目 錄 名 稱 和 用 途 使 用 縮 寫 檢 測 摘 要 與 說 明 步 驟 原 理 提 供 的 試 劑 警 告 與 預 防 措 施 試 劑 存 放 和 處 理 要 求 額 外 的 試 劑 和 材 料 未 提 供 的 必 需 材 料 分 析 樣 本 的 採 集 和 存 放 檢 測 程 序 步 驟

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1 Cervista HPV HR 護 妳 身 高 危 險 型 人 類 乳 突 病 毒 去 氧 核 醣 核 酸 檢 測 套 組 使 用 前 請 務 必 詳 閱 原 廠 之 使 用 說 明 書 並 遵 照 指 示 使 用 衛 署 醫 器 輸 字 第 號 使 用 於 檢 測 子 宮 頸 樣 本 中 14 種 ( ) 高 危 險 型 人 類 乳 突 病 毒 (HPV) 去 氧 核 醣 核 酸 的 體 外 診 斷 檢 測 套 組 體 外 診 斷 醫 療 器 材 包 含 足 夠 完 成 96 次 檢 測 的 試 劑 劑 量 溫 度 限 制 請 勿 存 放 於 無 霜 冷 凍 室 避 免 光 照 1

2 目 錄 名 稱 和 用 途 使 用 縮 寫 檢 測 摘 要 與 說 明 步 驟 原 理 提 供 的 試 劑 警 告 與 預 防 措 施 試 劑 存 放 和 處 理 要 求 額 外 的 試 劑 和 材 料 未 提 供 的 必 需 材 料 分 析 樣 本 的 採 集 和 存 放 檢 測 程 序 步 驟 注 意 事 項 和 預 防 措 施 結 果 說 明 品 質 控 制 限 制 預 期 的 結 果 性 能 特 徵 參 考 文 獻 疑 難 排 解 指 南 2

3 名 稱 和 用 途 Cervista 高 危 險 型 人 類 乳 突 病 毒 去 氧 核 醣 核 酸 檢 測 套 組 是 使 用 於 定 性 檢 測 子 宮 頸 樣 本 中 14 種 ( ) 高 危 險 型 人 類 乳 突 病 毒 (HPV) 去 氧 核 醣 核 酸 的 體 外 診 斷 檢 測 此 套 組 不 能 鑑 定 存 在 的 HPV 類 型 Cervista HPV HR 檢 測 使 用 Invader 化 學 方 法, 為 偵 測 特 異 核 酸 序 列 的 信 號 放 大 方 法 此 方 法 使 用 兩 種 等 溫 反 應 : 初 級 反 應 發 生 於 目 標 DNA 序 列, 次 級 反 應 則 產 生 螢 光 信 號 ( 請 參 見 圖 1) Cervista HPV HR 檢 測 適 用 於 : 1) 篩 檢 子 宮 頸 細 胞 檢 查 結 果 為 非 典 型 鱗 狀 細 胞 但 意 義 未 明 (ASC-US) 的 患 者, 確 認 是 否 需 轉 診 接 受 陰 道 鏡 檢 查 2) 30 歲 以 上 的 婦 女, 進 行 子 宮 頸 細 胞 檢 查 時, 可 使 用 Cervista HPV HR 測 試 輔 助 篩 檢, 以 評 估 是 否 存 在 高 風 險 型 的 HPV 類 型 根 據 該 項 資 訊, 再 加 上 醫 師 對 細 胞 學 病 史 的 評 估 其 他 風 險 因 素 和 專 業 指 引, 可 用 於 引 導 病 患 之 管 理 可 用 於 Cervista HPV HR 檢 測 進 行 測 試 的 子 宮 頸 樣 本, 包 括 以 下 保 存 系 統 採 集 介 質 和 採 集 裝 置 : ThinPrep 巴 氏 子 宮 頸 癌 檢 驗 法 PreservCyt 保 存 液 掃 帚 型 裝 置 ( 如 Rovers Cervex 刷 Wallach Papette), 或 子 宮 頸 刷 / 抹 片 棒 警 告 Cervista HPV HR 檢 測 不 適 合 作 為 30 歲 以 下 子 宮 頸 細 胞 檢 查 正 常 婦 女 的 篩 檢 裝 置 Cervista HPV HR 檢 測 不 能 取 代 常 規 的 子 宮 頸 細 胞 篩 檢 使 用 Cervista HPV HR 測 試 偵 測 HPV, 無 法 區 分 HPV 類 型, 亦 無 法 評 估 任 何 類 型 的 持 續 存 在 對 於 先 前 細 胞 或 組 織 異 常 的 婦 女, 子 宮 切 除 懷 孕 停 經, 或 擁 有 其 他 風 險 因 素 的 婦 女 ( 如 HIV+ 免 疫 功 能 不 足 STI 病 史 ), 該 檢 測 方 式 的 應 用 尚 未 經 過 評 估 3

4 Cervista HPV HR 檢 測 的 目 的 是 增 強 子 宮 頸 疾 病 現 有 的 檢 測 方 法, 應 依 照 適 當 的 病 患 管 理 程 序, 配 合 來 自 其 他 診 斷 和 篩 檢 測 試 體 檢 和 完 整 的 醫 療 歷 史 記 錄 的 臨 床 資 料 使 用 Cervista HPV HR 檢 測 結 果 不 應 作 為 病 患 臨 床 評 估 和 治 療 的 唯 一 依 據 使 用 縮 寫 ASC-US: 非 典 型 鱗 狀 細 胞 但 意 義 未 明 CIN: 子 宮 頸 上 皮 內 贅 瘤 CLSI: 臨 床 與 實 驗 室 標 準 協 會 DNA: 去 氧 核 糖 核 酸 FAM: 羧 基 螢 光 染 料 Red: Redmond 紅 色 染 料 FRET: 螢 光 共 振 能 量 轉 移 FOZ: Fold over zero( 樣 品 或 對 照 信 號 除 以 無 目 標 對 照 信 號 ) gdna: 染 色 體 DNA HIST2H2BE: 人 類 組 蛋 白 群 2 基 因,H2be 基 因 HPV: 人 類 乳 突 病 毒 HR: 高 風 險 LoB 空 白 極 限 LoD 偵 測 極 限 Max. 最 大 值 Min. 最 小 值 NILM: 上 皮 內 病 變 或 惡 性 腫 瘤 呈 陰 性 反 應 此 類 別 包 含 在 正 常 範 圍 內 和 良 性 細 胞 變 化 兩 類 別 NTC: 無 目 標 對 照 Oligo: 寡 核 苷 酸 Pap: 巴 氏 子 宮 頸 細 胞 檢 查 RFU: 相 對 螢 光 單 位 檢 測 摘 要 與 說 明 超 過 100 種 HPV 類 型 已 記 載 於 文 獻 中, 其 中 約 40 種 會 感 染 肛 門 及 生 殖 器 區 域, 且 透 過 性 行 為 傳 播 肛 門 及 生 殖 器 區 域 的 HPV 幾 乎 與 所 有 子 宮 頸 癌 相 關 1 子 宮 頸 癌 先 前 已 證 實 為 高 度 可 預 防 的 疾 病, 採 用 細 胞 學 和 HPV 篩 檢 方 案 有 助 於 癌 症 前 期 病 變 的 偵 測 和 治 療 藉 由 性 行 為 傳 播 的 HPV 類 型 中,14 種 致 癌 基 因 型 (HPV 和 68), 由 於 與 子 宮 頸 癌 高 度 相 關 ( 相 對 於 與 子 宮 頸 癌 低 度 相 關 或 無 關 的 低 風 險 型 HPV 類 型 ), 因 此 被 視 為 高 風 險 型 (HR)HPV 類 型 2,3 儘 管 如 此, 絕 大 多 數 的 高 風 險 型 HPV 感 染 會 自 動 清 除, 4 只 有 極 少 數 的 高 風 險 型 HPV DNA 陽 性 婦 女, 會 發 展 為 細 胞 學 高 度 鱗 狀 上 皮 內 病 變 (HSIL), 表 示 潛 在 的 CIN2-3 或 癌 症 5 感 染 HR HPV 後, 發 展 為 細 胞 學 異 常 病 變 的 絕 對 風 險 已 知 會 因 族 群 而 異 4

