浙江大学学报医学版７第卷ＫｙｗｄＰＤｕｇｄｕＤｙｐｄｕＣｈｍｇｐｈｙｈｇｈｐｕｑｕｄＬＣＭＳＭＳＭｋＰＪＺｈｊｇｕｖＭｄＳ７７青霉素Ｐ属 β 内酰胺类药物是敏度较仪器分析方法差已很少采用其中液常用的一

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三煤苗
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1 第 41 卷第 2 期 2012 年浙江大学学报 ( 医学版 ) JOURNALOFZHEJIANGUNIVERSITY(MEDICALSCIENCES) Vol41 No htp: DOI: /j.isn 高效液相色谱串联质谱法测定牛奶中 9 种青霉素类药物的残留量赵维 1, 杜钢 2 1, 李向荣 (1. 浙江大学城市学院医学与生命科学学院, 浙江杭州 ; 2. 四川省食品药品检验所, 四川成都 ) [ 摘要 ] 目的 : 建立一种 HPLC MS/MS 方法快速测定牛奶中 9 种青霉素类药物的残留量方法 : 前处理方法采用乙腈沉淀蛋白, 正己烷液液萃取除脂 ; 经高效液相色谱 C 18 柱分离, 选用 ph3 1 甲酸水溶液和乙睛 ph3.1 甲酸水溶液为流动相,11min 内在线梯度洗脱 ; 在优化的质谱条件下, 采用多反应监测 (MRM), 外标法定量结果 : 方法的线性范围为 0.4~400μg/L,9 种青霉素类药物在牛奶基质中均有良好的线性关系 (r>0.990); 方法最低检测限为 0.1~0.8μg/L, 定量限为 0 3 ~2.6μg/L; 方法回收率均在 80% 以上, 重复性良好, 日内精密度 <8.5% 结论: 该方法测定 9 种青霉素药物的残留量简便快速准确, 可以满足对青霉素残留的监测要求 [ 关键词 ] 药物残留物 / 分析 ; 乳制品 ; 色谱法, 高压液相 ; 液相色谱串联质谱 ; 牛奶 ; 青霉素 [ 中图分类号 ] R978.1;TS252.7 [ 文献标志码 ]A [ 文章编号 ] (2012) Determinationofninepenicilinresiduesinmilkbyhigh performance liquidchromatography masspectrometry ZHAOWei,DUGang,LIXiang rong(1.schoolofmedicineandlifesciences,zhejianguniversitycity Colege,Hangzhou310015,China;2.SichuanProvincialInstituteforDrugandFoodControl,Chengdu ,China) [Abstract] Objective:Toestablishahigh performanceliquidchromatography masspectrometry (HPLC MS/MS)methodfordetectionofninepenicilinresiduesinmilk.Methods:Thesampleswere precipitatedwithacetonitrileanddegreasedwithn hexaneforpre procesing.thechromatographywas performedbyreversed phasehplcinac 18 columnandelutedgradientlyonlinefor11min.themobile phaseswerewaterwithformicacid(ph3.1)andacetonitrile waterwithformicacid(ph 3.1).By optimizingthemascondition,themethodwasoperatedbymultiple reactionmonitoring(mrm)and quantitatedbyexternalstandardcalibration.results:thestandardcurveswerelinearinconcentration