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1 第 35 卷 第 2 期 西 南 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ) 2013 年 2 月 Vol.35 No.2 JournalofSouthwestUniversity (NaturalScienceEdition) Feb 文 章 编 号 : (2013) 澳 洲 坚 果 花 粉 母 细 胞 减 数 分 裂 观 察 孔 广 红, 柳 觐, 倪 书 邦, 贺 熙 勇 云 南 省 热 带 作 物 科 学 研 究 所, 云 南 景 洪 摘 要 : 采 用 压 片 法 观 察 了 澳 洲 坚 果 花 粉 母 细 胞 (PMC) 减 数 分 裂 的 完 整 过 程, 证 实 澳 洲 坚 果 PMC 减 数 分 裂 始 于 12 月 份, 其 减 数 分 裂 进 程 与 单 花 大 小 有 密 切 关 系, 且 同 一 花 蕾 甚 至 同 一 花 药 中 表 现 不 同 步. 减 数 分 裂 双 线 期 历 时 时 间 长 且 形 态 多 样, 可 于 终 变 期 中 期 Ⅰ 后 期 Ⅰ 以 及 后 期 Ⅱ 观 察 到 染 色 体 数 目 和 结 构. 澳 洲 坚 果 PMC 减 数 分 裂 过 程 中 无 染 色 体 结 构 和 数 目 的 变 异, 属 二 倍 体 的 标 准 分 裂 进 程. 关 键 词 : 澳 洲 坚 果 ; 花 粉 母 细 胞 ; 减 数 分 裂 ; 染 色 体 中 图 分 类 号 :S664.9 文 献 标 志 码 :A 澳 洲 坚 果 (Macadamiaspṗ ) 系 山 龙 眼 科 (Proteaceae) 澳 洲 坚 果 属 (MacadamiaF.Muel.) 多 年 生 常 绿 乔 木 果 树, 原 产 于 澳 大 利 亚 昆 士 兰 东 南 部 和 新 南 威 尔 士 东 北 部 沿 岸 的 亚 热 带 雨 林 地 区 ( 南 纬 25 ~32 ) [1], 因 其 营 养 丰 富, 口 感 极 佳, 备 受 消 费 者 青 睐. 我 国 自 20 世 纪 70 年 代 末 开 始 澳 洲 坚 果 的 引 种 和 试 种. 随 着 引 [2-3] 种 和 试 种 的 成 功, 澳 洲 坚 果 在 我 国 得 到 快 速 发 展. 据 农 业 部 统 计,2011 年 全 国 澳 洲 坚 果 种 植 面 积 2.19 万 hm 2, 总 产 量 t. 其 中, 云 南 省 达 2.14 万 hm 2, 产 量 t. 但 云 南 省 澳 洲 坚 果 的 平 均 产 量 低 于 750kg/hm 2, 与 国 外 平 均 1500~1800kg/hm 2 的 产 量 相 比, 存 在 较 大 差 异. 单 位 面 积 产 量 偏 低 是 目 [4-5] 前 制 约 我 国 澳 洲 坚 果 产 业 健 康 发 展 的 主 要 问 题 之 一. 影 响 澳 洲 坚 果 产 量 的 因 素 很 多, 比 如 品 种 栽 培 管 理 技 术 环 境 因 素 等, 花 器 的 发 育 是 否 正 常 也 有 可 能 影 响 到 产 量 的 形 成, 然 而 在 这 方 面 缺 乏 研 究. 笔 者 通 过 压 片 法 对 澳 洲 坚 果 花 粉 母 细 胞 (PMC) 减 数 分 裂 过 程 进 行 观 察, 以 期 在 细 胞 学 水 平 描 述 澳 洲 坚 果 减 数 分 裂 的 完 整 过 程, 并 进 一 步 探 讨 澳 洲 坚 果 花 器 发 育 对 产 量 形 成 的 影 响. 