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1 生 理 学 报 Acta Physiologica Sinica, August 25, 2011, 63(4): 研 究 论 文 低 频 电 刺 激 大 鼠 脚 桥 核 对 丘 脑 腹 外 侧 核 神 经 元 自 发 放 电 的 影 响 及 其 机 制 刘 焕 1, 林 宇 涵 2, 程 九 华 1, 蔡 越 1, 於 进 文 1, 马 进 1, 高 东 明 2,* 1 第 四 军 医 大 学 航 空 航 天 医 学 教 育 部 重 点 实 验 室, 航 空 航 天 生 理 学 教 研 室, 西 安 ; 2 辽 宁 医 学 院 生 理 学 教 研 室, 锦 州 摘 要 : 本 文 旨 在 观 察 低 频 电 刺 激 脚 桥 核 (pedunculopontine nucleus, PPN) 对 帕 金 森 病 (Parkinson s disease, PD) 模 型 大 鼠 丘 脑 腹 外 侧 核 (ventrolateral thalamic nucleus, VL) 神 经 元 自 发 放 电 活 动 的 影 响, 以 探 讨 低 频 电 刺 激 PPN 改 善 PD 症 状 的 作 用 机 制 通 过 纹 状 体 内 注 射 6- 羟 多 巴 胺 制 备 PD 大 鼠 模 型 采 用 在 体 细 胞 外 记 录 电 刺 激 及 微 电 泳 方 法, 观 察 低 频 电 刺 激 PPN 微 电 泳 乙 酰 胆 碱 (acetylcholine, ACh) 及 其 M 型 受 体 阻 断 剂 阿 托 品 (atropine, ATR) γ- 氨 基 丁 酸 (γ-aminobutyric acid, GABA) 及 其 A 型 受 体 阻 断 剂 荷 包 牡 丹 碱 (bicuculline, BIC) 对 大 鼠 VL 神 经 元 放 电 频 率 的 影 响 结 果 显 示, 低 频 电 刺 激 PPN 可 使 正 常 大 鼠 和 PD 大 鼠 VL 神 经 元 自 发 放 电 频 率 增 加 微 电 泳 ACh 对 VL 神 经 元 具 有 兴 奋 和 抑 制 两 种 作 用, 而 微 电 泳 ATR 则 主 要 抑 制 VL 神 经 元, 即 使 对 被 ACh 抑 制 的 神 经 元 也 产 生 抑 制 作 用 微 电 泳 GABA 抑 制 VL 神 经 元, 而 微 电 泳 BIC 则 兴 奋 VL 神 经 元 另 外, 在 微 电 泳 ACh 的 过 程 中 微 电 泳 GABA, 被 ACh 兴 奋 或 抑 制 的 VL 神 经 元 放 电 频 率 明 显 降 低 在 ATR 抑 制 作 用 的 基 础 上 低 频 电 刺 激 PPN 则 不 能 使 VL 神 经 元 放 电 频 率 增 加 以 上 结 果 提 示, 胆 碱 能 和 GABA 能 传 入 纤 维 可 能 会 聚 于 同 一 VL 神 经 元, 并 对 其 具 有 紧 张 性 作 用 低 频 电 刺 激 PPN 可 能 使 该 核 团 投 射 至 VL 的 胆 碱 能 纤 维 释 放 ACh 增 加, 从 而 通 过 突 触 前 负 反 馈 调 节 抑 制 投 射 至 基 底 节 输 出 核 VL 的 GABA 能 通 路, 释 放 丘 脑 皮 层 投 射, 使 相 应 运 动 皮 层 活 动 提 高 而 改 善 PD 症 状 关 键 词 : 帕 金 森 病 ; 脚 桥 核 ; 丘 脑 腹 外 侧 核 ; 微 电 泳 ; 低 频 电 刺 激 中 图 分 类 号 :R338.8 Effects and mechanism of low frequency stimulation of pedunculopontine nucleus on spontaneous discharges of ventrolateral thalamic nucleus in rats LIU Huan 1, LIN Yu-Han 2, CHENG Jiu-Hua 1, CAI Yue 1, YU Jin-Wen 1, MA Jin 1, GAO Dong-Ming 2,* 1 Key Laboratory of Aerospace Medicine, Ministry of Education; Department of Aerospace Physiology, the Fourth Military Medical University, Xi an , China; 2 Department of Physiology, Liaoning Medical College, Jinzhou , China Abstract: Parkinson s disease is a progressive neurodegenerative disorder characterized clinically by rigidity, akinesia, resting tremor and postural instability. It has recently been suggested that low frequency stimulation of the pedunculopontine nucleus (PPN) has a role in the therapy for Parkinsonism, particularly in gait disorder and postural instability. However, there is limited information about the mechanism of low frequency stimulation of the PPN on Parkinson s disease. The present study was to investigate the effect and mechanism of low frequency stimulation of the PPN on the firing rate of the ventrolateral thalamic nucleus (VL) in a rat model with unilateral 6-hydroxydopamine lesioning of the substantia nigra pars compacta. In vivo extracellular recording and microiontophoresis were adopted. The