B2 临床微生物 Clinical Microbiology 责任编辑 程敬伟 我国常见非白念珠菌抗真菌药物敏感性分析 新发现橡树念珠菌致感染的证据 据 JAntimicrob Chemother 对较低 对氟康唑和伏立康唑的敏感 据 J Clin Microbiol 2014年 质进行分析 采用引

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2 B2 临床微生物 Clinical Microbiology 责任编辑 程敬伟 我国常见非白念珠菌抗真菌药物敏感性分析 新发现橡树念珠菌致感染的证据 据 JAntimicrob Chemother 对较低 对氟康唑和伏立康唑的敏感 据 J Clin Microbiol 2014年 质进行分析 采用引物RAPD24和 2014年12月报道 题 中国引起侵袭性 性分别为88.4%和90.5% 且7.1%的热 1月报道 题 三例由橡树念珠菌引 RAPD1283进行随机扩增DNA多态 念珠菌病的非白念珠菌抗真菌药物的敏 带念珠菌出现唑类交叉耐药 近14.3% 起的念珠菌血症的发现及其真菌学 性分析 通过与基因库中的橡树念 感性分析 3年全国监测数据 作者Xiao 的光滑念珠菌对氟康唑耐药 且11.6% 特征 作者Xiao M等 珠菌ITS及D1/D2区序列进行比对 M等 的光滑念珠菌对氟康唑和伏立康唑交 念珠菌血症病死率高 严重威胁 三株菌株的ITS和D1/D2区的DNA 侵袭性念珠菌病是指由念珠菌引起 患者生命 既往研究显示 1/3以上的 序列均是相似的 考虑到它们相似 的系统性真菌感染 其中白念珠菌为最常 念珠菌血症是由院内感染引起的 此 的RAPD及MALDI-TOF蛋白分析结 见的致病菌种 但近年来 非白念珠菌所 另外 97.7%~100%的非白念珠菌 外 由少见念珠菌引起的菌血症日益 果 推测其可能来自同一感染源 致的侵袭性念珠菌病有所增加 有研究指 对棘白菌素类药物敏感 其中近平滑念 增多 北京协和医院的Xiao M等人近 而对转录间隔区的最大简约法分析 出 在欧洲 印度等国家 非白念珠菌引 珠菌种复合体 热带念珠菌 光滑念珠 期发现了3例由橡树念珠菌引起的血流 则显示它们与非临床来源的菌株有 起的念珠菌血症的比例已经高于白念珠 菌种复合体 克柔菌对棘白霉素类药物 感染 为全球首次报道 叉耐药 所有的克柔念珠菌对伏立康 唑 泊沙康唑 伊曲康唑均敏感 很大不同 当然 感染也可能是由 菌 因此 对非白念珠菌的监测及研究愈 的敏感性分别为100% 99.7% 97.7%和 3例病例于两个月内相继发生在 于血培养瓶的污染或完全肠外营养 为重要 美国 欧洲等地已有较多的非白 95% 所有菌株均对两性霉素B敏感 我国东北部某医院的同一重症监护 袋引起 而营养袋并不能用于培 念珠菌流行病学研究数据 但是中国缺乏 0.8%的近平滑念珠菌种复合体和1.1%的 病房中 经Vitek 2 API 20C分别鉴 养 但并不是所有的病人都接受肠 相关数据 非白念珠菌对常用抗真菌药物 热带念珠菌对5-氟胞嘧啶耐药 定为铁红念珠菌及葡萄牙念珠菌 外营养治疗 所以肠外营养袋不太 的敏感性也不甚明确 上述菌株被纳入中国侵袭性真菌耐 可能成为感染来源 血培养瓶分别 药监测网 China Hospital Invasive 来自不同批号而在同一时期并无其他 Fungal Surveillance Net CHIF- 病人感染念珠菌血症 但由于该研究 NET 送至北京协和医院真菌参 是一篇回顾性研究 考虑到最初的错 考实验室做进一步研究 在沙保罗 误鉴定以及因此导致的延误 无法调 琼脂培养基和显色培养基上 三株 查其可能的环境来源或者是人-人传 菌落在25 和30 长势良好 37 播 尽管确切的来源无从证实 但是 生长缓慢 但在42 不生长 在念 从分离时间及分离菌株严密的相似度 珠菌CHROMagar显色培养基上菌落 来看 研究者推测这可能是一次微小 呈深蓝色 与热带念珠菌类似 而 的爆发 在Brilliance显色培养基菌落呈深绿 色 与白色念珠菌类似 最后研究者对三年内不同菌种 此外 在对临床常见药物的体 外药敏实验中发现 三株分离菌对 经转录间隔区 ITS 及rRNA 氟康唑都不敏感 对伊曲康唑及伏 的D1/D2区域测序确证三株菌株均 立康唑的敏感性较好 而对卡泊芬 为橡树念珠菌 在此基础上 采用 净和两性霉素B最为敏感 提示卡泊 最大简约法对所有现有的橡树念珠 芬净和两性霉素B可用于橡树念珠菌 菌菌落的序列进行亲缘关系分析 感染的治疗 图 非白念珠菌药敏变化趋势 CHIF-NET 注 S or wild type 敏感 同时 采用基质辅助激光解析电 总体说 研究者首次报道通过监 来自北京协和医院的Xiao M等人首次 的药物敏感性变化趋势进行了总体分 离飞行时间质谱仪 MALDI-TOF 测发现的3例由橡树念珠菌引起的菌血 报道了中国常见的侵袭性非白念珠菌的流 析 其中 热带念珠菌对氟康唑的敏 MS 对菌落进行鉴定 通过主要光 症病人 尽管橡树念珠菌在许多国家 行病学及药物敏感性数据 实验菌株为 感性降低了4% 而对泊沙康唑的敏 已被报道从植物 水以及昆虫等分 2009~2012年期间由CHIF-NET收集的1,072 感性由73.8%降为64.2% 近平滑念珠 离出来 却尚未见报道能够 株非白念珠菌 其中 近平滑念珠菌种 菌种复合体对所有药物敏感性相对稳 引起人类感染 从最大简 复合体392株 36.6% 热带念珠菌379 定 均超过97.4% 光滑念珠菌对伏立 约法亲缘关系分析结 株 35.4% 光滑念珠菌种复合体261株 康唑 伊曲康唑 泊沙康唑的敏感性 果及MALDI-TOF 24.3% 克柔念珠菌40株 3.7% 使 三年内均没有显著的变化 RAPD分析结果推 用SensititreYeastOneTM试剂盒 显色微量肉 值得注意的是 在我国近平滑念 测这可能是一次 汤稀释法 测定了9种抗真菌药物的活性 珠菌种复合体的分离比例最高 约为 谱投射对蛋白 地区集聚性的小 包括 氟康唑 伏立康唑 伊曲康唑 泊 36.6% 其次为热带念珠菌 35.5% 型爆发 提示ITS 沙康唑 卡泊芬净 米卡芬净 阿尼芬 光滑念珠菌 24.3% 这与美国 印 和D1/D2区域的测 净 两性霉素B 5-氟胞嘧啶 根据临床 度等国家非白念珠菌的分布有很大差 序对疑难菌株的鉴 折点 CBPs 或流行病学折点 ECVs 判 异 为中国非白念珠菌属流行病学研究 定菌株对药物的敏感性 提供了重要的科学依据 该研究同时为 定是很有必要的 南京医科大学 结果显示 大于97.5%的近平滑念珠 周梦兰 菌种复合体菌株对四种唑类敏感 其中对 北京协和医院 氟康唑和伏立康唑的敏感性分别为97.7% 程敬伟 徐英春 报道 和99.2% 热带念珠菌对唑类的敏感性相 医学参考报 临床非白念珠菌引起的侵袭性念珠菌病 的治疗提供了重要的数据基础 北京协和医院 陈欣欣 肖盟 程敬伟 徐英春 报道 检 验 医 学 频 道 理事长兼总编辑 巴德年 社 长 魏海明 副理事长兼副总编辑 曹雪涛 副社长 吕春雷 理事会秘书长 周 赞 副社长 周 赞 社 址 北京西城区红莲南路30号4层B0403 邮 编 总 机 名誉主编 尚 红 顾 问 侯生才 刘人伟 邹伟民 张 捷 居 军 主 编 王清涛 本期执行主编 徐英春 副主编 李金明 编 委 王治国 许 斌 仲人前 李连青 沈佐君 申子瑜 沈雁英 马斌荣 张 正 张会英 黄文方 杨振华 吕 元 胡丽华 张伟民 王兰兰 陈民钧 郭 健 康熙雄 于维林 徐维家 丛玉隆 潘柏申 田亚平 任健康 徐国宾 王建中 刘 勇 孙桂荣 李俊明 张 峰 徐英春 王培昌 刘 敏 孙自镛 李晓军 张 曼 姜晓峰 王露楠 刘文恩 李 艳 李彬先 张军力 王传新 卢志明 刘彦虹 李永哲 何成彦 张传宝 张忠英 张炳昌 陈 燕 范 红 赵建宏 郝晓柯 胡晓波 胡朝晖 夏 薇 徐克前 彭 林 彭明婷 潘 卫 魏 军 邓冠华 企业编委 陈春志 林日升 凌 励 吴乐斌 杨 军 朱耀毅 按拼音排序 编辑部主任 陈文明 陈 倩 编 辑 陈阳阳 苏 丹 孙 宇 张莉萍 陈 瑜 陈文明 郑卫东 府伟灵 赵 敏 胡 娟 胡成进 胡志东 秦 雪 秦东春 袁 宏 高 红 高春芳 崔 巍 鲁辛辛 谢 风 韩晓芳 魏殿军 按姓氏笔划为序 段少雷 顾小丰 黄柏兴 秦 颖 沈广仟 万志静 姚 勇 俞 捷 张 颖 张 琪 邢 薇 刘亚丽 左 畅 刘 禹

3 B3 责 任 编 辑 : 程 敬 伟 临 床 微 生 物 Clinical Microbiology 中 国 的 侵 袭 性 真 菌 监 测 网 酵 母 菌 鉴 定 策 略 制 定 据 J Clin Microbiol 2014 年 2 月 报 道 题 : 使 用 Vitek MS 联 合 测 序 来 鉴 定 酵 母 菌 : 为 中 国 的 侵 袭 性 真 菌 监 测 网 提 出 菌 株 鉴 定 参 考 方 法 (Zhang L 等 ) 中 国 侵 袭 性 真 菌 耐 药 监 测 网 (CHIF-NET) 于 2009 年 发 起, 收 集 全 国 多 中 心 菌 株 在 中 心 实 验 室 进 行 菌 种 和 药 敏 的 复 核 鉴 定 ITS 测 序 作 为 菌 株 复 核 鉴 定 的 金 标 准, 虽 然 准 确 但 耗 费 大 量 人 力 物 力 和 时 间 最 近 MALDI-TOF MS 为 临 床 微 生 物 检 测 带 来 革 命 性 变 化, 成 为 菌 种 鉴 定 的 新 方 法, 操 作 简 便 并 且 花 费 时 间 较 短, 已 有 研 究 证 实 其 对 于 细 菌 的 鉴 定 准 确 性 很 高, 但 是 对 于 真 菌 的 鉴 定 能 力 不 是 十 分 清 楚 因 此, 来 自 北 京 协 和 医 院 检 验 科 的 Zhang L 等 对 Vitek MS 进 行 评 估, 并 尝 试 制 定 联 合 应 用 Vitek MS 和 ITS 测 序 鉴 定 菌 种 的 策 略 在 此 之 前, 没 有 在 大 型 真 菌 监 测 项 目 中 评 估 Vitek MS 2.0 性 能 的 研 究 在 该 研 究 中, 以 ITS 测 序 为 金 标 准, 通 过 检 测 CHIF-NET 2011 年 在 13 个 省 市 收 集 的 1,243 株 菌 株 来 评 估 Vitek MS 的 性 能 ITS 测 序 显 示 共 分 为 31 个 种, 包 括 21 种 念 珠 菌 (1,137 株 ;91.5%),3 种 隐 球 菌 (87 株 ;7.0%) 和 7 种 其 他 酵 母 菌 (19 株 ;1.5%) Vitek MS 能 够 将 96.7% (n =1,202) 的 菌 株 准 确 鉴 定 到 