rangeof0.4~400μg/landalninepenicilinsshowedagoodlinearrelationshipinthemilkmatrix(r >0.990).Thedetectionlimitofthemethodwasfrom0.1to0.8μg/Lwhilethelimitofquantification wasfrom0.3to2.6μg/l.theaveragerecoverieswerehigherthan80%.thewithin dayprecisionswere lesthan8.5%.conclusion:theestablishedmethodisconvenient,rapidandaccurateandmeetsthe requirementofmonitoringpenicilinresiduesinmilk. 收稿日期 : 修回日期 : 基金项目 : 浙江大学城市学院 2012 年教师基金项目作者简介 : 赵维 (1983-), 女, 硕士, 从事体内药物分析及药品质量控制研究. 通讯作者 : 李向荣 (1957-), 男, 硕士, 教授, 研究生导师 ; lixr@zucc.edu.cn

2 浙江大学学报医学版７第卷ＫｙｗｄＰＤｕｇｄｕＤｙｐｄｕＣｈｍｇｐｈｙｈｇｈｐｕｑｕｄＬＣＭＳＭＳＭｋＰＪＺｈｊｇｕｖＭｄＳ７７青霉素Ｐ属 β 内酰胺类药物是敏度较仪器分析方法差已很少采用其中液常用的一类广谱抗生素兽医临床上常把它作相色谱质谱联用法ＬＣＭＳ已成为当今重要为消炎抗感染的首选药物据调查目前我国的分离与鉴定的方法之一它为解决兽药奶牛患乳腺炎的治疗方法就是注射青霉素或残留的痕量检测这一难题提供了较佳的解决方者对乳房局部用药用药天内采集的牛奶中案随着我国经济的发展和对食品安全的重会残留青霉素也有报道称不法商家为了防视以及液质联用技术的完善ＬＣＭＳ将在兽药止牛奶在夏天变坏直接在鲜奶中添加青霉素残留检测领域得到更加广泛的应用类药物长期饮用有抗奶会使正常人被动ＬＣＭＳ对青霉素类残留的分析最早见于接受积累青霉素造成人体生理紊乱产生耐世纪年代末目前此方法检测牛奶中多药性因此需要一个准确简便的方法来对其进种青霉素药物液相分离时间较长前处理方法行监测繁琐检测结果不理想本研究在国内外研究目前食品中青霉素类残留的分析方法有传统的微生物法高效液相色谱紫外检测法素Ｖ萘夫西林苯唑西林氯唑西林双氯西高效液相色谱荧光检测法林哌拉西林阿莫西林氨苄西林为研究对象结构见图通过选择合适的质谱色谱条ＵＶＨＰＬＣＨＰＬＣＦＬＤ及液相色谱串联质谱法ＬＣ７ＭＳＭＳ基础上以种青霉素类药物青霉素Ｇ青霉等由于青霉素类药物结构相近且在食品中痕量存在微生物法的专属性及灵图青霉素类种药物的结构ＦｇＮｈｍｕｕｆｐ件优化牛奶样品前处理方法并对方法进行验证建立在痕量级水平上分析测定牛奶中残留

3 第 2 期赵维, 等. 高效液相色谱串联质谱法测定牛奶中 9 种青霉素类药物的残留量 173 的 9 种青霉素类药物的液相色谱串联质谱法该方法更简便快速准确, 为市场监管提供有力的技术支撑, 对保障人民身体健康和促进我国动物性食品的出口都具有重要意义 1 仪器与试剂 1.1 仪器色谱系统 : 岛津 SHIMADZUPromi nence 系列高效液相色谱仪, 包括系统控制器 GBM 20A, 在线脱气机 DGU 20A3, 二元泵 LC 20AD, 自动进样器 SIL 20AHT, 柱温箱 CTO 20A 质谱系统: 美国 AppliedBiosystems 公司 API3200LC/MS/MSSystems 串联四极杆质谱仪, 电喷雾电离离子源 (ESI),Analyst1.4.2 数据处理软件十万分之一电子分析天平,BP 211DSTARTORIUS; 冷冻高速离心机,3K30, SIGMA; 氮气浓缩仪,OA SYS HEATING SYSTEM/N EVAP111NITROGENEVAPORATOR; 离心机,BAIYANG; 涡旋混匀仪,MS3digital, IKA; 超纯水仪,MILLI Q 1.2 试剂牛奶样品, 全国各超市购买青霉素类 9 种药物对照品见表 1 其他试剂:( 均为色谱纯 ) 甲酸, 乙酸, 