苏 州 大 学 学 位 论 文 独 创 性 声 明 及 使 用 授 权 声 明 学 位 论 文 独 创 性 声 明 本 人 郑 重 声 明 : 所 提 交 的 学 位 论 文 是 本 人 在 导 师 的 指 导 下, 独 立 进 行 研 究 工 作 所 取 得 的 成 果 除 文 中 已 经 注 明
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- 符坊 鱼
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1 苏 州 大 学 硕 士 学 位 论 文 ( 2006 届 ) 蛇 床 子 素 抑 制 地 塞 米 松 诱 导 大 鼠 骨 质 疏 松 形 成 及 其 作 用 机 制 研 究 Experimental study on inhibitory effect of osthole on rat osteoporosis induced by dexamethasone and its mechanism 研 究 生 姓 名 汤 群 芳 指 导 教 师 姓 名 谢 梅 林 顾 振 纶 专 业 名 称 药 理 学 研 究 方 向 论 文 提 交 日 期 中 药 药 理 2006 年 5 月
2 苏 州 大 学 学 位 论 文 独 创 性 声 明 及 使 用 授 权 声 明 学 位 论 文 独 创 性 声 明 本 人 郑 重 声 明 : 所 提 交 的 学 位 论 文 是 本 人 在 导 师 的 指 导 下, 独 立 进 行 研 究 工 作 所 取 得 的 成 果 除 文 中 已 经 注 明 引 用 的 内 容 外, 本 论 文 不 含 其 他 个 人 或 集 体 已 经 发 表 或 撰 写 过 的 研 究 成 果, 也 不 含 为 获 得 苏 州 大 学 或 其 它 教 育 机 构 的 学 位 证 书 而 使 用 过 的 材 料 对 本 文 的 研 究 作 出 重 要 贡 献 的 个 人 和 集 体, 均 已 在 文 中 以 明 确 方 式 标 明 本 人 承 担 本 声 明 的 法 律 责 任 研 究 生 签 名 : 日 期 : 学 位 论 文 使 用 授 权 声 明 苏 州 大 学 中 国 科 学 技 术 信 息 研 究 所 国 家 图 书 馆 清 华 大 学 论 文 合 作 部 中 国 社 科 院 文 献 信 息 情 报 中 心 有 权 保 留 本 人 所 送 交 学 位 论 文 的 复 印 件 和 电 子 文 档, 可 以 采 用 影 印 缩 印 或 其 他 复 制 手 段 保 存 论 文 本 人 电 子 文 档 的 内 容 和 纸 质 论 文 的 内 容 相 一 致 除 在 保 密 期 内 的 保 密 论 文 外, 允 许 论 文 被 查 阅 和 借 阅, 可 以 公 布 ( 包 括 刊 登 ) 论 文 的 全 部 或 部 分 内 容 论 文 的 公 布 ( 包 括 刊 登 ) 授 权 苏 州 大 学 学 位 办 办 理 研 究 生 签 名 : 日 期 : 导 师 签 名 : 日 期 :
3 摘 要 蛇 床 子 素 抑 制 地 塞 米 松 诱 导 大 鼠 骨 质 疏 松 形 成 及 其 作 用 机 制 研 究 中 文 摘 要 目 的 观 察 蛇 床 子 素 对 地 塞 米 松 所 致 大 鼠 骨 质 疏 松 形 成 的 影 响 及 其 作 用 机 制 的 探 讨 方 法 1. 整 体 动 物 模 型 : 采 用 SD 雌 性 大 鼠 48 只, 随 机 分 为 溶 媒 对 照 组, 地 塞 米 松 模 型 组, 蛇 床 子 素 5,10,20 mg/kg 组, 阳 性 对 照 VitD 3 组 除 溶 媒 对 照 组 外, 其 余 各 组 分 别 肌 注 地 塞 米 松, 同 时 给 予 相 应 的 药 物,8 周 后 行 血 清 学 指 标 骨 密 度 及 骨 组 织 形 态 学 检 测 2. 体 外 细 胞 实 验 : 酶 消 化 法 分 离 培 养 新 生 SD 大 鼠 颅 盖 骨 成 骨 细 胞, 用 改 良 Kaplow 氏 染 色 法 和 磷 酸 苯 二 钠 法 测 定 细 胞 碱 性 磷 酸 酶 (ALP) 活 性 ; 用 MTT 法 检 测 成 骨 细 胞 增 殖 情 况 ; 用 RT-PCR 方 法 测 定 TGF-β1 和 BGP mrna 的 表 达 结 果 1. 整 体 动 物 模 型 : 蛇 床 子 素 各 剂 量 组 的 血 清 P 3+ ALP E 2 PTH CT 和 IL-1 水 平 均 不 同 程 度 地 低 于 地 塞 米 松 模 型 组, 分 别 降 低 了 18.0 %~19.1%,41.9 %~52.7 %,14.1 %~38.0 %,2.3 %~56.0 %,10.3 %~21.1 %,8.3 %~33.3 %; 血 清 Ca 2+ BGP 水 平 高 于 地 塞 米 松 模 型 组, 分 别 增 加 了 5.0 %~20.0 %,13.4 %~21.5 % 蛇 床 子 素 能 明 显 增 加 骨 小 梁 的 数 目 和 宽 度, 提 高 股 骨 骨 密 度 2. 体 外 细 胞 实 验 : 蛇 床 子 素 对 新 生 SD 大 鼠 颅 盖 骨 成 骨 细 胞 的 增 殖 和 ALP 的 活 性 都 有 促 进 作 用 ;TGFβ1 和 BGP mrna 的 表 达 增 加 结 论 蛇 床 子 素 可 有 效 地 预 防 地 塞 米 松 诱 导 雌 性 大 鼠 骨 质 疏 松 症 的 发 生, 其 机 制 可 能 与 通 过 增 加 TGF-β1 和 BGP 水 平, 降 低 PTH 和 IL-1 水 平, 从 而 恢 复 机 体 激 素 和 细 胞 因 子 间 的 平 衡 有 关 关 键 词 : 骨 质 疏 松 ; 地 塞 米 松 ; 蛇 床 子 素 ; 转 化 因 子 -β1; 骨 钙 素 研 究 生 : 汤 群 芳 导 师 : 谢 梅 林 教 授 顾 振 纶 教 授 I