results showed that the firing rate of 60.71% VL neurons in normal rats and 59.57% VL neurons in 6-hydroxydopamine lesioned rats increased with low frequency stimulation of the PPN. Using microiontophoresis to VL neurons, we found the firing rate in VL neurons responded with either an increase or decrease in application of acetylcholine (ACh) in normal rats, whereas with a predominant decrease in M receptor antagonist atropine. Furthermore, the VL neurons were mainly inhibited by application of Received Accepted This work was supported by the Science and Technology Foundation of Liaoning Province, China (No ). * Corresponding author. Tel: ; Fax: ; jzgaodm@163.com

2 312 生 理 学 报 Acta Physiologica Sinica, August 25, 2011, 63(4): γ-aminobutyric acid (GABA) and excited by GABA A receptor antagonist bicuculline. Importantly, the VL neurons responding to ACh were also inhibited by application of GABA. We also found that the excitatory response of the VL neurons to the low frequency stimulation of the PPN was significantly reversed by microiontophoresis of atropine. These results demonstrate that cholinergic and GABAergic afferent nerve fibers may converge on the same VL neurons and they are involved in the effects of low frequency stimulation of the PPN, with ACh combining M 2 receptors on the presynaptic membrane of GABAergic afferents, which will inhibit the release of GABA in the VL and then improve the symptoms of Parkinson s disease. Key words: Parkinson s disease; pedunculopontine nucleus; ventrolateral thalamic nucleus; microiontophoresis; low frequency stimulation 帕 金 森 病 (Parkinson s disease, PD) 是 一 种 常 见 的 中 枢 神 经 系 统 渐 进 性 变 性 疾 病, 典 型 的 病 理 特 征 为 中 脑 黑 质 致 密 部 (substantia nigra pars compacta, SNc) 的 多 巴 胺 能 神 经 元 变 性 坏 死, 从 而 引 发 基 底 节 [1] 环 路 的 功 能 调 节 异 常 除 此 之 外,PD 患 者 还 伴 有 中 枢 胆 碱 能 5- 羟 色 胺 能 及 去 甲 肾 上 腺 素 能 神 经 [2] 元 不 同 程 度 的 缺 失, 其 中 脚 桥 核 (pedunculopontine nucleus, PPN) 致 密 部 胆 碱 能 大 神 经 元 缺 失 约 达 50% [3] 另 外, 电 生 理 研 究 证 实 6- 羟 多 巴 胺 毁 损 SNc 神 经 元 的 大 鼠 的 PPN 神 经 元 自 发 放 电 活 动 增 [4] 强 这 些 均 提 示 PPN 在 PD 发 病 过 程 中 起 重 要 作 [5] 用 Mazzone 等 发 现 低 频 电 刺 激 PPN 可 明 显 改 善 PD 患 者 难 治 的 步 态 障 碍 和 姿 势 异 常 等 症 状, 但 其 治 疗 机 制 并 不 清 楚 胆 碱 能 神 经 元 是 PPN 中 分 布 最 多 的 神 经 元, 在 致 密 部 占 神 经 元 总 数 的 90% 以 上, 在 网 状 部 可 占 20%~75% [6] PPN 与 许 多 参 与 运 动 调 节 的 核 团 如 基 底 节 丘 脑 大 脑 皮 层 脊 髓 等 存 在 广 泛 的 相 互 纤 维 联 系 丘 脑 腹 外 侧 核 (ventrolateral thalamic nucleus, VL) 是 传 递 基 底 神 经 节 信 息 并 投 向 大 脑 皮 层 的 最 后 中 继 核 团 之 一, 它 除 了 接 受 来 自 苍 白 球 内 侧 部 / 黑 质 网 状 部 (Gpi/SNr) 的 大 量 的 γ- 氨 基 丁 酸 (γaminobutyric acid, GABA) 能 投 射, 还 接 受 其 它 不 同 调 节 系 统 的 投 射, 其 中 62% 的 胆 碱 能 投 射 来 自 PPN [7,8] 为 此, 我 们 通 过 电 刺 激 及 微 电 泳 方 法 研 究 低 频 电 刺 激 PPN 对 PD 大 鼠 VL 神 经 元 的 作 用 及 微 电 泳 乙 酰 胆 碱 (acetylcholine, ACh) 和 GABA 对 VL 神 经 元 自 发 放 电 活 动 的 影 响, 以 探 讨 PPN 投 射 至 VL 的 胆 碱 能 通 路 在 低 频 电 刺 激 PPN 改 善 PD 症 状 方 面 的 作 用 机 制, 为 临 床 低 频 电 刺 激 PPN 