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钮牛
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1 Vol. 33 高等学校化学学报 No 年 2 月摇摇摇摇摇摇 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 摇摇摇摇摇摇 308 ~ 312 海地瓜蛋白水解物中 ACE 抑制肽的分离纯化及合成赵元晖 1, 李八方 1, 马敬军 2, 董士远 1, 刘尊英 1 1, 曾名湧 (1. 中国海洋大学食品科学与工程学院, 青岛 ; 2. 中国检验认证集团山东有限公司, 青岛 ) 摘要摇采用 Sephadex G 鄄 25 凝胶柱层析 SP Sephadex C 鄄 25 阳离子交换层析和反相高效液相色谱等方法对海地瓜水解产物进行分离纯化, 得到了一种新的强活性 ACE 抑制肽, 其氨基酸序列为 MEGAQEAQGD, IC 50 值为 15 郾 9 滋 mol / L. 采用逐步缩合和片段缩合的方法对该抑制肽进行了设计合成. 合成肽的纯度为 99 郾 72%, 分子量与序列结构均与理论值相符. 研究发现, 抑制肽与胃蛋白酶和糜蛋白酶水解反应后, 活性增强了 3 郾 5 倍. 动物实验结果表明, 剂量为 3 滋 mol / kg 的抑制肽对大鼠自发性高血压具有明显的降压效果. 关键词摇海地瓜 ; ACE 抑制肽 ; 分离纯化中图分类号摇 O629 郾 72 摇摇摇摇文献标识码摇 A 摇摇摇摇 DOI: / j. issn 鄄海地瓜 ( Acaudina molpadioides Semper) 俗称香参, 也称为海茄子, 盛产于亚热带沙质海区, 在日本菲律宾印度尼西亚及我国山东到海南岛的海域均有分布, 资源丰富. 海地瓜含有丰富的氨基酸和有益于人体的多种微量元素及维生素, 这为进一步开发利用海地瓜资源提供了一定的科学依据. 目前, 我国的高血压病发病率呈逐年上升趋势, 已成为仅次于肿瘤的第二大疾病, 不仅严重威胁人们的生命安全, 而且严重影响我国社会经济的发展. 这就要求人们不仅要有高效的治疗药物, 还要从预防高血压做起 [1,2] [3 ~. 目前已有不少有关酶解食物蛋白制备具有 ACE 抑制活性肽的研究报道 5]. 来自于 [6 ~ 纯天然食物蛋白质的 ACE 抑制肽对正常血压无影响并且安全可靠 8]. 本文利用凝胶柱层析阳离子交换层析反相高效液相色谱等纯化技术从海地瓜蛋白酶解物中分离出具有高活性的 ACE 抑制肽, 应用纳升电喷雾鄄四极杆鄄飞行时间串联质谱 ( Nano 鄄 ESI 鄄 Ms / Ms) 技术, 对活性肽进行结构鉴定, 并采用逐步缩合和片段缩合相结合的方法对该肽进行了设计合成. 这不仅可以提高海地瓜的综合利用价值, 还可以通过对降压机理及肽结构的深入研究为提取或合成高血压治疗药物提供实验基础. 1 摇实验部分 1. 1 摇试剂与仪器海地瓜购于青岛市天桥综合超市, 冷冻制品, 湿重平均每只 25 g, 去除内脏洗净备用 ; 雄性自发性高血压大鼠 (SHR, SPF), 每只 280 ~ 300 g, 购于上海斯莱克斯实验动物有限公司 ; 马尿酰鄄组氨酰鄄亮氨酸菠萝蛋白酶 ACE 酶胃蛋白酶胰蛋白酶和糜蛋白酶为 Sigma 公司产品 ; Alcalase 2 郾 4L 酶 ( 丹麦诺维信公司 ); SP Sephadex C 鄄 25 和 Sephadex G 鄄 25( Phamacia 公司 ); 氨基酸 Boc 鄄 Met 鄄 OH, Fmoc 鄄 Glu(OtBu) 鄄 OH, Boc 鄄 Gly 鄄 OH, H 鄄 Ala 鄄 OBzl ToSH, Fmoc 鄄 Gln(Trt) 鄄 OH 和 H 鄄 Asp(OBzl) 2 ToSH, 缩合剂 DCC, EDC, HOAt 和 HOBt 以及缚酸剂 NMM 均购自上海吉尔生化公司. 