5 高 風 險 型 HPV DNA 的 存 在 與 可 疑 或 不 明 確 的 細 胞 學 檢 驗 結 果 (ASC-US), 增 加 婦 女 具 有 潛 在 第 二 級 或 第 三 級 子 宮 頸 上 皮 內 贅 瘤 (CIN2 或 CIN3) 的 風 險 6,7,8 雖 然 只 有 約 5% 的 ASC-US 病 例 會 形 成 CIN3, 9 但 卻 是 子 宮 頸 癌 的 前 兆, 所 以 該 檢 測 對 於 病 患 管 理 是 相 當 重 要 的 3 因 此, 確 認 哪 些 婦 女 具 有 ASC-US 細 胞 與 高 風 險 型 HPV 感 染, 可 有 效 地 協 助 臨 床 醫 師 決 定 應 更 積 極 進 行 監 控 的 患 者 名 單 3,6,10,11 目 前 的 科 學 文 獻 表 示, 持 續 感 染 高 風 險 型 HPV 是 形 成 高 度 子 宮 頸 腫 瘤 和 癌 症 的 主 要 風 險 因 素 4,12,13,14 表 面 持 續 症 狀 可 能 表 示 持 續 感 染 單 一 HPV 類 型, 多 重 HPV 類 型, 或 再 感 染 而 子 宮 頸 細 胞 檢 查 HR HPV 呈 陰 性 的 正 常 婦 女, 患 有 或 形 成 子 宮 頸 癌 前 期 病 變 的 風 險 似 乎 較 低 15,16 從 2002 年 開 始, 許 多 美 國 醫 療 保 健 專 業 組 織 已 發 佈 病 患 管 理 準 則, 建 議 應 如 何 根 據 年 齡 子 宮 頸 樣 本 的 細 胞 異 常 與 其 他 因 素, 篩 檢 罹 患 子 宮 頸 癌 的 婦 女 7,17,15 上 述 病 患 管 理 準 則 建 議, 在 特 定 情 況 下, 可 將 高 風 險 型 HPV 類 型 之 檢 測 與 細 胞 學 檢 驗 結 合, 作 為 常 規 篩 檢 工 具 最 新 專 業 執 業 準 則 的 主 要 HR HPV 檢 測 建 議 (2006 年 管 理 子 宮 頸 癌 篩 檢 異 常 婦 女 的 共 識 準 則 ) 包 括 :1) 結 合 細 胞 學 或 其 他 篩 檢 方 法, 檢 查 30 歲 以 上 的 婦 女 ;2) 管 理 21 歲 以 上 具 有 ASC-US 的 婦 女 15,18 在 所 有 情 況 下, 病 患 管 理 決 策 除 了 反 映 是 否 存 在 高 風 險 型 HPV 類 型 外, 亦 反 映 患 者 整 體 的 細 胞 學 病 史 和 其 他 風 險 因 素 7,10,18 步 驟 原 理 Cervista HPV HR 為 定 性 體 外 診 斷 檢 測, 偵 測 14 種 高 風 險 型 HPV 類 型 DNA, 即 和 68 型 Cervista HPV HR 檢 測 使 用 Invader 化 學 方 法, 為 偵 測 特 定 核 酸 序 列 的 信 號 放 大 方 法 此 方 法 使 用 兩 種 等 溫 反 應 : 初 級 反 應 發 生 於 目 標 DNA 序 列, 次 級 反 應 則 產 生 螢 光 信 號 ( 請 參 見 圖 1) 在 初 級 反 應 中, 兩 類 序 列 特 異 的 寡 核 苷 酸 ( 即 探 針 寡 核 苷 酸 和 Invader 寡 核 苷 酸 ) 將 與 DNA 目 標 序 列 結 合 當 上 述 寡 核 苷 酸 在 目 標 序 列 上 至 少 有 一 個 鹼 基 對 重 疊 時, 侵 入 結 構 形 成, 作 為 Cleavase 酶 的 基 質 酶 將 於 重 疊 位 置 切 割 探 針 的 5' 部 分 ( 垂 下 物 ) 在 探 針 過 量 存 在 的 環 境, 可 快 速 與 目 標 序 列 發 生 結 合 和 分 離 的 循 環 反 應, 因 此 每 個 目 標 序 列 會 產 生 許 多 切 斷 的 5' 垂 下 物 切 斷 的 垂 下 物 將 與 一 般 髮 夾 式 螢 光 共 振 能 量 轉 移 (FRET) 寡 核 苷 酸 結 合, 建 立 另 一 個 侵 入 結 構, 作 為 Cleavase 酶 的 基 質 酶 於 螢 光 和 消 光 分 子 間 切 割 FRET 寡 核 苷 酸, 當 切 斷 的 垂 下 物 進 行 結 合 和 分 離 的 循 環 時 將 產 生 螢 光 信 號 5

6 對 於 每 個 目 標 複 製, 結 合 的 初 級 和 次 級 反 應 每 小 時 將 產 生 倍 的 信 號 放 大 19 由 於 垂 下 物 序 列 和 FRET 寡 核 苷 酸 兩 者 與 目 標 序 列 無 互 補 性, 因 此 皆 具 有 通 用 性 該 檢 測 試 劑 提 供 三 種 寡 核 苷 酸 混 合 物, 檢 測 14 種 依 據 種 系 發 生 相 關 性 分 類 的 HPV, 即 依 據 病 毒 類 型 與 類 似 DNA 序 列 分 類 之 群 組 (A5/A6 A7 A9 HPV 群 組 ) 結 合 人 類 組 蛋 白 群 2 基 因 (H2be, HIST2H2BE ) 的 寡 核 苷 酸 亦 存 在 於 三 種 寡 核 苷 酸 混 合 物 中 以 HIST2H2BE 作 為 內 部 對 照, 從 樣 本 中 的 染 色 體 DNA 產 生 信 號 Cervista HPV HR 檢 測 形 式 利 用 探 針 上 兩 種 不 同 的 5' 垂 下 物 序 列, 以 及 兩 種 不 同 的 FRET 寡 核 苷 酸 ( 每 種 具 有 不 同 的 螢 光 光 譜,FAM 和 Red), 可 在 單 孔 中 同 時 偵 測 HPV DNA 序 列 和 HIST2H2BE 按 照 設 計, 分 離 的 5' 垂 下 物 只 與 其 各 自 的 FRET 寡 核 苷 酸 結 合, 生 成 特 定 的 目 標 信 號 ( 請 參 見 圖 1) 陽 性 結 果 表 示,DNA 樣 本 中 至 少 存 在 14 個 高 風 險 類 型 其 中 一 個 若 FAM 螢 光 信 號 高 於 經 驗 推 得 的 臨 界 值, 代 表 陽 性 結 果 對 於 每 個 反 應, 若 FAM 螢 光 信 號 低 於 經 驗 推 得 的 臨 界 值, 代 表 陰 性 結 果 在 每 個 反 應 中, 以 高 於 經 驗 臨 界 值 之 Red 螢 光 信 號, 測 量 人 類 HIST2H2BE, 作 為 決 定 樣 品 中 DNA 相 對 數 量 的 方 法 以 該 目 標 測 量 作 為 品 質 控 制 的 機 制, 確 認 陰 性 結 果 並 非 由 於 不 足 的 樣 本 而 造 成 該 內 部 對 照 目 標 亦 可 作 為 程 序 評 量, 確 保 測 試 程 序 已 充 分 執 行 6

7 1a.HPV 寡 核 苷 酸 在 HPV DNA 形 成 侵 入 結 構 1b.HIST2H2BE 寡 核 苷 酸 在 染 色 體 DNA 形 成 侵 入 結 構 2.Cleavase 酶 辨 識 結 構 並 切 割 探 針 寡 核 苷 酸 3a. 來 自 HPV 探 針 寡 核 苷 酸 的 下 垂 物 在 FAM FRET 寡 核 苷 酸 形 成 侵 入 結 構 3b. 來 自 HIST2H2BE 探 針 寡 核 苷 酸 的 下 垂 物 在 Red FRET 寡 核 苷 酸 形 成 侵 入 結 構 4.Cleavase 酶 辨 識 結 構, 並 從 FRET 寡 核 苷 酸 釋 放 螢 光 團, 產 生 螢 光 信 號 FAM 螢 光 Red 螢 光 圖 1:Cervista HPV HR 檢 測 的 Invader 化 學 方 法 圖 示 7