4 abstract Experimental study on inhibitory effect of osthole on rat osteoporosis induced by dexamethasone and its mechanism Abstract Objective To study the effect of osthole on osteoporosis induced by dexamethasone (Dex) in female rats, and to explore its mechanism. Methods 1.Experimental study in rats: forty-eight female SD rats were chosen. They were divided into six groups (control group, Dex model group, osthole 5, 10 and 20 mg/kg groups, Vitamin D 3 group). Osthole and Vitamin D 3 group were administered when the osteoporotic model was created. Serum calcium (Ca 2+ ), phosphorus (P 3+ ), alkaline phosphatase (ALP), estradiol (E 2 ), parathyroid hormone (PTH), osteocalcin (BGP), calcitonin (CT), interleukin-1 (IL-1)were measured. The bone mineral density (BMD) and histomorphological features of femural bone of rats were observed. 2. Experimental study on osteoblasts in cultured neonatal SD rat calvarial cells in vitro: Osteoblasts were isolated from neonatal rat calvaria through trypsin and collagenase digestion. Quality of the cells was assessed by special ALP histochemistry. The activity of ALP was measured by p-nitrophenyl sodium phosphate assay. MTT method was used to observe the proliferation of osteoblast cultured with osthole of different concentration and incubation periods. Expression of TGF-β1and BGP mrna was detected by RT-PCR. Results 1. As compared with Dex model group, levels of serum P 3+, ALP, E 2, PTH, CT and IL-1 in osthole groups were decreased by 18.0 %~19.1 %,41.9 %~52.7 %,14.1 %~38.0 %,2.3 %~56.0 %,10.3 %~21.1 % and 8.3 %~33.3 %, respectively, while levels of serum Ca 2+ and BGP were increased by 5.0%~20.0% and 13.4%~21.5 %, respectively. Osthole could markedly improve the morphological construction and BMD of femural bone in rats. 2. Osthole significantly promoted osteoblast proliferation, increased ALP activity and the expression of TGF-β1 and BGP mrna. II