种 水 平, 其 中 1,162 株 菌 可 信 度 达 到 99.9%, 仅 有 40 株 小 于 99.9%;0.2% (n=2) 的 菌 株 被 鉴 定 到 属 水 平 ;2.4% (n=30) 的 菌 株 无 鉴 定 结 果,0.7% (n =9) 菌 株 鉴 定 错 误 对 未 出 的 和 错 误 的 菌 株 重 新 鉴 定 之 后, 总 共 97.3% (n=1,209) 的 菌 株 准 确 鉴 定 到 种 的 水 平 从 评 估 结 果 来 看 Vitek MS 用 来 鉴 定 酵 母 菌 的 性 能 是 很 好 的, 因 此 Zhang L 等 提 出 了 一 个 联 合 Vitek MS 和 ITS 测 序 进 行 酵 母 菌 鉴 定 的 策 略 基 于 这 个 策 略, 可 信 度 小 于 99.9% 的 菌 株 或 同 时 多 个 鉴 定 结 果 时 需 要 重 新 检 测, 再 次 检 测 后 仍 然 小 于 99.9% 时 则 进 行 ITS 测 序 ; 少 见 菌 种 ( 占 菌 株 总 数 小 于 1%) 需 ITS 测 序 复 核 利 用 这 个 策 略, 除 了 1 株 Candida fermentati 和 1 株 格 特 隐 球 菌,99.7% (1,240/1,243) 的 菌 株 被 准 确 鉴 定 到 种 ; 并 且 节 省 时 间 和 成 本, 分 子 测 序 花 费 30 周 6,215 美 元 ;Vitek MS 花 费 4 周 4,100 美 元 ; 使 用 此 鉴 定 策 略 花 费 6 周 4,668 美 元 因 此, 从 鉴 定 准 确 率 时 间 和 成 本 来 分 析, 提 出 的 这 个 策 略 很 适 用 于 真 菌 监 测 网 中 酵 母 菌 的 鉴 定 ( 北 京 协 和 医 院 张 丽 程 敬 伟 徐 英 春 报 道 ) 临 床 分 离 到 罕 见 致 病 真 菌 环 境 污 染 还 是 致 病 菌? 据 PLoS ONE 2014 年 10 月 报 道 题 : 分 离 自 隆 胸 术 患 者 的 一 种 罕 见 真 菌 Quambalariacyanescens 环 境 污 染 还 是 致 病 菌?( 作 者 Fan X) 近 年 来 临 床 发 现 的 一 些 致 病 真 菌 其 实 是 已 知 的 环 境 微 生 物, 来 自 于 土 壤 植 物 昆 虫 水 等 这 类 致 病 真 菌 通 常 毒 性 较 低, 但 可 能 表 现 出 对 某 些 药 物 的 天 然 耐 药 性 Quambalariacyanescens 是 一 种 罕 见 的 担 子 菌 纲 致 病 真 菌, 该 菌 从 人 体 分 离 的 报 道 大 多 数 集 中 于 上 世 纪 九 十 年 代, 但 都 缺 少 分 子 生 物 学 水 平 的 相 关 信 息 来 自 北 京 协 和 医 院 的 Fan X 等 人 报 道 了 1 株 分 离 自 注 射 隆 胸 术 后 患 者 的 Q. cyanescens 并 对 该 菌 的 真 菌 学 及 分 子 生 物 学 特 征 进 行 了 研 究 菌 株 分 离 自 一 位 43 岁 女 性 患 者,11 年 前 曾 在 外 省 市 进 行 过 注 射 隆 乳 2011 年 9 月 15 日 因 左 乳 红 肿 疼 痛 入 住 北 京 协 和 医 院 整 形 外 科, 临 床 诊 断 隆 乳 术 后 感 染 患 者 基 础 情 况 良 好, 予 手 术 去 除 移 植 物 术 中 取 出 物 与 周 围 组 织 送 病 理 检 查 发 现 炎 细 胞 浸 润 及 多 核 巨 细 胞, 但 没 有 细 菌 或 真 菌 感 染 的 直 接 证 据 ; 微 生 物 检 验, 检 出 中 量 酵 母 样 菌 落, 科 玛 嘉 显 色 平 板 上 呈 蓝 色, 因 此 常 规 鉴 定 为 热 带 念 珠 菌 但 在 微 生 物 结 果 回 报 前, 患 者 已 遵 医 嘱 出 院 该 菌 株 纳 入 中 国 医 院 侵 袭 性 真 菌 感 染 监 测 网 (CHIF-NET), 利 用 ITS 测 序 重 新 鉴 定 为 Quambalariacyanescens 研 究 人 员 发 现, 该 菌 在 科 玛 嘉 平 板 上 与 热 带 念 珠 菌 极 为 相 似 在 赛 保 罗 平 板 上, 起 初 菌 落 湿 润, 而 后 呈 酵 母 样 菌 落 ;2 周 后 呈 现 出 典 型 的 丝 状 真 菌 菌 落, 紧 凑 脑 回 样, 有 绒 毛, 产 红 色 色 素, 背 后 呈 深 紫 红 色 28 孵 育 比 37 更 容 易 产 色 素 该 菌 的 其 ITS 序 列 与 数 据 库 中 Quambalariacyanescens 的 模 式 株 CBS 相 似 度 为 99.3% (576/580 bp),d1/d2 序 列 的 相 似 度 为 100%(600/600 bp) 研 究 者 将 数 据 库 中 Quambalaria 属 其 他 菌 种 以 及 所 有 Q. cyanescens 的 ITS 及 D1/D2 序 列 进 行 了 比 对 分 析, 发 现 ITS 序 列 能 够 鉴 别 不 同 菌 种 ( 种 之 间 相 似 度 92.9%~96.3%); 但 D1/ D2 序 列 的 相 似 度 均 >99.1% 以 上, 因 此 D1/D2 序 列 不 能 有 效 区 分 属 内 各 菌 种 该 菌 株 对 于 5- 氟 胞 嘧 啶 及 所 有 棘 白 菌 素 类 药 物 呈 现 非 常 高 的 MIC 值, 但 对 两 性 霉 素 B 及 唑 类 药 物 的 MIC 较 低 文 献 回 顾 发 现, 该 菌 主 要 感 染 免 疫 力 低 下 患 者, 动 物 试 验 显 示 其 毒 性 很 低 在 该 病 例 中, 由 于 术 前 并 未 做 相 关 微 生 物 检 查, 该 菌 株 仅 术 后 分 离 到 一 次, 因 此, 该 菌 是 致 病 菌 还 是 环 境 污 染 菌 还 有 待 进 一 步 讨 论 ( 北 京 协 和 医 院 范 欣 程 敬 伟 徐 英 春 报 道 ) ATB FUNGUS 3 机 读 造 成 唑 类 药 敏 结 果 假 耐 药 执 行 主 编 点 评 ATB Fungus 3 是 中 国 等 发 展 中 国 家 临 床 微 生 物 最 常 用 的 真 菌 药 敏 检 测 系 统, 为 确 保 结 果 准 确 可 信, 一 定 严 格 按 照 说 明 书 操 作, 同 时 提 醒 常 规 工 作 人 员 注 意 两 点 : 一 实 验 室 无 ATB 结 果 读 取 仪, 可 直 接 用 肉 眼 判 读 结 果, 与 微 量 肉 汤 稀 释 法 结 果 一 致 性 很 高 二 实 验 室 有 ATB 结 果 读 取 仪, 可 用 仪 器 读 取 板 条 药 敏 结 果, 但 应 特 别 注 意 报 告 审 核, 如 果 三 唑 类 药 物 ( 氟 康 唑 伏 立 康 唑 伊 曲 康 唑 ) 均 敏 感, 报 告 审 核 通 过 ; 如 果 某 种 三 唑 类 药 物 耐 药 需 肉 眼 复 判 结 果, 排 除 拖 尾 导 致 的 假 耐 药 ( 北 京 协 和 医 院 徐 英 春 教 授 ) 据 PLoS ONE 2014 年 12 月 报 道 题 : 中 国 广 泛 使 用 的 ATB FUNGUS 3 机 读 造 成 唑 类 药 物 假 耐 药 : 发 展 中 国 家 临 床 微 生 物 实 验 室 面 临 的 挑 战 (Zhang L 等 ) 在 临 床 微 生 物 检 验 快 速 发 展 的 今 天, 实 验 室 引 进 新 方 法 的 验 证 问 题 上 存 在 巨 大 挑 战 中 国 不 同 实 验 室 的 真 菌 药 敏 数 据 相 差 比 较 大, 由 于 ATB FUNGUS 3 是 最 常 使 用 真 菌 药 敏 试 验 方 法, 因 此 具 体 分 析 其 在 国 内 相 关 数 据, 结 果 显 示 使 用 ATB expression 药 敏 自 动 读 取 仪 判 读 ATB Fungus 3 的 结 果 高 于 人 读 结 果, 尤 其 是 唑 类 药 物 因 此 推 断 ATB Fungus 3 机 读 结 果 是 不 准 确 的 北 京 协 和 医 院 的 Zhang L 等 以 微 量 肉 汤 稀 释 法 为 金 标 准, 来 评 估 ATB Fungus 3 人 工 判 读 结 果 和 机 器 判 读 结 果 的 准 确 性 测 试 菌 株 来 源 于 CHIF-NET (2010), 包 括 81 株 白 念 珠 菌,42 株 光 滑 念 珠 菌 复 合 体,41 株 热 带 念 珠 菌, 38 株 近 平 滑 念 珠 菌 复 合 体 以 及 16 株 克 柔 念 珠 菌 药 敏 结 果 的 判 定 参 考 最 新 的 酵 母 菌 的 菌 种 特 异 性 折 点 (CBPs) 和 流 行 病 学 折 点 (ECVs) 采 用 EA (essential agreement,ea) 来 评 估 ATB Fungus 3 的 人 读 结 果 和 机 读 结 果, 如 果 待 评 估 药 敏 方 法 和 微 量 肉 汤 稀 释 法 的 MIC 值 相 差 在 两 个 稀 释 度 以 内, 则 认 为 是 EA 一 致 中 国 侵 袭 性 感 染 热 带 念 珠 菌 的 来 源 具 有 多 样 性 据 Chin Med J (Engl) 2014 年 12 月 报 道 题 : 多 位 点 序 列 分 型 显 示 中 国 侵 袭 性 热 带 念 珠 菌 来 源 的 多 样 性 ( 作 者 Fan X 等 ) 随 着 广 谱 抗 生 素 免 疫 抑 制 剂 在 临 床 上 的 应 用, 侵 袭 性 真 菌 感 染 在 全 球 范 围 内 都 呈 现 逐 年 增 多 的 趋 势 CHIF-NET 2010 年 监 测 数 据 显 示, 热 带 念 珠 菌 分 离 率 是 居 于 第 三 位, 是 最 常 见 的 侵 袭 性 真 菌 感 染 病 原 菌 之 一 并 且 发 现, 大 多 数 氟 康 唑 耐 药 的 热 带 念 珠 菌 集 中 分 离 于 同 一 家 医 院 的 ICU 病 房 因 此, 该 研 究 对 中 国 侵 袭 性 感 染 热 带 念 珠 菌 进 行 分 子 流 行 病 学 研 究 以 明 确 菌 株 的 同 源 性 关 系 来 自 北 京 协 和 医 院 的 Fan X 等 研 究 者 选 取 了 四 家 医 院 临 床 分 离 的 侵 袭 性 感 染 热 带 念 珠 菌, 总 计 48 株 所 有 菌 株 进 行 