8 提 供 的 試 劑 表 1:Cervista HPV HR( ) 內 容 試 劑 HPV 寡 核 苷 酸 混 合 物 1 試 劑 瓶 標 籤 縮 寫 O1 ( 藍 色 瓶 蓋 與 藍 色 條 紋 ) 試 劑 數 量 與 試 劑 容 量 1 x 1400 μl 成 份 描 述 對 HPV 型 與 懸 浮 於 水 和 MOPS 緩 衝 液 (ph 7.5) 中 的 人 類 HIST2H2BE 具 有 親 和 力 的 寡 核 苷 酸 HPV 寡 核 苷 酸 混 合 物 2 O2 ( 黃 色 瓶 蓋 與 黃 色 條 紋 ) 1 x 1400 μl 對 HPV 型 與 懸 浮 於 水 和 MOPS 緩 衝 液 (ph 7.5) 中 的 人 類 HIST2H2BE 具 有 親 和 力 的 寡 核 苷 酸 HPV 寡 核 苷 酸 混 合 物 3 O3 ( 橙 色 瓶 蓋 與 橙 色 條 紋 ) 1 x 1400 μl 對 HPV 型 與 懸 浮 於 水 和 MOPS 緩 衝 液 (ph 7.5) 中 的 人 類 HIST2H2BE 具 有 親 和 力 的 寡 核 苷 酸 Cleavase 酶 溶 液 E ( 紫 色 瓶 蓋 與 紫 色 條 紋 ) 1 x 1100 μl 懸 浮 於 140 mm MgCl2 10 mm Tris(pH 8.0) 25 mm KCl 0.25% Tween % Nonidet P40 25% Glycerol 和 0.05 mg/ml BSA 的 Cleavase 酶 HPV 對 照 組 1 HPV 對 照 組 2 HPV 對 照 組 3 無 目 標 對 照 C1 ( 透 明 瓶 蓋 與 黑 色 條 紋 ) C2 ( 透 明 瓶 蓋 與 黑 色 條 紋 ) C3 ( 透 明 瓶 蓋 與 黑 色 條 紋 ) NTC ( 透 明 瓶 蓋 與 黑 色 條 紋 ) 1 x 350 μl 1 x 350 μl 1 x 350 μl 酵 母 trna 和 10 mm Tris 0.1 mm EDTA 緩 衝 液 中 有 1000 複 製 數 /μl 複 製 HPV 51 型 DNA 和 3000 複 製 數 /μl 複 製 HIST2H2BE DNA 酵 母 trna 和 10 mm Tris 0.1 mm EDTA 緩 衝 液 中 有 1000 複 製 數 /μl 複 製 HPV 18 型 DNA 和 3000 複 製 數 /μl 複 製 HIST2H2BE DNA 酵 母 trna 和 10 mm Tris 0.1 mm EDTA 緩 衝 液 中 有 1000 複 製 數 /μl 複 製 HPV 16 型 DNA 和 3000 複 製 數 /μl 複 製 HIST2H2BE DNA 1 x 350 μl 酵 母 trna 和 10 mm Tris 0.1 mm EDTA 緩 衝 液 警 告 與 預 防 措 施 供 體 外 診 斷 使 用 安 全 及 處 理 預 防 措 施 1. 處 理 任 何 人 體 組 織 或 體 液 時, 應 使 用 通 用 的 安 全 預 防 措 施 樣 本 應 依 據 地 方 要 求 進 行 處 理 2. 產 品 成 份 ( 產 品 殘 留 物 包 裝 ) 可 視 為 實 驗 室 廢 棄 物 應 依 照 適 用 的 法 規 處 置 未 使 用 的 試 劑 和 廢 棄 物 8

9 試 劑 存 放 和 處 理 要 求 所 有 試 劑 存 放 於 -30 C 和 -15 C 之 間 若 試 劑 已 超 過 包 裝 外 註 明 的 保 存 期 限, 則 不 得 使 用 請 勿 存 放 於 無 霜 冷 凍 室 避 免 光 照 使 用 前, 請 從 冷 凍 室 取 出 試 劑, 至 少 在 室 溫 解 凍 30 分 鐘, 或 使 用 目 視 法 檢 查, 直 到 無 凍 結 物 質 存 在 為 止 每 次 使 用 試 劑 前 需 先 振 盪 混 合 Hologic 建 議 所 有 Cervista HPV HR 檢 測 試 劑 不 得 超 過 六 次 凍 融 循 環 額 外 的 試 劑 和 材 料 Invader Call Reporter(V5.4) 軟 體 為 本 IVD 檢 測 的 必 需 工 具 首 次 訂 購 Cervista HPV HR 檢 測 時, 會 提 供 該 軟 體 Invader Call Reporter 之 軟 硬 體 需 求 及 搭 配 之 螢 光 儀 機 型 建 議 硬 體 Pentium P4 2GHz 處 理 器 40 GB 硬 碟 512 MB 記 憶 體 印 表 機 ( 彩 色 印 表 機 較 佳 ) 軟 體 需 求 Windows XP Professional, Service Pack3 Microsoft Excel 2000, 2003, 或 2007 Adobe Reader 7.0 或 8.0 搭 配 之 螢 光 儀 機 型 及 軟 體 Tecan Infinite F200 配 合 i-control 版 Tecan GENios 配 合 XFluor 4.51 版 BioTek FLx800 配 合 BioTek KC4 3.4 Rev. 16 版 從 盤 式 螢 光 分 析 儀 輸 出 的 原 始 數 據 將 用 來 輸 入 軟 體 程 式, 因 此 它 必 須 是 能 被 運 行 Invader Call Reporter 的 電 腦 所 接 受 的 格 式 原 始 數 據 所 輸 出 的 檔 案 必 須 是 下 列 的 格 式 之 一 : Microsoft Excel 2000 活 頁 簿 副 檔 名 為.xls) Microsoft Excel 2003 活 頁 簿 ( 副 檔 名 為.xls) Microsoft Excel 2007 活 頁 簿 ( 副 檔 名 為.xlsx) XML 檔 ( 副 檔 名 為.xml) 9

10 Genfind DNA 萃 取 套 組 是 Cervista HPV HR 檢 測 的 配 件 ( ) 未 提 供 的 必 需 材 料 耗 材 附 隔 離 塞 且 無 核 酸 酶 的 吸 頭 96 孔 聚 丙 烯 盤 透 明 封 膜 器 分 子 生 物 學 等 級 的 礦 物 油 2.0 ml 無 菌 聚 丙 烯 管 和 螺 旋 蓋 設 備 分 注 滴 管 振 盪 器 盤 式 螢 光 分 析 儀 ( 請 參 閱 表 3) 配 備 Microsoft Windows XP 作 業 系 統, 以 及 Microsoft Excel 和 Adobe Reader 軟 體 的 桌 上 型 電 腦 可 維 持 適 當 反 應 溫 度 的 熱 循 環 儀 或 烤 箱 10

11 分 析 樣 本 的 採 集 和 存 放 子 宮 頸 樣 本 應 存 放 於 PreservCyt 保 存 液 ThinPrep 巴 氏 子 宮 頸 癌 檢 驗 保 存 系 統, 使 用 掃 帚 型 裝 置 ( 如 Rovers Cervex 刷 Wallach Papette), 或 子 宮 頸 刷 / 抹 片 棒 執 行 測 試 前, 將 Cervist HPV HR 檢 測 的 子 宮 頸 樣 本 存 放 於 PreservCyt 溶 液 中, 室 溫 下 (20-30 C) 最 多 可 保 存 18 個 星 期 不 得 冷 凍 PreservCyt 溶 液 樣 本 應 使 用 Genfind DNA 萃 取 套 組 ( ), 從 PreservCyt 樣 本 萃 取 DNA 檢 測 程 序 注 意 : 在 反 應 程 序 開 始 前, 使 用 Genfind DNA 萃 取 套 組 ( ), 從 PreservCyt 溶 液 中 的 子 宮 頸 樣 本 萃 取 DNA 反 應 程 序 1. 將 每 種 對 照 組 和 樣 品 DNA 分 別 加 入 96 孔 盤 的 其 中 三 個 孔, 每 孔 10 μ L, 如 檢 測 盤 配 置 所 示 ( 請 參 見 圖 2) 混 合 1 混 合 2 混 合 3 混 合 1 混 合 2 混 合 3 混 合 1 混 合 2 混 合 3 混 合 1 混 合 2 混 合 A C1 C1 C1 S5 S5 S5 S13 S13 S13 S21 S21 S21 B C2 C2 C2 S6 S6 S6 S14 S14 S14 S22 S22 S22 C C3 C3 C3 S7 S7 S7 S15 S15 S15 S23 S23 S23 D NTC NTC NTC S8 S8 S8 S16 S16 S16 S24 S24 S24 E S1 S1 S1 S9 S9 S9 S17 S17 S17 S25 S25 S25 F S2 S2 S2 S10 S10 S10 S18 S18 S18 S26 S26 S26 G S3 S3 S3 S11 S11 S11 S19 S19 S19 S27 S27 S27 H S4 S4 S4 S12 S12 S12 S20 S20 S20 S28 S28 S28 圖 2:Cervista HPV HR 檢 測 盤 配 置 2. 每 個 孔 再 以 20 μl 的 礦 物 油 覆 蓋, 並 使 用 密 封 膠 帶 減 少 揮 發 3. 使 用 熱 循 環 儀, 讓 樣 品 在 95 C 的 環 境 下 培 養 5 分 鐘 4. 使 用 前 必 須 徹 底 且 均 勻 地 混 合 試 劑 與 反 應 混 合 物 5. 依 據 混 合 準 備 表 ( 從 Invader Call Reporter 軟 體 列 印 ) 或 表 2 的 計 算 結 果, 準 備 反 應 混 合 物 每 次 使 用 前, 需 分 別 準 備 三 種 HPV 寡 核 苷 酸 混 合 物 的 反 應 混 合 物 準 備 完 成 的 反 應 混 合 物 應 在 30 分 鐘 內 使 用 完 畢 表 2: 反 應 混 合 物 準 備 指 南 試 劑 μl/ 反 應 反 應 數 ( 樣 品 和 對 照 組 (k)) 總 容 積 HPV 寡 核 苷 酸 混 合 物 1 2 或 3 8 μl k =8k(1.25) μl Cleavase 酶 溶 液 2 μl k =2k(1.25) μl 總 混 合 物 容 積 10 μl k =10k(1.25) μl 11