5 abstract Conclusion Osthole could prevent the osteoporotic generation induced by Dex in female rats, its mechanism might be associated with restoring the balance between the hormone and cytokine by increasing the level of TGF-β1 and BGP and decreasing the level of serum PTH and IL-1. Key words: osteoporosis; dexamethasone; osthole; TGF-β1; BGP Written by: Qunfang Tang Supervised by: Prof Meilin Xie Prof Zhenlun Gu III
6 目 录 第 一 部 分 研 究 背 景 1 第 二 部 分 蛇 床 子 素 抑 制 地 塞 米 松 诱 导 大 鼠 骨 质 疏 松 的 实 验 研 究 7 第 三 部 分 蛇 床 子 素 对 新 生 大 鼠 成 骨 细 胞 增 殖 和 分 化 的 影 响 21 第 四 部 分 蛇 床 子 素 对 成 骨 细 胞 相 关 基 因 表 达 的 影 响 33 第 五 部 分 蛇 床 子 素 抗 糖 皮 质 激 素 引 发 骨 质 疏 松 的 机 制 讨 论 44 第 六 部 分 结 论 48 参 考 文 献 49 综 述 55 缩 写 词 表 61 攻 读 学 位 期 间 发 表 的 论 文 62 致 谢 63
7 研 究 背 景 第 一 部 分 研 究 背 景 骨 质 疏 松 症 以 骨 量 减 少 骨 组 织 细 微 结 构 退 化 为 特 征, 伴 有 骨 脆 性 增 加 及 易 发 生 骨 折 的 一 种 全 身 性 骨 骼 系 统 疾 病 [1] 据 欧 洲 联 盟 1998 年 6 月 份 的 一 份 有 关 骨 质 疏 松 的 报 告 报 道, 骨 质 疏 松 症 患 者 发 生 骨 折 的 危 险 在 女 子 可 高 达 40 %, 男 子 高 达 13 %; 髋 骨 骨 折 人 数 到 2050 年 将 由 1990 年 的 170 万 人 增 至 630 万 人 [2] 骨 质 疏 松 性 骨 折 是 由 于 骨 强 度 下 降 并 遭 受 创 伤 或 其 他 各 种 危 险 因 素 而 导 致 的 严 重 后 果 高 冲 击 性 摔 倒 或 日 常 生 活 中 的 提 重 和 弯 腰 均 有 可 能 导 致 骨 质 疏 松 性 骨 折, 其 造 成 的 后 果 涉 及 经 济 生 理 和 社 会 心 理 等 多 方 面, 从 而 严 重 影 响 患 者 本 人 家 庭 以 及 社 会 [3,4] 其 中 危 害 最 大 的 是 髋 部 骨 折, 死 亡 率 10 %~20 %, 余 下 的 50 % 将 终 身 残 疾 [5] 股 骨 骨 折 严 重 影 响 患 者 的 生 活 质 量 长 期 以 来, 糖 皮 质 激 素 (glucocorticoid, GC) 广 泛 应 用 于 肾 脏 疾 病 风 湿 性 疾 病 器 官 移 植 肺 部 疾 病 等 的 治 疗 这 类 药 物 通 过 非 特 异 性 抗 炎 抗 毒 和 免 疫 抑 制 等 药 理 效 应 发 挥 治 疗 作 用, 但 长 程 治 疗 引 起 的 骨 质 疏 松 又 成 了 临 床 医 师 面 临 的 难 题, 是 最 常 见 的 药 物 性 骨 质 疏 松 症, 称 之 为 糖 皮 质 激 素 性 骨 质 疏 松 症 (glucocorticoid induced ostoporosis, GIO), 其 发 病 率 仅 次 于 原 发 性 骨 质 疏 松 症 ( 绝 经 后 骨 质 疏 松 症 及 老 年 性 骨 质 疏 松 症 ) 而 居 第 三 位, 大 约 90 % 长 期 使 用 GC 者, 有 明 显 骨 量 丢 失, 骨 折 发 生 率 增 加 [6] 骨 在 整 个 生 命 过 程 中 都 具 有 新 陈 代 谢 的 活 性, 骨 形 成 骨 吸 收 和 静 止 构 成 骨 重 建 过 程, 一 般 骨 吸 收 和 骨 形 成 达 到 基 本 平 衡 GC 正 是 通 过 与 其 特 异 性 受 体 (glycocorticoid receptor, GCR) 结 合 而 抑 制 成 骨 细 胞 功 能, 减 少 新 生 骨 形 成 [7], 导 致 成 熟 的 具 有 分 泌 功 能 的 成 骨 细 胞 及 支 撑 破 骨 细 胞 产 生 的 成 骨 细 胞 数 目 减 少 [8] 此 外,GC 还 能 直 接 作 用 于 骨 基 质, 使 I 型 骨 胶 原 和 骨 钙 素 基 因 表 达 减 少 蛋 白 质 合 成 受 抑 [9] GC 抑 制 十 二 指 肠 跨 膜 Ca 2+ 转 运 载 体 的 活 性, 减 少 Ca 2+ 结 合 蛋 白 合 成, 并 使 粘 膜 结 合 部 位 1,25-(OH) 2 D 3 降 解 加 速 [10] 持 续 给 予 过 量 GC 可 导 致 高 尿 钙, 引 起 继 发 性 高 甲 状 旁 腺 激 素 (parathyroid hormone, PTH) 血 症 [9,10] GC 使 用 者 发 生 髋 关 节 骨 折 及 桡 骨 远 端 骨 折 的 危 险 性 是 非 GC 使 用 者 的 2 倍, 骨 骼 主 要 的 受 累 部 位 是 小 梁 骨 [11] 1
