲料蛋白水平的升高, 循环的生长激素水平降低, 有较低肝生长激素结合 点和较低 - 水平 饲料中大豆蛋白对鱼粉蛋白 替代量的增加对翘嘴鲌生长激素也遵循同样的规律 金头鲷饲料中植物蛋白 ( 玉米面筋粉 小麦粉

5 水生生物学报 卷 和豌豆粉 ) [ ] 植物蛋白 ( 大豆粉和麦粉 ) [ ] 替代鱼粉蛋白的研究结果都表明, 随着植物蛋白的替代, 生 长激素的升高, 是由肝中生长激素受体和血浆中 [ ] - 和 - 表达降低的结果 在 - - 内分泌轴中, - 的水平可负反馈调控 的分泌, 因肝组织 受体数量的下降, - 的负 反馈效应减弱是鱼类血清 水平升高的重要因 [ ] 素 对北极红点鲑 ( ) 的研究也支持这一结论 有关循环生长激素与生长的关系报道不一, 外 [ ] 源生长激素的引入, 促进动物生长, 内源生长激 [ ] 素与生长的关系不完全吻合 邓利等报道, 血液中生长激素含量和鱼体生长的季节性变化有相关关 系, 但不完全吻合 一般而言, 营养限制引起生长下 降不能用循环 水平升高来解释, 因为营养缺乏时, 尽管血浆生长激素水平很高, 但动物生长仍然受 到了抑制 本试验翘嘴鲌血清 均与生长负相 关 饲料蛋白水平对虹鳟 鲤 北极红点鲑 ( ) 的研究和金头鲷饲料中植物蛋白 ( 玉米面筋粉 小麦粉和豌豆粉 ) [ ] 植物蛋白 ( 大豆粉和麦粉 ) [ ] 替代鱼粉蛋白的研究都得出相 同的结论 可见, 的促长作用并非完全依赖于血清 水平, 还取决于循环 的清除率 靶 组织上 受体数量和亲和力的变化以及与其他激 [ ] 素和生长因子如 - 的相互作用 加之 的 脉冲式分泌, 很难建立生长激素水平与生长特性之间的关系. 饲料蛋白与翘嘴鲌血清类胰岛素生长因子 - 水平 鲤鱼等鱼类 - 的氨基酸序列与人的 - 有 [, ] % 左右的同源性 所以本实验使用测定人的 - 的试剂盒测定鱼血清的 - 具有可行性 生长激素的促生长效应主要是由 - 介导 的, 生长激素与肝细胞表面或其他局部组织生长激素受体结合, 使细胞分泌 -, - 通过内分泌 ( 由肝脏产生 ) 自分泌或旁分泌途径作用于靶器官 而起作用 - 及其受体蛋白的分泌与表达主要 受营养 生长激素 局部细胞因子和发育阶段的调 [ ] 控, 其中主要是营养水平和 [ ] 对 - 分泌 的影响 在众多的营养物质中, 蛋白质是动物 - 合成的一个重要调节因子, 循环 - 的分泌也与 [ ] 蛋白水平密切相关 大西洋鲑和尖吻鲈 金头 [ ] 鲷血浆 - 浓度变化与饲料蛋白质水平正相 关, 本研究也得到同样的结果 但华益民等研究 不同饲料蛋白水平对鲤鱼内分泌的影响时发现, 不 同蛋白水平对 - 无显著影响, 可能是因为 - 表达的调节是一个相对缓慢的过程, 实验时间 只有 太短的缘故 关于饲料蛋白质质量对鱼类 - 分泌的影响报道不多 金头鲷饲料中植物蛋 白 ( 玉米面筋粉 小麦粉和豌豆粉 ) [ ] 植物蛋白 ( 大豆粉和麦粉 ) [ ] 替代鱼粉蛋白都表现出一致的 结果, 即随着植物蛋白的替代, 血浆 - 和肝 - 下降 本试验也得到同样的结果 - 能通过促进蛋白代谢而影响生长 对大 西洋鲑和尖吻鲈 ( ) [ ] 银大马哈鱼 ( ) [ ] 金头鲷的研究都表明, 循环 - 水平相对稳定, 与其生长率正相关, 可反映动物生长发育状况 本研究中饲料蛋白水平和豆 粕替代鱼粉对翘嘴鲌血清 - 的影响都得出同样 的结果, 即血清 - 的水平与其生长正相关 - 是一种广谱性促细胞分裂素, 能促进鸟氨酸脱 氢酶的活性及细胞内 和蛋白质的生物合 成, 最终引起细胞的增殖与分化, 促进蛋白质的合成 [ ] 和结缔组织及骨髓的产生 这表明血清 - 是表示生长的稳定指标, 可作为反映鱼类生长速度 的重要参数之一 参考文献 : , [ ].,, : -, -,,. :, ( ) [ ].,, : -, -,. (), - -,, [ ]. -,, :,. -, [ ].,, :. : - [].,, :,., -.,,,, [ ].,, :,. :

6 期王桂芹等 : 饲料蛋白对翘嘴鲌生长和内分泌激素的影响, ( )[ ].,, ( ):,. - - [ ].-,, ( ): [ 华益民, 林浩然. 营养状况对幼年鲤鱼肝脏 - 表达的影响. 动物学报,, ( ): ],,,. [].,, ( ): [ ] -,, -,., ()[ ].,, : [ ] -,.,. -, - ( )[ ].,, : [ ],. ( ) [ ].,, : [ ],,,. [ ].,, ( ): [ 王桂芹, 周洪琪, 陈建明, 等. 翘嘴红鲌对饲料蛋白质的营养需求及豆粕对鱼粉的适宜替代量. 中国水产科学,, ( ): ] [ ]. [ ].- :., [ 王渊源. 鱼虾营养概论. 北京 : 科学出版社., ] [ ],,. - -, [].,, : [ ],. -, - - -, [].-,, ( ): [ ],., - [ ]. -,, ( ): [ 邓利, 张为民. 饥饿对黑鲷血清生长激素 甲状腺激素以及白肌和肝脏脂肪 蛋白质含量的影响. 动物学研究,, ( ): ] [ ],,. -, - [ ].,, : [ ],,,. [ ].,, : [ ],. - [ ].,, : [ ],,,. - ( ):, [ ].,, : [ ],,,., [].,, : [ ],.,. ( - ), [ ].,, : [ ],. [ ].,, : [ ],,. - - [ ].,, : [ ],,,. : [ ].,, : [ ],,,. - -,, [ ].,, : [ ],,. ( )[ ].,, ( ): [ ],,. [ ].-,, ( ): [ ],,,. [].,, ( ): [ 邓利, 张伟民, 林浩然, 等. 黑鲷生长激素及其受体的季节变化. 水产学报,, ( ): ] [ ],, [ ].,, ( ): [ ]. [ ].,, : [ ]. - -(- ) -, [].,, : [ ],,,.

7 水生生物学报 卷 - - : [ ].,, : [ ],,,. - [].-,, ( ): [ ],,,. : - [ ].,, : -, -, -, -, -,, -, - (.,, ;. -,, ;., ) : -. ((. ±. )) ( /), -, (. %,. %,. %,. %. % ) %, ( % ) ( /) -. %,. %,. %,. %. %,.- -, ( ), ( ), () --(-). (<. ).. %. %. % (<. ),. %. %( >. ). (<. ),.-,. - (<. ). -.. %, %. %,, ( >. ), % (<. ). -.. %,.- (<. )... %. %,. (<. ) -(<. ).-. %. % -. %. %. -. :; ;; ( );( );- ();- -(-)

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