12 6. 將 熱 循 環 儀 的 溫 度 降 至 63 C 7. 添 加 10 μl 適 當 的 反 應 混 合 物 至 每 個 孔 中, 包 含 對 照 組 或 樣 品 ( 請 參 見 圖 2), 注 意 滴 管 需 低 於 礦 物 油 8. 將 測 試 盤 在 63 C 中 置 放 4 小 時 資 料 收 集 1. 讀 取 前 請 務 必 將 測 試 盤 置 於 室 溫 下 若 無 法 立 即 讀 取 測 試 盤, 請 儲 存 於 2-8 C 中 ( 建 議 在 測 試 完 成 的 24 小 時 內 讀 取 測 試 盤 ) 2. 將 96 孔 盤 (A1 孔 必 須 在 左 上 角 ) 置 於 盤 式 螢 光 分 析 儀 的 盤 架 上, 移 除 密 封 膠 帶 3. 定 義 測 試 盤 類 型, 以 設 定 特 定 盤 型 的 座 標 和 探 針 高 度 儲 存 設 定 值 4. 讀 取 整 個 測 試 盤 必 須 進 行 兩 項 獨 立 掃 描 :FAM( 激 發 = 485 nm, 放 射 = 535 nm) 和 Red( 激 發 = 560 nm, 放 射 = 612 nm) 為 了 偵 測 HPV 信 號, 應 設 定 儀 器 先 偵 測 FAM 染 料 為 了 偵 測 樣 品 染 色 體 DNA, 應 設 定 儀 器 偵 測 Red 染 料 ( 請 參 閱 表 3) 5. 依 照 製 造 商 的 使 用 說 明, 調 整 盤 式 螢 光 分 析 儀 的 增 益, 使 其 落 在 分 析 儀 的 線 性 動 態 範 圍 設 定 後 的 增 益 應 使 無 目 標 對 照 (NTC) 產 率 落 在 分 析 儀 的 背 景 範 圍, 最 小 RFU 為 600 NTC 值 不 需 與 FAM 和 Red 讀 值 一 致 表 3: 盤 式 螢 光 分 析 儀 規 格 / 設 定 多 標 籤 測 量 參 數 測 量 1 (FAM) 測 量 2 (Red) 讀 取 模 式 : 上 方 上 方 激 發 波 長 / 頻 寬 : 485/20 nm 560/20 nm 放 射 波 長 / 頻 寬 : 535/25 nm 612/10 nm 閃 光 次 數 : 積 分 時 間 : 20μs 20μs 步 驟 注 意 事 項 和 預 防 措 施 1. 實 驗 室 應 使 用 良 好 的 實 驗 室 規 範, 並 遵 守 所 有 適 用 的 法 規 要 求 12

13 2. 上 述 套 組 應 視 為 單 一 單 元 完 成 測 試 請 勿 從 其 他 來 源 更 換 或 使 用 不 同 批 次 的 套 組 請 勿 混 合 來 自 不 同 批 次 或 同 批 次 但 不 同 瓶 的 試 劑 3. 請 勿 使 用 過 期 的 試 劑 4. 徹 底 且 均 勻 地 混 合 樣 品 試 劑 和 反 應 混 合 物 5. 每 次 增 加 或 轉 移 內 容 物, 皆 使 用 無 核 酸 酶 無 菌 的 一 次 性 附 隔 離 塞 吸 頭, 以 避 免 交 叉 汙 染 6. 使 用 無 核 酸 酶 一 次 性 聚 丙 烯 管 準 備 反 應 混 合 物 7. 測 試 開 始 前, 請 先 確 認 96 孔 盤 的 類 型 與 特 定 的 熱 循 環 儀 和 盤 式 螢 光 分 析 儀 相 容 8. 對 照 組 必 須 添 加 至 測 試 盤 配 置 的 指 定 位 置, 如 圖 2 所 示,Invader Call Reporter 軟 體 才 能 正 常 工 作 9. 每 次 反 應 設 置 請 使 用 新 鮮 的 礦 物 油 ( 上 述 試 劑 一 旦 取 出 後, 請 勿 放 回 原 來 的 容 器 ) 10. 請 參 考 測 試 盤 配 置, 以 確 保 將 正 確 的 混 合 物 添 加 至 適 當 的 位 置 11. 請 務 必 將 吸 頭 置 於 測 試 孔 的 底 部 附 近, 以 確 保 反 應 混 合 物 添 加 至 礦 物 油 下 方 仔 細 地 填 充 和 排 空 吸 頭 3 5 次, 使 其 混 合 12. 必 須 嚴 格 遵 循 Cervista HPV HR 檢 測 程 序 品 質 控 制 及 結 果 說 明, 以 獲 得 可 靠 的 測 試 結 果 結 果 說 明 三 種 反 應 將 分 別 產 生 信 號 對 雜 訊 值 ( 測 得 的 樣 品 信 號 相 對 於 無 目 標 對 照 反 應 孔 的 信 號 ) 此 信 號 對 雜 訊 值 稱 為 FOZ(Fold-Over-Zero) 根 據 三 種 獨 立 反 應 孔 的 分 析, 任 何 特 定 樣 品 最 後 將 產 生 陽 性 陰 性 或 無 法 判 定 的 結 果 三 種 反 應 混 合 物 將 產 生 HPV FOZ 值, 藉 由 之 間 的 比 值 可 決 定 樣 品 是 否 為 陽 性 從 三 種 反 應 混 合 物 的 HPV FOZ 值 中, 找 出 最 大 值 除 以 最 小 值, 可 計 算 出 HPV FOZ 比 若 任 何 FOZ 值 小 於 1, 比 率 計 算 時 則 調 整 為 1 若 HPV FOZ 比 大 於 或 等 於 1.525, 則 樣 品 為 HPV 陽 性 然 而, 在 混 合 感 染 的 情 況 下, 三 種 反 應 孔 生 成 的 信 號 都 可 能 遠 高 於 背 景 信 號 在 某 些 情 況 下, 上 述 混 合 感 染 可 能 會 在 三 種 反 應 孔 產 生 相 似 強 度 的 陽 性 信 號, 因 此,HPV FOZ 比 會 小 於 為 了 避 免 由 於 上 述 三 個 陽 性 信 號, 造 成 偽 陰 性 的 判 定, 應 用 第 二 種 計 算 方 式 如 下 : 當 FOZ 比 小 於 1.525, 但 三 種 個 別 反 應 FOZ 值 皆 大 於 第 二 個 臨 界 值 1.93 時, 則 樣 品 為 HPV 陽 性 13