高效液相色谱仪 ( 美国 Agilent 公司 ); JNM 鄄 ECP 600 核磁共振谱仪 ( 日本 JEOL 公司 ); Nexus 670 型傅里叶变换红外 / 拉曼光谱仪 ( 美国 Nicolet 公司 ); HP5890 鄄 HP5971A 色谱质谱联用仪 ( 美国惠普公司 ). 收稿日期 : 2011 鄄 02 鄄 23. 基金项目 : 国家自然科学基金 ( 批准号 : ) 和山东省自然科学基金 ( 批准号 : ZR2010CQ001) 资助. 联系人简介 : 曾名湧, 男, 博士, 教授, 主要从事水产品高值化利用研究. E 鄄 mail: mingyz@ mail. ouc. edu. cn 赵元晖, 男, 博士, 讲师, 主要从事海洋生物活性物质研究. E 鄄 mail: zhaoyuanhui@ ouc. edu. cn

2 摇 No. 2 摇赵元晖等 : 海地瓜蛋白水解物中 ACE 抑制肽的分离纯化及合成摇实验过程摇体壁蛋白的提取摇参照文献 [9,10] 方法并进行了改进. 将海地瓜体壁加入蒸馏水打成碎块, 用 8 倍体积 0 郾 05 mol / L 的 NaOH 溶液搅拌过夜, 去除 NaOH 溶液, 残渣用蒸馏水冲洗至中性, 加入蒸馏水打浆, 于 45 益恒温搅拌抽提 8 h, 离心 (10000 r / min, 20 min) 分离得热水溶性蛋白溶液摇酶解液的制备摇以海地瓜蛋白 ( 配制成浓度为 0 郾 01 g / ml 的溶液 ) 为原料, 先采用菠萝蛋白酶 (45 益, ph = 7 郾 0, 加酶量为海地瓜蛋白质量的 1 郾 0% ) 对其进行水解 4 h, 再用 Alcalase 蛋白酶 (55 益, ph = 7 郾 4, 加酶量为海地瓜蛋白质量的 2 郾 0% ) 水解 2 h. 所得复合酶水解液经过 2000 分子量的膜超滤, 得到了分子量大于或小于 2000 的 2 种超滤组分摇 ACE 抑制肽活性的测定摇参照文献 [11] 方法测定 ACE 抑制肽的活性摇 ACE 抑制肽的分离纯化摇将海地瓜酶解液 ( 分子量小于 2000) 用 Sephadex G 鄄 25 凝胶柱 (1 郾 6 cm 伊 30 cm) 进行分离纯化. 洗脱液为双蒸水, 洗脱速度 0 郾 6 ml / min, 在 220 nm 下收集各峰. 取活性最高的组分用 SP Sephadex C 鄄 25 阳离子交换柱 (2 郾 6 cm 伊 30 cm) 进一步分离纯化, 平衡液为 20 mmol / L 的醋酸缓冲液 (ph = 4 郾 0), 用含 NaCl(0 ~ 1 mol / L) 的醋酸缓冲液进行线性梯度洗脱, 洗脱速度 0 郾 6 ml / min, 检测波长 220 nm. 所得高活性组分用 Sephadex G 鄄 25 凝胶柱 (1 郾 6 cm 伊 100 cm) 脱盐, 洗脱液为双蒸水, 洗脱速度 0 郾 6 ml / min. 将脱盐后的高活性样品用反相高效液相色谱 C 18 半制备柱 (9 郾 4 mm 伊 250 mm) 纯化以体积分数为 10%~ 30% 的乙腈梯度洗脱 30 min, 洗脱速度 0 郾 8 ml / min, 柱温 30 益. 在 220 nm 下收集主峰, 检测活性, 得到活性肽摇 ACE 抑制肽结构的鉴定摇将纯化得到的 ACE 抑制肽用 Q_TOF2 电喷雾四极杆正交加速鄄飞行时间串联质谱 ( 英国 Micromass 公司 ) 进行测序摇 ACE 抑制肽的设计合成摇海地瓜 ACE 抑制肽 (MEGAQEAQGD) 通过多步氨基酸及肽片段缩合而成. 将该十肽片段裂分为 2 个三肽片段 QGD 和 QEA 以及 1 个四肽片段 MEGA, 总体合成策略为 (3+ 3+4) 片段缩合. 将氨基酸或肽片段溶于有机溶剂体系中, 冰浴降温后加入缚酸剂 NMM, 10 min 后依次加入氨基酸或肽片段复合缩合剂, 先在冰浴下反应, 再逐渐升至室温, 反应过夜. 