ITS 测 序 鉴 定, 并 采 用 CLSI 标 准 微 量 肉 汤 稀 释 法 测 定 对 氟 康 唑 伏 立 康 唑 伊 曲 康 唑 两 性 霉 素 B 卡 泊 芬 净 五 种 常 用 抗 真 菌 药 物 的 药 物 敏 感 性 共 检 出 7 株 氟 康 唑 耐 药 株 (6 株 分 离 自 哈 尔 滨,1 株 分 离 自 天 津 ) 以 及 3 株 剂 量 依 赖 性 敏 感 株 ATB Fungus3 人 读 结 果 与 CLSI BMD 一 致 率 很 高,EA 一 致 率 为 99.1% 从 抗 菌 药 物 角 度 来 看, 所 有 菌 种 的 EA 一 致 率 均 较 高 相 对 于 ATB Fungus3 人 读 结 果,ATB Fungus3 机 读 结 果 与 CLSI BMD 的 一 致 性 较 低,EA 一 致 率 只 有 86.2%, 两 性 霉 素 B(99.5%) 和 5- 氟 胞 嘧 啶 (99.5%) 一 致 率 稍 高, 唑 类 药 物 一 致 率 低, 分 别 为 氟 康 唑 (80.7%), 伏 立 康 唑 (77.5%), 伊 曲 康 唑 (73.4%) 从 所 有 菌 株 与 药 物 的 组 合 分 析 结 果 中 可 以 看 到, 近 平 滑 念 珠 菌 和 克 柔 念 珠 菌 对 所 有 药 物 的 一 致 率 均 大 于 90%; 但 热 带 念 珠 菌 白 念 珠 菌 和 光 滑 念 珠 菌 一 致 率 较 低, 其 中 最 为 明 显 的 是 热 带 念 珠 菌, 一 致 率 分 别 为 氟 康 唑 (31.7%), 伏 立 康 唑 (24.4%), 伊 曲 康 唑 (22.0%) 造 成 这 种 现 象 的 主 要 原 因 是 真 菌 药 敏 试 验 中 唑 类 药 物 存 在 拖 尾 现 象, 影 响 仪 器 对 于 药 敏 板 的 判 读 总 之,ATB Fungus 3 是 一 种 简 单 易 于 操 作 的 酵 母 菌 药 敏 试 验 方 法, 其 人 工 判 读 结 果 准 确 性 较 高, 适 用 于 发 展 中 国 家 使 用 仪 器 判 读 导 致 临 床 错 误 用 药 和 耐 药 率 假 性 升 高, 不 推 荐 使 用 药 敏 读 取 仪 对 其 结 果 进 行 判 读 ( 北 京 协 和 医 院 张 丽 程 敬 伟 徐 英 春 报 道 ) (2 株 分 离 自 四 川 1 株 分 离 自 天 津 ) 研 究 者 还 采 用 多 位 点 序 列 分 型 (MLST) 对 菌 株 进 行 分 型, 并 采 用 eburst 及 最 大 简 约 法 (MP) 对 菌 株 进 行 了 系 统 发 生 分 析 研 究 发 现,48 株 菌 共 分 为 40 个 DST 型 别, 其 中 包 含 36 个 新 型 别,XYR1 基 因 的 分 辨 率 最 高, 其 次 为 MDR1 菌 株 的 DST 型 别 与 我 国 之 前 单 中 心 研 究 报 道 的 DST 型 别 并 不 一 致 eburst 分 析 法 将 菌 株 分 为 9 个 群 和 11 个 singleton; 同 时,MP 分 析 法 将 菌 株 分 为 两 个 群 (10 个 亚 群 ) 总 体 来 讲,7 株 氟 康 唑 耐 药 的 菌 株 在 三 个 分 支 (branch) 上, 克 隆 群 与 标 本 类 型 医 院 来 院 之 间 也 没 有 明 显 的 对 应 关 系, 说 明 我 国 侵 袭 性 感 染 热 带 念 珠 菌 的 来 源 呈 现 出 多 样 性 除 此 之 外, 研 究 者 还 将 该 研 究 菌 株 DST 型 与 之 前 报 道 菌 株 的 DST 型 进 行 了 综 合 系 统 发 生 分 析, 发 现 该 研 究 菌 株 与 之 前 报 道 的 亚 洲 菌 株 有 聚 集 的 趋 势, 但 与 其 他 地 域 来 源 菌 株 克 隆 群 还 是 有 差 别 ( 北 京 协 和 医 院 范 欣 程 敬 伟 徐 英 春 报 道 )

4 B4 临床生物化学 Clinical Biochemistry 责任编辑 徐 婷 基因突变谱随着肺癌的发展而改变 据 Science 2014年10月报道 题 肺癌发生发展 过程中的基因组不稳定性在空间和时间上不同 作者Elza C. de Bruin等 肺癌是癌症相关死亡的主要原因之一 理解肺癌的发 生 发展机制有利于临床更好地指导治疗 尽管先前的研究 图 六种不同基因突变类型在肺癌早期和晚期中的比例 美国学者成功在体外培 养乳腺癌循环肿瘤细胞 据 Science 2014年7月报道 题 可用于个体化药物敏感性测试的循 环乳腺癌细胞的体外培养 作者Daniel A. Haber等 通过对非小细胞肺癌患者的单个肿瘤组织空间分布不同的部 循环肿瘤细胞 CTC 在很多实体瘤患 位进行分析 发现了亚克隆的存在 但基因在原发性非小细 者的血液中出现 并与肿瘤的转移密切相 胞肺癌中的差异程度以及非小细胞肺癌发展过程中基因的动态变化 目前仍不清楚 关 但其中大部分CTC会由于生存信号的丢 由英国伦敦大学癌症研究所的Elza C. de Bruin领导的研究组对7名非小细胞肺癌患者 包括吸烟者 戒烟者和从不吸烟者 的 失或血液剪切压力而在循环系统中死亡 如 25个肿瘤区域进行了全外显子测序或全基因组测序 发现了1,884个非同义突变和76,129个同义突变 而且每位患者平均约有30% 果能在体外成功培养从肿瘤患者外周血中分 4%~64% 的非同义突变仅存在某些区域中 离出的CTC 而且这些CTC经药物刺激后 为了分析非小细胞肺癌中的基因差异程度 并推断肿瘤不同区域基因改变的起源关系 研究者评估了含每个基因突变的肿 也会像人体一样出现新的基因或功能的改 瘤细胞在每位患者的肿瘤组织空间分布不同的部位中所占的比例 结果发现不同区域表现出不同的亚克隆差异 该研究采用最 变 那么针对原发瘤发展过程中新的基因突 大简约法和非加权配对算术平均法构建了系统发育树 发现在肿瘤进展过程中 7位非小细胞肺癌患者的基因突变谱均发生改变 变开展有效的靶向治疗将成为可能 P <0.05 肿瘤早期发生改变的大多是系统发育树躯干上的基因 提示早期发生的突变很可能参与肿瘤的发生 而且这些基 因是目前我们已知的 肿瘤进展时发生改变的大多是系统发育树枝干上的基因 这些晚期出现的突变与肿瘤的异质性有关 美国麻省总医院癌症中心的Daniel A. Haber等人 应用新的CTC分离技术 与肿瘤早期相比 无论是在已戒烟者还是吸烟者中 肿瘤晚期出现C>A颠换的基因突变比例均大大降低 P >0.05 如图所 CTCiChip平台 从36名已放弃治疗或治疗 示 TpC位点的C>T突变和C>G突变则增加 肿瘤后期 APOBEC TpC位点是APOBEC胞嘧啶核苷脱氨酶的活性位点 相关突 无效的转移的晚期乳腺癌病人外周血中分 变明显较肿瘤早期多 31% vs 11% 而且这种现象在肺腺癌和肺鳞癌中更常见 离出CTC 经细胞表面特征和染色鉴定 该研究首次发现早期非小细胞肺癌中的瘤内异质性较小 但该研究从每位患者获得的肿瘤组织部分仅约为整个肿瘤组织块 证明分离的CTC具有活性 其中有6例能 的5% 这可能会导致瘤内异质性被低估 此外 研究结果显示肿瘤的基因突变谱在肿瘤演变的过程中会不断改变 在肿瘤快 在体外进行传代培养 并成功构建细胞 速生长期 会有多种形式的遗传错误出现在肿瘤的各个区域 导致每个区域按不同的路径发展 使得肿瘤各个部分具有各自的 系 有3例患者由于在治疗过程中的不同 遗传特性 许多靶向疗法只取得有限的成功 就是因为它们只攻击特定的基因变异 如能及早发现肺癌 把它扼杀在尚未开始 时段采血 所以每位患者建立了四株以 沿多条进化路径发展的萌芽状态 那么将会有更多肺癌患者存活 这项研究还表明 与肺癌有关的许多早期遗传错误由吸烟造 上的细胞系 培养条件为 表皮生长因 成 不过后期的遗传错误更多与一个叫做APOBEC的蛋白有关 子 20ng/ml 成纤维生长因子 20ng/ 吉林医药学院 代新钰 北京大学肿瘤医院 徐婷 徐国宾 报道 ml B27 10ml 1 x 抗生素的RPMI1640 培养基 37 5% CO2 4% O2 9 早期肺腺癌的瘤内异质性较小 例由于在收集CTC时 患者治疗有效 而 不能培养获得细胞系 据 Science 2014年10月报道 题 通 该研究分析了CTC细胞系和CTC- 过多个区域的测序分析早期肺腺癌的瘤内异质性 ichip分离的未经培养的ctc的细胞学特 作者张建军等 性 发现两者一致 而且CTC细胞系的增 瘤内异质性 是指同一位肿瘤患者的多个 殖能力优于细胞系库的乳腺癌细胞株和 肿瘤细胞具有不同的基因变异 这些不同的变异 CTC-iChip分离的未经培养的CTC 将不 驱动了肿瘤的形成 生长和进展 有可能导致选 同的CTC细胞系注射到6只小鼠体内 其 择治疗方案和治疗疗效的复杂化 2012年一项具 中3只在三个月内长出肿瘤 而且肿瘤细 有里程碑意义的肾细胞癌研究发现 大多数促癌 胞组织学和免疫组化特点与原发瘤一致 变异并不存在于这些肿瘤的所有区域中 因此对 为探究体外CTC培养对不同药物的反 一个区域进行活检并不能很好地描绘出在某个肿 应 该研究检测了CTC细胞系对标准临床治 瘤发病中起重要作用的癌基因 但最近发表在 疗方案和针对特定突变的新药的敏感性和耐 Science 杂志上的一项新研究发现 在局限性 药性 这些药物包括紫杉醇 卡培他滨 氟 肺癌中一些已知的癌症驱动基因组畸变似乎一致 维司群 阿霉素和奥拉帕尼等 结果发现药 存在于整个肿瘤之中 对肿瘤的某一区域进行单 物刺激反应与临床治疗效果一致 药物敏感试验发现 其中1位患者的 次活检就有可能鉴别出其中的大多数畸变 由美国德克萨斯大学安德森癌症中心的张建 CTC 无论是他莫昔芬 雷洛昔芬 选择 军博士领导的这项研究对来自11份肿瘤组织 Ⅰ 性雌激素受体调节剂 和氟维司群 选择 期8例 Ⅱ期2例 Ⅲ期1例 的48个肿瘤区域进 性雌激素受体拮抗剂 这三种药物单独刺 行了全外显子测序 平均深度277 x 他们鉴定 激还是与目前临床认可的依维莫司 PI3K- 出了7,269个突变 并采用捕获测序 平均深度 863 x 对其中的7,026 97% 个突变进行验证 图 11 例肺腺癌患者的瘤内异质性分析 而且发现不同肿瘤患者间的基因突变个数极不一致 突变个数与患者年龄 性别 肿瘤大小及吸烟与否无关 mtor通路抑制剂 联合刺激均未见疗 效 但是 HSP90抑制剂STA9090无论单独 使用 还是和雷洛昔芬 氟维司群联合使 研究发现76%的突变以及21个已知癌症基因突变中的20个存在于同一肿瘤的所有区域 这表明单次活检 以适当的深 用 都具有细胞毒性 低剂量的STA9090 度对其测序 