8 研 究 背 景 目 前 治 疗 骨 质 疏 松 症 的 药 物 主 要 有 三 大 类 : 一 类 以 抑 制 骨 吸 收 为 主, 又 称 为 抗 吸 收 药, 包 括 二 磷 酸 盐 降 钙 素 (calcitonin, CT) 雌 激 素 和 选 择 性 雌 激 素 受 体 调 节 剂 (selective estrogen receptor modulators, SERM) 此 类 抗 吸 收 药 物 通 过 减 少 骨 吸 收, 抑 制 新 的 骨 重 建 的 发 生, 减 少 重 建 空 白, 来 增 加 骨 密 度 (bome mineral density, BMD) 第 二 类 药 物 以 促 进 骨 形 成 为 主, 如 氟 化 物 甲 状 旁 腺 激 素 (parathyroid hormone, PTH) 同 化 类 固 醇 此 类 药 物 刺 激 新 骨 形 成, 使 形 成 的 新 骨 充 填 于 吸 收 陷 窝, 或 沉 积 于 未 被 吸 收 的 骨 表 面, 使 BMD 增 加 第 三 类 药 物 为 骨 矿 化 药 物, 主 要 包 括 钙 制 剂 和 维 生 素 (Vitamin, Vit)D 3 第 一 类 抗 骨 质 疏 松 药 : 1. 二 磷 酸 盐 : 二 磷 酸 盐 是 骨 重 建 中 与 羟 基 磷 灰 石 相 结 合 的 焦 磷 酸 盐 类 似 物, 能 抑 制 破 骨 细 胞 增 生 和 增 加 破 骨 细 胞 死 亡 同 时 也 能 刺 激 成 骨 细 胞 生 长 及 减 少 成 骨 细 胞 成 骨 母 细 胞 的 凋 亡 [12] 二 磷 酸 盐 结 构 稳 定, 吸 收 后 沉 积 于 骨 质 矿 化 处 和 吸 收 陷 窝 研 究 表 明 二 磷 酸 盐 可 减 少 骨 的 吸 收, 增 加 BMD, 减 少 骨 折 发 生 率 [13] 目 前 用 于 临 床 的 二 磷 酸 盐 有 依 替 磷 酸 盐 (etidronate) 阿 仑 磷 酸 盐 (alendronate) 利 塞 磷 酸 盐 (risedronate) 等, 这 些 药 物 均 具 有 抗 骨 吸 收 能 力, 但 大 剂 量 服 用 可 不 同 程 度 地 抑 制 骨 矿 化, 故 建 议 采 用 间 歇 性 短 疗 程 给 药 如 小 剂 量 间 断 应 用 etidronate 可 增 加 骨 矿 化, 但 大 剂 量 持 续 使 用, 作 用 与 此 相 反 连 续 2 周 给 予 400 mg/d 的 etidronate, 随 后 补 钙 500 mg/d,11 周 后 可 使 腰 椎 BMD 增 加 4-8 %, 大 转 子 BMD 增 加 2 %, 椎 体 骨 折 发 生 率 显 著 减 少 [14] 但 用 药 期 间 不 宜 骤 然 停 药, 否 则 有 致 骨 折 发 生 率 增 高 的 可 能 [15] 二 磷 酸 盐 的 疗 效 主 要 是 促 使 骨 小 梁 骨 量 稳 定 并 增 加 其 数 量, 但 对 皮 质 骨 作 用 不 明 显 [5] 其 不 良 反 应 较 少, 有 时 会 发 生 胃 肠 道 不 适, 少 数 发 生 腐 蚀 性 食 管 炎, 多 发 生 在 用 药 后 一 个 月 内, 餐 前 二 小 时 服 药 及 服 药 后 多 饮 水 可 减 少 食 管 炎 的 发 生 和 增 加 药 物 吸 收, 食 管 狭 窄 食 管 失 弛 缓 症 或 其 它 食 管 排 空 障 碍 的 疾 病 患 者 禁 忌 应 用, 胃 食 管 返 流 性 疾 病 者 慎 用 [16] 但 近 来 开 发 出 的 新 一 代 二 磷 酸 盐 伊 班 磷 酸 盐 (ibandronate) 则 几 无 上 述 胃 肠 道 不 适, 尤 为 特 别 的 是, 此 药 不 需 长 期 服 用 [17] 2. CT: 2
9 研 究 背 景 CT 是 一 种 由 32 个 氨 基 酸 残 基 组 成 的 多 肽, 由 甲 状 腺 C 细 胞 ( 滤 泡 旁 细 胞 ) 产 生 CT 通 过 与 破 骨 细 胞 特 异 性 受 体 结 合, 直 接 作 用 于 破 骨 细 胞, 使 破 骨 细 胞 离 开 骨 吸 收 表 面, 抑 制 骨 的 再 吸 收 ; 并 能 使 破 骨 细 胞 内 部 结 构 发 生 改 变, 促 进 其 凋 亡 [12] 临 床 应 用 的 CT 包 括 猪 鲑 和 鳗 鱼 CT 对 绝 经 后 的 妇 女,CT 防 止 网 状 骨 [18] 质 的 骨 丢 失 效 果 优 于 皮 质 骨, 但 每 天 至 少 需 用 200IU 才 能 有 效 3 另 外,CT 具 有 β- 内 啡 呔 作 用, 有 良 好 的 止 痛 效 果, 可 用 于 治 疗 脊 椎 压 碎 性 骨 折 引 起 的 剧 痛 CranneyA [19] 等 研 究 发 现 用 CT 治 疗 6~12 月 与 单 独 补 充 钙 相 比, 更 能 有 效 维 持 长 期 应 用 GC 治 疗 患 者 的 腰 椎 BMD 然 而,CT 并 不 能 降 低 发 生 腰 椎 或 股 骨 颈 骨 折 的 危 险 性 因 而,CT 是 长 期 用 GC 治 疗 伴 低 BMD 病 人 的 二 线 用 药 由 于 CT 价 格 昂 贵, 且 必 须 注 射 给 药, 恶 心 潮 红 和 腹 泻 等 副 反 应 常 见, 并 且 长 期 用 药 致 体 内 产 生 中 和 抗 体 使 疗 效 降 低, 限 制 了 临 床 应 用 3. 