加入乙酸乙酯 (EtOAc) 稀释反应液, 然后依次用 10% 柠檬酸 5% NaHCO 3 溶液水及饱和食盐水洗涤, 有机相经干燥减压浓缩后用硅胶柱层析, 得肽产物片段. 将肽产物片段脱去 N 端或 C 端保护基进行下一步缩合反应, 直到获得全保护十肽. 全保护十肽经 Pd / C 氢解脱除苄基, TFA / DCM 脱除 Boc 和侧链保护基, 再经液相纯化后得海地瓜 ACE 抑制肽摇 ACE 对活性肽稳定性的影响摇将 ACE 抑制肽与 ACE(50 mu) 溶解在硼酸缓冲液中, 在 37 益水浴下反应 3 h, 通过对比反应前后 ACE 抑制肽的活性 (IC 50 ) 来判断 ACE 对活性肽稳定性的影响摇胃肠蛋白酶对活性肽稳定性的影响摇 ACE 抑制活性肽 (1 mg / ml) 连续与胃蛋白酶 ( ph = 2 郾 5, 37 益, 2 郾 5 h) 糜蛋白酶 (ph = 8 郾 0, 37 益, 1 h) 和胰蛋白酶 (ph = 8 郾 0, 55 益, 1 h) 进行反应, 通过测定各阶段水解液 ACE 抑制活性来判断胃肠蛋白酶对活性肽稳定性的影响摇活性肽在自发性高血压大鼠体内的降压效果摇将大鼠随机分为给药组阳性对照组 ( 卡托普利 ) 和阴性对照组 ( 生理盐水 ). 给药组灌胃海地瓜 ACE 抑制活性肽 (3 滋 mol / kg), 阳性对照组灌胃卡托普利 (3 滋 mol / kg), 阴性对照组灌胃生理盐水. 分别在灌胃前和灌胃后的 1 ~ 6 h 内检测每组中高血压大鼠的收缩压摇统计学分析摇应用 Statview 统计处理软件进行统计分析, 结果以平均值依标准偏差 ( Mean values 依 SD) 表示, 采用方差分析 (ANOVA) 进行比较. 实验设 3 ~ 4 个平行样. 2 摇结果与讨论 2. 1 摇 ACE 抑制肽的分离纯化经过超滤后, 分子量小于 2000 的水解液显示出最强的 ACE 抑制活性 (IC 50 值为 0 郾 615 mg / ml). 该水解液经 Sephadex G 鄄 25 凝胶柱分离后, 可得到 5 个峰 [ 图 1(A) 中 a ~ e 峰 ]. 相同蛋白浓度下峰 c 的抑

3 310 高等学校化学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇 Vol. 33 摇制率最大, 收集峰 c 并浓缩, 测得其 IC 50 值为 0 郾 0934 mg / ml. 虽然 5 个峰已被凝胶柱完全分开, 但每个峰并不是单一物质. 对峰 c 组分进一步采用 SP Sephadex C 鄄 25 阳离子交换柱分离纯化, 得到 7 个肽峰 [ 图 1(B)], 其中第 6 个肽峰 ( 遇 ) 显示出最强的 ACE 抑制活性, 其 IC 50 值为 0 郾 05 mg / ml. 脱盐后的峰遇采用反相高效液相色谱 C 18 半制备柱继续纯化, 得到活性肽 P[ 图 1(C)], 其 IC 50 值为 0 郾 0165 mg / ml. Fig. 1 摇 Purification profiles of ACE inhibitory peptide (A) Sephadex G 鄄 25 elution profile; (B) SP Sephadex C 鄄 25 elution profile; (C) RP 鄄 HPLC profile on a Zorbax C 18 semi 鄄 prep column 摇 ACE 抑制肽结构的鉴定采用纳升电喷雾鄄四极杆鄄飞行时间串联质谱 (Nano 鄄 ESI 鄄 Ms / Ms) 对纯化肽 P 进行分析, 经 Mas Seq 软件确认该肽的结构为 MEGAQEAQGD ( 图 2), 精确分子量为 1034 郾 5444 郾经换算, 其 IC 50 值为 15 郾 9 滋 mol / L. [12] Cheung 等研究了蝮蛇毒液肽及其类似物的构效关系, 认为肽 C 末端为酸性氨基酸时, 与 ACE 的亲和力最弱. 