或许能够提供有关肺癌已知癌基因突变的大量信息 肿瘤中的基因组异质性可以被描述成树形结构 如图所 可抑制1例CTC细胞系 含ESR1突变 的雌 示 树干代表存在于肿瘤所有区域中的突变 树枝代表只存在于一些区域的突变 而更小的树枝则代表只存在于一个区 激素受体水平 但是对MCF7乳腺癌细胞系 域中的变异 黑色代表基因点突变 红色代表基因扩增 绿色代表基因缺失 ER阴性 无作用 这提示HSP90抑制剂 研究对这些患者平均随访21个月 发现3位患者于术后复发 这3位患者的系统发育树的树枝部分的基因突变比例大 于其他患者 40% vs 17% P =0.006 即亚克隆变异较其他患者多 提示亚克隆变异的存在可能与肿瘤进展有关 亚克 可能对含ESR1突变的ER阳性的患者治疗有 效 但具体方案还需优化 隆变异越多 术后复发的可能性就越大 张建军和Futreal谨慎地表示 该研究样本例数太少 尚需要更大的研究来证实复 该研究首次在体外成功培养乳腺癌 发与这些树枝突变负荷之间的联系 如果存在这种关联 则意味着这些树枝突变的某些方面有可能驱动了复发 或者揭 CTC 并构建乳腺癌CTC细胞系 为通过 示某些我们还未认识到的肿瘤生物学问题 目前该研究小组正在发起一项更大型的研究将焦点放在早期肺腺癌上 以研 体外的药物敏感试验调整患者用药情况带 究树枝突变与手术后复发之间的关联 研究结果促成的一些新见解将使得人们能够划分出具有较高复发风险的患者 并 来了契机 但该方法在应用于临床实践之 促成一些阻止复发的手术后药物的临床试验 前 还需进一步优化 构建的CTC细胞系 该研究首次发现早期肺腺癌中的瘤内异质性较小 在达到一定测序深度的情况下 单个肿瘤组织活检足以检测到患者的大多 数驱动基因变异 该研究指出了肿瘤异质性在不同癌症类型之间各不相同 江苏大学 倪伟旭 北京大学肿瘤医院 徐婷 徐国宾 报道 的生物学特性也还需进一步鉴定 北京大学肿瘤医院 田德全 徐婷 徐国宾 报道

5 B5 责任编辑 孙 宇 临床分子诊断 Clinical Molecular Diagnosis 结直肠癌原发灶和 转移灶的基因突变高度一致 能预测中国结直肠癌患者低生存期的两种突变 据 BMC Cancer 2014年11月 突变可以分别在44.9% 96/214 报道 题 BRAF V600E突变和KRAS 4.2% 9/214 和12.3% 26/212 的 13密码子突变能预测中国结直肠癌患 CRC患者中检测到 在这三个基因突变 者的低生存期 作者Chen J等 中出现频率最高的突变是G12D V600E 据 Genome Biol 2014年8月报 的一致性 93% 229/247 特别是所 道 题 对比测序分析显示在配对的 有样本的KRAS NRAS 和BRAF 突变状态 KRAS BRAF 和PIK3CA 突变是在 原发和转移结直肠恶变中高度的基因 在原发灶和转移灶中是完全一致的 18 西方国家的结直肠癌 CRC 患者体 80.8% PIK3CA 突变来自于结肠癌患者 一致性 作者Brannon AR等 个在原发和转移 内发现的最常见的体细胞 BRAF V600E突变与结肠癌患者进展的 目前 抗EGFR治疗已经成为治疗 灶中不同的突 和H1047R 所有检测到的B R A F 和 突变 但是它们的 TNM阶段 更多的远处转移以及更差的 转移性结直肠癌的方案之一 该疗法 变分别出现在 流行和预后价值 总体生存期具有明显的统计学相关性 极大地依赖精确的肿瘤突变状态检测 APC n =7 还未在亚洲人 与KRAS 野生型/BRAF 野生型的结直肠 结果 然而 对于已发生转移的肿瘤 P I K 3 C A 群中充分的评 癌患者 109例 相比 出现KRAS 第13 特别是一些微小转移灶 来说 很 n = 5 估 密码子突变 25例 具有更差的总生存 难获取活检标本 如果采用原发灶突 S M A D 4 变的检测结果来指导用药 是否会由 于肿瘤异质性的问题导致治疗失败 二代测序等技术的开发应用为回答上 述问题提供线索 为了确定 期 而KRAS 第12密码子突变与患者的 n =3 和TP53 这些基因在中 生存期并没有统计学的相关性 在最常 n =3 研究 国CRC病人中 见的三种KRAS 突变中 出现G13D突变 者进一步挑选 突变的频率以及 23例 的患者和KRAS 野生型/BRAF 了两对230个肿 调查它们对于预 野生型患者相比表现出与不良的总生存 针对上述现状 来自美国纪念斯 瘤相关的基因 后的影响 来自 隆-凯特琳癌症中心的Brannon AR等 突变状态一致的 中国东南大学医 这项研究暗示了PI3K/RAS-RAF 研究人员利用二代测序技术从基因水 样本进行全基因 学院的Chen J等从 信号通路的基因是在中国结直肠癌患 平系统地对比了原发和转移肿瘤异质 组测序 显示突 214例原发结直肠 者中突变最频繁的基因 但是与在西 性 他们收集了69例结直肠癌患者的 变状态一致的突变分 正常组织以及原发和转移肿瘤组织 别占80%和83% 其中52例样本的原发及转移肿瘤样本 研究者认为 研究中原发 癌患者 结肠癌/直肠 方人群的发现仍具有一些不同的特 癌 126/88 肿瘤组织的 点 BRAF V600E对于中国患者来说 福尔马林固定石蜡包埋组织样本 是一个独立的预后因素 这项研究发 FFPE 抽提DNA 并通过PCR和 现在BRAF 野生型结直肠癌中国患者 一致性说明在结直肠癌早期出现 直接测序的方法 BigDye Terminator 体内KRAS 第13密码子突变 在特别的 的基因改变 特别是常见的基因 Cycle Sequencing kit 评估了KRAS G13D突变中 与交叉的生存期相关 第 2 密 码 子 B R A F 第 1 5 密 码 子 这一点迄今为止还没有过报道 同时获得 另17例样本的原发和转移 肿瘤与转移肿瘤突变状态高度的 肿瘤组织为先后获取的 平均时间 间隔为15.3个月 所有患者从未接受 过抗EGFR治疗 检测的靶基因为230 如KRAS NRAS BRAF 和APC 发生 个肿瘤相关的基因 采用的仪器为 的突变 在肿瘤进一步恶化后 该突 PIK3CA 第9和第20密码子的序列 通 Illumina HiSeq 2000 变的状态一般不会发生改变 这一结 过检测发现 KRAS BRAF 和PIK3CA 结果显示 通过对69对结直肠癌 论的前提是患者未经抗EGFR治疗 否 样本深度测序 共检测出434个突变 则 突变状态可能会随着药物的选择压 其中247个突变为之前报道过的突变频 力而发生变化 率较高的突变 在上述常见突变中 原发肿瘤与转移灶突变状态具有很高 期极大的统计学相关性 卫生部临床检验中心 孙宇 李金明 报道 新一代测序技术可用于 准确检测慢性淋巴细胞白血病的预后相关基因 卫生部临床检验中心 李禹龙 李金明 报道 新一代测序技术 在丝状病毒病原学检测上的应用及评价 据 PLoS ONE 2014年9月报 性样本进行检测验证 结果显示 荧 道 题 新一代测序技术在一系列丝 光定量PCR检测为阳性的样本中 新 状病毒序列捕获探针病原学检测方面 一代测序技术的检出率占五分之三 的应用及评价 作者Koehler JW等 而一例荧光定量PCR检测为阴性的样 目前 西非地区爆发的埃博拉 本 该方法可成功测得 据 Haematologica 2014年12 的177个突变中 有149个突变 84% 出血热为埃博拉病毒扎伊尔型 应对 应用这一方法 可在感染埃博拉 月报道 题 慢性淋巴细胞白血病的 集中在ATM BIRC3 NOTCH1 SF3B1 此次疫情 全面评价区域性病原体情 病毒的灵长类动物中成功检测到特异 靶向新一代测序 一种在特定临床设 和TP53 基因上 随后 研究者用Sanger测 况 可及早确定丝状病毒疾病暴发的 性丝状病毒感染 虽然这一方法的检 定下实现基因突变检测的高通量定制 序法验证了其中的155个突变 有144个 危险 增大检出率及提高应对能力 测特异性及速度不及荧光定量PCR方 方法 作者Sutton LA等 93% 得到了确认 其它11个不一致的 美国研究者即设计出可捕获识 法 但其具有同一时间 利用一个较 最近 来自瑞典乌普萨拉大学 突变其变异等位基因频率为11%~27% 别一系列丝状病毒 包括 埃博拉病 小的反应体系 即可实现对大量病原 的Sutton LA等运用靶向新下一代测序 恰好在传统Sanger测序的检测限上 因此 毒苏丹型 扎伊尔型 雷斯顿型 塔 体的多重筛查的优势 这使得区域特 next-generation sequencing NGS 推测其不一致可能是由于Sanger测序法自 伊森林型 本迪布焦型 以及马尔堡 异性检测具有生物危害的病原体成为 技术对一组与慢性淋巴细胞白血病 身的检测局限性所致 证实了靶向NGS技 病毒Musoke Ci67 安哥拉变异株 可能 有利于进一步开展多重病原学 chronic lymphocytic leukemia CLL 术的可靠性 此外 研究者还对靶向NGS 序列的探针 该线性核酸探针包括 筛查及生物监测 预后相关的基因的突变情况进行了检 技术的准确度和可重复性进行了评估 位于两端的可与待检靶序列杂交互补 测 并用Sanger测序法进行了验证 同 他们对63例之前进行过测序的CLL患者重 的序列 内侧PCR上下游引物结合序 时对该技术的准确性和可重复性进行 新设计实验并进行靶向NGS测序 检测 列 当探针两端的序列与待检靶序列 了评估 对象是之前检测中突变频率较高的6种基 特异性结合后 利用体系中多聚酶延 因 BIRC3 NOTCH1 SF3B1 TP53 POT1 XPO1 通过对两次测序结果的 伸及连接酶作用 产生与相结合靶序 剂盒以及双末端测序技术 在Illumina HiSeq2000测序仪上对188例预后不良 对比 研究者发现在82个突变中 有77个 酸外切酶将靶序列以及多余的未结合 的CLL患者进行了一组包含9种与CLL 94% 突变是一致的 而第一次测序时 探针降解成片段 剩余的通过特异性 预 后 相 关 的 基 因 A T M B I R C 3 MYD88 NOTCH1 SF3B1 TP53 未检出的突变在第二次测序中同样没有检 捕获获得的序列 可通过后续高通 出 即假阳性率为0% 证实了靶向NGS技 量新一代测序方法 PCR上下游引物 KLHL6 POT1 XPO1 的突变检测 术具有较高的准确性和可重复性 与原探针本身带有的PCR引物结合位 研究者利用HaloPlex靶向富集试 列互补的一段序列 随后体系中的核 以10%的突变频率作为临界值 研究 综上所述 靶向NGS技术是一种准确 点相结合 进行扩增 进行检测 者发现在180例测序深度和覆盖率符 性高 可重复性强的基因检测技术 具有 应用MiSeq测序仪及GAIIx测序平台 合要求的样本中 有114例 63% 在临床上进行常规筛查的巨大潜力 TruSeq DNA样本处理试剂盒及其配 携带了至少一种突变 且在所有检出 卫生部临床检验中心 鲁添 李金明 报道 套试剂 对本迪布焦型埃博拉病毒阳 卫生部临床检验中心 王国婧 李金明 报道