治 疗 PD 提 供 电 生 理 学 依 据 1 材 料 和 方 法 1.1 实 验 动 物 与 试 剂 健 康 成 年 雄 性 Sprague- Dawley 大 鼠 20 只, 体 重 250~300 g, 由 辽 宁 医 学 院 实 验 动 物 中 心 提 供 随 机 分 为 两 组 : 对 照 组 10 只, PD 组 10 只 6- 羟 多 巴 胺 阿 朴 吗 啡 滂 胺 天 蓝 ACh 阿 托 品 (atropine, ATR) GABA 和 荷 包 牡 丹 碱 (bicuculline, BIC) 均 购 自 美 国 Sigma 公 司 1.2 PD 模 型 建 立 及 行 为 检 测 PD 大 鼠 模 型 制 备 [9] 按 文 献 描 述 方 法 进 行 术 前 30 min 腹 腔 注 射 0.75% 地 昔 帕 明 (3.3 ml/kg) 以 保 护 去 甲 肾 上 腺 素 能 神 经 元 大 鼠 麻 醉 后, 俯 位 固 定 于 脑 立 体 定 位 仪 (Stoelting, USA) 上, 行 常 规 无 菌 开 颅 术 参 照 Paxinos & Watson 大 鼠 脑 图 谱, 在 右 侧 纹 状 体 两 位 点 ( 前 :AP [10] 1.7 mm,l 2.2 mm,h 5.4 mm ; 后 :AP 0.4 mm, L 4.0 mm,h 6.0 mm) 所 对 应 颅 骨 处 各 钻 一 直 径 为 1 mm 的 骨 窗, 并 分 别 向 两 点 注 入 6- 羟 多 巴 胺 (4 μg/μl) 2 μl, 注 射 速 度 1 μl/min, 留 针 10 min, 再 以 1 mm/min 的 速 度 缓 慢 退 针, 缝 合 皮 肤, 术 后 置 于 笼 内 正 常 饲 养 术 后 4 周 进 行 旋 转 行 为 测 试, 在 大 鼠 颈 背 部 皮 下 注 射 0.05% 阿 朴 吗 啡 (0.5 mg/kg) 诱 发 大 鼠 旋 转 行 为 5 min 后 开 始 人 工 观 察 并 记 录 旋 转 圈 数, 观 察 30 min, 平 均 转 数 达 7 r/min 者 为 成 功 PD 模 型, 否 则 予 以 淘 汰 1.3 电 刺 激 方 法 大 鼠 经 20% 乌 拉 坦 (8 ml/kg) 腹 腔 注 射 麻 醉 后, 固 定 于 脑 立 体 定 位 仪 上, 常 规 开 颅 将 刺 激 电 极 (NEX100 双 极 同 心 圆 电 极, 外 径 0.25 mm, 直 流 输 出 阻 抗 3~6 MΩ) 缓 慢 推 入 PPN (AP 7.8~ 8.1 mm, L 1.6~2.0 mm, H 6.1~7.2 mm) 电 刺 激 由 A320R 隔 离 电 刺 激 器 (WPI, USA) 产 生, 经 同 心 圆 电 极 输 出 刺 激 参 数 : 方 波 脉 冲, 频 率 20 Hz, 强 度 0.4 ma, 波 宽 0.06 ms, 刺 激 时 程 5 s 1.4 微 电 泳 及 细 胞 外 记 录 确 定 右 侧 VL 坐 标 (AP 2.2~ 3.0 mm, L 1.5~2.2 mm, H 5.4~6.4 mm), 采 用 自 制 多 管 玻 璃 微 电 极 进 行 微 电 泳 及 细 胞 外 记 录, 电 极 尖 端 直 径 为 4~8 µm, 外 周 管 ( 电 阻 20~100 MΩ) 分 别 灌 注 以 下 药 物 :ACh (1.0 mol/l, ph 4.0),ATR

3 刘 焕 等 : 低 频 电 刺 激 大 鼠 脚 桥 核 对 丘 脑 腹 外 侧 核 神 经 元 自 发 放 电 的 影 响 及 其 机 制 313 (0.2 mol/l, ph 5.0),GABA (0.2 mol/l, ph 3.5),BIC (0.01 mol/l, ph 4.0),NaCl (3.0 mol/l, ph 7.0) 中 心 管 ( 电 阻 5~12 MΩ) 灌 注 含 1% 滂 胺 天 蓝 的 3 mol/l NaCl (ph 7.0) 溶 液 用 于 引 导 神 经 元 放 电 借 助 微 电 极 推 进 器, 将 玻 璃 微 电 极 缓 慢 推 进 至 大 鼠 VL, 记 录 神 经 元 的 单 位 放 电 活 动 应 用 6400 A 微 电 泳 仪 (Dagan, USA) 将 外 周 管 内 药 物 用 正 电 流 泳 入 VL 内, 电 泳 电 流 为 5~100 na, 滞 流 电 流 为 5~10 na 神 经 元 放 电 经 DAM80 微 电 极 放 大 器 (WPI, USA) 引 导 放 大 滤 波 后 显 示 于 示 波 器 上, 应 用 Spike2 生 物 信 号 系 统 (CED, England) 采 集 实 验 数 据 并 输 入 计 算 机 实 验 过 程 中, 只 对 放 电 稳 定 且 信 噪 比 >3:1 的 放 电 信 号 进 行 记 录 为 排 除 可 能 发 生 的 电 流 作 用, 只 要 泳 入 NaCl 引 起 放 电 变 化, 该 数 据 不 计 入 统 计 1.5 组 织 学 鉴 定 实 验 结 束 后, 玻 璃 微 电 极 中 心 管 通 以 20 μa 电 流 20 min, 将 滂 胺 天 蓝 泳 入 VL 标 记 放 电 记 录 部 位 刺 激 部 位 通 过 直 流 电 毁 损 方 法 (+20 ma, 10 s) 进 行 标 记 大 鼠 经 颈 总 动 脉 用 含 4% 多 聚 甲 醛 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 灌 流 固 定, 迅 速 取 脑, 做 连 续 冠 状 冰 冻 切 片, 片 厚 30 μm 焦 油 紫 染 色, 光 镜 下 观 察, 取 刺 激 和 记 录 部 位 正 确 的 单 位 进 行 统 计 分 析 1.6 统 计 处 理 微 电 泳 或 电 刺 激 后,VL 神 经 元 放 电 频 率 的 变 化 根 据 下 列 公 式 判 断 :R = ( 处 理 后 放 电 频 率 / 处 理 前 放 电 频 率 1) 100%,R > 20% 为 兴 奋 性 反 应 ;R < 20% 为 抑 制 性 反 应 ; 介 于 两 者 之 间 为 无 反 应 应 用 SPSS 11.0 统 计 软 件 进 行 数 据 处 理, 所 得 数 据 以 mean ± SEM 表 示, 处 理 前 后 放 电 频 率 的 比 较 用 配 对 t 检 验, 同 一 处 理 因 素 在 两 组 之 间 的 放 电 频 率 比 较 用 独 立 样 本 t 检 验, 放 电 类 型 