事实上, 在 ACE 中有 2 个活性位点, 使其具有广泛的底物和竞争性抑制剂 [13,14]. 一些 C 末端为酸性氨基酸的 ACE 抑制肽已被报道, 如 IVVE [15] ( IC 50 = 315 郾 3 滋 mol / L ), IAE [15] (IC 50 = 34 郾 7 滋 mol / L) 和 MRWRD [16] (IC 50 = 2 郾 1 滋 mol / L) 摇合成肽的分析鉴定 Fig. 2 摇 Sequence profile of purified fraction P 采用反相高效液相色谱 C 18 分析柱测得终产物十肽的纯度为 99 郾 72%. 纯化后的十肽经质谱分析, [M+H] 郾 4, 同位素分子量为 1036 郾 5, 计算其分子量为 1034 郾 4( 图 3), 序列结构为 MEGAQEAQGD ( 图 4), 均与理论值相符. Fig. 3 摇 Mass spectrum of synthesized decapeptide Fig. 4 摇 MS / MS spectrum of synthesized The ion at m / z 1035 郾 4 designated as a molecular cation(m+h) + decapeptide

脱盐后的峰遇采用反相高效液相色谱 C 18 半制备柱继续纯化, 得到活性肽 P[ 图 1(C)], 其 IC 50 值为 0 郾 0165 mg / ml. Fig.

4 摇 No. 2 摇赵元晖等 : 海地瓜蛋白水解物中 ACE 抑制肽的分离纯化及合成 311 利用 MALDI 鄄 TOF 鄄 MS 对经 RP 鄄 HPLC 分离纯化后的十肽峰分析表明, 所得十肽峰组分为单一分子离子峰 ([M+H] + ), 说明所得组分为单一肽. 十肽的 m / z 为 1035 郾 4, 该母离子经 TOF 鄄 TOF 二级质谱分析后, 得到图 4 所示的 MS / MS 图谱. 在十肽的 Fig. 5 摇 MS / MS spectrum analysis of synthesized decapeptide MS / MS 质谱图中出现的 b 型和 y 型碎片离子峰总结于图 5 中. 同时, 在 MS / MS 图谱中也出现了 b 型和 y 型离子的脱水及脱氨峰. 另外, 图谱中还出现了相当于氨基酸脱羧或脱氨而产生的特征峰, 这些特征峰以 m / z = 氨基酸分子量 -45 或分子量 -17 为标志, 它们对确定肽的氨基酸组成具有重要意义摇海地瓜 ACE 抑制肽的特性摇 ACE 对活性肽稳定性的影响摇为了研究 ACE 对抑制肽稳定性的影响, 测定了该肽与 ACE 反应前后的活性. 结果表明, ACE 并未改变抑制肽的活性, 该肽与 ACE 反应前后的 IC 50 值不变 (15 郾 9 滋 mol / L), 所以 ACE 不会影响所得海地瓜 ACE 抑制肽的稳定性摇胃肠蛋白酶对活性肽稳定性的影响摇研究胃肠蛋白酶对活性肽稳定性影响的目的是考察该肽在体内的降压效果. 实验结果表明, 抑制肽与胃肠蛋白酶反应后, 活性发生了变化 ( 表 1). Table 1 摇 ACE inhibitory activity of the peptide following digestion by gastrointestinal proteases Enzyme Pepsin a Pepsin + chymotrypsin b Pepsin + chymotrypsin + trypsin c IC 50 / ( 滋 mol L -1 ) 5 郾 3 4 郾 5 4 郾 5 摇摇 a. Pepsin digestion(2 郾 5 h); b. pepsin digestion(2 郾 5 h) plus further chymotrypsin digestion(1 h); c. trypsin digestion(1 h) after pepsin (2 郾 5 h) and chymotrypsin(1 h) digestion. 