雌 激 素 : 雌 激 素 是 防 治 绝 经 后 骨 质 疏 松 症 (postmenopausal osteoporosis, PMOP) 的 首 选 药 物, 一 般 在 绝 经 后 的 5~8 年 疗 效 最 明 显, 此 法 称 为 雌 激 素 替 代 疗 法 (estrogen replacement therapy, ERT) 其 机 制 为 雌 激 素 能 与 成 骨 细 胞 上 的 相 应 受 体 结 合, 通 过 促 进 成 骨 细 胞 分 泌 胶 原 酶, 释 放 生 长 因 子 细 胞 因 子 等 促 进 骨 有 机 质 合 成 和 骨 重 建, 同 时, 雌 激 素 可 直 接 抑 制 破 骨 细 胞 性 骨 吸 收, 在 有 效 抑 制 浓 度 下, 雌 激 素 可 直 接 造 成 破 骨 细 胞 凋 亡, 并 呈 时 间 和 剂 量 依 赖 性 另 外, 雌 激 素 还 通 过 钙 调 节 激 素 如 PTH CT VitD 3 等 发 挥 对 骨 代 谢 的 调 节 作 用 [20,21] 但 到 目 前 为 止, 还 没 有 研 究 证 明 ERT 对 于 预 防 GIO 的 有 效 性 临 床 上 长 期 使 用 雌 激 素 可 增 加 乳 腺 癌 子 宫 内 膜 癌 发 生 的 危 险 性 4. SERM: [6] 故 目 前 仅 推 荐 用 于 短 期 妇 女 绝 经 后 骨 质 疏 松 症 的 治 疗 [22] SERM 是 指 一 组 人 工 合 成 的 结 构 不 同 的 非 类 固 醇 化 合 物, 与 雌 激 素 受 体 结 合 后 在 不 同 靶 组 织 分 别 产 生 类 雌 激 素 样 和 拮 抗 雌 激 素 的 作 用 对 第 二 代 代 表 药 物 雷 洛 昔 芬 (raloxifene) 多 重 治 疗 效 果 的 评 价 研 究 (MORE 研 究 ) 发 现, 与 对 照 组 相 比, Raloxifene 用 药 1 年 时 患 者 新 椎 体 骨 折 发 生 率 降 低 68 %, 服 用 2 年 时 椎 体 骨 折 发 生 率 降 低 46 %, 服 用 4 年 时 降 低 39 %, 因 此 长 期 服 用 Raloxifene 60 mg/d 可 降 低 椎 体 骨 折 的 发 生 [23] Raloxifene 对 子 宫 内 膜 的 影 响 较 小, 表 现 为 抗 激 素 样 作 用 [24] Raloxifene 的 治 疗 效 果 与 多 种 影 响 因 素 ( 如 身 体 矮 小 症 年 龄 绝 经 年 数 骨 骼 强
10 研 究 背 景 度 糖 尿 病 等 ) 无 关 [25-26], 但 它 可 增 加 静 脉 血 栓 栓 塞 的 危 险 性 [27] Raloxifene 已 被 FDA 批 准 用 于 预 防 和 治 疗 绝 经 后 骨 质 疏 松 迄 今, 没 有 实 验 证 实 SERM 在 预 防 和 治 疗 GIO 中 的 有 效 性 [6] 第 二 类 抗 骨 质 疏 松 药 : 1. 氟 化 钠 : 氟 化 物 能 刺 激 GC 治 疗 患 者 的 成 骨 细 胞 的 增 殖 分 化, 并 且 使 降 低 的 血 清 骨 钙 素 水 平 恢 复 正 常 [6] 有 研 究 报 道 202 例 绝 经 后 骨 质 疏 松 患 者 应 用 氟 化 钠 治 疗 四 年, 腰 椎 BMD 每 年 增 加 8 %, 对 椎 体 骨 折 的 发 生 率 无 明 显 影 响 但 也 有 报 道, 氟 化 钠 可 明 显 减 少 椎 体 骨 折 发 生 率 [28] 氟 化 钠 的 主 要 不 良 反 应 包 括 胃 肠 道 不 适, 尤 其 是 下 肢 骨 关 节 疼 痛 及 继 发 性 钙 缺 乏 2. PTH: PTH 是 由 84 个 氨 基 酸 残 基 组 成 的 多 肽, 能 直 接 作 用 于 成 骨 细 胞 PTH 特 异 性 受 体, 通 过 选 择 性 增 加 骨 形 成 表 面 积 和 增 加 胰 岛 素 样 生 长 因 子 (insulin-like growth factor, IGF)-1 的 合 成 来 刺 激 成 骨 细 胞 的 分 化 增 殖, 从 而 增 加 骨 质 [6] 应 用 PTH 治 疗 二 年, 椎 体 BMD 增 加, 但 股 骨 颈 的 BMD 变 化 不 大, 对 骨 折 发 生 率 的 影 响 尚 不 清 楚 [29] 34 例 接 受 ERT 的 患 者, 同 时 应 用 PTH 治 疗 三 年, 腰 椎 BMD 增 加 13 %, 大 转 子 BMD 增 加 3 %, 椎 体 畸 形 的 发 生 率 显 著 下 降 [30] 但 有 研 究 表 明, 连 续 给 予 PTH 时, 破 骨 细 胞 吸 收 和 成 骨 细 胞 合 成 都 增 加, 最 终 导 致 骨 丢 失 相 反, 间 歇 给 予 PTH, 骨 质 和 骨 密 度 都 有 所 增 加, 椎 骨 骨 折 发 生 率 也 有 所 降 低 [31] 应 用 PTH 治 疗 骨 质 疏 松 症 有 可 能 引 起 甲 状 腺 机 能 减 退 和 一 过 性 血 Ca 2+ 升 高 等 副 反 应 第 三 类 抗 骨 质 疏 松 药 : 1. 