14 三 種 不 同 情 況 下 會 產 生 無 法 判 定 的 結 果 1) 當 gdna FOZ 值 之 間 的 % CV 25.0%( 高 % CV),2) 當 三 種 HPV FOZ 值 皆 < 0.7( 低 HPV FOZ),3) 當 陰 性 樣 品 的 平 均 gdna FOZ < 1.5( 低 gdna) 無 法 判 定 表 示 未 充 分 混 合 分 注 滴 管 取 量 誤 差, 或 樣 品 中 的 gdna 不 足 ( 請 參 閱 疑 難 排 解 指 南 ) 上 述 樣 品 判 定 標 準 的 摘 要 如 圖 3 所 示 術 語 HPV FOZ: 對 於 每 種 HPV 寡 核 苷 酸 混 合 物, 將 樣 品 的 FAM 信 號 除 以 無 目 標 對 照 的 FAM 信 號 HPV FOZ 比 : 三 種 HPV 寡 核 苷 酸 混 合 物 中, 找 出 HPV FOZ 的 最 大 值 除 以 最 小 值 ( 若 FOZ 小 於 1.0, 將 其 標 準 化 至 1.0) 平 均 gdna FOZ: 平 均 值 是 由 三 種 反 應 混 合 物 獲 得 的 三 種 染 色 體 DNA FOZ 值 所 決 定, 染 色 體 DNA FOZ 值 的 計 算 方 式 是 將 樣 品 的 Red 信 號 除 以 無 目 標 對 照 的 Red 信 號 %CV gdna FOZ: 由 三 種 HPV 寡 核 苷 酸 混 合 物 產 生 之 gdna FOZ 值 的 % 變 異 係 數 14

15 標 準 %CV gdna < 25% 是 一 個 或 多 個 HPV FOZ > 0.70 是 否 否 產 生 的 結 果 無 法 判 定 : 高 %CV 無 法 判 定 : 低 HPV FOZ HPV FOZ 比 < 是 否 陽 性 一 個 或 多 個 HPV FOZ < 1.93 是 平 均 gdna FOZ < 1.50 否 否 陽 性 陰 性 是 無 法 判 定 : 低 gdna 圖 3: 由 上 至 下 的 樣 品 判 定 標 準 注 意 :Cervista HPV HR 檢 測 不 需 使 用 不 明 確 (equivocal) 或 再 測 試 區 域 表 4:Cervista HPV HR 檢 測 結 果 之 說 明 Cervista HPV HR 測 試 結 果 結 果 報 告 陽 性 偵 測 到 HPV 或 68 型 陰 性 未 偵 測 到 HPV 和 68 型 針 對 具 有 ASC-US 細 胞 的 病 患 說 明 陰 道 鏡 檢 查 時 偵 測 到 潛 在 高 度 CIN 的 可 能 性 雖 低 但 可 能 性 增 加 醫 學 文 獻 表 示 可 能 會 發 展 為 高 度 病 變 2,3,7,18 潛 在 CIN2-3 或 癌 症 的 可 能 性 很 低 ; 此 結 果 並 非 阻 止 婦 女 進 行 陰 道 鏡 檢 查 無 法 判 定 : 高 % CV** 無 法 判 定 無 法 確 認 高 風 險 HPV 狀 態 無 法 判 定 : 低 gdna** 針 對 30 歲 * 具 有 NILM 細 胞 的 病 患 說 明 潛 在 高 度 CIN 的 可 能 性 低 ; HPV 感 染 可 能 是 暫 時 的 逐 步 形 成 或 持 續 的 潛 在 高 度 CIN 或 癌 症 的 可 能 性 極 低 ; 此 結 果 並 非 排 除 將 來 HPV 感 染 或 潛 在 CIN2-3/ 癌 症 細 胞 異 常 的 可 能 性 * 依 據 2006 共 識 準 則 18, 若 30 歲 以 上 的 婦 女 具 有 比 ASC-US 細 胞 更 嚴 重 的 病 變 ( 包 括 ASC-H, LSIL 或 以 上 ), 不 論 HPV 檢 測 結 果 為 何, 都 應 接 受 陰 道 鏡 檢 查 ** 根 據 所 有 檢 測 的 病 患 樣 本,Cervista HPV HR 臨 床 試 驗 證 明, 無 法 判 定 率 為 0.54%(95%CI:0.32%- 0.86%) 15

16 品 質 控 制 內 部 對 照 Cervista HPV HR 檢 測 包 括 內 部 對 照, 可 決 定 每 種 反 應 中 樣 品 DNA 的 相 對 數 量 內 部 對 照 ( 人 類 HIST2H2BE) 是 在 每 個 反 應 中, 以 高 於 經 驗 臨 界 值 之 Red 螢 光 信 號 進 行 測 量 以 該 目 標 測 量 作 為 品 質 控 制 的 機 制, 確 認 陰 性 結 果 並 非 由 於 不 足 的 樣 本 而 造 成 該 內 部 對 照 目 標 亦 可 作 為 程 序 測 量, 確 保 測 試 程 序 已 充 分 執 行 外 部 對 照 陰 性 對 照 每 個 試 驗 盤 上 都 必 須 進 行 無 目 標 對 照, 且 結 果 必 須 符 合 下 列 標 準, 該 試 驗 盤 上 的 樣 品 才 算 有 效 若 不 符 合 以 下 標 準, 試 驗 盤 上 的 樣 品 和 對 照 組 皆 無 效, 必 須 再 次 進 行 測 試 ( 請 參 閱 表 5 的 摘 要 ): 1. 三 種 混 合 物 的 最 小 信 號 都 必 須 大 於 或 等 於 600 RFU( 600) 2. 來 自 三 種 混 合 物 的 平 均 HPV 信 號 %CV 必 須 小 於 25.0%(<25.0%) 3. 來 自 三 種 混 合 物 的 平 均 gdna 信 號 %CV 必 須 小 於 25.0%(<25.0%) 表 5: 無 目 標 對 照 標 準 最 大 % CV 結 果 最 小 HPV 信 號 最 小 gdna 信 號 (HPV 和 gdna) 有 效 % 陽 性 控 制 每 個 試 驗 盤 上 都 必 須 進 行 HPV 對 照 (HPV 對 照 組 1-3), 且 結 果 必 須 符 合 下 列 標 準, 該 試 驗 才 算 有 效 若 對 照 組 不 符 合 下 列 標 準, 試 驗 盤 上 的 樣 品 亦 無 效, 必 須 再 次 進 行 測 試 ( 請 參 閱 表 6 的 摘 要 ): 1. 從 三 種 反 應 混 合 物 的 HPV FOZ 值 中, 找 出 最 大 值 除 以 最 小 值, 以 決 定 HPV FOZ 比 ( 若 FOZ 小 於 1.0, 將 其 標 準 化 至 1.0) HPV 對 照 組 1 應 只 會 對 HPV 寡 核 苷 酸 混 合 物 1 產 生 陽 性 HPV FOZ 值 ( 1.525),HPV 對 照 組 2 應 只 會 對 HPV 寡 核 苷 酸 混 合 物 2 產 生 陽 性 HPV FOZ 值 ( 1.525),HPV 對 照 組 3 應 只 會 對 HPV 寡 核 苷 酸 混 合 物 3 產 生 陽 性 HPV FOZ 值 ( 1.525) 2. 三 種 混 合 物 的 平 均 gdna FOZ 必 須 大 於 或 等 於 1.50( 1.50), 否 則 低 gdna 會 造 成 對 照 組 無 效 3. 三 種 混 合 物 的 平 均 gdna FOZ %CV 應 小 於 25.0%(<25.0%) 16