由表 1 可见, 当 ACE 抑制肽被胃蛋白酶水解后, 活性增强了 3 倍 (IC 50 值由 15 郾 9 滋 mol / L 变为 5 郾 3 滋 mol / L); 再与糜蛋白酶反应, 抑制肽的活性则增强到原来的 3 郾 5 倍 ( IC 50 值由 15 郾 9 滋 mol / L 变为 4 郾 5 滋 mol / L); 而胰蛋白酶并未改变抑制肽的活性. 抑制肽与胃肠蛋白酶的水解反应增强了其活性, 因此该肽应该是前体药物型的 ACE 抑制剂 [17,18], 推测它在体内可能会有较强的降压效果摇活性肽在自发性高压大鼠体内的降压效果摇通过观测 1 ~ 6 h 内高血压大鼠收缩压的变化, 考察活性肽在大鼠体内的降压效果. 由图 6 可见, 在观测期间, 阴性对照组的收缩压未发生变化. 而给药组灌胃抑制肽 3 h 后, 降压效果最好, 高压大鼠的收缩压从 (26 依 0 郾 2) kpa 下降到 (23 依 0 郾 4) kpa, 且该活性可持续 5 h. 卡托普利组在 1 ~ 4 h 内有明显的降压效果. 口服给药 4 h Fig. 6 摇 Changes in systolic blood pressure of SHR 后, 抑制肽的降压效果明显好于卡托普利 ( P < 0 郾 01). 在体外, 海地瓜 ACE 抑制肽的活性要比合成类药物 ( 卡托普利 ) 弱得多. 但是, 从体内降压 a. Purified ACE inhibitory peptide 3 滋 mol / kg; b. positive control( cap 鄄 topril) 3 滋 mol / kg; c. negative control. Significance of the difference from negative control at ( *) P<0 郾 05, ( **) P<0 郾 01; significance of the difference from positive control at ( 吟 ) P<0 郾 01. 效果来看, 二者活性却相差不多, 而且海地瓜 ACE 抑制肽体内活性持续的时间更长. 相似的结果也出现在一些其它蛋白源的 ACE 抑制肽中 [17], 这可能因为这些肽与合成药物 ( 卡托普利 ) 相比, 与机体组织有着更强的亲和力. 参摇考摇文摇献 [ 1 ] 摇 Kuba M., Tana C., Twata S., Yasuda M.. Process Biochem. [J], 2005, 40: [ 2 ] 摇 Fahmi A., Morimura S., Guo H. C., Shigematsu T., Kida K., Uemura Y.. Process Biochem. [J], 2004, 39: [ 3 ] 摇 LI Xiao 鄄 Hui( 李晓晖 ), YUAN Heng 鄄 Li( 袁恒立 ), HU Jian 鄄 En( 胡建恩 ), XIU Zhi 鄄 Long( 修志龙 ). Chem. J. Chinese Universities( 高等学校化学学报 )[J], 2008, 29(3): [ 4 ] 摇 Nakamura Y., Yamamoto N., Sakai K., Takano T.. J. Dairy Sci. [J], 1995, 78(6):

5 摇 MS / MS spectrum analysis of synthesized decapeptide MS / MS 质谱图中出现的 b 型和 y 型碎片离子峰总结于图 5 中. 同时, 在 MS / MS 图谱中也出现了 b 型和 y 型离子的脱水及脱氨峰.

