近红外漫反射光谱法测定阿莫西林胶囊的含量
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- 禁畅 武
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1 近 红 外 漫 反 射 光 谱 法 对 阿 莫 西 林 胶 囊 的 定 量 及 定 性 分 析 1 沈 漪 1 潘 颖 2 刘 全 1 项 竞 佐 (1. 上 海 市 药 品 检 验 所 上 海 ;2. 美 国 Thermo Nicolet 公 司 ) 摘 要 目 的 : 采 用 近 红 外 漫 反 射 光 谱 分 析 技 术 对 阿 莫 西 林 胶 囊 进 行 定 量 和 定 性 分 析 方 法 : 按 阿 莫 西 林 胶 囊 配 方 组 成 配 制 含 主 药 阿 莫 西 林 浓 度 范 围 从 5.91%~84.13% 的 32 个 实 验 室 样 品, 并 收 集 来 源 于 九 个 厂 家 的 41 批 工 业 样 品, 采 集 其 近 红 外 光 谱 分 别 采 用 偏 最 小 二 乘 回 归 和 判 别 分 析 法 建 立 定 量 和 定 性 分 析 模 型, 将 其 用 于 对 未 知 样 品 含 量 进 行 预 测 分 析, 并 对 定 量 分 析 方 法 的 重 现 性 和 加 样 回 收 率 进 行 考 察 结 果 : 定 量 分 析 模 型 对 24 个 未 知 样 品 的 的 预 测 均 方 差 RMSEP 为 1.22%, 预 测 值 与 真 值 的 相 关 系 数 R 为 , 加 样 平 均 回 收 率 为 99.75%, 系 统 精 密 度 RSD 为 0.3%, 方 法 精 密 度 RSD 为 0.6%; 定 性 分 析 模 型 对 18 个 预 测 样 品 的 判 错 率 为 0% 结 论 : 用 近 红 外 光 谱 分 析 技 术 对 阿 莫 西 林 胶 囊 进 行 定 量 和 定 性 分 析 结 果 准 确 可 靠, 方 法 简 便 快 速, 不 需 预 处 理, 可 推 广 用 于 此 类 样 品 工 业 现 场 的 原 位 和 在 线 检 测 关 键 词 近 红 外 漫 反 射 光 谱 阿 莫 西 林 定 量 分 析 Determination and qualitification of the Amoxicillin Capsules by NIR Diffuse Reflectance Spectroscopy Shen Yi 1, Pan ying 1, Liu Quan 2, Xiang Jingzuo 1 (1. Shanghai Institute for Drug Control, Shanghai ) (2. Thermo Nicolet corporation, U.S.A) Abstract Objective To determinate and qualitification of the amoxicillin capsule by near-infrared(nir) Diffuse Reflectance Spectroscopy. Method We prepared 32 samples which concentration range of amoxicillin is from 5.91%to 84.13%, at the same time collect 41 batches samples which came from 9 factories, then use Partial least square(pls) to build the calibration model to predict the concentration of unknown sample, and examine the method reproducibility and recovery. We use discriminant analysis to build classification model.result A model was set up using a calibration set (73 samples). The determination coefficient R is , which came from cross-validation, and root mean square error of cross-validation (RMSECV ) is Root mean square error of prediction (RMSEP) obtained from the validation including 24 unknown samples