钙 : 一 般 人 体 每 日 需 要 1200~1500mg Ca 2+, Ca 2+ 可 以 从 饮 食 中 获 取, 也 可 用 枸 橼 酸 钙 补 充, 由 于 枸 橼 酸 钙 可 溶 于 所 有 ph 值 溶 液, 而 碳 酸 钙 要 求 在 酸 性 溶 液 中 使 用, 所 以 枸 橼 酸 钙 的 吸 收 比 碳 酸 钙 好, 对 于 同 时 需 要 补 酸 的 患 者, 碳 酸 钙 较 合 适 单 纯 补 充 钙 对 预 防 和 治 疗 骨 质 疏 松 症 的 作 用 一 直 存 在 争 议, 一 般 认 为, 在 青 春 期 之 前 补 钙 可 增 加 骨 量, 并 可 使 骨 量 增 加 到 最 大 限 度 钙 剂 大 多 是 安 全 的, 但 摄 入 大 4
11 研 究 背 景 剂 量 钙 可 发 生 便 秘, 理 论 上 认 为 肾 结 石 危 险 性 也 可 增 加, 但 尚 无 实 验 依 据 [32-34] 2. VitD 衍 生 物 : 作 为 机 体 必 需 营 养 成 分 及 激 素, 在 维 持 机 体 钙 磷 代 谢 平 衡 起 着 重 要 作 用, 是 机 体 维 持 钙 内 环 境 稳 定 的 主 要 调 节 激 素 之 一, 对 正 常 骨 的 矿 化 有 一 定 的 作 用, 被 认 为 是 一 种 与 骨 代 谢 有 关 的 激 素 VitD 3 可 有 效 防 止 老 年 妇 女 的 髋 骨 骨 折 和 非 椎 体 骨 折 Chapuy [35] 等 发 现 在 1765 名 老 年 妇 女 中 服 用 1200 mg Ca 2+ 和 800 IU VitD 3,18 月 后, 与 安 慰 剂 组 相 比 髋 骨 骨 折 减 少 43 %, 非 椎 体 骨 折 减 少 32 % 在 随 后 的 研 究 中 发 现, 每 日 服 用 1200 mg Ca 2+ 和 800 IU VitD 3 36 月 后, 可 持 续 预 防 髋 骨 骨 折 和 非 椎 体 骨 折 VitD 衍 生 物 的 不 良 反 应 有 头 痛, 失 眠, 骚 痒 等 [5] 但 近 来 有 报 道 指 出, 妇 女 绝 经 后 骨 质 疏 松 症 伴 体 内 VitD 缺 乏 患 者, 服 用 500 mg Ca 2+ 和 400 IU VitD 3 治 疗 [35] 12 个 月 后, 疗 效 未 见 满 意 大 多 数 临 床 研 究 表 明 联 合 应 用 钙 和 VitD 对 于 GC 治 疗 的 患 者 是 必 须 的 [6], 但 不 能 代 替 Ca 吸 收 不 良 的 一 类 药 物 的 治 疗 [5], 此 外 应 在 用 药 过 程 中 注 意 高 钙 血 症 和 高 钙 尿 的 发 生 [12] 各 种 补 肾 健 脾 中 药 ( 淫 羊 藿 骨 碎 补 蛇 床 子 杜 仲 黄 芪 ) 及 其 复 方 制 剂 均 具 有 防 治 骨 质 疏 松 症 的 作 用, 如 有 研 究 者 报 道 青 娥 丸 金 刚 健 骨 片 延 藿 骨 宝 等 中 药 在 防 治 骨 质 疏 松 症 中 具 有 整 体 调 治 疗 效 确 切 毒 副 作 用 相 对 较 少 等 优 势, 但 目 前 对 防 治 骨 质 疏 松 症 中 药 的 开 发 研 究 工 作 还 处 于 初 级 阶 段, 真 正 开 发 出 的 成 药 很 少, 中 药 中 有 效 成 份 的 研 究 报 道 也 较 少 如 何 利 用 我 国 丰 富 的 中 药 资 源, 结 合 传 统 中 医 药 理 论 及 现 代 药 理 学 试 验, 利 用 现 代 科 技, 把 中 药 治 疗 骨 质 疏 松 症 的 有 效 成 份 和 临 床 药 理 作 用 进 行 深 入 分 析, 尽 快 开 发 出 既 安 全 疗 效 又 好 易 于 被 广 大 患 者 所 接 受 的 产 品 是 目 前 研 究 骨 质 疏 松 药 物 的 发 展 趋 势 蛇 床 子 素 是 从 伞 形 科 蛇 床 子 属 植 物 蛇 床 (Cnidium monnier (L.) Cusson) 的 果 实 中 提 取 的 一 种 香 豆 素 类 化 合 物, 分 子 量 , 其 毒 性 较 低,LD 50 为 g/kg, 现 代 药 理 学 研 究 证 明, 蛇 床 子 素 具 有 多 种 药 理 作 用, 包 括 促 成 骨 细 胞 的 作 用 抗 炎 抗 心 律 失 常 抗 诱 变 抗 肿 瘤 抗 变 态 反 应 以 及 抑 制 伴 刀 豆 球 蛋 白 A 所 致 小 鼠 肝 炎 改 善 小 鼠 学 习 记 忆 等 作 用 [37-42] 近 年 来, 有 人 发 现 蛇 床 子 中 所 含 的 香 豆 素 类 成 份 具 有 预 防 和 治 疗 骨 质 疏 松 的 作 用 [43] 蛇 床 子 素 能 够 提 高 成 骨 细 胞 3 H-TdR 5