氨水,DikmaPure; 甲醇, 乙腈,Burdick&Jackson; 正己烷,FisherScientific; 研究用水均为超纯水表 1 青霉素类对照品 Table1 Referencesubstancesofpenicilins 药物名称对照品厂家批号纯度 /% 青霉素 G VETRANAL 3027X 96.9 青霉素 V VETRANAL 5213X 98.3 氨苄西林 VETRANAL 6129X 99.8 苯唑西林中检所氯唑西林中检所哌拉西林中检所阿莫西林中检所萘夫西林 Dr.EhrenstorferGmbH 双氯西林 Dr.EhrenstorferGmbH 标准溶液配制标准储备溶液分别精密称取 9 种青霉素对照品约 10mg 用水稀释, 制得浓度约为 100μg/ml 的标准储备溶液, 于 4 冰箱中贮存备用混合标准工作溶液将标准储备溶液用水逐级稀释为混合标准工作溶液, 临用时制备 2 方法 2.1 牛奶前处理方法精密量取牛奶样品 2 ml 于 10ml 玻璃离心管中, 精密加入 4ml 乙腈,1000r/min 涡旋 2min,2800r/min 离心 4 min, 精密移取 5ml 上清液至另一 10ml 玻璃离心管, 加入 2.5ml 正己烷,2000r/min 涡旋 1 min, 静置, 待分层后弃去上层溶液, 下层溶液于 45 水浴中氮吹至尽干, 用 1ml 水乙腈 (90 10) 溶解残渣,0.45μm 微孔滤膜滤过, 滤液再用 0.2μm 微孔滤膜滤过, 作为供试液, 供 LC MS/MS 检测 2.2 色谱条件色谱柱 AgilentEclipseXDB C 18 (5 μm,4.6 mm 150 mm); 保护柱 PhenomenexSecurityGuardCartridgeC 8 (4mmL 3.0mmI.D); 柱温 35 ; 进样量 10μl; 洗脱梯度见表 2 表 2 9 种青霉素液相分离的洗脱梯度 Table2 Elutiongradientofninepenicilins A 相 /% B 相 /% 时间流速水 ( 甲酸 ) 乙腈 ph3.1 水 /min /ml min -1 (ph3.1) (90 10) 质谱条件离子源参数为气帘气 (CUR) 30psi, 碰撞气 (CAD)10 psi, 离子源温度 (TEM)400, 雾化气 (GAS1)60psi, 辅助加热气 (GAS2)60psi, 各离子在多反应监测 (MRM) 模式下测定将采集时间 11min 分成两段, 前段 0.0~4.2min,ESI 正模式采集, 离子源喷雾电压 (IS)5000V; 后段 4.2~11.0min,ESI 负模式采集,IS 4500V, 并将两个采集段合并在同一记录过程中 9 种青霉素的出峰时间质谱测定参数见表 3

4 浙江大学学报医学版７第卷表青霉素药物在ＥＳＩ条件下的保留时间与质谱参数ＴｂＲｍｄｍｐｍｆｐＥＳＩ药物名称保留时间阿莫西林母离子定量离子定性离子ｍｍｚｍｚｍｚ氨苄西林哌拉西林青霉素Ｇ图空白牛奶样品图ＦｇＴＩＣｆｍｋ青霉素Ｖ苯唑西林氯唑西林萘夫西林７７双氯西林７图种青霉素总离子流谱图ＦｇＴＩＣｆｐ结果表种青霉素检出限与定量限方法学验证干扰性试验ＴｂＬＯＤｄｌｏｑｆｐ取不含青霉素的空白牛奶按样品前处理方法进行处理进样经质谱药物名称ＬＯＤＬ μｇＬＯＱ国家药监局规定牛奶Ｌ中最高残留量Ｌ μｇ μｇ检测结果见图种青霉素的总离子流谱图青霉素Ｇ见图可见牛奶中不含有与各青霉素相对青霉素Ｖ应的干扰峰不影响青霉素的检测萘夫西林检测限和定量在ＥＳＩ正模式下对阿苯唑西林莫西林和氨苄西林进行检测其余７种青霉素哌拉西林在ＥＳＩ负模式下检测最低检测限ＬＯＤ以信氯唑西林噪比等于ＳＮ的目标化合物浓度表示双氯西林最低定量限ＬＯＱ以信噪比等于ＳＮ阿莫西林的浓度表示并计算方法检出限与定量限氨苄西林结果见表可见各组分在牛奶中的ＬＯＤ与ＬＯＱ均低于国家标准对最高残留量的要求线性和范围制备种青霉素混合标表明该方法灵敏度较高准对照溶液于按照前处理方法制备的牛奶基质