17 表 6:HPV 對 照 標 準 對 照 組 HPV 對 照 組 1 HPV 對 照 組 2 HPV 對 照 組 3 結 果 有 效 對 照 有 效 對 照 有 效 對 照 HPV FOZ 比 陽 性 FOZ 混 合 物 平 均 gdna FOZ % CV gdna FOZ 只 有 混 合 物 < 25.0% 只 有 混 合 物 < 25.0% 只 有 混 合 物 < 25.0% 注 意 : 額 外 的 外 部 對 照 可 依 據 國 家 法 規 或 認 證 機 構 的 準 則 或 要 求 進 行 測 試 任 何 額 外 的 外 部 對 照 應 使 用 每 個 測 試 盤 配 置 給 病 患 樣 品 專 用 的 測 試 孔 檢 測 驗 證 1. 當 陽 性 和 陰 性 對 照 組 皆 產 生 正 確 的 結 果 時, 樣 品 結 果 是 有 效 的 若 無 目 標 對 照 ( 陰 性 對 照 ) 無 效 和 / 或 任 何 陽 性 對 照 結 果 無 效, 所 有 測 試 盤 上 的 樣 本 檢 測 結 果 皆 無 效, 必 須 重 新 測 試 請 參 閱 本 文 件 或 Invader Call Reporter 軟 體 使 用 者 手 冊 中 的 疑 難 排 解 章 節 2. 所 有 品 質 控 制 要 求 的 執 行 應 符 合 法 規 以 及 認 證 要 求 限 制 1. Cervista HPV HR 檢 測 可 偵 測 高 風 險 型 HPV DNA 和 68 型 由 於 測 試 低 風 險 型 HPV 類 型 無 臨 床 實 用 性, 因 此 該 測 試 不 偵 測 HPV DNA 的 低 風 險 類 型 ( 如 ) Cervista HPV HR 檢 測 顯 示 與 兩 種 未 知 風 險 HPV 類 型 交 叉 反 應 HPV 67 型 需 5000 複 製 數 / 反 應,HPV 70 型 需 50,000 複 製 數 / 反 應, 可 觀 察 到 陽 性 結 果 3. 陰 性 結 果 並 不 排 除 HPV 感 染 的 可 能 性, 因 為 非 常 低 度 的 感 染 或 取 樣 誤 差 都 可 能 導 致 偽 陰 性 結 果 4. 該 測 試 驗 證 的 條 件 為 使 用 Rovers Cervex 刷 Wallach Papette 或 子 宮 頸 刷 / 抹 片 棒 採 集, 存 放 於 PreservCyt 保 存 液 的 子 宮 頸 細 胞 樣 本 5. 唯 有 使 用 Genfind DNA 萃 取 套 組 萃 取 DNA 的 情 況 下, 才 能 保 證 Cervista HPV HR 檢 測 的 性 能 6. 唯 有 使 用 在 ThinPrep 2000 處 理 機 處 理 的 子 宮 頸 細 胞 PreservCyt 樣 本, 才 能 保 證 Cervista HPV HR 檢 測 的 性 能, 使 用 其 他 處 理 機 的 檢 測 性 能 則 無 法 確 認 7. 接 種 HPV 疫 苗 者 的 Cervista HPV HR 檢 測 性 能 尚 未 充 分 確 立 17

18 8. DNA 使 用 Genfind DNA 萃 取 套 組 進 行 萃 取 時, 若 子 宮 頸 樣 本 被 高 濃 度 (2%) 避 孕 凝 膠 和 / 或 抗 黴 菌 乳 膏 污 染, 會 對 測 試 產 生 干 擾 在 上 述 情 況 下, 可 能 會 獲 得 偽 陰 性 結 果 9. 人 類 乳 突 病 毒 和 68 型 的 Cervista HPV HR 檢 測, 不 建 議 用 於 疑 似 性 侵 的 評 估 10. 族 群 中 HPV 感 染 的 盛 行 率 可 能 會 影 響 性 能 表 現 當 檢 測 族 群 的 盛 行 率 低 或 個 人 無 感 染 風 險 時, 將 降 低 陽 性 預 測 值 11. 感 染 HPV 並 非 細 胞 HSIL 或 潛 在 高 度 CIN 的 跡 象, 也 不 表 示 將 形 成 CIN2-3 或 癌 症 大 多 數 感 染 一 種 或 多 種 高 風 險 型 HPV 類 型 的 婦 女, 不 會 發 展 為 CIN2-3 或 癌 症 12. 陰 性 高 風 險 型 HPV 結 果 並 未 排 除 將 來 罹 患 細 胞 HSIL 或 潛 在 CIN2-3 或 癌 症 的 可 能 性 13.ThinPrep 巴 氏 子 宮 頸 檢 驗 抹 片 準 備 完 成 後, 若 PreservCyt 保 存 液 樣 本 剩 餘 量 小 於 2 ml, 則 認 為 不 足 以 進 行 Cervista HPV HR 檢 測 預 期 的 結 果 高 風 險 型 HPV 盛 行 率 婦 女 HPV 感 染 報 告 的 盛 行 率 變 動 範 圍 很 廣, 從 14% 到 高 於 90% 20 數 種 因 素 會 影 響 患 者 族 群 間 的 HPV 盛 行 率, 包 括 地 理 位 置 年 齡 性 伴 侶 數 量 異 常 子 宮 頸 細 胞 病 史 等 異 質 性, 再 加 上 取 樣 技 術 和 測 試 方 法 的 差 異, 以 及 感 染 的 間 歇 性 Cervista HPV HR 多 中 心 前 瞻 性 臨 床 研 究 共 納 入 來 自 美 國 23 州 89 個 臨 床 檢 驗 站 的 婦 女 資 料, 產 生 人 口 統 計 上 不 同 的 患 者 族 群 表 7 顯 示 來 自 四 個 臨 床 試 驗 中 心, 執 行 所 有 Cervista HPV HR 檢 測 試 驗 的 盛 行 率 結 果 樣 品 來 自 測 試 中 心 隨 機 分 佈 的 所 有 檢 驗 站 表 7: 來 自 臨 床 試 驗 測 試 中 心 的 高 風 險 型 HPV 盛 行 率 ASC-US 族 群 NILM 族 群 中 心 測 試 數 量 HPV HR 陽 性 率 測 試 數 量 HPV HR 陽 性 率 % (429/709) % (190/1007) % (178/312) % (35/225) % (133/247) % (135/721) % (29/79) % (3/13) 總 計 1, % (769/1347) 1, % (363/1966) 18

19 表 8 顯 示 在 具 有 ASC-US 細 胞 的 試 驗 者 中, 依 年 齡 區 分 的 高 風 險 型 HPV 盛 行 率 表 8: 依 年 齡 區 分 的 高 風 險 型 HPV 盛 行 率 年 齡 ASC-US 族 群 年 齡 NILM 族 群 18 < % (105/135) 30 < % (132/618) 21 < % (352/491) 40 < % (118/674) 30 < % (167/302) 50 < % (79/489) > % (145/419) > % (34/185) 所 有 57.1% (769/1347) 所 有 18.5% (363/1966) 表 9 顯 示 不 考 慮 各 項 研 究 報 告 中 細 胞 學 檢 驗 結 果 的 情 況 下, 不 同 美 國 族 群 的 婦 女 高 風 險 型 HPV 的 盛 行 率 表 9: 不 同 美 國 族 群 的 高 風 險 型 HPV 盛 行 率 發 表 年 齡 地 點 日 期 總 研 究 數 量 範 圍 HPV 盛 行 率 (%) 21 新 墨 西 哥 州 , % 美 國 公 民 , % 22 族 群 23 奧 勒 崗 州 , % 24 亞 利 桑 那 州 % 性 能 特 徵 篩 檢 具 有 ASC-US 子 宮 頸 細 胞 結 果 的 患 者, 以 決 定 是 否 需 轉 診 接 受 陰 道 鏡 檢 查 之 臨 床 靈 敏 度 和 特 異 性 進 行 多 中 心 前 瞻 性 臨 床 研 究, 以 評 估 Cervista HPV HR 測 試 篩 檢 具 有 ASC-US 細 胞 結 果 患 者 時 的 性 能, 依 此 決 定 是 否 需 轉 診 進 行 陰 道 鏡 檢 查 所 有 臨 床 性 能 特 徵 皆 使 用 ThinPrep 液 體 細 胞 樣 本 建 立 最 初 的 ThinPrep 子 宮 頸 樣 本 是 依 據 2001 年 Bethesda 系 統 分 類 法 進 行 分 類 在 例 行 子 宮 頸 癌 篩 檢 程 序 中, 檢 驗 出 具 有 ASC-US 細 胞 結 果 的 所 有 婦 女 (18 歲 以 上 ), 在 了 解 其 HPV 狀 態 前, 邀 請 她 們 參 與 此 項 研 究 同 意 參 與 的 婦 女, 其 起 初 剩 餘 的 ASC-US ThinPrep 樣 本 隨 後 將 進 行 Cervista HPV HR 檢 測 所 有 同 意 參 與 研 究 的 患 者 將 接 受 陰 道 鏡 檢 查 完 成 陰 道 鏡 檢 查 程 序 前, 研 究 員 和 患 者 仍 不 清 楚 患 者 的 HPV 狀 態, 以 避 免 產 生 偏 見 由 不 清 楚 患 者 HPV 狀 態 的 病 理 學 醫 師 檢 驗 陰 道 鏡 導 引 的 組 織 樣 本 最 後 有 1,514 位 18 歲 以 上 * 具 有 ASC-US 結 果 的 婦 女 參 與 了 此 項 研 究, 分 別 來 自 全 美 89 個 臨 床 檢 驗 站 Cervista HPV HR 檢 測 的 臨 床 表 現 是 透 過 陰 道 鏡 及 組 織 學 結 果 進 行 判 定 保 證 每 個 參 與 的 臨 床 檢 驗 站, 皆 依 據 照 護 指 引 標 準, 從 具 有 ASC-US 細 胞 的 婦 女 採 集 活 組 織 樣 品 由 中 央 病 理 學 家 審 查 小 組 提 供 的 組 織 學 結 果 共 識, 作 為 判 定 疾 病 是 否 存 在 的 黃 金 標 準 缺 乏 組 織 學 數 據 的 情 況 下, 若 無 陰 道 鏡 可 見 的 子 宮 頸 病 變 且 未 進 行 活 組 織 檢 查 時, 視 同 於 沒 有 疾 病 * 建 議 ASC-US HPV 測 試 限 用 於 21 歲 以 上 婦 女 之 準 則 18, 其 施 行 時 間 晚 於 此 項 研 究 進 行 的 時 間 19