构 成 比 的 比 较 用 χ 2 检 验,P < 0.05 时 认 为 差 异 有 统 计 学 意 义 2 结 果 2.1 低 频 电 刺 激 大 鼠 PPN 对 VL 神 经 元 自 发 放 电 的 影 响 共 记 录 了 对 照 组 大 鼠 58 个 神 经 元 和 PD 组 大 鼠 55 个 神 经 元 的 自 发 放 电 活 动, 其 自 发 放 电 较 慢, 大 多 数 (51/58, 39/55) 夹 杂 爆 发 式 串 放 电, 每 串 由 2~7 个 动 作 电 位 组 成 对 照 组 大 鼠 神 经 元 的 放 电 频 率 在 0.93~20.18 Hz 之 间 [ 平 均 (6.74 ± 0.73) Hz],PD 组 放 电 频 率 在 0.91~15.88 Hz 之 间 [ 平 均 (5.57 ± 0.48) Hz], 两 组 大 鼠 神 经 元 自 发 放 电 频 率 无 明 显 差 异 记 录 了 对 照 组 56 个 神 经 元 及 PD 组 47 个 神 经 元 对 低 频 电 刺 激 PPN 的 反 应 两 组 大 鼠 VL 神 经 元 对 低 频 电 刺 激 PPN 均 可 产 生 兴 奋 抑 制 和 无 反 应 三 种 反 应 类 型, 均 以 兴 奋 性 反 应 为 主, 且 作 用 明 显 ( 图 1) 被 兴 奋 神 经 元 的 放 电 频 率 在 对 照 组 平 均 由 (5.32 ± 0.96) Hz 增 加 至 (9.55 ± 1.27) Hz (P < 0.01, n = 34), 在 PD 组 由 (5.75 ± 0.86) Hz 增 加 至 (10.40 ± 1.46) 图 1. 大 鼠 VL 神 经 元 对 低 频 电 刺 激 PPN 的 兴 奋 性 反 应 Fig. 1. Excitatory effect of low frequency stimulation of the PPN on the firing rate of the VL neurons in a rat (bin time: 1 s). A: Sequence histogram; B: Original chart recording. S: low frequency stimulation (20 Hz).

4 314 生 理 学 报 Acta Physiologica Sinica, August 25, 2011, 63(4): Hz (P < 0.01, n = 28), 两 组 间 的 兴 奋 作 用 无 明 显 差 异, 两 组 神 经 元 反 应 的 构 成 比 也 无 明 显 差 异 ( 表 1) 2.2 微 电 泳 ACh 和 ATR 对 正 常 大 鼠 VL 神 经 元 自 发 放 电 的 影 响 微 电 泳 ACh (10~80 na, 20 s) 使 45 个 VL 神 经 元 中 21 个 (47%) 表 现 为 兴 奋 性 反 应, 另 外 24 个 (53%) 神 经 元 表 现 为 抑 制 性 反 应 被 兴 奋 神 经 元 的 平 均 放 电 频 率 由 (9.36 ± 1.31) Hz 增 加 至 (28.43 ± 3.45) Hz (P < 0.01, n = 21), 而 被 抑 制 神 经 元 的 平 均 放 电 频 率 则 由 (4.13 ± 0.66) Hz 减 少 至 (1.59 ± 0.41) Hz (P < 0.01, n = 24), 分 别 增 加 了 204% 和 减 少 了 62% ACh 作 用 缓 慢, 有 潜 伏 期 和 明 显 的 后 作 用, 电 泳 停 止 后 需 要 一 段 时 间 才 能 使 神 经 元 放 电 活 动 恢 复 正 常 在 52 个 VL 神 经 元 中, 微 电 泳 M 型 胆 碱 能 受 体 阻 断 剂 ATR (10~100 na, 20 s) 主 要 抑 制 神 经 元 自 发 放 电 活 动, 有 92% 的 神 经 元 被 抑 制, 平 均 放 电 频 率 由 (6.96 ± 1.15) Hz 减 少 至 (2.84 ± 0.53) Hz (P < 0.01, n = 48), 降 低 了 59%, 另 外 有 4 个 神 经 元 不 受 影 响 ATR 与 ACh 具 有 相 似 的 作 用 特 点, 作 用 缓 慢, 有 明 显 的 潜 伏 期 和 后 作 用 ( 图 2) 另 外, 观 察 了 同 一 神 经 元 对 ACh 和 ATR 的 反 应 被 ACh 兴 奋 的 16 个 神 经 元 中 有 15 个 (94%) 被 ATR 抑 制, 另 外 1 个 神 经 元 无 反 应 同 时 微 电 泳 ACh 和 ATR,ATR 可 明 显 抑 制 ACh 的 兴 奋 作 用, 其 平 均 放 电 频 率 由 ACh 作 用 时 的 (18.27 ± 2.99) Hz 减 少 至 (5.88 ± 1.26) Hz (P < 0.01, n = 15) 被 ACh 抑 制 的 20 个 神 经 元 中 有 18 个 (90%) 也 被 ATR 抑 制, 并 且 ATR 可 使 神 经 元 放 电 频 率 在 ACh 抑 制 作 用 的 基 础 上 进 一 步 降 低, 其 平 均 放 电 频 率 由 ACh 作 用 时 的 (2.67 ± 0.85) Hz 减 少 至 (2.09 ± 0.76) Hz (P < 表 1. 大 鼠 VL 神 经 元 对 低 频 电 刺 激 PPN 的 反 应 Table 1. The responses of the VL neurons to the stimulation of the PPN in rats Groups Total neurons Excitation Inhibition No response n % n % n % Control PD 图 2. 微 电 泳 ACh 和 ATR 对 大 鼠 VL 神 经 元 放 电 频 率 的 影 响 Fig. 2. Effects of ACh and ATR application on the firing rate of the VL neurons in a rat (bin time: 1 s). A: The VL neuron was excited by ACh and inhibited by ATR. B: The VL neuron was inhibited by ACh and ATR. Numbers above bars indicate the intensity of injection current (na).