5 第 2 期赵维, 等. 高效液相色谱串联质谱法测定牛奶中 9 种青霉素类药物的残留量 175 中, 照样品检测方法测定, 并记录峰面积以对照品峰面积为纵坐标, 浓度为横坐标分别作校正曲线, 线性范围回归方程与相关系数, 见表 5 结果表明相关系数均 >0.990,9 种青霉素类药物在牛奶基质中均有良好的线性关系表 5 牛奶中 9 种青霉素标准曲线的线性范围回归方程与相关系数 Table5 Linearityrange,regresionequationand rofninepenicilinsinmilk 药物名称线性范围相关回归方程 /μg L -1 系数青霉素 G 1.026~51.31 y=171x 青霉素 V ~36.38 y=356x 萘夫西林 ~35.45 y=951x 苯唑西林 ~38.73 y=1120x 氯唑西林 1.451~48.36 y=414x 双氯西林 4.707~407.7 y=143x 哌拉西林 1.501~50.05 y=562x 阿莫西林 2.492~49.83 y=481x 氨苄西林 ~36.92 y=1700x 回收率研究对氯唑西林进行 μg/L, 其余 8 种青霉素进行 μg/l, 高中低三个浓度的回收研究 (n=3) 在不含待测青霉素的牛奶中加入不同浓度对照品后, 照前处理方法回收样品, 测定结果见表 6 结果表明, 方法回收率均在 80% 以上, 对动物源性食品来说回收较好表 6 牛奶中 9 种青霉素回收研究结果 (n=3) Table6 Recoveriesofninepenicilinsinmilk (n=3) 低浓度回中浓度回高浓度回相对标准偏药物名称收率 /% 收率 /% 收率 /% 差 RSD/% 青霉素 G 青霉素 V 萘夫西林苯唑西林哌拉西林氯唑西林阿莫西林氨苄西林双氯西林重复性研究取 9 种青霉素在标准曲线中间浓度的基质对照溶液, 一日内分别连续进样 6 次, 记录峰面积, 计算 RSD 均 <4.5%, 表明方法重复性良好日内精密度研究一日内在 h 分别用 9 种青霉素, 在标准曲线中间浓度的基质对照溶液进样, 记录峰面积, 计算 RSD 均 <8.5%, 表明方法日内精密度良好 3.2 样品测定对重庆广西青海贵州陕西云南西藏市场销售的各品牌各类型的牛奶 ( 共 420 份 ) 进行检测, 从测定结果发现某批牛奶可能含有青霉素 G 对阳性样品进行了初试和复试, 检测结果吻合, 含量为 4.0mg/L 4 讨论 4.1 前处理方法的优化牛奶中存在复杂的基质, 排除基质效应的干扰是本研究的一个重点和难点这些物质与分析物共同流出喷雾针可能影响待分析物的雾化挥发裂分化学反应及带电过程, 导致进入质谱的离子抑制或增加, 从而影响定量结果的准确性, 方法的线性及重现性加之牛奶中的蛋白质必须在进样前去除, 否则会影响色谱柱的使用寿命, 因此在进样前必需进行处理本研究在国家标准 GB/T ( 畜禽肉中 9 种青霉素类药物残留量的测定液相色谱串联质谱法 ) 前处理方法的基础上, 对牛奶中青霉素类药物残留前处理方法改进, 将沉淀蛋白液液萃取和固相萃取进行了对比, 并对除蛋白, 除脂肪, 样品浓缩各步骤进行优化研究中发现 WatersOasis Supclean 的 SEP 柱对 9 种青霉素药物的保留有一定的差异其中 HLB 单柱和双柱萃取对青霉素 G 青霉素 V 萘夫西林苯唑西林氯唑西林双氯西林哌拉西林净化后样品中杂质较少, 色谱图中没有明显的的干扰峰存在, 回收率可达 60% 以上固相萃取净化后样品中杂质虽少, 但是 HLB 双柱对极性较大的氨苄西林回收率仅 47%, 阿莫西林回收率仅 32%, 而单柱对氨苄西林阿莫西林的回收率为 15% 和 22%, 保留不佳况且固相萃取仪器和小柱成本较高, 操