6 B6 责 任 编 辑 : 程 敬 伟 临 床 微 生 物 Clinical Microbiology 福 氏 志 贺 菌 磺 胺 甲 恶 唑 耐 药 性 研 究 据 PLoS ONE 2014 年 1 月 报 这 三 种 质 粒 被 认 为 是 福 氏 志 贺 菌 2a 的 核 心 道 题 : 孟 加 拉 国 达 卡 急 性 腹 泻 病 人 质 粒, 相 比 复 方 新 诺 明 敏 感 株 SXTS, 所 有 分 离 的 多 重 耐 药 福 氏 志 贺 2a 菌 株 sul2 基 的 磺 胺 耐 药 菌 株 SXTR 均 产 生 一 个 独 特 的 因 编 码 质 粒 介 导 的 磺 胺 甲 恶 唑 耐 药 性 4.3MDa 的 质 粒 结 构 通 过 吖 啶 橙 固 化 构 成 研 究 ( 作 者 Lqbal MS 等 ) 无 4.3 MDa 质 粒 的 福 氏 志 贺 菌 2a 衍 生 物, 发 由 于 多 重 耐 药 的 出 现, 细 菌 性 痢 现 将 这 个 质 粒 去 除, 可 导 致 菌 株 对 磺 胺 甲 疾 正 成 为 一 个 日 益 严 重 的 公 共 卫 生 问 恶 唑 敏 感 同 时,PCR 分 析 表 明 sul2 基 因 在 题, 导 致 全 球 高 发 病 率 和 死 亡 率, 尤 SXTR 菌 株 可 检 测 到, 而 在 SXTS 菌 株 和 缺 失 其 是 在 孟 加 拉 国 这 样 的 发 展 中 国 家 流 4.3MDa 质 粒 的 衍 生 物 中 未 能 检 测 到, 这 些 行 地 区 在 发 展 中 国 家 如 孟 加 拉 国, 证 明 4.3MDa 质 粒 固 化 导 致 sul2 基 因 缺 失 以 主 要 的 血 清 型 为 福 氏 志 贺 菌 2a 对 于 及 磺 胺 甲 恶 唑 敏 感 性 降 低, 因 此 4.3MDa 质 流 行 志 贺 菌 株 以 前 有 效 的 一 线 抗 菌 药 物 磺 胺 等 已 逐 渐 无 效, 最 近 的 报 道 显 示, 其 对 环 丙 沙 星 和 第 三 代 头 孢 菌 素 也 出 现 耐 药, 同 时 对 替 代 药 物 阿 奇 霉 素 也 开 始 出 现 抵 抗 和 敏 感 性 下 降, 因 而 进 一 步 缩 小 了 有 效 抗 菌 药 物 的 选 择 来 自 孟 加 拉 国 达 卡 食 物 和 水 传 播 疾 病 中 心 的 Lqbal MS 等 人 报 道 了 粒 和 sul2 基 因 参 与 磺 胺 甲 恶 唑 的 耐 药 性 福 氏 志 贺 菌 对 磺 胺 耐 药 机 制 研 究 的 新 此 外,4.3MDa 质 粒 和 它 的 固 化 衍 生 物 同 源 进 展 在 这 项 研 究 中, 临 床 多 重 耐 药 性 非 常 接 近 (95%), 证 明 吖 啶 橙 处 理 对 福 氏 志 贺 菌 2a 介 导 的 磺 胺 甲 恶 唑 耐 药 性 染 色 体 DNA 没 有 影 响 在 孟 加 拉 国 首 次 阐 明 这 项 研 究 将 有 综 上 所 述, 该 研 究 第 一 次 系 统 阐 述 助 于 了 解 流 行 菌 株 福 氏 2a 的 获 得 性 耐 药 了 sul2 和 4.3MDa 质 粒 在 磺 胺 耐 药 性 中 的 关 机 制, 以 及 与 世 界 各 地 分 离 的 临 床 其 系, 为 进 一 步 对 小 质 粒 的 功 能 和 对 其 它 志 它 志 贺 菌 属 和 肠 道 病 原 体 耐 药 机 制 的 贺 菌 血 清 型 毒 力 质 粒 的 比 较 分 析 提 供 更 为 相 关 性 研 究, 从 而 为 临 床 管 理 提 供 有 完 整 的 质 粒 演 化 表 征 同 时 对 目 前 大 多 数 效 方 法 流 行 福 氏 志 贺 菌 2a 株 的 获 得 性 耐 药 机 制 研 研 究 所 用 的 200 例 菌 株 均 收 自 孟 加 究 有 重 要 意 义 拉 国 国 际 腹 泻 病 研 究 中 心 达 卡 治 疗 中 ( 中 国 康 复 研 究 中 心 刘 媛 心 质 粒 分 析 表 明 超 过 90% 的 菌 株 出 现 复 兴 医 院 王 新 宇 140,2.7 和 2.1 MDa 三 种 大 小 的 质 粒, 北 京 协 和 医 院 程 敬 伟 徐 英 春 报 道 ) CTX-M-55 致 病 志 贺 菌 耐 药 性 的 关 键 据 Future Microbiology 2014 年 9 月 报 道 题 : 中 国 宋 内 志 贺 菌 株 中 编 码 ESBLCTX-M-55 的 质 粒 ( 作 者 曲 芬 等 ) 宋 内 志 贺 菌 是 引 起 志 贺 菌 病 的 主 要 菌 种, 因 其 产 生 ESBL 对 多 种 头 孢 菌 素 耐 药 更 是 受 到 全 世 界 关 注 CTX-M 型 ESBL 有 至 少 150 种 突 变 体, 这 些 突 变 体 在 全 球 快 速 传 播 蔓 延, 被 称 为 CTX-M 流 行 病 在 中 国,CTX-M-14 CTX-M-15 和 CTX-M-55 是 最 常 见 的 CTX-M 型 其 中 CTX-M-55 是 CTX-M-15 的 第 80 位 结 氨 酸 突 变 为 丙 氨 酸 的 突 变 体, CTX-M-55 和 CTX-M-15 水 解 酶 活 性 相 似, 但 CTXM-55 具 有 更 强 的 催 化 头 孢 他 啶 活 性 来 自 解 放 军 302 医 院 的 曲 芬 等 人 报 道 了 一 株 携 带 bla CTX-M-55 质 粒 的 宋 内 志 贺 菌, 他 们 研 究 了 该 菌 株 的 耐 药 性 和 携 带 质 粒 的 核 酸 序 列 及 结 构 特 点, 发 现 CTX-M-55 与 细 菌 多 重 耐 药 性 之 间 的 重 要 关 联 志 贺 菌 中 CTX-M-55 的 研 究 方 法 限 定 在 PCR 检 测 和 对 bla CTX-M-55 的 测 序 上,CTX-M-55 质 粒 编 码 的 产 物 可 能 是 S.sonnei 耐 药 性 的 决 定 因 素 2010 年 10 月, 杭 州 萧 山 医 院 收 治 一 名 水 样 腹 泻 呕 吐, 无 脱 水 症 状 的 5 岁 男 孩 研 究 者 从 病 人 粪 便 中 分 离 出 宋 内 志 贺 菌 株 #1081 并 鉴 定, 双 纸 片 协 同 实 验 结 果 显 示 其 产 ESBL, 并 具 有 多 重 耐 药 性 PCR 检 测 发 现 菌 株 含 bla CTX-M-55 基 因 片 段, 通 过 结 合 转 移 实 验 将 质 粒 接 合 到 大 肠 埃 希 菌 EC600 中, 筛 选 bla CTX-M-55 阳 性 的 E.coli, 使 用 PCR 测 序 Bruker 等 方 法 鉴 定 得 到 菌 株 #1081-EC600, 分 别 检 测 MIC 和 质 粒 DNA 序 列 结 果 表 明 #1081 菌 株 的 耐 药 性 来 自 bla CTX-M-55 质 粒 表 达 的 CTX-M-55 bla CTX-M-55 是 唯 一 已 知 的 耐 药 基 因, 定 位 于 一 个 3090bp 的 ISEcp1-bla CTX-M-55 -orf477 转 座 子 上, 而 ISEcp1 介 导 的 转 座 为 CTX-M-55 的 表 达 提 供 启 动 子 由 于 bla CTX-M-55 上 游 与 ISEcp1 相 邻, 使 得 bla CTX-M-55 能 够 被 转 移 到 其 他 细 菌 中 获 得 耐 药 性 因 此 bla CTX-M-55 被 当 作 一 个 重 要 的 检 测 靶 点, 尤 其 是 在 胃 肠 道 感 染 的 病 人 当 中 由 于 志 贺 菌 质 粒 p1081- CTXM 和 大 肠 埃 希 菌 质 粒 phn 全 基 因 组 测 序 结 果 高 度 相 似, 提 示 携 带 CTX-M-55 的 质 粒 有 可 能 是 由 非 致 病 的 E.coli 转 移 到 致 病 的 S.sonnei 中 bla CTX-M-55 质 粒 的 全 序 列 分 析 能 帮 助 我 们 更 深 入 的 了 解 bla CTX-M-55 在 不 同 遗 传 平 台 的 进 化 与 传 递 ( 北 京 地 坛 医 院 盛 琳 君 北 京 协 和 医 院 程 敬 伟 徐 英 春 报 道 ) ISEcp1 调 节 bla CTX-M-55 介 导 福 氏 志 贺 菌 对 头 孢 菌 素 耐 药 性 的 研 究 产 超 广 谱 β 内 酰 胺 酶 质 粒 对 三 代 头 孢 菌 素 耐 药 性 影 响 据 Infect Genet Evol 2014 年 等 人 探 讨 了 一 种 在 大 肠 杆 菌 和 志 贺 菌 之 11 月 报 道 题 : 可 传 递 型 质 粒 在 大 肠 间 转 染 产 超 广 谱 β 内 酰 胺 酶 的 R 质 粒 的 可 杆 菌 和 志 贺 菌 中 介 导 第 三 代 头 孢 菌 素 能 机 制 耐 药 性 的 分 析 ( 作 者 Mahbubur Rahman 该 研 究 在 痢 疾 患 者 的 大 便 培 养 物 中 等 ) 发 现 了 大 肠 杆 菌 和 宋 内 志 贺 杆 菌 采 用 广 泛 不 恰 当 使 用 抗 生 素 可 导 致 耐 E-test 条 对 这 两 种 细 菌 进 行 药 敏 检 测, 发 药 菌 株 的 产 生, 目 前 多 耐 药 志 贺 菌 在 现 这 两 种 细 菌 均 对 氨 苄 青 霉 素, 氯 霉 素, 许 多 国 家 普 遍 存 在 第 三 代 头 孢 菌 素 复 方 新 诺 明 等 耐 药, 对 奥 格 门 汀, 丁 胺 卡 通 常 用 来 治 疗 多 耐 药 型 志 贺 菌 由 于 那 霉 素, 亚 胺 培 南 等 敏 感, 并 且 发 现 转 化 其 产 超 广 谱 β 内 酰 胺 酶, 故 对 除 头 霉 结 合 株 与 超 广 谱 β 内 酰 胺 酶 菌 株 对 β 内 酰 素 碳 青 霉 素 外 的 所 有 产 β 内 酰 胺 酶 胺 类 药 物 具 有 相 似 的 最 小 抑 菌 浓 度 和 相 同 的 抗 生 素 均 产 生 耐 药, 这 已 经 成 为 世 的 质 粒 (50MDa) 界 性 难 题 迄 今 为 止, 已 有 150 种 不 研 究 表 明 产 超 广 谱 β 内 酰 胺 酶 