is 1.22%, the correlation coefficient between the true value and prediction value is The average recovery is %, RSD of the system precision is 0.3%, RSD of the method precision is 0.6%. The misclassified rate is 0% on the qualitification model using discriminant analysis. Conclusion The results show that the predict model using NIR is reliable, the method is fast and exact, and can be applied to on-line detection. Key words near infrared, diffuse reflectance spectrophotometry, amoxicillin, quantitative analysis 近 红 外 (Near Infrared, NIR) 光 谱 是 指 处 于 可 见 光 和 中 红 外 光 之 间, 波 长 范 围 为 nm( cm -1 ) 的 一 段 谱 区, 其 光 谱 信 息 主 要 反 映 的 是 有 机 物 分 子 中 C-H N-H O-H 等 含 氢 基 团 的 倍 频 与 合 频 吸 收 [1] 由 于 谱 带 严 重 重 叠, 谱 峰 难 以 分 辨, 该 谱 区 曾 一 度 被 称 为 光 谱 技 术 中 的 沉 睡 着 [ 2] 近 几 年 来, 随 着 化 学 计 量 学 技 术 的 发 展 及 先 进 光 谱 仪 器 的 出 现, 人 们 重 新 认 识 了 它 的 价 值 目 前,NIR 光 谱 分 析 技 术 因 其 快 速 无 损 多 成 分 同 时 测 [3 定 等 特 性, 已 被 广 泛 应 用 于 农 业 ] [ 石 油 4] [5] 化 工 等 行 业, 而 在 医 药 领 域, 它 已 被 成 功 用 于 包 括 原 辅 料 [6] [7, 制 剂 8] [9] 生 产 过 程 等 几 乎 所 有 环 节 的 定 性 和 定 量 分 析
2 阿 莫 西 林 (Amoxicillin) 胶 囊 是 一 种 口 服 半 合 成 青 霉 素, 具 有 抗 菌 谱 广, 杀 菌 力 强, 毒 性 低 等 特 点, 适 用 于 轻 中 度 感 染, 已 广 泛 应 用 于 临 床 目 前 其 含 量 测 定 方 法 为 高 效 液 相 色 谱 法, 该 方 法 需 进 行 复 杂 的 样 品 制 备 和 预 处 理 工 作, 不 能 用 于 工 业 现 场 的 原 位 快 速 分 析 本 文 以 阿 莫 西 林 胶 囊 为 例, 按 一 个 厂 家 的 制 剂 配 方 配 制 了 32 个 样 品, 同 时 收 集 了 九 个 厂 家 的 阿 莫 西 林 胶 囊 制 剂 共 41 批, 采 集 其 近 红 外 光 谱, 分 别 应 用 偏 最 小 二 乘 回 归 算 法 (PLS) 和 判 别 分 析 技 术 建 立 了 定 量 和 定 性 分 析 模 型, 并 对 未 知 样 品 进 行 预 测 分 析 结 果 证 明, 该 方 法 准 确 可 靠, 可 推 广 用 于 此 类 样 品 工 业 现 场 的 定 性 和 定 量 快 速 检 测 1 仪 器 与 样 品 Antaris 傅 立 叶 变 换 NIR 光 谱 仪 ( 美 国 Thermo Nicolet 公 司 ), 配 有 积 分 球 漫 反 射 采 样 系 统,Result 操 作 软 件,TQ Analyst 6.2 分 析 软 件 ; 阿 莫 西 林 原 料 ( 纯 度 86.74%), 辅 料 硬 脂 酸 镁 淀 粉 为 药 用 规 格 按 阿 莫 西 林 胶 囊 配 方 组 成 配 制 含 主 药 阿 莫 西 林 浓 度 范 围 从 5.91%~84.13% 的 32 个 实 验 室 样 品 九 个 厂 家 的 阿 莫 西 林 胶 囊 制 剂 共 41 批, 分 别 是 : 昆 明 贝 克 诺 顿 制 药 有 限 公 司 4 批, 上 海 衡 山 药 业 有 限 公 司 8 批, 香 港 澳 美 制 药 厂 5 批, 香 港 联 邦 制 药 厂 有 限 公 司 4 批, 丽 珠 集 团 丽 珠 制 药 厂 4 批, 浙 江 金 华 康 恩 贝 生 物 制 药 有 限 公 司 4 批, 甘 肃 兰 药 药 业 集 团 有 限 责 任 公 司 4 批, 海 南 三 叶 制 药 厂 有 限 公 司 4 