20 總 共 有 1,347 個 已 知 疾 病 狀 態 ( 中 央 組 織 學 檢 查 或 陰 道 鏡 檢 查 為 陰 性 ) 和 Cervista HPV HR 結 果 的 ASC-US 受 試 者 Cervista HPV HR 結 果 與 陰 道 鏡 / 中 央 組 織 學 檢 查 的 比 較 顯 示 於 表 10 Cervista HPV HR 檢 測 的 臨 床 表 現, 歸 納 於 表 和 13 表 10: 針 對 具 有 ASC-US 細 胞 的 婦 女, 其 Cervista HPV HR 結 果 與 陰 道 鏡 / 中 央 組 織 學 檢 查 結 果 的 比 較 Cervista HPV HR 陰 道 鏡 檢 查 為 陰 性 未 進 行 活 組 織 檢 查 中 央 組 織 學 檢 查 無 CIN CIN1 CIN2 CIN3 HPV HR 陽 性 HPV HR 陰 性 HPV HR 無 法 判 定 總 計 表 11: 針 對 具 有 ASC-US 細 胞 的 婦 女, 其 Cervista HPV HR 檢 測 與 陰 道 鏡 / 中 央 組 織 學 檢 查 結 果 ( CIN2) 的 臨 床 表 現 比 較 摘 要 總 計 靈 敏 度 特 異 性 PPV NPV 92.8% (64/69) 44.2% (558/1263) 8.3% (64/769) 99.1% (558/563) 95% CI: (84.1% %) 95% CI: (41.5% %) 95% CI: (7.6% - 8.9%) 95% CI: (98.1% %) 疾 病 盛 行 率 5.2% (69/1332) 注 意 : 具 有 ASC-US 細 胞 的 婦 女 中, 有 1.1%(1347 中 的 15) 的 結 果 為 Cervista HPV HR 無 法 判 定, 具 有 95% CI:0.7% 至 1.8% 表 12: 針 對 具 有 ASC-US 細 胞 的 婦 女, 其 Cervista HPV HR 檢 測 與 陰 道 鏡 / 中 央 組 織 學 檢 查 結 果 ( CIN3) 的 臨 床 表 現 比 較 摘 要 靈 敏 度 特 異 性 PPV NPV 100% (22/22) 43% (563/1310) 2.9% (22/769) 100% (563/563) 95% CI: (85.1% - 100%) 95% CI: (40.3% %) 95% CI: (2.4% - 3.0%) 95% CI: (99.4% - 100%) 疾 病 盛 行 率 1.7% (22/1332) 注 意 : 具 有 ASC-US 細 胞 的 婦 女 中, 有 1.1%(15/1347) 的 結 果 為 Cervista HPV HR 無 法 判 定, 具 有 95% CI:0.7% 至 1.8% 在 此 表 格 中,CIN2 組 織 學 檢 查 結 果 (47) 視 為 疾 病 ( CIN3) 陰 性 20

21 表 13: 依 年 齡 區 分 具 有 ASC-US 細 胞 的 婦 女, 其 Cervista HPV HR 檢 測 與 陰 道 鏡 / 中 央 組 織 學 檢 查 結 果 ( CIN2) 的 臨 床 表 現 比 較 年 齡 :18 至 <21 中 央 組 織 學 檢 查 CIN2 Cervista HPV HR 陰 性 陽 性 總 計 陽 性 陰 性 總 計 疾 病 盛 行 率 : 6.8% (9/133) 95% CI 靈 敏 度 : 100% (9/9) 70.1% 100.0% 特 異 性 : 22.6% (28/124) 16.1% 30.7% PPV: 8.6% (9/105) 4.0% 15.70% NPV: 100% (28/28) 87.7% 100.0% 年 齡 :21 至 <30 中 央 組 織 學 檢 查 CIN2 Cervista HPV HR 陰 性 陽 性 總 計 陽 性 陰 性 總 計 疾 病 盛 行 率 : 6.4% (31/488) 95% CI 靈 敏 度 : 100% (31/31) 89.0% 100.0% 特 異 性 : 29.8% (136/457) 25.8% 34.1% PPV: 8.8% (31/352) 6.1% 12.27% NPV: 100% (136/136) 97.3% 100.0% 年 齡 :30 至 <39 中 央 組 織 學 檢 查 CIN2 Cervista HPV HR 陰 性 陽 性 總 計 陽 性 陰 性 總 計 疾 病 盛 行 率 : 4.4% (13/296) 95% CI 靈 敏 度 : 76.9% (10/13) 49.7% 91.8% 特 異 性 : 44.5% (126/283) 38.8% 50.3% PPV: 6.0% (10/167) 2.9% 10.74% NPV: 97.7% (126/129) 93.4% 99.5% 年 齡 :39 以 上 中 央 組 織 學 檢 查 CIN2 Cervista HPV HR 陰 性 陽 性 總 計 陽 性 陰 性 總 計 疾 病 盛 行 率 : 3.9% (16/415) 95% CI 靈 敏 度 : 87.5% (14/16) 64.0% 96.5% 特 異 性 : 67.2% (268/399) 62.4% 71.6% PPV: 9.7% (14/145) 5.4% 15.67% NPV: 99.3% (268/270) 97.3% 99.9% 21