5 刘 焕 等 : 低 频 电 刺 激 大 鼠 脚 桥 核 对 丘 脑 腹 外 侧 核 神 经 元 自 发 放 电 的 影 响 及 其 机 制 , n = 18), 其 余 2 个 神 经 元 对 ATR 无 反 应 ( 图 2) 2.3 微 电 泳 GABA 和 BIC 对 正 常 大 鼠 VL 神 经 元 自 发 放 电 的 影 响 观 察 了 48 个 VL 神 经 元 对 微 电 泳 GABA (10 ~ 60 na, 20 s) 的 反 应,96% 的 神 经 元 表 现 为 明 显 的 抑 制 反 应, 平 均 放 电 频 率 由 (5.46 ± 0.90) Hz 减 少 至 (1.66 ± 0.42) Hz (P < 0.01, n = 46), 减 少 了 70%, 另 外 2 个 神 经 元 不 受 影 响 在 45 个 神 经 元 中, 微 电 泳 GABA A 受 体 阻 断 剂 BIC (20~80 na, 20 s) 使 89% 的 神 经 元 表 现 为 兴 奋 性 反 应, 平 均 放 电 频 率 由 (5.93 ± 0.88) Hz 增 加 至 (21.57 ± 2.36) Hz (P < 0.01, n = 40), 增 加 了 264%, 其 余 1 个 被 抑 制 4 个 无 反 应 在 23 个 神 经 元 中,BIC 可 明 显 改 变 GABA 对 VL 神 经 元 的 作 用, 神 经 元 平 均 放 电 频 率 由 GABA 作 用 时 的 (1.74 ± 0.61) Hz 增 加 至 (9.35 ± 1.52) Hz (P < 0.01, n = 23) GABA 及 BIC 均 作 用 迅 速, 无 潜 伏 期, 也 无 明 显 的 后 作 用 ( 图 3) 另 外, 观 察 了 被 ACh 兴 奋 的 18 个 神 经 元 及 被 抑 制 的 19 个 神 经 元 对 微 电 泳 GABA 的 反 应, 发 现 17 个 (94%) 被 ACh 兴 奋 的 神 经 元 及 16 个 (84%) 被 ACh 抑 制 的 神 经 元 在 微 电 泳 GABA 后 放 电 频 率 明 显 降 低 ( 图 4) 2.4 微 电 泳 ATR 和 低 频 电 刺 激 PPN 对 VL 神 经 元 自 发 放 电 活 动 的 影 响 本 文 进 一 步 观 察 了 微 电 泳 ATR (10~100 na, 40 s) 对 被 低 频 电 刺 激 PPN 所 兴 奋 的 对 照 组 和 PD 组 大 鼠 VL 神 经 元 放 电 活 动 的 影 响 ( 图 5) 在 对 照 组 大 鼠 10 个 VL 神 经 元 中, 微 电 泳 ATR 的 过 程 中 低 频 电 刺 激 PPN,7 个 神 经 元 在 ATR 抑 制 作 用 的 基 础 上 没 有 出 现 单 独 给 予 低 频 电 刺 激 PPN 时 所 呈 现 的 兴 奋 反 应, 反 而 出 现 了 进 一 步 的 抑 制 反 应, 其 平 均 放 电 频 率 由 ATR 作 用 时 的 (3.07 ± 0.55) Hz 减 少 至 (0.93 ± 0.21) Hz (P < 0.01, n = 7), 其 中 3 个 神 经 元 完 全 被 抑 制 另 外 3 个 神 经 元 在 ATR 作 用 (2 个 抑 制 1 个 无 反 应 ) 的 基 础 上 仅 出 现 了 较 小 幅 度 的 兴 奋 反 应 图 3. 微 电 泳 GABA 和 BIC 对 大 鼠 VL 神 经 元 放 电 频 率 的 影 响 Fig. 3. Effects of GABA and BIC application on the firing rate of the VL neurons in a rat (bin time: 1 s). Numbers above bars indicate the intensity of injection current (na). 图 4. 微 电 泳 ACh 和 GABA 对 大 鼠 VL 神 经 元 放 电 频 率 的 影 响 Fig. 4. Effects of ACh and GABA application on the firing rate of the VL neurons in a rat (bin time: 1 s). The VL neuron was excited (A) or inhibited (B) by application of ACh, and was both inhibited by further application of GABA. Numbers above bars indicate the intensity of injection current (na).