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 选 取 澳 洲 坚 果 品 种 Ownchoice(O.C) 为 供 试 材 料, 该 品 种 由 澳 大 利 亚 选 育, 在 云 南 种 植 表 现 良 好, 产 量 高 且 稳 定, 并 于 2011 年 12 月 获 云 南 省 林 木 品 种 审 定 委 员 会 审 定. 试 验 材 料 花 序 于 2011 年 12 月 下 旬 采 自 云 南 省 热 带 作 物 科 学 研 究 所 澳 洲 坚 果 品 比 试 验 区 16 年 生 优 良 植 株. 1.2 方 法 [6] 澳 洲 坚 果 PMC 减 数 分 裂 采 用 乙 酸 铁 矾 苏 木 精 染 色 法. 具 体 步 骤 如 下 : 固 定 卡 诺 氏 固 定 液 ( 无 水 乙 醇 与 乙 酸 体 积 比 3 1) 加 铁 矾 配 成 过 饱 和 溶 液, 取 上 清 液 使 用. 于 2011 年 12 月 下 旬 某 晴 天 上 午 采 取 20 个 花 序, 置 入 已 配 好 的 过 饱 和 液, 使 花 序 全 浸 入 过 饱 和 溶 液, 待 固 定 至 花 序 微 黑, 取 出 花 序 置 于 70% 酒 精 中 4 冰 箱 保 存 备 用 软 化 取 出 3~5 个 已 固 定 好 的 花 序, 于 50% 乙 酸 中 软 化 1~2d 压 片 将 软 化 后 的 花 序 取 出, 放 置 于 滤 纸 上, 吸 除 花 序 中 的 50% 乙 酸. 用 解 剖 针 和 镊 子 剥 去 萼 片, 取 出 花 药, 1 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 农 业 部 热 带 作 物 种 质 资 源 保 护 项 目 (12RZZY 14); 云 南 省 重 点 新 产 品 种 开 发 计 划 项 目 (2009BB005); 云 南 省 应 用 基 础 研 究 计 划 面 上 项 目 (2011FB140); 云 南 省 技 术 创 新 人 才 培 养 对 象 培 养 项 目 (2012HB082) 基 金 资 助. 作 者 简 介 : 孔 广 红 (1986 ), 女, 云 南 临 沧 人, 研 究 实 习 员, 主 要 从 事 热 带 果 树 选 育 种 和 栽 培 技 术 研 究. 通 信 作 者 : 贺 熙 勇, 副 研 究 员.

2 2 西 南 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 35 卷 将 花 药 置 于 洁 净 的 载 玻 片 上, 加 1 滴 乙 酸 铁 矾 苏 木 精 染 色 液 染 色 3 min, 然 后 用 镊 子 轻 轻 挤 压 花 药, 使 PMC 从 切 口 逸 出, 接 着, 用 镊 子 把 药 壁 残 片 拣 干 净, 加 盖 玻 片, 在 盖 玻 片 上 加 一 层 滤 纸, 用 拇 指 紧 压, 可 稍 微 用 力 镜 检 光 学 显 微 镜 (LeicaDM4000) 下 观 察 并 拍 照. 2 结 果 与 分 析 2.1 澳 洲 坚 果 花 蕾 大 小 与 PMC 减 数 分 裂 的 关 系 由 于 澳 洲 坚 果 花 蕾 直 径 很 小, 不 易 把 握, 故 以 花 蕾 长 度 为 计 量 标 准, 其 中 包 括 花 柄 长 度. 澳 洲 坚 果 花 蕾 长 度 可 达 12mm, 而 只 有 选 择 大 小 合 适 的 花 蕾 才 可 以 观 察 到 澳 洲 坚 果 PMC 的 减 数 分 裂 过 程. 花 蕾 长 度 在 1.63~3.25mm 之 间, 才 适 于 澳 洲 坚 果 PMC 减 数 分 裂 的 观 察 ( 表 1). 