批, 山 东 鲁 抗 医 药 股 份 有 限 公 司 4 批 2 NIR 光 谱 采 集 将 样 品 分 别 装 于 样 品 瓶 中, 在 ~ 4000 cm -1 波 数 范 围 内 采 集 其 NIR 光 谱, 扫 描 次 数 40 次, 分 辨 率 8cm -1, 每 个 样 品 重 复 3 次, 取 平 均 值 图 1 为 阿 莫 西 林 和 辅 料 的 NIR 光 谱 图 图 2 和 图 3 分 别 为 32 个 实 验 室 样 品 及 41 个 工 业 样 品 的 原 始 光 谱 及 一 阶 导 数 光 谱 图 1 阿 莫 西 林 和 辅 料 的 NIR 光 谱 图 Fig.1 NIR spectra of excipient and amoxicillin 1. 辅 料 (excipient) 2. 阿 莫 西 林 (amoxicillin)
3 Log(1/R) Log(1/R) Wavenumbers (cm-1) Wavenumbers (cm-1) 5000 图 2 样 品 的 原 始 NIR 漫 反 射 光 谱 图 Fig.2 Original NIR spectra 图 3 一 阶 导 数 光 谱 图 Fig.3 First derivative spectra 3 定 性 分 析 将 九 个 厂 家 41 批 样 品 的 NIR 光 谱 图 用 判 别 分 析 法 建 立 定 性 分 析 模 型 采 用 一 阶 导 数, 并 选 取 光 谱 波 数 范 围 为 cm -1, 作 为 建 模 参 数, 并 用 建 立 的 模 型 对 其 中 18 个 未 知 样 品 进 行 预 测, 以 验 证 模 型 的 预 测 效 果, 结 果 判 错 数 为 0, 证 明 该 模 型 能 很 好 的 对 建 模 的 九 个 厂 方 的 样 品 进 行 识 别 其 优 化 过 程 如 下 : 3.1 光 谱 范 围 及 数 据 处 理 方 法 的 选 择 尝 试 用 三 个 一 阶 导 数 光 谱 区 别 较 明 显 的 三 个 谱 段 : cm cm -1 和 cm -1, 以 及 仪 器 推 荐 的 光 谱 范 围 cm -1 ( 选 取 导 数 光 谱 时 均 采 用 Norris 平 滑 滤 波 进 行 校 正 ) 表 1 为 采 用 不 同 光 谱 范 围 和 光 谱 预 处 理 方 法 所 建 立 的 判 别 分 析 模 型 的 误 判 样 品 数 比 较 序 号 No. 表 1 采 用 不 同 光 谱 范 围 和 光 谱 预 处 理 方 法 所 建 立 的 判 别 分 析 模 型 的 误 判 样 品 数 比 较 Table1 Influence of NIR spectra range and pretreatment method on the number of misclassified samples 波 数 范 围 (cm -1 ) Wavenumber range(cm -1 ) 原 始 光 谱 Original NIR spectra 一 阶 导 数 光 谱 First derivative spectra 二 阶 导 数 光 谱 Second derivative spectra 校 正 集 验 证 集 校 正 集 验 证 集 校 正 集 验 证 集 从 表 1 可 见 用 一 阶 导 数 光 谱 在 任 何 光 谱 范 围 的 判 错 数 均 为 0, 用 原 始 光 谱 的 判 错 数 最 高, 二 阶 导 数 光 谱 其 次, 说 明 采 用 一 阶 导 数 光 谱 可 以 非 常 好 的 消 除 基 线 的 偏 移, 扣 除 本 底, 使 各 个 不 同 厂 家 的 特 征 区 别 更 明 显, 从 而 达 到 良 好 的 区 分 ; 另 外, 尽 管 在 四 个 光 谱 范 围 一 阶 导 数 的 判 处 率 均 为 0%, 但 考 虑 到 由 于 厂 家 较 多, 选 取 光 谱 范 围 越 宽, 利 用 的 信 息 越 充 分, 模 型 更 稳 健, 最 终 选 取 波 数 范 围 为 cm 定 性 分 析 模 型 及 样 品 判 别 结 果 主 成 分 分 析 (Principle Component Analysis, PCA) 是 最 常 用 的 判 别 分 析 方 法 (7), 它 可 以 将 多 波 长 下 的 光 谱 数 据 压 缩 到 有 限 的 几 个 因 子 空 间 内, 再 通 过 样 品 在 各 因 子 空 间 的 得 分 确 定 所 属 的 类 别 光 谱 数 据 经 前 述 一 节 导 数 处 理 并 选 择 光 谱 范 围 后, 对 其 作 PCA 分 析, 以 第 一 主 成 分 对 第 二 主 成 分 作 图, 如 图 4