6 176 浙江大学学报 ( 医学版 ) 第 41 卷作较烦琐, 不是回收牛奶中青霉素的较理想方法本研究参照国家标准对禽肉样品的处理方法, 改用沉淀蛋白液液萃取法研究中发现沉淀蛋白与提取次数对回收率结果影响不大, 氮吹后玻璃离心管底有蛋黄色油脂出现, 考虑到可能由于其存在使得青霉素药物被吸附与包裹, 参照兽药残留的常用除脂方法, 采用正己烷结果表明, 是否除脂对青霉素的回收有很大影响, 除脂后的回收率明显提高, 均有 80% 以上, 结果较好, 成本较低, 操作简便, 使用该方法处理样品, 更加快速, 且结果准确可靠 4.2 质谱条件的选择青霉素分子中有一个游离羧基和酰胺侧链, 极性较大, 应选择 ESI 离子源对青霉素进行分析本研究大多数青霉素的电离常数 pka 在 2.5~2.8 之间, 其分子中的游离羧基具有较强的酸性, 易带上负电荷, 因此对哌拉西林青霉素 G 青霉素 V 苯唑西林氯唑西林萘夫西林双氯西林采用负离子模式分析而对氨苄西林和阿莫西林采用正离子模式, 这可能是因为氨苄西林 pka 为 3.5,7.3, 阿莫西林 pka 为 2.4,7.4,9.6, 其酰胺侧链的碱性占主导地位, 使得二者更易带上正电荷本研究在优化离子源条件初, 青霉素 V 和氨苄西林选用 ESI 正模式 MRM 扫描时, 发现青霉素 V 离子对 351.1/106.1, 氨苄西林离子对 350.1/106.1, 均出现双峰, 且两种化合物的两峰的保留时间相同这可能是由于两个化合物的母离子的 m/z 值仅相差 1,MRM 监测时两个离子通道会相互干扰对青霉素 V 和氨苄西林的 106.1,160.1,192.1 三个子离子分别进行质谱参数优化, 最后 MRM 扫描发现对青霉素 V160.1,192.1 两个子离子出峰情况较好, 而对氨苄西林 106.1,192.1 两个子离子出峰情况较好, 可以排除青霉素 V 和氨苄西林之间的干扰 4.3 研究的延伸青霉素水溶液很不稳定, 在酸碱青霉素酶羟胺及某些金属离子 ( 铜铅汞和银 ) 或氧化剂等作用下, 易发生水解和分子重排, 生成青霉噻唑酸青霉脱羧噻唑酸青霉二酸青霉烯酸青霉醛青霉胺等, 导致 β 内酰胺环被破坏而失去抗菌活性新鲜牛奶中若残留或添加了青霉素, 在生产贮藏销售过程中, 牛奶复杂的基质环境可能使得青霉素原型药物发生结构的重排或者降解, 因此也可以借助 LC MS/MS 的高灵敏度, 对青霉素降解产物进行初步研究若牛奶样品检测结果中发现有降解产物出峰, 可以推断其中可能加入了青霉素类药物 References: [1] Detectionmethodforpenicilinantibioticresiduesin animal derivedfood MicrobiologicalMethod[J]. ChineseJournalofVeterinaryDrug( 中国兽药杂志 ),2004,38(3):14 15.(inChinese) [2] VERDONE,COUEDOR P.Multiresidueanalytical method forthe determination ofeightpenicilin antibioticsinmuscletisuebyion pairreversed phasehplcafterprecolumnderivatization[j].j AOACInt,1999,82(5): [3] VERDONE,COUEDORP,MARISP,etal.Liquid chromatographic determination of ampicilin residuesinporcinemuscletisuebyamultipenicilin analyticalmethod:european Colaborative Study [J].JAOACInt,2002,85(4): [4] LUO W,ANSC Y,THOMPSON H C,Jr.Rapid methodforthedeterminationofampicilinresidues inanimalmuscletisuesbyhigh performanceliquid chromatographywithfluorescencedetection[j].j ChromatogrBBiomedSciAppl,1997,694(2): [5] ANG C Y,LUO W.Rapid determination of ampicilininbovinemilkbyliquidchromatography withfluorescencedetection[j].j AOAC Int, 1997,80(1): [6] HUANGBai fen,ren Yi ping,caizeng xuan,et al( 黄百芬, 任一平, 蔡增轩, 等 ).Analysisofsix penicilinresiduesinmilkbylc MS/MS[J]. ChineseJournalofFoodHygiene( 中国食品卫生杂志 ),2007,19(1):31 35.