6 316 生 理 学 报 Acta Physiologica Sinica, August 25, 2011, 63(4): 图 5. 微 电 泳 ATR 过 程 中 低 频 电 刺 激 PPN 对 PD 大 鼠 VL 神 经 元 放 电 活 动 的 影 响 Fig. 5. Effects of low frequency stimulation of the PPN and microiontophoresis of ATR on the firing rate of the VL neurons in a 6-hydroxydopamine lesioned rat (bin time: 1 s). A: Sequence histogram. B: Original chart recording. S: low frequency stimulation (20 Hz). ATR40: microiontophoresis of ATR with 40 na injection current. 在 PD 组 大 鼠 11 个 VL 神 经 元 中, 微 电 泳 ATR 的 过 程 中 低 频 电 刺 激 PPN,9 个 神 经 元 在 ATR 抑 制 作 用 的 基 础 上 出 现 了 进 一 步 的 抑 制 反 应, 其 平 均 放 电 频 率 由 ATR 作 用 时 的 (2.96 ± 0.56) Hz 减 少 至 (0.79 ± 0.13) Hz (P < 0.01, n = 9), 其 中 4 个 神 经 元 完 全 被 抑 制 另 外 1 个 神 经 元 被 兴 奋,1 个 无 反 应 3 讨 论 在 皮 层 基 底 节 丘 脑 皮 层 运 动 环 路 中,VL 作 为 基 底 神 经 节 传 出 核 团, 在 基 底 节 运 动 功 能 调 节 方 面 起 重 要 作 用 在 PD 状 态 下,SNc 神 经 元 变 性 坏 死, 丘 脑 底 核 Gpi/SNr 活 动 增 强,Gpi/SNr 过 强 的 GABA 能 神 经 通 路 抑 制 丘 脑 皮 层 投 射, 降 低 [2] 相 应 皮 层 运 动 区 的 活 动 而 产 生 PD 症 状 在 本 研 究 中, 我 们 观 察 到 低 频 电 刺 激 PPN 对 正 常 和 PD 大 鼠 的 VL 神 经 元 主 要 产 生 兴 奋 效 应, 并 且 此 效 应 在 [9] 两 组 间 无 差 异 我 们 前 期 的 研 究 显 示 正 常 和 PD 模 型 大 鼠 VL 的 放 电 频 率 和 放 电 类 型 并 不 存 在 差 异, PD 大 鼠 VL 仅 出 现 爆 发 式 放 电 神 经 元 放 电 频 率 的 [11] 明 显 降 低 Pessiglione 等 认 为 丘 脑 是 一 个 特 别 复 杂 的 核 团, 除 了 接 受 基 底 节 25%~30% 的 抑 制 性 投 射 外, 还 接 受 额 叶 皮 质 网 状 核 和 其 它 不 同 的 调 节 系 统 的 投 射, 有 些 神 经 元 的 放 电 频 率 降 低, 同 时 也 可 能 有 其 它 神 经 元 的 放 电 频 率 升 高, 总 体 放 电 频 率 [12] 却 没 有 变 化 Oueslati 等 通 过 代 谢 研 究 发 现 PD 大 鼠 细 胞 色 素 氧 化 酶 Ⅰ mrna 在 VL 并 没 有 明 显 改 变 我 们 认 为 在 正 常 和 PD 组 大 鼠 低 频 电 刺 激 PPN 后 VL 神 经 元 放 电 频 率 无 差 异 可 能 与 两 组 大 鼠 VL 神 经 元 总 体 放 电 频 率 和 放 电 形 式 亦 无 差 异 这 一 现 象 有 关 在 正 常 大 鼠,PPN 主 要 通 过 PPN-SNc 胆 碱 能 和 Glu 能 投 射 兴 奋 SNc 神 经 元, 进 而 通 过 间 接 环 路 多 突 触 投 射 抑 制 丘 脑 底 核 (subthalmic nucleus, [4] STN) 神 经 元 来 反 馈 调 节 基 底 节 环 路 ; 在 PD 大 鼠, SNc 神 经 元 受 损,STN PPN 神 经 元 放 电 频 率 增 高, PPN 失 去 对 SNc 的 兴 奋 性 调 节, 则 主 要 通 过 单 突 触 [13] PPN-STN 投 射 兴 奋 STN 神 经 元, 进 而 使 基 底 节 输 出 增 加, 抑 制 VL 神 经 元 的 活 动 本 研 究 中, 我 们 观 察 到 两 组 大 鼠 对 低 频 电 刺 激 PPN 的 三 种 反 应 类 型 构 成 比 亦 没 有 显 著 差 异, 提 示 PPN-VL 胆 碱 能 投 射 在 低 频 刺 激 PPN 过 程 中 可 能 对 VL 神 经 元 起 着 非 常 重 要 的 调 控 作 用, 并 且 这 种 调 控 作 用 可 能 不 受 SNc 多 巴 胺 能 神 经 元 缺 失 的 影 响 另 外,c-fos 免 疫 组 化 研 究 显 示, 单 侧 PPN 微 量 注 射 L- 谷 氨 酸 再 摄 取 抑 制 剂 以 阻 断 PPN 内 源 性 递 质 的 重 吸 收 可 引 起 [14] 大 鼠 VL 相 应 的 fos 蛋 白 表 达 变 化, 这 也 提 示 PPN 对 VL 神 经 元 放 电 活 动 的 影 响 中 枢 胆 碱 能 系 统 参 与 学 习 记 忆 过 程 感 觉 和 运 动 的 调 节 等 功 能 胆 碱 能 受 体 可 分 为 两 种 : 烟 碱 受