4 图 4 样 品 在 前 两 个 主 成 分 中 的 得 分 分 布 Fig. 4 Scatter plot of scores for the first and second PC of the 41samples from 9 different factories 其 中 香 港 澳 美 制 药 厂 山 东 鲁 抗 医 药 股 份 有 限 公 司 浙 江 金 华 康 恩 贝 生 物 制 药 有 限 公 司 〇 海 南 三 叶 制 药 厂 有 限 公 司 甘 肃 兰 药 药 业 集 团 有 限 责 任 公 司 昆 明 贝 克 诺 顿 制 药 有 限 公 司 上 海 衡 山 药 业 有 限 公 司 丽 珠 集 团 丽 珠 制 药 厂 香 港 联 邦 制 药 厂 有 限 公 司 主 因 子 数 的 选 择 是 影 响 PCA 法 效 果 的 一 个 关 键 因 素 主 因 子 数 太 少, 会 导 致 信 息 利 用 率 过 低, 主 因 子 数 太 多, 则 会 引 入 许 多 无 用 或 噪 音 信 息, 两 者 均 会 降 低 模 型 预 测 精 度 和 稳 健 性 在 本 文 的 实 验 中, 主 成 分 数 的 选 择 对 模 型 判 错 率 的 影 响 情 况 如 表 2 从 中 可 见, 当 主 因 子 数 为 15 时, 即 可 以 对 9 个 厂 家 的 样 品 进 行 准 确 地 判 别 分 析, 此 时, 光 谱 信 息 的 利 用 率 为 99.93% 表 2 主 成 分 数 对 模 型 判 错 率 及 对 累 计 贡 献 的 影 响 Table 2 The infection of principle components to misclassified and cumulative contribution 编 号 主 成 分 数 累 计 贡 献 % 判 错 数 定 量 分 析 4.1 数 据 处 理 方 法 分 别 从 32 个 实 验 室 样 品 和 41 个 工 业 样 品 中 随 机 选 取 49 个 样 品 组 成 校 正 集, 用 于 建 立 定 量 分 析 模 型, 其 余 24 个 样 品 当 作 未 知 样 品 组 成 预 测 集, 用 于 验 证 模 型 的 预 测 效 果 光 谱 数 据 经 多 元 散 射 校 正 (Multiplicative Scatter Correction, MSC) 预 处 理 和 Norris 导 数 平 滑 滤 波 后, 采 用 偏 最 小 二 乘 (Partial Least Square, PLS) 回 归 法 建 立 定 量 校 正 模 型, 以 内 部 交 叉 验 证 均 方 差 (RMSECV) 为 指 标 优 化 建 模 参 数, 以 未 知 样 品 的 预 测 均 方 差 (RMSEP) 及 其 相 对 偏 差 (RSEP) 考 察 模 型 的 预 测 准 确 性,RMSECV RSECV RMSEP 和 RSEP 的 计 算 公 式 见 文 [10 献 ] 4.2 定 量 分 析 模 型 的 建 立 光 谱 预 处 理 方 法 的 选 择 表 3 为 分 别 采 用 原 始 光 谱 一 阶 导 数 光 谱 和 二 阶 导 数 光 谱 进 行 建 模 时 的 RMSECV 值 从 表 3 可 见 采 用 原 始 光 谱 时 的 RMSECV 最 小, 这 同 建 立 定 性 分 析 模 型 时 的 光 谱 预 处 理 方 法
5 不 同, 因 为 样 品 的 定 性 分 析 除 了 涉 及 样 品 组 成 信 息 外, 还 涉 及 到 制 剂 工 艺 的 不 同 带 来 的 样 品 物 理 性 质 的 差 异, 用 一 阶 导 数 光 谱 消 除 各 方 面 的 影 响 选 取 特 征 信 息 来 进 行 区 分 类 别, 而 定 量 往 往 只 需 考 虑 组 成 浓 度 的 不 同, 在 本 实 验 中 则 只 需 原 始 光 谱 即 能 达 到 最 优 化 光 谱 范 围 的 选 择 表 3 导 数 处 理 对 校 正 模 型 RMSECV 的 影 响 * Table 3 RMSECV result of model using derivative spectra and original spectra No. 光 谱 预 处 理 方 法 主 因 子 数 RMSECV 1 原 始 光 谱 一 阶 导 数 二 阶 导 数 * 光 谱 范 围 : cm -1 表 4 为 使 用 不 同 谱 区 的 光 谱 : 全 谱 带 cm -1 软 件 推 荐 光 谱 带 cm -1 与 自 选 光 谱 带 cm cm cm -1 信 息 建 立 模 型 时 的 内 部 交 叉 验 证 均 方 差 (RMSECV) 值, 其 结 果 表 明 在 cm -1 范 围 内 内 部 交 叉 验 证 均 方 差 (RMSECV) 最 小, 证 明 其 最 佳 谱 区 为 cm -1 表 4 不 同 光 谱 范 围 的 选 择 对 参 数 的 影 响 * Table 4 Eeffect of parameters on various wavenumbers of the spectra No. 