的 质 同 的 超 广 谱 β 内 酰 胺 酶 相 继 报 道, 在 粒 可 以 在 大 肠 杆 菌 和 宋 内 志 贺 菌 之 间 进 行 不 同 的 肠 杆 菌 属 和 绿 脓 杆 菌 中 广 泛 存 转 移 据 此 推 断 产 超 广 谱 β 内 酰 胺 酶 的 在 不 同 类 型 的 超 广 谱 β 内 酰 胺 酶, 但 质 粒 也 可 能 在 大 肠 杆 菌 和 伤 寒 属 弧 菌 关 于 产 超 广 谱 β 内 酰 胺 酶 的 志 贺 菌 的 属 等 这 些 敏 感 受 体 间 进 行 转 移, 可 导 致 这 报 道 却 很 少 产 超 广 谱 β 内 酰 胺 酶 的 些 菌 属 对 第 三 代 头 孢 菌 素 的 耐 药 性 增 强 质 粒 存 在 于 体 外 野 生 型 志 贺 菌 中, 并 产 ESBL 志 贺 菌 引 起 的 痢 疾 较 为 严 重, 且 且 可 以 转 移 到 大 肠 杆 菌 K12 中 抗 性 疗 效 较 差, 对 儿 童 的 危 害 则 更 为 严 重 这 因 子 可 在 肠 杆 菌 之 间 进 行 转 移 已 在 一 一 发 现 警 示 我 们 应 当 持 续 监 测 和 控 制 产 些 体 外 实 验 中 得 到 证 实, 但 并 未 成 功 ESBL 质 粒 在 志 贺 菌 属 伤 寒 属 和 弧 菌 属 转 染 R 质 粒 这 使 得 在 肠 道 内 转 染 产 的 转 移, 从 而 降 低 耐 药 现 象 的 产 生 超 广 谱 β 内 酰 胺 酶 的 R 质 粒 成 为 该 领 ( 整 形 外 科 医 院 蒋 峰 丽 域 的 研 究 热 点 来 自 美 国 伯 明 翰 大 学 北 京 中 医 医 院 马 红 叶 黄 河 细 胞 生 物 研 究 所 的 Mahbubur Rahman 北 京 协 和 医 院 程 敬 伟 徐 英 春 报 道 ) 据 Int Antimicrob Ag 2013 年 12 月 报 道 题 : 插 入 元 件 ISEcp1 能 够 插 入 到 福 氏 志 贺 菌 bla CTX-M-55 基 因 上 游 并 调 节 bla CTX-M-55 基 因 的 表 达, 使 其 对 超 广 谱 头 孢 菌 素 类 耐 药 性 增 强 ( 作 者 Yingfang Wang 等 ) 目 前 志 贺 氏 菌 病 仍 然 是 威 胁 人 类 健 康 的 重 要 疾 病, 尤 其 是 在 发 展 中 国 家,5 岁 以 下 感 染 儿 童 中, 死 亡 率 可 达 二 分 之 一 由 于 抗 生 素 的 广 泛 使 用, 越 来 越 多 的 志 贺 菌 产 生 多 耐 药 性, 尤 其 是 能 够 产 生 超 广 谱 β 内 酰 胺 酶, 其 中 产 酶 基 因 CTX-M 家 族 的 变 异 性 最 大 与 此 同 时 多 项 研 究 显 示 插 入 序 列 与 bla CTX-M 基 因 的 表 达 有 联 系 来 自 中 国 郑 州 大 学 公 共 卫 生 学 院 流 行 病 研 究 所 的 Yingfang Wang 等 人 进 一 步 研 究 了 插 入 序 列 ISEcp1 在 头 孢 菌 素 诱 导 耐 药 的 含 有 bla CTX-M 基 因 的 福 氏 志 贺 菌 中 所 起 的 耐 药 作 用 研 究 显 示 经 过 诱 导 后 插 入 序 列 ISEcp1 插 入 定 位 于 福 氏 志 贺 菌 CTX-M-55 的 上 游, 并 通 过 上 调 CTX-M-55 基 因 的 表 达 水 平, 使 其 产 生 更 多 的 耐 超 广 谱 β 内 酰 胺 酶 来 增 强 对 超 广 谱 头 孢 菌 素 类 的 耐 药 性 研 究 所 用 的 菌 株 福 氏 志 贺 菌 mel /zz 分 离 自 郑 州 大 学 附 属 医 院 病 人 粪 便 标 本,S. flexneri YDC 是 mel /zz 经 头 孢 噻 吩 诱 导 产 生 的 耐 药 菌 株 为 了 进 一 步 确 定 ISEcp1 在 耐 药 机 制 中 所 起 作 用, 他 们 分 别 构 建 了 只 含 有 bla CTX-M 和 同 时 含 有 ISEcp1 和 bla CTX-M 基 因 的 质 粒 pctx 和 pisectx, 并 将 其 导 入 大 肠 杆 菌 DH5α 中, 通 过 对 这 两 种 菌 株 进 行 药 敏 测 定, 发 现 pisectx DH5α 对 所 有 β 内 酰 胺 类 抗 生 素 均 耐 药, 而 pctx DH5α 对 除 头 孢 唑 林 和 头 孢 噻 吩 外 所 有 β 内 酰 胺 类 抗 生 素 均 敏 感 继 而 反 转 录 测 定 显 示 pisectx DH5α 中 bla CTX-M-55 的 表 达 高 于 pctx DH5α 以 上 研 究 提 示 ISEcp1 插 入 序 列 在 bla CTX-M-55 基 因 上 游 能 够 使 其 过 表 达, 从 而 使 低 表 达 的 bla CTX-M-55 基 因 通 过 上 调 表 达 使 其 对 头 孢 菌 素 类 的 耐 药 性 增 加, 在 此 过 程 中 ISEcp1 扮 演 了 bla CTX-M-55 基 因 激 活 剂 的 作 用 ( 首 都 医 科 大 学 附 属 北 京 佑 安 医 院 代 芳 芳 北 京 协 和 医 院 程 敬 伟 徐 英 春 报 道 )

7 B7 责 任 编 辑 : 左 畅 临 床 实 验 室 管 理 Clinical Laboratory Management 关 于 实 验 室 性 能 和 方 法 学 性 能 比 较 EQA 项 目 的 国 际 性 研 究 据 Clinica Chimica Acta 2014 年 9 月 报 道 题 : 关 于 实 验 室 性 能 和 方 法 学 性 能 比 较 的 1 个 分 类 1 的 EQA 项 目 : 校 准 2000 项 目 的 初 步 国 际 性 研 究 ( 作 者 Cas keycamp 等 ) 在 当 前 的 医 疗 服 务 模 式 下, 病 人 通 常 会 到 多 家 医 院 获 得 诊 疗 服 务 即 使 小 的 分 析 偏 倚 可 能 对 病 人 的 分 类 以 及 对 医 生 的 诊 疗 策 略 带 来 重 大 的 影 响, 保 证 实 验 室 内 和 实 验 室 间 不 同 方 法 不 同 仪 器 结 果 的 一 致 性 是 极 其 重 要 的 该 研 究 的 目 的 是 采 用 分 类 1 的 EQA 物 质 ( 即 该 物 质 既 有 互 通 性, 又 有 参 考 测 量 程 序 为 其 定 值, 而 且 同 一 水 平 有 多 个 样 本 ) 来 评 估 4 个 欧 洲 国 家 对 应 项 目 检 验 结 果 的 一 致 性 水 平 该 研 究 由 荷 兰 室 间 质 量 保 证 计 划 SKML 发 起 使 用 的 样 本 来 源 于 Combi 项 目, 且 被 多 个 研 究 证 明 具 有 互 通 性, 其 电 解 质 肌 酐 和 总 蛋 白 的 值 被 JCTLM 列 表 中 的 实 验 室 所 定 值, 酶 类 和 脂 类 被 IFCC 或 CDC 的 网 络 实 验 室 所 定 值 该 研 究 包 含 了 来 自 英 国 西 班 牙 葡 萄 牙 的 28 家 小 型 独 立 健 康 服 务 机 构 和 大 型 教 学 医 院 的 实 验 室 和 荷 兰 的 120 家 实 验 室 共 有 6 个 常 规 化 学 和 6 个 脂 类 的 样 本 干 冰 运 输 到 中 心 实 验 室, 随 后 干 冰 运 输 分 发 到 各 自 实 验 室 各 实 验 室 采 用 常 规 方 法 检 测 18 个 项 目, 分 别 为 5 个 电 解 质 (Ca Cl Mg K 和 Na) 6 个 酶 类 (ALT AMY AST CK GGT 和 LDH) 2 个 脂 类 (TC 和 HDL) 4 个 其 他 类 (Crea Glu TP 和 UA), 并 且 由 Crea 计 算 估 计 肾 小 球 滤 过 率 (egfr) 对 每 个 实 验 室 的 结 果 和 方 法 组 的 平 均 值 作 回 归 分 析, 剩 余 SD 即 能 代 表 该 实 验 室 室 内 SDWL, 由 此 可 得 到 6 个 样 本 结 果 的 平 均 值 的 SDWL 而 实 验 室 6 个 结 果 的 平 均 值 与 6 个 参 考 方 法 所 得 平 均 值 即 为 偏 倚 (bias) 某 个 实 验 室 结 果 在 TEA 内 的 概 率 ( 即 TE 得 分 ) 采 用 以 上 平 均 值 的 SDWL 和 bias 所 构 成 的 密 度 函 数 的 百 分 率 来 计 算 ( 这 里 密 度 函 数 的 宽 度 即 为 SDWL, 而 bias 则 要 求 在 TEA 范 围 内 ) 低 的 TE 得 分 可 能 意 味 着 明 显 的 正 或 负 偏 倚 或 很 大 的 室 内 SD 研 究 结 果 表 明, 有 必 要 对 这 些 项 目 进 行 更 多 的 一 致 化 努 力, 特 别 是 电 解 质 (Ca Cl Mg 和 Na), 酶 类 (ALT AMY AST 和 LDH), 脂 类 (HDL) 以 及 Crea 和 TP 具 体 如 下 :(1) 除 K 外, 4 个 国 家 所 有 电 解 质 的 得 分 都 很 低, 特 别 对 于 Ca Cl Mg 和 Na, 少 于 30% 的 实 验 室 TE 得 分 在 95% 标 准 之 上 CK 和 GGT 的 得 分 很 高, 但 对 于 ALT,AST 和 AMY, 实 验 室 内 和 实 验 室 间 的 TE 得 分 变 异 度 较 大 (2) 除 荷 兰 外, 其 他 3 个 国 家 LDH 的 得 分 特 别 差, 几 乎 为 0 原 因 在 于 很 多 实 验 室 采 用 丙 酮 酸 盐 而 不 是 IFCC 推 荐 的 乳 酸 盐 作 为 底 物, 这 些 方 法 产 生 2 倍 的 偏 倚 (3) 对 于 TC, 平 均 TE 得 分 大 于 90%, 超 过 85% 的 实 验 室 满 足 TE 得 分 大 于 95% 的 标 准 但 对 于 HDL 却 没 有 这 么 乐 观, 虽 然 葡 萄 牙 所 有 实 验 室 的 得 分 都 为 100%, 而 其 他 实 验 室 的 变 异 则 较 大 (4) 对 于 Crea 和 egfr, 所 有 实 验 室 的 平 均 得 分 和 TE 大 于 95% 的 百 分 率 都 很 低, 原 因 可 能 是 许 多 实 验 室 使 用 非 补 偿 的 Jaffe 动 力 法, 由 此 也 在 低 值 区 都 