表 1 澳 洲 坚 果 PMC 减 数 分 裂 时 期 的 花 蕾 长 度 减 数 分 裂 时 期 母 细 胞 时 期 细 线 期 其 他 时 期 四 分 孢 子 单 核 花 粉 花 蕾 长 度 /mm 1.03~ ~ ~ ~ ~3.52 由 表 1 可 知, 减 数 分 裂 过 程 与 花 蕾 长 度 有 一 定 的 相 关 性, 当 花 蕾 长 度 为 1.63~2.25 mm 时,PMC 只 处 于 细 线 期, 当 花 蕾 长 度 超 过 3.25mm 时, 减 数 分 裂 已 结 束, 大 多 已 经 为 单 核 花 粉. 同 时 还 发 现, 同 一 花 蕾 中 不 同 花 药 内 澳 洲 坚 果 PMC 减 数 分 裂 进 程 具 有 不 同 步 性 ( 图 1). 在 减 数 分 裂 的 所 有 时 期 中, 双 线 期 停 留 的 时 间 最 长, 且 形 态 多 样. 1. 双 线 期 和 粗 线 期 ;2. 双 线 期 和 中 期 Ⅰ;3. 双 线 期 和 后 期 Ⅰ. 图 1 同 一 花 蕾 不 同 时 期 减 数 分 裂 相 2.2 澳 洲 坚 果 花 粉 母 细 胞 减 数 分 裂 观 察 减 数 第 一 次 分 裂 细 线 期 : 染 色 质 凝 集, 呈 细 长 的 单 线 状, 常 绕 成 比 较 紧 密 的 一 团, 偏 于 核 膜 的 一 侧 ( 图 2-1). 偶 线 期 : 同 源 染 色 体 配 对 联 会, 故 染 色 体 比 细 线 期 明 显 增 粗, 而 且 染 色 体 也 明 显 松 散 开 来, 位 于 细 胞 中 央 ( 图 2-2). 粗 线 期 : 开 始 于 同 源 染 色 体 配 对 完 成 之 后, 配 对 或 联 会 的 染 色 体 随 着 螺 旋 化 的 加 强 而 明 显 缩 短 变 粗 并 相 互 缠 绕 ( 图 2-3). 双 线 期 : 染 色 体 重 组 阶 段 结 束, 组 成 二 价 体 的 两 条 同 源 染 色 体 发 生 互 斥 作 用 彼 此 分 离, 仅 留 几 处 相 互 联 系, 形 成 交 叉 结. 此 时 已 可 以 分 清 二 价 体 首 尾 ( 图 2-4~8). 双 线 期 的 形 态 多 样, 且 持 续 时 间 长, 往 往 于 同 一 张 制 片 中 与 其 他 时 期 同 时 出 现 ( 图 1). 终 变 期 : 二 价 体 高 度 浓 缩, 中 间 交 叉 数 减 少, 交 叉 移 端, 核 仁 消 失.14 个 二 价 体 无 规 则 地 分 散 于 核 膜 内 缘, 表 现 为 V 型 X 型 棒 状 和 点 状 ( 图 ). 中 期 Ⅰ: 核 膜 核 仁 消 失,14 个 二 价 体 排 列 于 赤 道 板 ( 图 2-11~13). 从 细 胞 侧 面 观 察, 染 色 体 在 赤 道 板 上 排 成 一 列 ( 图 2-11), 从 细 胞 极 面 观 察 染 色 体 整 齐 排 列 在 赤 道 板 上 ( 图 2-12). 后 期 Ⅰ: 同 源 染 色 体 受 纺 锤 丝 的 牵 引 分 离, 标 志 着 减 数 分 裂 后 期 Ⅰ 的 开 始. 被 均 匀 拉 向 两 极 的 同 源 染 色 体 均 含 两 条 姐 妹 染 色 单 体. 由 于 分 开 的 是 半 个 二 价 体, 其 染 色 体 形 态 并 不 规 则, 也 更 显 浓 缩. 部 分 细 胞 染 色 体 高 度 浓 缩 成 为 鉴 定 澳 洲 坚 果 染 色 体 数 目 的 绝 佳 时 期 ( 图 ), 此 时 可 清 晰 观 察 到 28 个 同 源 染 色 体. 末 期 Ⅰ: 移 至 两 极 的 染 色 体 的 个 体 性 逐 渐 消 失, 有 的 松 散 变 细 逐 渐 成 为 染 色 质 ( 图 2-16) 或 聚 集 成 不 规 则 的 团 块 ( 图 2-17).