5 312 高等学校化学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇 Vol. 33 摇 [ 5 ] 摇 Yoshikawa M., Fujita H., Matoba N., Takenaka Y., Yamamoto T., Yamauchi R., Tsuruki H., Takahata K.. Biofactors[J], 2000, 12(4): [ 6 ] 摇 GUAN Xiao( 管骁 ), LIU Jing( 刘静 ), WANG Li( 王立 ), YAO Hui 鄄 Yuan( 姚惠源 ). Chem. J. Chinese Universities( 高等学校化学学报 )[J], 2009, 30(10): [ 7 ] 摇 Li G. H., Le G. W., Shi Y. H., Shrestha S.. Nutri. Res. [J], 2004, 24: [ 8 ] 摇 GUAN Xiao( 管骁 ), YAO Hui 鄄 Yuan( 姚惠源 ). J. Chinese Cereals and Oils Association( 中国粮油学报 )[J], 2007, 22: [ 9 ] 摇 Jamilan B., Harvinder K. G.. Food Chemistry[J], 2002, 77: [10] 摇 Sato K., Yoshinaka R., Sato M.. Nippon Suisa Gakkaishi[J], 1987, 53(8): [11] 摇 ZHAO Yuan 鄄 Hui( 赵元晖 ), LI Ba 鄄 Fang( 李八方 ), LIU Yi 鄄 Jie( 刘艺杰 ), GENG Juan( 耿娟 ), ZENG Ming 鄄 Yong( 曾名湧 ). Chinese Journal of Marine Drugs( 中国海洋药物 )[J], 2009, 28(4): 5 8 [12] 摇 Cheung H. S., Cushman D. W.. Biochimica et Biophysica Acta[J], 1973, 293: [13] 摇 Perich R. B., Jackson B., Rogerson F. M., Mendelsohn F. A. O., Johnston C. I.. Molecular Pharmacology[ J], 1992, 42: [14] 摇 Wei L., Alhenc 鄄 Gelas F., Corvol P., Claver E.. Journal of Biological Chemistry[J], 1991, 266: [15] 摇 Suetsuna K., Chen J. R.. Marine Biotechnology[J], 2001, 3: [16] 摇 Yang Y. J., Yoshikawa M.. Chinese Journal of Chromatography[J], 2003, 21(3): [17] 摇 Fujita H., Yokoyama K., Yoshikawa M.. J. Food Science[J], 2000, 65: [18] 摇 Fujita H., Yoshikawa M.. Immunopharmacology[J], 1999, 44: Purification and Synthesis of ACE Inhibitory Peptide from Acaudina molpadioidea Protein Hydrolysate ZHAO Yuan 鄄 Hui 1*, LI Ba 鄄 Fang 1, MA Jing 鄄 Jun 2, DONG Shi 鄄 Yuan 1, LIU Zun 鄄 Ying 1, ZENG Ming 鄄 Yong 1* (1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao , China; 2. China Certification and Inspection Group Shandong Co. Ltd., Qingdao , China) Abstract 摇 A novel ACE inhibitory peptide was isolated from the sea cucumber ( Acaudina molpadioidea) hydrolysate using the chromatographic methods including gel filtration, ion 鄄 exchange chromatography and reversed phase high 鄄 performance liquid chromatography. The purified ACE inhibitory peptide was sequenced as MEGAQEAQGD, with a IC 50 value of 15 郾 9 滋 mol / L. The ACE inhibitory peptide was synthesized by a method of gradual condensation and fragmental condensation. The purity of the decapeptide was 99 郾 72%, and the molecular weight and sequence structure of the decapeptide equate with the fact. It was found that the in 鄄 hibitory activity of the peptide was intensified by 3 郾 5 times after incubation with pepsin and chymotrypsin. The ACE inhibitory peptide from Acaudina molpadioidea showed a clear antihypertensive effect on spontaneously hypertensive rats(shr), at a dosage of 3 滋 mol / kg. Keywords 摇 Acaudina molpadioidea; ACE inhibitory peptide; Isolation and purification (Ed. : H, J, K)

H., Le G. W., Shi Y. H., Shrestha S.. Nutri. Res. [J], 2004, 24: 469 486 [ 8 ] 摇 GUAN Xiao( 管骁 ), YAO Hui 鄄 Yuan( 姚惠源 ). J.

说明为了反映教运行的基本状态, 为校和院制定相关政策和进行教建设与改革提供据依据, 校从程资源 ( 开类别开量规模 ) 教师结构程考核等维度, 对 2015 年春季期教运行基

说明为了反映教运行的基本状态, 为校和院制定相关政策和进行教建设与改革提供据依据, 校从程资源 ( 开类别开量规模 ) 教师结构程考核等维度, 对 2015 年春季期教运行基内部资料东北师范大教运行基本状态据报告 2015 年春季期教务处 2015 年 10 月 27 日说明为了反映教运行的基本状态, 为校和院制定相关政策和进行教建设与改革提供据依据, 校从程资源 ( 开类别开量规模 ) 教师结构程考核等维度,