12 研 究 背 景 和 3 H- 脯 氨 酸 掺 入 量, 在 成 骨 细 胞 分 化 阶 段 明 显 增 加 碱 性 磷 酸 酶 的 活 性, 提 示 其 具 有 刺 激 成 骨 细 胞 增 殖 和 骨 胶 原 合 成 作 用 [44], 但 至 今 未 见 在 整 体 动 物 上 对 蛇 床 子 素 防 治 地 塞 米 松 诱 导 的 骨 质 疏 松 症 及 其 作 用 机 制 的 系 统 研 究 报 道 本 文 通 过 整 体 动 物 的 预 防 性 给 药 实 验 和 体 外 成 骨 细 胞 培 养 实 验 研 究, 观 察 蛇 床 子 素 对 地 塞 米 松 诱 导 大 鼠 骨 质 疏 松 症 的 影 响, 并 探 讨 其 可 能 的 作 用 机 制, 为 蛇 床 子 素 应 用 于 临 床 提 供 实 验 依 据 和 理 论 基 础 6
13 第 二 部 分 第 二 部 分 蛇 床 子 素 抑 制 地 塞 米 松 诱 导 大 鼠 骨 质 疏 松 的 实 验 研 究 随 着 GC 广 泛 应 用 于 临 床, GIO 发 生 率 增 加, 仅 次 于 原 发 性 骨 质 疏 松 症 ( 绝 经 后 骨 质 疏 松 及 老 年 性 骨 质 疏 松 ), 而 居 第 三 位 [6] 因 而 GIO 发 病 机 制 及 其 防 治 也 越 来 越 受 到 关 注, 寻 找 一 种 疗 效 确 切 毒 副 作 用 相 对 较 少 的 抗 骨 质 疏 松 症 药 物 是 当 前 研 究 的 热 点 蛇 床 子 为 伞 形 科 蛇 床 子 属 植 物 蛇 床 (Cnidium monnier (L.) Cusson) 的 果 实, 具 有 温 肾 助 阳 之 功 效, 现 代 药 理 研 究 证 明, 蛇 床 子 提 取 物 蛇 床 子 总 香 豆 素 具 有 抗 骨 质 疏 松 症 的 作 用 [43,44] 本 课 题 拟 采 用 大 鼠 地 塞 米 松 肌 注 法 建 立 GIO 动 物 模 型, 进 一 步 观 察 蛇 床 子 总 香 豆 素 的 成 份 之 一 蛇 床 子 素 对 地 塞 米 松 诱 导 的 大 鼠 骨 质 疏 松 模 型 影 响, 为 蛇 床 子 素 预 防 骨 质 疏 松 症 提 供 实 验 依 据 一 材 料 与 方 法 1 药 品 与 试 剂 1) 蛇 床 子 素, 纯 度 为 95 %, 批 号 :030516, 西 安 绿 泉 生 物 技 术 有 限 公 司 提 供, 用 0.2 % 吐 温 -80 配 制 成 0.05 % 0.1 % 0.2 % 混 悬 液, 备 用 2) 维 生 素 D(VitD 3 3 ), 上 海 罗 氏 制 药 有 限 公 司 惠 赠, 用 0.2% 吐 温 -80 配 制 成 2μg % 混 悬 液, 备 用 3) 地 塞 米 松 磷 酸 钠 注 射 液, 批 号 , 江 苏 第 六 制 药 厂 提 供 4) 血 清 碱 性 磷 酸 酶 (ALP), 磷 (P 3+ ), 钙 (Ca 2+ ) 测 定 试 剂 盒, 批 号 : 均 为 , 南 京 建 成 生 物 技 术 公 司 提 供 5) PTH, 雌 二 醇 (E 2 ) 放 射 免 疫 测 定 试 剂 盒, 批 号 均 为 白 细 胞 介 素 -1(IL-1), 骨 钙 素 (BGP), 降 钙 素 (CT) 放 射 免 疫 测 定 试 剂 盒, 批 号 均 为 这 些 试 剂 盒 均 由 北 京 中 国 原 子 能 科 学 研 究 院 提 供 2 主 要 仪 器 LUNAR DPXIQ 双 能 X 线 骨 密 度 仪 ( 美 国 GE 公 司 );γ 放 射 免 疫 仪 ( 上 海 原 子 能 核 研 究 所 );Labsystems Wellscan MK3 酶 标 仪 和 4MK2 洗 板 机 ( 芬 兰 雷 勃 公 司 ); KG-101 型 高 精 密 度 显 光 栅 位 移 测 微 计 和 722 型 分 光 光 度 计 ( 上 海 第 三 分 析 仪 器 厂 ) 7
14 第 二 部 分 3 实 验 动 物 3 月 龄 健 康 SD 雌 性 大 鼠 48 只, 体 重 160±20g, 清 洁 级, 苏 州 大 学 实 验 动 物 中 心 供 应, 实 验 动 物 生 产 许 可 证 :XCYK( 苏 ) , 实 验 动 物 使 用 许 可 证 号 : XCYK( 苏 ) 实 验 方 法 动 物 分 组 : 取 SD 雌 性 大 鼠 48 只, 适 应 性 喂 养 1 周 后, 随 机 分 成 6 组, 即 : 溶 媒 对 照 组 模 型 组 阳 性 药 组 及 蛇 床 子 素 5,10,20 mg/kg 组, 每 组 8 只, 分 笼 喂 养 骨 质 疏 松 模 型 的 复 制 [45] : 分 组 后, 除 溶 媒 对 照 组 外, 其 余 各 组 大 鼠 分 别 给 予 肌 肉 注 射 地 塞 米 松 磷 酸 钠 1mg/kg, 每 周 2 次, 溶 媒 对 照 组 大 鼠 给 予 等 量 生 理 盐 水 肌 注 所 有 大 鼠 喂 食 正 常 饲 料, 自 由 饮 水, 共 8 周 大 鼠 每 周 称 重 一 次 给 药 方 法 : 在 模 