3 第2期 孔广红,等:澳洲坚果花粉母细胞减数分裂观察 3

4 4 西南大学学报(自然科学版) //xbb h t t b.swu.cn p: j 第 35 卷 1:细线期;2:偶线期;3:粗线期;4~8:双线期;9:终变期(早);10:终变期(晚);11~13:中期 Ⅰ ;14 15:后期 Ⅰ ;16 17:末期 Ⅰ ; 18:前期 Ⅱ ;19 20:中期 Ⅱ ;21 22:后期 Ⅱ (纺锤体垂直排列);23:后期 Ⅱ (纺锤体平行排列);24:末期 Ⅱ ;25 26:四分体;27:单核 花粉. 图 2 澳洲坚果减数分裂过程 减数第二次分裂 前期 Ⅱ :核内的染色体浓缩变粗,着丝点仍有连接,并且核仁重新出现(图 2 18). 中期 Ⅱ :两组染色体各自排列在赤道面上,形成不同的空间结构,两个平行的纺锤体(图 2 19)和 两 个 [ 7] 相互倾斜的纺锤体 (图 2 20). 后期Ⅱ:姐妹染色单体从着丝点处分开,在纺锤丝的牵引下分别移向两极(图 2 21~23).而且染色体高度 浓缩,分散开来,部分 PMC 成为染色体计数的另一个最佳时期,可观察到 56 条姐妹染色单体(图 2 23). ) 末期 Ⅱ :形成仅含半数染色体的 4 个子核(图 四分孢子:核仁重新出现,单倍染色体分散在核仁 周 围.有 四 面 体 形 的 四 分 体(图 2 25),也 有 四 角 形 ) 的四分体(图 讨 论 3.1 澳洲坚果 PMC 减数分裂进程不同步的原因 澳洲坚果 PMC 减数分裂过程中有多个分裂相于同一制片(即同一花蕾)中 同 时 出 现.这 可 能 是 因 为 澳 洲坚果的每个花蕾有 4 枚花药,而各个花药的生长发育不同步造成的.也有可能是因为同一花药不同 PMC 的生长发育不同步造成的.澳洲坚果 PMC 减数分 裂 进 程 的 不 同 步 性 延 长 了 花 期,增 加 了 雌 雄 配 子 授 粉 受 精的时间,对其种群繁衍后代有利 [8],同时也可提高澳洲坚果的结实率.虽然,澳洲坚果 PMC 减数分裂进 程不同步,但这并未影响花粉粒的形成.根据实验观察,大部分 PMC 最后均完成减数分裂形成花粉粒,这 一现象与唐宇等的研究相一致 [9]. 3.2 澳洲坚果 PMC 减数分裂双线期 澳洲坚果 PMC 减数分裂双线期停留的时间长,且形态多样,这在其他作物中尚未见报道.值得注意的 是,图 2 的 4~6 从形态看酷似弥散双线期.在此时期,二价体变为弥散状,碱性染料不易着色,形态上看 似为细线期的早期阶段,故称之为弥散双线期.关于弥散双线期的生物学意义目前尚处于推测阶段 [10].已

5 第 2 期 孔 广 红, 等 : 澳 洲 坚 果 花 粉 母 细 胞 减 数 分 裂 观 察 5 [10] [11] [12] 经 在 一 些 物 种 中 观 察 到 了 弥 散 双 线 期, 例 如 红 皮 云 杉 华 北 落 叶 松 冷 杉 等. 云 南 西 双 版 纳 雨 季 和 旱 季 交 替 很 明 显, 从 头 年 的 10 月 甚 至 到 次 年 的 5 月 可 能 都 无 降 水. 澳 洲 坚 果 于 冬 季 进 入 花 芽 分 化, 此 时 正 处 于 旱 季, 且 温 度 较 低. 长 期 干 旱 加 上 低 温 气 候 可 能 是 导 致 澳 洲 坚 果 PMC 减 数 分 裂 多 种 双 线 期 形 态 出 现 的 根 本 原 因, 也 是 澳 洲 坚 果 对 于 恶 劣 环 境 条 件 的 一 种 适 应. 3.3 鉴 定 澳 洲 坚 果 染 色 体 数 目 的 最 佳 时 期 一 般 认 为 PMC 减 数 分 裂 染 色 体 计 数 于 终 变 期 为 最 佳 时 期, 本 研 究 却 发 现 有 4 个 时 期 可 以 清 晰 地 观 察 到 澳 洲 坚 果 染 色 体 数 目, 分 别 为 终 变 期 中 期 Ⅰ 后 期 Ⅰ 后 期 Ⅱ. 其 中 终 变 期 和 中 期 Ⅰ 可 以 观 察 到 14 个 二 价 体, 且 二 价 体 的 构 型 有 X 型 V 型 点 状 和 棒 状. 而 在 后 期 Ⅰ 能 够 清 晰 的 观 测 到 28 条 同 源 染 色 体, 后 期 Ⅱ 则 能 观 察 到 56 条 姐 妹 染 色 单 体. 3.4 澳 洲 坚 果 PMC 减 数 分 裂 过 程 与 澳 洲 坚 果 结 实 率 低 的 关 系 张 守 攻 等 认 为 PMC 减 数 分 裂 过 程 中 染 色 体 变 异 通 常 引 起 雄 配 子 体 遗 传 物 质 缺 失 重 复 等, 从 而 引 起 [10] 花 粉 畸 形 不 育 甚 至 死 亡, 这 可 能 造 成 作 物 结 实 率 偏 低. 本 试 验 中, 澳 洲 坚 果 PMC 减 数 分 裂 过 程 中 并 没 有 观 察 到 染 色 体 结 构 和 数 目 的 变 异 现 象, 且 澳 洲 坚 果 PMC 减 数 分 裂 进 程 属 二 倍 体 的 标 准 分 裂 进 程, 说 明 澳 洲 坚 果 结 实 率 低 并 不 是 因 为 PMC 减 数 分 裂 过 程 中 染 色 体 变 异 造 成 的. 