产 生 了 一 个 正 偏 倚 (5) 对 于 Glu 和 UA,4 个 国 家 的 大 多 数 实 验 室 性 能 表 现 较 好, 而 TP 则 较 差 按 照 欧 盟 IVDD98/79/EC 指 令 要 求, 所 有 检 测 结 果 都 应 溯 源 到 高 阶 参 考 物 质, 这 意 味 着 每 个 仪 器 的 结 果 都 应 该 和 参 考 方 法 有 可 比 性 然 而 该 初 步 研 究 的 结 果 表 明 仪 器 间 和 实 验 室 间 TE 得 分 的 变 异 很 大 原 因 是 很 多 实 验 室 没 有 采 用 IFCC 推 荐 的 方 法 ( 如 AMY 采 用 三 氧 化 物 作 底 物,LDH 采 用 丙 酮 酸 盐 ) 该 研 究 中 的 项 目 都 有 参 考 测 量 程 序 和 溯 源 链, 但 是 多 数 项 目 分 析 变 异 仍 然 存 在 这 就 提 示 单 纯 的 标 准 化 对 结 果 的 一 致 性 是 远 远 不 够 的, 还 需 要 方 法 和 操 作 的 一 致 化 ( 首 都 医 科 大 学 附 属 北 京 朝 阳 医 院 张 顺 利 王 清 涛 报 道 ) 体 外 医 疗 诊 断 量 值 溯 源 的 验 证 : 策 略 与 责 任 据 Clinica Chimica Acta 2014 年 9 月 报 道 题 : 体 外 医 疗 诊 断 量 值 溯 源 的 策 略 和 责 任 ( 作 者 Federica Braga 等 ) 检 验 医 学 的 目 的 是 为 临 床 准 确 诊 断 治 疗 提 供 有 用 的 信 息, 从 而 提 高 医 疗 保 健 的 质 量 对 于 临 床 检 验 而 言, 不 同 实 验 室 不 同 检 测 系 统 对 同 一 分 析 物 的 测 定 结 果 都 应 该 是 准 确 一 致 的 为 了 达 到 这 一 目 标, 明 确 定 义 每 种 分 析 测 量 物, 建 立 计 量 学 参 考 测 量 体 系 和 确 定 临 床 测 量 不 确 定 度 的 评 价 标 准 至 关 重 要 只 有 建 立 了 连 续 的 计 量 溯 源 链, 体 外 诊 断 (IVD) 制 造 商 才 能 够 将 高 一 级 参 考 方 法 的 测 量 真 值 正 确 传 递 给 商 品 化 校 准 品 欧 盟 (EU) 指 南 98/78 要 求 制 造 商 确 保 他 们 的 分 析 系 统 可 溯 源 至 公 认 的 更 高 级 别 参 考 体 系 目 前 缺 乏 第 三 方 机 构 对 制 造 商 的 声 明 进 行 确 认 或 验 证 由 国 际 计 量 局 (BIPM) 国 际 临 床 化 学 和 实 验 室 医 学 联 合 会 (IFCC) 和 国 际 实 验 室 认 可 合 作 组 织 (ILAC) 组 成 的 检 验 医 学 溯 源 联 合 委 员 会 (JCTLM) 确 定 了 一 个 数 据 库 清 单, 它 包 含 计 量 学 溯 源 性 和 标 准 化 的 三 根 支 柱, 即 1) 高 阶 参 考 物 质,2) 高 阶 参 考 方 法,3) 通 过 认 可 的 参 考 实 验 室 所 提 供 的 服 务 这 些 信 息 提 供 给 IVD 制 造 商, 使 他 们 能 够 符 合 欧 盟 指 南 要 求, 实 现 常 规 测 量 方 法 的 计 量 学 溯 源 性 此 外,JCTLM 还 描 述 临 床 实 践 中 标 准 化 的 三 个 方 面, 分 别 是 1)2005 年,IFCC 医 学 决 定 值 委 员 会 提 出 了 可 溯 源 的 参 考 区 间 别 ;2) 质 量 控 制 计 划, 包 括 室 内 质 控 和 室 间 质 评 ; 3) 检 测 项 目 的 测 量 不 确 定 度 和 误 差 应 在 临 床 可 接 受 范 围 以 内 在 确 定 分 析 目 标 时, 应 特 别 注 意 溯 源 链 的 选 择 为 保 证 临 床 实 验 室 测 量 结 果 能 够 更 好 的 应 用 于 临 床, 在 明 确 溯 源 链 的 基 础 上, 还 须 进 一 步 确 定 两 个 界 限, 它 们 是 1) 厂 家 商 品 化 校 准 品 扩 展 不 确 定 度 的 允 许 限, 2) 针 对 各 临 床 实 验 室 的 允 许 总 误 差 (TEa) 一 方 面, 制 造 商 需 按 照 欧 盟 指 南 要 求, 确 保 其 分 析 系 统 可 溯 源 至 高 阶 参 考 体 系 如 果 厂 家 提 供 的 溯 源 和 不 确 定 度 信 息 是 针 对 整 个 分 析 检 测 系 统 ( 即 检 测 设 备 试 剂 校 准 品 质 控 品 ), 则 实 验 室 无 需 分 别 考 虑 每 个 要 素 对 检 测 结 果 的 影 响 然 而, 任 何 与 分 析 检 测 系 统 相 关 的 要 素 发 生 改 变, 都 会 影 响 整 个 分 析 检 测 系 统 的 检 测 质 量 必 须 强 调, 为 了 有 效 的 利 用 检 测 结 果, 制 造 商 的 系 统 不 仅 要 有 溯 源 性, 而 且 要 能 满 足 基 于 临 床 应 用 的 分 析 目 标 这 就 要 求 制 造 商 提 供 的 不 确 定 度 估 计 应 是 合 成 不 确 定 度, 包 括 溯 源 链 上 端 和 测 量 方 法 的 不 确 定 度, 以 便 与 定 义 的 最 大 可 接 受 合 成 不 确 定 度 范 围 进 行 比 较 另 一 方 面, 一 旦 确 定 了 参 考 测 量 系 统 和 相 关 的 临 床 可 接 受 的 分 析 目 标, 同 时 IVD 厂 家 生 产 的 常 规 检 测 系 统 ( 包 括 检 测 设 备 试 剂 校 准 品 和 质 控 品 ) 能 够 满 足 溯 源 和 质 量 要 求 检 验 专 业 人 员 则 需 要 验 证 这 些 溯 源 过 程 的 一 致 性 和 这 些 系 统 的 性 能 是 否 符 合 临 床 应 用 的 要 求 验 证 方 法 : 1) 获 得 溯 源 和 测 量 不 确 定 度 的 完 整 信 息, 但 这 通 常 是 困 难 的 2) 每 日 对 IVD 检 测 系 统 溯 源 性 进 行 监 测, 包 括 系 统 的 配 套 溯 源 性, 室 内 质 控 和 室 间 质 评 总 之, 检 验 医 学 溯 源 理 论 具 有 巨 大 的 应 用 潜 力 可 概 括 为 如 下 六 方 面 : 1)JCTLM 负 责 定 义 和 批 准 参 考 测 量 体 系 ;2)IVD 行 业 的 溯 源 应 以 科 学 全 面 透 明 的 方 式 执 行 ;3)EQA 组 织 者 应 采 用 具 有 互 通 性 的 质 控 物, 组 织 基 于 准 确 度 的 室 间 质 量 评 价 计 划 ;4) 实 验 室 应 确 定 每 个 分 析 检 测 项 目 的 临 床 可 接 受 的 测 量 误 差 ;5) 每 个 实 验 室 需 通 过 参 加 适 当 的 EQA 计 划 和 应 用 临 床 可 接 受 限 的 方 式 监 测 其 分 析 检 测 性 能 ;6) 实 验 室 应 放 弃 非 特 异 性 方 法 存 在 明 显 的 质 量 问 题 的 分 析 检 测 系 统 及 厂 家 ( 首 都 医 科 大 学 附 属 北 京 朝 阳 医 院 周 睿 王 尉 王 清 涛 报 道 ) 如 何 间 接 评 估 新 生 儿 血 小 板 参 数 的 参 考 区 间 据 Clin Biochem 2014 年 7 月 报 道 题 : 实 验 室 检 测 过 程 质 量 保 证 : 间 接 评 估 新 生 儿 血 小 板 参 数 参 考 区 间 ( 作 者 DS.Grecu 等 ) 参 考 区 间 是 临 床 医 生 解 释 检 验 结 果 的 依 据, 在 临 床 决 策 和 患 者 护 理 质 量 中 发 挥 着 重 要 作 用 因 此, 检 验 报 告 中 提 供 准 确 可 靠 的 参 考 区 间 是 非 常 必 要 的 ISO 医 学 实 验 室 质 量 和 能 力 准 则 要 求 实 验 室 定 期 复 核 生 物 参 考 区 间 因 此, 参 考 区 间 应 适 用 于 特 定 的 参 考 人 群 和 检 测 系 统 满 足 该 要 求 的 最 佳 方 法 是 实 验 室 根 据 所 使 用 的 检 测 方 法 建 立 自 己 的 参 考 区 间 实 验 室 通 常 采 用 美 国 临 床 和 实 验 室 标 准 化 协 会 (CLSI) 指 南 中 的 直 接 抽 样 方 法, 每 个 分 组 ( 年 龄 性 别 ) 需 至 少 抽 取 120 例 合 格 参 考 个 体, 利 用 非 参 数 统 计 方 法 建 立 参 考 区 间 某 些 情 况 下, 如 建 立 儿 科 参 考 区 间 时, 很 难 获 得 健 康 个 体 并 涉 及 伦 理 问 题, 因 此 关 于 儿 科 检 验 项 目 参 考 区 间 的 信 息 非 常 有 限 大 部 分 文 献 报 道 的 血 小 板 参 数 参 考 区 间 仅 针 对 Sysmex Coulter 等 检 测 系 统 为 建 立 适 用 于 本 实 验 室 检 测 系 统 [ 日 本 光 电 全 自 动 血 液 分 析 仪 (Nihon Celltac F)] 的 血 小 板 参 数 参 考 区 间, 保 证 实 验 室 检 测 质 量, 罗 马 尼 亚 的 研 究 人 员 进 行 了 该 项 研 究 罗 马 尼 亚 Timisoara 医 药 大 学 生 物 化 学 和 药 学 实 验 室 的 Grecu 等 利 用 间 接 抽 样 方 法, 从 Athena 医 院 实 验 室 信 息 系 统 中 采 集 了 2011 年 1 月 ~2012 年 12 月 期 间, 在 Nihon Celltac F 血 液 分 析 仪 上 检 测 的 1,124 份 新 生 儿 ( 出 生 第 一 天 ) 静 脉 全 血 细 胞 计 数 (CBCs) 结 果 血 小 板 参 数 包 括 血 小 板 计 数 (PLT) 血 小 板 压 积 (PCT) 血 小 板 平 均 体 积 (MPV) 及 血 小 板 分 布 宽 度 (PDW) 利 用 两 种 不 同 的 统 计 方 法 : 简 单 非 参 数 法 和 Bootstrap 法 计 算 获 得 了 血 小 板 参 数 参 考 区 间 研 究 结 果 显 示,PLT 参 考 区 间 :270.39±0.68 (156~ /L);PCT 参 考 区 间 : 0.151±0.0072(0.10%~0.23%);MPV: 5.72±0.0085(4.0~8.0fL); 血 小 板 分 布 宽 度 (PDW) 参 考 区 间 :17.67±3.03 (16.3%~18.9%) 两 种 不 同 的 统 计 方 法 获 得 的 血 小 板 参 数 参 考 区 间 基 本 相 同, 差 异 无 统 计 学 意 义 与 其 它 文 献 报 道 比 较, 血 小 板 计 数 的 参 考 区 间 与 其 一 致, 而 由 于 可 能 存 在 的 检 测 方 法 学 差 异, PCT MPV 和 PDW 参 考 区 间 则 不 同 该 研 究 使 用 两 种 不 同 的 统 计 方 法 评 估 了 Nihon Celltac F 血 液 分 析 仪 血 小 板 相 关 参 数 的 参 考 区 间 实 验 室 既 满 足 了 ISO 的 要 求, 也 验 证 了 实 验 室 建 立 自 身 参 考 区 间 的 必 要 性 ( 首 都 医 科 大 学 附 属 北 京 朝 阳 医 院 张 建 平 岳 育 红 王 清 涛 报 道 )