光 谱 范 围 (cm -1 主 因 子 ) 数 RMSECV , , * 光 谱 预 处 理 方 法 :MSC+ 平 滑 + 原 始 光 谱 基 于 前 述 优 化 得 到 的 光 谱 预 处 理 方 法 光 谱 范 围 及 主 因 子 数, 即 可 建 立 定 量 分 析 模 型 4.3 样 品 分 析 用 前 面 所 建 立 的 定 量 校 正 模 型 对 验 证 集 中 24 个 样 品 浓 度 进 行 预 测, 预 测 值 与 真 值 的 相 关 图 见 图 4 从 图 中 可 见,24 个 未 知 样 品 的 NIR 预 测 值 能 够 很 好 地 逼 近 实 际 值, 相 关 系 数 达 到 了 ,RMSEP RSEP 分 别 为 1.22% 0.96% 表 5 为 选 取 各 个 厂 家 的 样 品 用 HPLC 测 得 的 真 实 值 与 用 模 型 预 测 值 的 比 较 图 5 校 正 集 样 品 与 预 测 样 品 真 实 值 与 预 测 值 相 关 图 Fig.5 Scatter plots showing correlation between actual value and predicted value on the calibrated model
6 表 5 各 个 厂 家 的 样 品 真 实 值 与 预 测 值 的 比 较 Table 5Comparison between actual value and predicted value on the calibrated modle 编 号 生 产 厂 家 真 实 值 预 测 值 相 对 偏 差 % 1 香 港 澳 美 制 药 厂 昆 明 贝 克 诺 顿 制 药 有 限 公 司 上 海 衡 山 药 业 有 限 公 司 浙 江 金 华 康 恩 贝 生 物 制 药 有 限 公 司 香 港 联 邦 制 药 厂 有 限 公 司 山 东 鲁 抗 医 药 股 份 有 限 公 司 甘 肃 兰 药 药 业 集 团 有 限 责 任 公 司 丽 珠 集 团 丽 珠 制 药 厂 海 南 三 叶 制 药 厂 有 限 公 司 由 表 5 可 见, 九 个 厂 家 的 样 品 中 相 对 偏 差 最 大 为 2.52%, 最 小 为 0.01%, 说 明 该 模 型 可 以 对 来 自 这 九 个 厂 家 的 样 品 的 含 量 进 行 准 确 的 测 定 4.4 加 样 回 收 率 选 取 上 海 衡 山 药 业 有 限 公 司 提 供 的 其 中 一 批 样 品 加 入 原 料 适 量, 按 第 2 节 方 法 采 集 各 样 品 NIR 光 谱, 利 用 前 述 的 定 量 校 正 模 型 测 试 其 浓 度, 计 算 加 样 回 收 率, 结 果 见 表 4 加 样 回 收 率 范 围 为 97.66%~101.80%, 平 均 回 收 率 为 99.75%,RSD 为 1.4% 4.5 系 统 精 密 度 与 方 法 精 密 度 表 6. 加 样 回 收 率 结 果 Table 6 Result of recovery test 编 号 样 品 浓 度 % 测 得 浓 度 % 回 收 率 % 平 均 回 收 率 RSD(%) 1.4% 选 取 配 制 的 14 号 样 品, 重 复 测 试 6 次, 测 得 系 统 精 密 度 RSD 为 0.3%; 选 取 配 制 的 14 号 样 品, 装 于 不 同 的 测 试 样 品 瓶 测 定 6 次, 得 方 法 精 密 度 RSD 为 0.6% 5. 结 论 1. 本 文 应 用 NIR 漫 反 射 光 谱 分 析 技 术 成 功 地 对 阿 莫 西 林 胶 囊 制 剂 进 行 了 同 时 定 性 和 定 量 分 析, 该 方 法 准 确 可 靠 方 便 快 速, 定 量 分 析 系 统 精 密 度 方 法 精 密 度 以 及 加 样 回 收 率 均 良 好, 显 示 出 良 好 的 实 用 价 值 和 应 用 前 景 2. NIR 光 谱 定 量 分 析 模 型 的 建 立 对 校 正 集 样 品 化 学 组 成 的 分 布 范 围 有 一 定 要 求, 但 实 际 上, 工 业 上 收 集 到 的 制 剂 样 品 化 学 组 成 范 围 往 往 都 很 小, 为 此, 本 文 采 用 了 工 业 样 品 和 实 验 室 配 置 样 品 相 结 合 的 方 法, 以 扩 大 校 正 集 样 品 化 学 组 成 的 分 布 范 围, 取 得 了 良 好 效 果 3. 