参 考 文 献 : [1] RUSSSTEPHENSON.Macadamia:DomesticationandCommercialization[J].ChronicaHorticulture,2005,45(2): [2] 陈 作 泉, 李 仍 然, 胡 继 胜, 等. 澳 洲 坚 果 引 种 试 种 研 究 初 报 [J]. 热 带 作 物 学 报.1995,16(2): [3] 贺 熙 勇, 倪 书 邦, 陈 丽 兰, 等. 一 些 澳 洲 坚 果 品 种 在 云 南 的 早 期 表 现 [J]. 云 南 热 作 科 技,2002,25(3):1-8. [4] 贺 熙 勇, 陶 丽, 倪 书 邦, 等.15 个 澳 洲 坚 果 品 种 在 云 南 的 产 量 及 品 质 [J]. 热 带 作 物 学 报,2009,30(10): [5] 陆 超 忠, 曾 辉, 陈 作 泉, 等. 澳 洲 坚 果 主 要 引 进 品 种 产 量 和 品 质 的 研 究 [J]. 热 带 作 物 学 报,2000,21(2): [6] 李 懋 学, 张 敩 方. 植 物 染 色 体 研 究 技 术 [M]. 哈 尔 滨 : 东 北 林 业 大 学 出 版 社,1991: [7] 万 双 粉, 张 蜀 宁, 张 杰. 青 花 菜 花 粉 母 细 胞 减 数 分 裂 及 雄 配 子 体 发 育 [J]. 西 北 植 物 学 报,2006,26(5): [8] 张 彩 霞, 明 军, 李 博 生. 百 合 花 粉 母 细 胞 减 数 分 裂 及 其 雄 配 子 体 发 育 观 测 [J]. 生 物 学 通 报,2009,44(10): [9] 唐 宇, 吕 淑 霞, 王 桂 香, 等. 黑 芥 与 花 椰 菜 体 细 胞 杂 种 花 粉 母 细 胞 的 减 数 分 裂 不 同 步 及 染 色 体 行 为 异 常 [J]. 基 因 组 学 与 应 用 生 物 学,2009,28(6): [10] 张 守 攻, 韩 素 英, 杨 文 华, 等. 红 皮 云 杉 花 粉 母 细 胞 减 数 分 裂 和 花 粉 发 育 的 研 究 [J]. 园 艺 学 报,2009,36(7): [11] 张 守 攻, 杨 文 华, 李 懋 学, 等. 华 北 落 叶 松 小 孢 子 母 细 胞 (PMC) 减 数 分 裂 和 花 粉 的 发 育 [J]. 植 物 分 类 学 报,2007, 45(4): [12]MERGENF,LESTERD.MicrosporogenesisinAbies[J].SilvaeGenetica,1961(10): MicroscopicObservationofMeiosisof MacadamiaPolen MotherCels KONG Guangẖong, LIU Jin, NIShuḇang, HEXi-yong YunnanInstituteofTropicalCrops,JinghongYannan666100,China Abstract:ThecompleteprocessofmeiosisofMacadamiapolen mothercels(pmc)wasinvestigated,usingthesquashingtechnique.ourresultsshowedthatmeiosisofmacadamiastartedindecemberandthe meiosisprocesswascloselycorrelatedwiththebudlength,anddiferenceinthestagesofmeiosiswasoḇ servedinsamebudandinthesameanther.diplotenelastedforalongtimeandpresented manyshapes. ThenumberandstructureofMacadamiachromosomecouldbeobservedclearlyinthestagesofdiakmesis,metaphaseI,anaphaseIandanaphase I.NovariationinnumberandstructureweredetectedofMacadamiachromosomesinmeiosis,whichwasatypicaldivisionprocessofdiploidspecies. Keywords:Macadamiaspṗ ;polenmothercel;meiosis;chromosome 责 任 编 辑 欧 宾

6 6 西 南 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 35 卷

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