7 刘 焕 等 : 低 频 电 刺 激 大 鼠 脚 桥 核 对 丘 脑 腹 外 侧 核 神 经 元 自 发 放 电 的 影 响 及 其 机 制 317 体 (N 型 受 体 ) 和 毒 蕈 碱 (M 型 受 体 ) M 型 受 体 又 分 为 5 个 亚 型 :M 1 ~M 5 它 们 都 表 现 出 慢 反 应 并 与 G 蛋 白 偶 联, 或 直 接 作 用 于 离 子 通 道, 或 与 第 二 信 使 联 系, 最 终 开 启 或 关 闭 K + Ca 2+ 或 Cl 离 子 通 道 N 型 受 体 激 活 出 现 兴 奋 性 突 触 后 电 位, 而 M 型 受 体 激 活 后 根 据 其 亚 型 的 不 同 可 出 现 抑 制 性 或 兴 奋 性 [15] 突 触 后 电 位 其 中 M 2 受 体 是 VL 主 要 的 胆 碱 能 受 体, 在 胆 碱 能 或 非 胆 碱 能 神 经 元 突 触 前 膜 或 / 和 突 触 后 膜 大 量 分 布, 在 突 触 前 膜 通 过 与 ACh 结 合 引 起 K + 通 道 开 放, 使 突 触 前 膜 超 极 化, 可 对 递 质 [16] 的 释 放 进 行 负 反 馈 调 节 另 外,M 2 受 体 也 可 与 其 它 M 型 受 体 以 及 N 型 受 体 共 存 于 突 触 后 膜 在 本 实 验 中 我 们 观 察 到, 微 电 泳 ACh 对 正 常 大 鼠 VL 神 经 元 可 产 生 抑 制 和 兴 奋 两 种 不 同 的 作 用, 这 提 示 VL 神 经 元 突 触 部 位 不 同 类 型 的 胆 碱 能 受 体 对 神 经 元 活 动 进 行 着 复 杂 的 调 节, 而 通 过 微 电 泳 M 型 受 体 阻 断 剂 ATR 不 仅 抑 制 VL 神 经 元 的 活 动 而 且 抑 制 ACh 的 作 用, 证 实 胆 碱 能 传 入 对 VL 神 经 元 存 在 紧 张 性 作 用 另 外, 我 们 先 后 微 电 泳 ACh 和 ATR, 发 现 ATR 对 被 ACh 抑 制 的 神 经 元 也 产 生 抑 制 作 用, 提 示 ATR 不 仅 作 用 于 突 触 后 膜 胆 碱 能 受 体, 而 且 可 能 还 与 突 触 前 膜 M 2 受 体 竞 争 结 合 并 促 进 其 神 经 元 的 递 质 释 放 而 起 作 用 解 剖 学 研 究 证 实, 大 鼠 [17] VL 存 在 大 量 的 来 自 Gpi 及 SNr 的 GABA 能 投 射 为 此, 我 们 采 用 微 电 泳 GABA 及 其 A 型 受 体 阻 断 剂 BIC, 发 现 GABA 对 VL 神 经 元 具 有 明 显 的 抑 制 作 用, 而 BIC 不 仅 兴 奋 VL 神 经 元 而 且 可 以 阻 断 GABA 的 抑 制 作 用 另 外, 在 VL 微 电 泳 ACh 的 过 程 中 给 予 GABA, 被 ACh 兴 奋 或 抑 制 的 神 经 元 在 微 电 泳 GABA 后 放 电 活 动 明 显 降 低 这 些 均 证 实 VL 存 在 GABA 能 和 胆 碱 能 投 射, 并 且 二 者 可 会 聚 于 同 一 VL 神 经 元 并 对 其 进 行 紧 张 性 调 节 因 此, ATR 除 了 与 胆 碱 能 神 经 纤 维 末 梢 的 自 身 受 体 结 合 外, 还 可 能 作 用 于 GABA 能 纤 维 末 梢 的 M 2 受 体, 阻 断 其 负 反 馈 调 节 作 用, 使 GABA 递 质 释 放 增 多, 从 而 抑 制 突 触 后 VL 神 经 元 因 此,ATR 对 VL 神 经 元 的 抑 制 作 用 可 能 是 间 接 通 过 影 响 GABA 的 释 放 产 生 的 我 们 进 一 步 在 ATR 抑 制 作 用 的 基 础 上 观 察 了 低 频 电 刺 激 PPN 对 VL 神 经 元 的 影 响, 结 果 显 示 ATR 不 仅 抑 制 低 频 电 刺 激 对 VL 的 兴 奋 作 用, 而 且 使 低 频 电 刺 激 过 程 中 的 神 经 元 放 电 频 率 较 单 独 ATR 作 用 时 降 低 为 此, 我 们 推 断, 低 频 电 刺 激 PPN 可 能 使 PPN 放 电 模 式 发 生 转 换, 一 方 面 使 PPN 胆 碱 能 神 经 元 在 VL 释 放 ACh 增 加, 通 过 其 突 触 后 胆 碱 能 受 体 兴 奋 或 抑 制 VL 神 经 元 ; 另 一 方 面, 释 放 的 ACh 也 作 用 于 来 自 突 触 前 Gpi/SNr 的 GABA 能 神 经 纤 维 末 梢 的 突 触 前 膜 M 2 受 体, 反 馈 抑 制 GABA 能 投 射, 通 过 减 少 GABA 的 释 放 而 兴 奋 VL 神 经 元, 从 而 释 放 丘 脑 皮 层 通 路, 使 相 应 运 动 皮 层 活 动 提 高 而 改 善 PD 症 状 其 中,VL 核 团 内 GABA 能 末 梢 突 触 前 膜 M 2 受 体 的 负 反 馈 调 节 可 能 在 低 频 电 刺 激 过 程 中 起 着 更 为 重 要 的 作 用 因 此, 本 实 验 通 过 电 生 理 学 方 法 证 实 低 频 电 刺 激 PPN 可 以 通 过 胆 碱 能 投 射 增 加 VL 神 经 元 放 电 活 动 而 改 善 PD 症 状, 这 为 临 床 低 频 电 刺 激 PPN 治 疗 PD 提 供 了 电 生 理 学 依 据 参 考 文 献 1 Blandini F, Nappi G, Tassorelli C, Martignoni E. Functional changes of the basal ganglia circuitry in Parkinson s disease. Prog Neurobiol 2000; 62(1): Lewis SJ, Barker RA. Understanding the dopaminergic deficits in Parkinson s disease: Insights into disease heterogeneity. J Clin Neurosci 2009; 16(5): Bohnen NI, Albin RL. The cholinergic system and Parkinson disease. Behav Brain Res 2010; 221(2): Breit S, Bouali-Benazzouz R, Benabid AL, Benazzouz A. Unilateral lesion of the nigrostriatal pathway induces an increase of neuronal activity of the pedunculopontine nucleus, which is reversed by the lesion of the subthalamic nucleus in the rat. Eur