型 复 制 的 同 时, 每 天 上 午 溶 媒 对 照 组 和 模 型 组 大 鼠 以 10 ml/kg (0.2% 吐 温 -80) 溶 媒 溶 液 灌 胃 ; 阳 性 药 组 大 鼠 以 VitD μg/kg( 药 物 浓 度 :0.02 μg/ml) 灌 胃, 蛇 床 子 素 组 大 鼠 分 别 以 5 mg/kg 10 mg/kg 和 20 mg/kg 给 药 量 灌 胃 每 天 一 次, 共 8 周 标 本 采 集 与 检 测 : 给 药 8 周 后,10 % 水 合 氯 醛 0.4 ml/kg 腹 腔 注 射 麻 醉 大 鼠, 腹 主 动 脉 取 血, 离 心 后, 分 别 测 定 血 清 Ca 2+ P 3+ ALP BGP PTH E 2 CT IL-1 的 水 平, 具 体 测 定 方 法 按 药 盒 说 明 书 进 行 BMD 测 定 : 动 物 处 死 后, 迅 速 剥 离 右 侧 股 骨, 剔 除 周 围 软 组 织, 用 LUNAR OPXIQ 双 能 X 线 骨 密 度 仪 ( 美 国 GE 公 司 ), 应 用 动 物 分 析 软 件 进 行 大 鼠 股 骨 扫 描, 测 定 骨 矿 化 密 度 值 光 镜 观 察 : 大 鼠 处 死 后, 剥 离 左 侧 股 骨, 用 10 % 福 尔 马 林 溶 液 固 定,EDTA 脱 钙, 酒 精 逐 渐 脱 水 透 明, 石 蜡 包 埋, 切 5-7µm 厚 度 切 片,HE 染 色,Olympus 光 镜 观 察, 并 摄 像 5 统 计 学 处 理 实 验 数 据 用 均 数 ± 标 准 差 ( ) 表 示 采 用 Excel 统 计 软 件 处 理, 进 行 样 本 均 数 的 t 检 验 8
15 第 二 部 分 二 结 果 1 一 般 情 况 在 实 验 期 间, 模 型 组 大 鼠 逐 渐 出 现 毛 色 无 光 泽 懒 动 少 食 等, 而 溶 媒 对 照 组 和 各 治 疗 组 大 鼠 皮 毛 光 泽 较 好, 活 动 如 常 2 对 血 清 Ca 2+ P 3+ ALP 的 影 响 实 验 结 果 显 示, 造 模 后 模 型 组 血 清 Ca 2+ 下 降, 而 ALP 明 显 增 高, 与 溶 媒 对 照 组 比 较 有 统 计 学 差 异 (P<0.05 或 P<0.01) 如 在 造 模 同 时 给 予 蛇 床 子 素, 血 清 Ca 2+ 有 不 同 程 度 的 增 高, 与 模 型 组 比 较 有 统 计 学 意 义 (P<0.05 或 P<0.01), 而 血 清 P 3+ ALP 明 显 下 降 (P<0.05 或 P<0.01) 这 些 结 果 表 明 蛇 床 子 素 能 抑 制 地 塞 米 松 引 起 的 血 清 Ca 2+ 下 降 血 清 P 3+ 升 高 以 及 血 清 ALP 活 性 的 增 高 结 果 见 表 1 和 图 1-3 Tab1 Effects of osthole on serum Ca 2+, P 3+, and ALP in dexamethasone-induced osteoporosis rats (,n=8 ) Group Ca 2+ (mmol/l) P 3+ (mmol/l) ALP (U/L) Control 2.21± ± ±76.8 Dex model 2.01±0.22 # 2.51± ±93.6 ## Osthole 5 mg/kg 2.11± ±0.24* 282.8±75.6* Osthole 10 mg/kg 2.41±0.21** 2.07±0.36* 264.5±89.8* Osthole 20 mg/kg 2.24±0.19* 2.07±0.28* 229.9±77.1** VitD μg/kg 2.31±0.09** 2.03±0.39* 353.8±85.7 # P<0.05, ## P<0.01 vs control group;*p<0.05, **P<0.01 vs model group 9
16 第 二 部 分 Serum Ca2+(mmol/L) # ** * ** Control Dex model Osthole 5mg/kg Osthole 10mg/kg Osthole 20mg/kg VitD Group Fig 1 Effect of osthole on serum Ca 2+ level in dexamethasone-induced osteoporosis rats (,n=8 ) # P<0.05 vs control group;*p<0.05, **P<0.01 vs model group 3.5 Control Dex model Serum P3+ (mmol/l) * * * * Osthole 5mg/kg Osthole 10mg/kg Osthole 20mg/kg VitD3 0 Group Fig 2 Effect of osthole on serum P 3+ level in dexamethasone-induced osteoporosis rats (,n=8 ) *P<0.05 vs model group 10
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