值 得 注 意 的 是, 近 红 外 光 谱 信 息 中 不 仅 包 含 样 品 的 化 学 组 成 信 息, 同 时 还 与 样 品 的 物 理 性 质 有 关 如 果 仅 采 用 实 验 室 配 置 的 样 品 建 立 定 量 分 析 模 型, 我 们 发 现 所 建 立 的 模 型 难 以 适 用 于 不 同 厂 家 的 工 业 样 品 的 预 测 分 析 这 是 由 于 各 厂 家 原 辅 料 及 制 剂 的 工 艺 条 件 的 不 同 带 来 了 样 品 除 了 化 学 组 成 之 外 的 一 些 物 化 性 质 的 差 异, 这 严 重 限 制 了 实 验 室 配 置 样 品 建 立 的 分 析 模 型 的 适 用 性 本 文 采 用 的 实 验 室 配 置 样 品 与 工 业 样 品 相 杂 交 的 方 法 也 同
7 时 很 好 地 解 决 了 这 一 问 题 参 考 文 献 : 1. 瞿 海 斌, 刘 全, 程 翼 宇. 近 红 外 漫 反 射 光 谱 法 测 定 黄 连 浸 膏 粉 中 生 物 碱 含 量, 分 析 化 学, 已 录 用 2. D.L. Wetzel, Anal. Chem. 1983, 55: 1165A 3. Maurizio Ventura, Anton de Jager, Herman de Putter, Frans P.M.M. Roelofs. Non-destructive determination of soluble solids in apple fruit by near infrared spectroscopy (NIRS), Postharvest Biology and Technology, 1998,14: Macho S., Larrechi M.S., Near-infrared spectroscopy and multivariate calibration for the quantitative determination of certain properties in the petrochemical industry, trends in analytical chemistry, 2002, 21(12): J. Amador-Herna ndez, J.M. Ferna ndez-romero, M.D. Luque de Castro. Near infrared thermal lens spectrometry for the real-time monitoring of supercritical fluid extraction, Talanta, 1999,49: A. Candolfi, R. De Maesschalck. Identification of pharmaceutical excipients using NIR spectroscopy and SIMCA, J. Pharm. Biomed. Anal., 1999,19: M.Blanco, J. Coello, H.Iturriaga. Development and validation of a near infrared method for the analytical control of a pharmaceutical preparation in three steps of the manufacturing process[j], Fresnius. J. Anal. Chem.,2000, 368: Xiangji Zhou, Patricia Hines. Matthew W. Borer, Moisture determination in hygroscopic drug substances by near infrared spectroscopy[j], J. Pharm. and Biomed. Anal., 1998,17: John D. Kirsch, James K. Drennen. Determination of film-coated tablet parameters by near-infrared spectroscopy[j], J. Pharm. Biomed. Anal., 1995,13: Blanco M., Coello J., Iturriaga H.. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 2000, 50: 75~82
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