J Neurosci 2001; 14(11): Mazzone P, Lozano A, Stanzione P, Galati S, Scarnati E, Peppe A, Stefani A. Implantation of human pedunculopontine nucleus: a safe and clinically relevant target in Parkinson s disease. Neuroreport 2005; 16(17): Gomez-Gallego M, Fernandez-Villalba E, Fernandez-Barreiro A, Herrero MT. Changes in the neuronal activity in the pedunculopontine nucleus in chronic MPTP-treated primates: an in situ hybridization study of cytochrome oxidase subunit I, choline acetyl transferase and substance P mrna expression. J Neural Transm 2007; 114(3): Ilinsky IA, Kultas-Ilinsky K. Motor thalamic circuits in primates with emphasis on the area targeted in treatment of movement disorders. Mov Disord 2002; 17(Suppl 3): S9 S14. 8 Hallanger AE, Wainer BH. Ascending projections from the pedunculopontine tegmental nucleus and the adjacent mesopontine tegmentum in the rat. J Comp Neurol 1988; 274(4):

8 318 生 理 学 报 Acta Physiologica Sinica, August 25, 2011, 63(4): Liu H ( 刘 焕 ), Zhang J, Gao DM. Effects of unilateral lesion of the nigrostriatal pathway by 6-OHDA on the neuronal activities of the pedunculopontine and the ventrolateral thalamic nucleus. Chin J Appl Physiol ( 中 国 应 用 生 理 学 杂 志 ) 2009; 25(2): (Chinese, English abstract). 10 Paxinos G, Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4th ed. San Diego: Academic Press, 1998, Pessiglione M, Guehl D, Rolland AS, Francois C, Hirsch EC, Féger J, Tremblay L. Thalamic neuronal activity in dopamine-depleted primates: evidence for a loss of functional segregation within basal ganglia circuits. J Neurosci 2005; 25(6): Oueslati A, Breysse N, Amalric M, Kerkerian-Le Goff L, Salin P. Dysfunction of thecortico-basal ganglia-cortical loop in a rat model of early parkinsonism is reversed by metabotropic glutamate receptor 5 antagonism. Eur J Neurosci 2005; 22 (11): Breit S, Lessmann L, Unterbrink D, Popa RC, Gasser T, Schulz JB. Lesion of the pedunculopontine nucleus reverses hyperactivity of the subthalamic nucleus and substantia nigra pars reticulata in a 6-hydroxydopamine rat model. Eur J Neurosci 2006; 24(8): Ainge JA, Jenkins TA, Winn P. Induction of c-fos in specific thalamic nuclei following stimulation of the pedunculopontine tegmental nucleus. Eur J Neurosci 2004; 20(7): Han JS ( 韩 济 生 ). Neuroscience. 3rd ed. Beijing: Peking University Medical Press, 2009, (Chinese). 16 Warren NM, Piggott MA, Lees AJ, Burn DJ. Muscarinic receptors in the thalamus in progressive supranuclear palsy and other neurodegenerative disorders. J Neuropathol Exp Neurol 2007; 66(5): Hamani C, Dostrovsky JO, Lozano AM. The motor thalamus in neurosurgery. Neurosurgery 2006; 58(1):

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