8 цѡ B8 责任编辑 高 卓 临床分子诊断 Clinical Molecular Diagnosis 编者按 2012 年 6 月 Nature 发表了一篇关于微滴式数字 PCR 系统 droplet digital PCR ddpcr 的介绍及其前景展望 正式宣告了数字 PCR 时代的到来 微滴式数字 PCR 通过对样本进行微 滴化处理使其形成数千个微小的反应体系 从而在其内进行单分子或几个分子的扩增 摆脱了 内参基因 标准曲线的限制 可实现真正意义上的绝对定量 同时提供了绝对的检测精度和极 高的灵敏度 是其他诸如新一代测序 芯片杂交等平台无法达到的 因此可以广泛应用于基因 表达量差异检测 产前诊断 个性化基因治疗等领域 染色体整合型人类疱疹病毒 6 的检测 微滴式数字 PCR 法检测肝 癌组织样本中 HBV 含量 据 Clin Chem 2014年10月报道 题 新一代微滴数字 PCR法对肝癌患者福尔马林固定-石蜡包埋组织中的乙肝病毒 DNA含量的检测和分析 作者Jing-Tao Huang等 肝细胞癌 Hepatocellular carcinoma HCC 是世界上最常见 的恶性肿瘤 2008年全世界有70万病例确诊 肝细胞癌的死亡 率极高 五年生存率只有5%~9% HCC的发生和HBV病毒的携 据 Clin Chem 2014年3 cihhv-6一致的高hhv-6病毒拷 研究者们对确诊的ciHHV-6 带 HBV病毒性肝炎的持续发生密切相关 说明其对肝癌的发 月报道 题 通过微滴式数字 贝数 同样会误导或延迟医务 患者 来自ciHHV-6患者的一株 生具有累积效应 现代医学界普遍采用血清学实验和定量PCR PCR识别染色体整合的人类疱疹 工作者对于HHV-6阳性感染病 细胞系以及疑似ciHHV-6的造血 quantitative PCR 的方法来对HBV进行检测 然而 由于受到 病毒6 作者Ruth Hall Sedlak等 患的临床诊断 干细胞移植患者样本进行了分 HBV表面抗原的多样性和病毒低拷贝量的影响使上述检测方法常 人类疱疹病毒6 HHV- 目前 cihhv-6的检测识 析 结果显示在荧光原位杂交 出现假阴性结果 尤其是在对HBV拷贝数较少样本的检测中 定 6 潜在地影响着超过90%的成 别需要应用荧光原位杂交法 法所确认的ciHHV-6携带者的样 量PCR的准确性中受到了限制 年人 并在30%~50%的移植后 FISH 这一方法十分耗 品中 ddpcr方法能够准确的识 来自武汉大学中南医院的Jing-Tao Huang等研究者们指出 当 患者体内被激活 最近研究表 时且利用率有限 毛囊细胞 别细胞样本中的ciHHV-6 在白 一个未知样本的定量PCR Cq quantification cycle Cq 值接近PCR 明大约有1%的人口其HHV-6 HHV-6 PCR测试也可用于检测 膜层细胞和外周血单核细胞样 体系Cut-off值的时候 它的结果很难准确判定 这一现象在福 可以稳定整合到所有体细胞和 这一病毒 但由于毛囊细胞样 本中HHV-6与细胞的比例非常 尔马林固定-石蜡包埋 FFPE 的HCC病理标本中频繁出现 同 生殖细胞染色体端粒区域 这 本是许多分子诊断实验室的非 接近1 1.02±0.03 进而验证 时 在临床实践中 肝硬化失代偿期的患者也需要通过检测HBV 种染色体整合形式的HHV-6 典型样本 也导致了有限的应 了该方法的有效性 此外 该 病毒DNA含量来给予紧急的抗病毒治疗 因此 需要开发一种更 cihhv-6 能够通过生殖途径 用范围 在该研究中 华盛顿 研究进一步评估了该方法是否 具分析灵敏性和准确性的方法来确定HBV感染 Jing-Tao Huang等 从父母传递给子代 目前临床 大学医学中心的研究者们通过 能够在血浆样本中对HHV-6进 人运用微滴式数字PCR Droplet digital PCR 的方法来检测FFPE肝 上普遍采用定量PCR的方法对疑 微滴式数字PCR Droplet digital 行检测 结果显示 ddpcr对于 癌组织样本中HBV的拷贝数 并验证了这一方法的准确性和敏感 似HHV-6感染个体进行检测 PCR ddpcr 的方法对不同细 血浆样本中HHV-6的检测具有 性 同时对HBV拷贝数与肿瘤分期和临床其他检测项目之间的关 这一方法会导致部分ciHHV-6的 胞样本 白膜层 外周血单核 100%的灵敏度 对于ciHHV-6 系进行了评估 个体被误诊为HHV-6感染 从 细胞 中ciHHV-6 DNA拷贝数 检测的特异性可以达到82% 充 研究者收集了132例肝癌患者和27例正常人的肝脏肿瘤组织 而对其进行不必要的药物及临 进行了检测 将其结果表示为 分展现了ddPCR在临床诊断中的 石蜡包埋样本 分别提取组织样本DNA 纯化后进行ddPCR检 床治疗 对病患造成生理危害 HHV-6 DNA拷贝数与细胞数的 应用价值和前景 测 同时针对所有患者来源进行血清生物化学检验和临床信息收 和经济损失 相反 HHV-6阳 比例 从而建立了一种快速有 哈尔滨医科大学附属第四医院 集分析 经过免疫学分析 排除患者组中的一名HCV感染患者 性感染者的样本中也可以有与 效的ciHHV-6鉴定与检测方法 李秀丽 姜晓峰 报道 其余131名患者中HBsAg阳性携带者分别按照Tumor Nodes Metastasis TNM 和Barcelona Clinic Liver Cancer BCLC 分期法进行分类 微滴式数字 PCR 检测 HCV 核心蛋白密码子突变 另外的25个HBsAg阴性患者也进行了分类分析 尔后通过ddPCR 的方法进行了HBV含量检测 结果显示 ddpcr的方法在所有石蜡包埋组织样本成功检测 据 J Virol Methods 2014 对序列的数据分析 其错误率根 年7月报道 题 高通量高灵敏 据聚合酶的不同会产生一定的变 高度吻合 n =87 P < y=1.017x Pearson s 化 区间0.01%~1% R2= 个样本中85例 了排除假阳性结果的干扰 研究者同时分析了27例健康人的DNA 微滴式数字PCR Droplet 样本通过ddPCR证实有突变 但 样本 确定了其HBV DNA拷贝数<0.2copies/µl 结果的置信区间 digital PCR ddpcr 方法比传统 直接测序法仅仅检测出了32个 在99%以内 的定量PCR技术具有更好的分析 因此 ddpcr对血液样本检测 研究者将通过ddPCR扩增获得的结果与血清学检测进行了比 毒 感染约1.85亿人口 每年新 序列的能力 但目前尚没有研究 HCV突变有较高准确性 ddpcr 较分析 发现血清学检测HBsAg的假阴性率达到了18.3% 另外 增感染人口约300~400万 HCV 将这种技术应用到对病毒多态 的LOD比COBAS TaqMan HCV和 通过ddPCR的方法 可以在血清学检测HBsAg阴性患者的样本中 基因组包括一个带有9.6kbRNA 性的突变研究中 来自日本国家 Invader分析法要高200倍 敏感 检测出HBV的存在 且HCC患者FFPE样本中HBV拷贝数和标准 的开放阅读框 可编码3,010个 医学健康研究中心的研究者们设 度比直接测序法提升18.4倍 肿瘤阶段性 BCLC阶段分期 临床肝功能生化指标之间的相关 度微滴式数字PCR检测丙型肝炎 病毒核心蛋白氨基酸70密码子突 变 作者Motokazu Mukaide等 丙肝病毒是一种RNA病 到了乙肝病毒DNA 其HBV拷贝数范围为1.1~175.5 copies/µl 为 性 发现HBV拷贝数与两种HCC肿瘤分期结果呈正相关关系 与 氨基酸 发生在核心蛋白70号 计了高通量高敏感性的ddPCR方 这一研究首次对ddPCR 氨基酸密码子 Core a.a.70 的 法 来检测丙肝病毒Core a.a.70突 这种高敏感性量化技术检测 血清胆碱酯酶含量也具有明显相关性 与其他肝脏生化指标无明 突变因其与肝病的发展进程 变 并与定量PCR法和直接测序 病毒SNP进行了报道 也确认 显相关性 同时也是肝癌发生的独立危险 法得到的结果进行了比较分析 了ddPCR可以准确地量化HCV 由于乙型肝炎病毒共价闭合型DNA Covalently closed circular- 研究者们采集了2011年5 DNA并能在目标区域内找到突 DNA cccdna 对于肝细胞癌的疾病进展有着十分重要的意义 月至2013年5月感染HCV的患者 变点 同样 在其他病毒基因 研究者们利用微滴式数字PCR检测了这种DNA的含量 并对其拷 目前可用的技术中 直接 血清样本 年龄在69~87岁 组中利用这种新方法检测突变 贝数与HCC疾病几种因素进行了相关性的分析 结果显示cccDNA 测序法不能准确地检测突变 其 分别采用罗氏COBAS TaqMan 也是可行的 总之 ddpcr技 拷贝数与Child-Pugh得分和血清AFP具有明显的正相关性 具有监 他的方法 比如应用TaqMan探 HCV检测试剂 直接测序法 术可以应用于HCV突变或其它 测HCC病程进展的能力 针的定量PCR扩增技术检测突变 及ddPCR进行HCV Core a.a.70 病毒的基因组多态性的相对和 可以将敏感度提高到1% 但突 突变检测 结果显示 ddpcr 绝对定量检测 行检测 并能够结合TNM BCLT分期法为HCC患者进行病程分期 变发生率一般都在这一水平之 法与采用罗氏COBAS TaqMan 哈尔滨医科大学附属第四医院 提供依据 因子 Core a.a.70突变是肝病进 展和抗病毒治疗的主要因素 下 此外 焦磷酸测序技术用于 HCV试剂检测HCV得到的结果 李博文 姜晓峰 报道 综上所述 运用ddPCR技术可以对低拷贝数乙型肝炎病毒进 哈尔滨医科大学附属第四医院 方传丰 姜晓峰 报道