(inChinese) [7] QINFeng,ZHENGWen Jie,CHENGui liang,etal ( 秦峰, 郑文捷, 陈桂良, 等 ).Determinationof sixpenicilinresiduesinmilkbylc MS/MS[J]. ChineseJournalofAntibiotics( 中国抗生素杂志 ),2009,34(6): (inChinese)

7 第 2 期赵维, 等. 高效液相色谱串联质谱法测定牛奶中 9 种青霉素类药物的残留量 177 [8] SHENG Long sheng,su Huan hua,guo Dan bin ( 盛龙生, 苏焕华, 郭丹滨 ).Chromatography mas spectrometrytechnology( 色谱质谱联用技术 ) [M].Beijing:ChemicalIndustry Publishing House,2006: (inChinese) [9] BOISON J O,KENGl J Y.Determination of sulafdimethoxine and sulafmethazine residues in animaltisuesbychromatographyandthermospray masspectrometry[j].jaoacint,1995,78(3): [10] DELEPINE B D, HURTAUD PESSE J D, SANDERSP.Multiresiduemethodforconfirmation ofmacrolide antibiotins in bovine muscle by chromatography masspectrometry[j].jaoac Int,1996,79(2): [11] YINGYong fei,chenhui hua,wuping gu( 应永飞, 陈慧华, 吴平谷 ).Theapplication of Chromatography masspectrometrytechnologyin veterinarydrugresidue[j].journalofanalytical Science( 分析科学学报 ),2008,24(3): (inChinese) [ 责任编辑张荣连 ] 檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵檵浙江大学学报 : 医学版征订和征稿启事浙江大学学报 : 医学版是由国家教育部主管, 浙江大学主办的报道医药学等方面研究成果的学术性刊物, 从 2003 年起, 正式被医学领域中最权威的美国医学索引, 即 IM/Medline 收录, 刊物印刷本被美国国立医学图书馆永久收藏 2008 年起, 浙江大学学报 : 医学版被中文核心期刊要目总览收录此外, 浙江大学学报 : 医学版还被中国科技论文统计源期刊 ( 中国科技核心期刊 ) 数据库中国科学引文数据库 (CSCD) 美国化学文摘美国乌利希国际期刊指南荷兰医学文摘波兰哥白尼索引等收录浙江大学学报 : 医学版主要登载医学药学生物医学以及相关学科的学术论文读者对象为医务工作者医药学教育和科研人员, 以及研究生等浙江大学学报 : 医学版欢迎广大作者来稿, 稿件的取舍以学术质量为标准, 一视同仁投稿须知请查阅刊物网址 (htp:// 上所登载的稿约浙江大学学报 : 医学版编辑部地址 : 杭州市天目山路 148 号 ; 邮编 :310028; 联系电话 : ; 电子信箱 :zdxbyxb@zju.edu.cn; 国内邮发代号 :32 2, 国外邮发代号 :BM6585; 订阅 : 全国各地邮局

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