22 在 臨 床 研 究 中, 已 知 某 些 關 鍵 變 數 將 影 響 任 何 HPV 檢 測 的 性 能 特 徵 上 述 變 數 包 括 但 不 限 於 子 宮 頸 取 樣 技 術 細 胞 檢 查 結 果 的 品 質 檢 測 族 群 的 年 齡 疾 病 盛 行 率 疾 病 確 認 法 及 組 織 學 說 明 方 法 鑑 於 多 個 臨 床 檢 驗 站 的 例 行 HPV 檢 測 存 在 某 些 變 數, 值 得 注 意 的 是, 從 Hologic 臨 床 試 驗 獲 得 的 許 多 結 果, 都 與 對 照 試 驗 條 件 下 ( 描 述 於 ASC-US/LSIL 傷 病 分 類 探 討 (ALTS) 中 ) 得 到 的 結 果 類 似 6,8,28 Hologic 研 究 與 ALTS 的 研 究 設 計 疾 病 盛 行 率 和 臨 床 性 能 特 徵 的 比 較, 如 表 14 所 示 兩 種 研 究 之 間 在 CIN2 比 率 的 差 異, 可 能 反 映 了 族 群 差 異 及 疾 病 確 認 法 的 差 異 表 14:Hologic 臨 床 試 驗 和 ALTS 6,8 的 比 較 標 準 ALTS TWT 參 與 的 檢 驗 站 / 州 數 4 / 4 89 / 22 受 試 者 平 均 年 齡 完 成 陰 道 鏡 檢 查 的 受 試 者 1149 a 1347 b 無 病 變 ; 未 進 行 活 組 織 檢 查 的 受 試 者 (%) 25% 28% 活 組 織 檢 查 無 病 理 病 變 的 受 試 者 (%) 49% 53% CIN1 的 受 試 者 (%) 15% 14% CIN2 的 受 試 者 (%) 11% 5% CIN2 的 偵 測 率 96% 93% CIN3 的 偵 測 率 96% 100% CIN2 的 陰 性 預 測 值 98.9% 99.1% CIN3 的 陰 性 預 測 值 99.5% 100.0% 至 陰 道 鏡 檢 查 的 轉 診 率 57% 57% c PCR 一 致 率 82.7% 86.1% a b c ALTS 立 即 進 行 陰 道 鏡 檢 查 的 患 者 已 知 疾 病 狀 態 和 Cervista HPV HR 結 果 的 受 試 者 數 目 30 歲 以 上 婦 女 的 轉 診 率 為 43% 針 對 30 歲 以 上 的 婦 女, 以 CERVISTA HPV HR 檢 測, 作 為 子 宮 頸 細 胞 檢 查 的 輔 助 項 目, 協 助 引 導 病 患 管 理 的 篩 檢 性 能 三 年 的 縱 向 批 准 後 研 究 已 經 開 始 以 支 持 使 用 Cervista HPV HR 檢 測 作 為 子 宮 頸 細 胞 檢 查 的 輔 助 項 目, 與 單 獨 使 用 子 宮 頸 細 胞 檢 查 進 行 比 較 研 究 設 計 如 下 所 述, 包 含 從 參 與 研 究 之 族 群 得 到 的 初 步 分 析 數 據 此 項 分 析 研 究 用 於 評 估 Cervista HPV HR 檢 測 與 ASC- US 和 NILM 30 族 群 間 的 HPV 綜 合 比 較 之 一 致 性 依 據 分 析 研 究 結 果 進 行 的 縱 向 研 究 完 成 前, 此 項 功 能 用 途 已 獲 得 核 准 此 外, 從 多 個 橫 斷 面 與 前 瞻 性 世 代 研 究 獲 得 一 致 的 數 據, 採 用 各 種 細 胞 取 樣 方 法 進 行 研 究, 並 利 用 多 種 HPV DNA 檢 測 方 法 ( 包 括 FDA 核 准 和 研 究 級 ) 提 供 了 強 而 有 力 的 證 據, 證 實 當 子 宮 頸 細 胞 檢 查 結 果 正 常 時, 陰 性 的 HPV DNA 檢 測 結 果 表 示 罹 患 早 期 的 CIN2-3 或 癌 症 之 風 險 極 低 5,16,23,25 22

23 NILM 30 臨 床 研 究 說 明 約 有 2,000 位 具 有 正 常 子 宮 頸 細 胞 檢 查 結 果 (NILM) 的 合 格 受 試 者 已 參 加 此 項 研 究, 他 們 來 自 全 美 國 26 個 參 與 試 驗 的 臨 床 中 心 願 意 提 供 三 年 後 續 追 蹤 資 料 的 受 試 者 預 計 將 有 1,000 位 以 上 在 第 一 年 年 底 的 後 續 追 蹤, 受 試 者 保 留 率 已 接 近 80% 將 持 續 追 蹤 受 試 者 3 年, 且 每 年 將 進 行 考 察 訪 問 每 次 後 續 追 蹤 訪 問 時, 將 進 行 子 宮 頸 細 胞 檢 查 具 有 ASC-US 或 更 高 度 細 胞 異 常 的 婦 女, 將 進 行 陰 道 鏡 檢 查, 若 有 需 要, 隨 後 將 進 行 活 組 織 檢 查 上 述 數 據 的 分 析 將 著 重 於 與 NILM 受 試 者 相 關 三 年 罹 患 子 宮 頸 疾 病 的 風 險, 比 較 參 加 時 (T 0 )Cervista HPV HR 結 果 為 陽 性 與 陰 性 的 差 異 在 T 0 時 的 陽 性 與 陰 性 Cervista HPV HR 結 果, 將 與 整 個 研 究 中 (a) CIN2 和 (b) CIN3 是 否 存 在 進 行 比 較 CIN2 CIN3 或 子 宮 頸 癌 的 存 在 將 由 中 央 組 織 學 檢 查 進 行 確 認 陰 性 結 果 將 由 陰 道 鏡 檢 查 定 義, 除 非 中 央 組 織 學 檢 查 結 果 取 代 最 初 的 陽 性 陰 道 鏡 檢 查 結 果 所 有 組 織 學 說 明 將 由 中 央 病 理 學 審 查 小 組 進 行 解 釋 與 ASC-US 和 NILM 30 族 群 間 的 綜 合 比 較 之 一 致 性 測 試 分 析 性 能 是 透 過 FDA 核 准 的 HPV 試 驗 和 PCR/ 定 序 的 綜 合 比 較 進 行 判 定 綜 合 比 較 的 定 義 如 下 : 若 FDA 核 准 的 HPV 試 驗 和 PCR/ 定 序 結 果 均 為 陽 性, 則 為 陽 性 ; 若 FDA 核 准 的 HPV 試 驗 和 PCR/ 定 序 結 果 均 為 陰 性, 則 為 陰 性 ; 若 FDA 核 准 的 HPV 試 驗 和 PCR/ 定 序 結 果 不 一 致, 則 無 法 判 定 在 ASC-US 族 群 臨 床 研 究 期 間 收 集 的 相 同 樣 品 隨 機 子 集 ( 收 集 於 17 個 月 的 參 與 時 間 ), 以 及 在 NILM 30 族 群 基 線 的 縱 向 批 准 後 評 估 ( 收 集 於 15 個 月 的 參 與 時 間 ), 分 別 使 用 於 此 項 分 析 研 究 中 至 於 PCR/ 定 序, 使 用 HPV L1 基 因 的 共 通 引 子 擴 增 DNA 樣 品 一 部 分 的 人 類 β- 球 蛋 白 基 因 亦 擴 增, 作 為 內 部 對 照 純 化 的 擴 增 子 做 為 14 種 HPV 高 風 險 類 型 : 和 68 的 多 重 定 序 反 應 之 模 板 定 序 數 據 採 用 各 種 序 列 比 對 軟 體 進 行 分 析 FDA 核 准 的 HPV 試 驗 則 依 據 其 核 准 標 籤 進 行 綜 合 分 析 結 果 如 以 下 的 表 15 和 表 16 所 示 表 15:ASC-US 族 群 Cervista HPV HR 與 綜 合 比 較 (PCR 定 序 和 FDA 核 准 的 HPV 試 驗 ) Cervista HPV HR 總 計 陽 性 陰 性 陽 性 綜 合 陰 性 HR 結 果 無 法 判 定 總 計 陽 性 一 致 性 百 分 比 :95.5% (536/561) 與 95% CI: (93.5% %) 陰 性 一 致 性 百 分 比 :89.4% (370/414) 與 95% CI: (86.0% %) 23

24 Table 16: 分 析 靈 敏 度 NILM 30 族 群 Cervista HPV HR 與 綜 合 比 較 (PCR 定 序 和 FDA 核 准 的 HPV 試 驗 ) Cervista HPV HR 陽 性 陰 性 總 計 陽 性 綜 合 陰 性 HR 結 果 無 法 判 定 總 計 陽 性 一 致 性 百 分 比 :94.4% (17/18) 與 95% CI: (72.7% %) 陰 性 一 致 性 百 分 比 :84.2% (357/424) 與 95% CI: (80.4% %) 針 對 基 因 重 組 HPV 質 體 DNA( 代 表 以 Cervista HPV HR 測 試 偵 測 的 14 種 HPV 類 型 ) 進 行 測 試, 以 確 定 每 種 特 定 類 型 的 個 別 分 析 靈 敏 度 對 九 種 從 子 宮 頸 樣 本 分 離 出 來 的 HPV 陰 性 DNA 樣 品 進 行 測 試, 每 種 樣 品 重 複 八 次 (9 種 樣 品 8 重 複 / 樣 品 = 72 個 數 據 點 ), 以 確 定 空 白 極 限 (LoB) LoB 值 (FAM FOZ 比 )= 1.20 偵 測 極 限 (LoD) 是 樣 品 中 最 低 的 分 析 量, 讓 至 少 95% 的 樣 品 測 試 結 果 為 測 得 HPV (FOZ >1.20)(95% 的 測 試 結 果 高 於 分 析 臨 界 值 ) 針 對 14 種 HPV 類 型 ( ) 計 算 其 個 別 偵 測 極 限 (LoD) 值 每 種 HPV 質 體 DNA 分 別 在 和 1250 複 製 數 的 濃 度 進 行 測 試, 其 背 景 是 由 HPV 陰 性 細 胞 株 分 離 出 來 的 三 種 染 色 體 DNA 濃 度 ( 分 別 為 每 一 反 應 10 ng 100 ng 和 1 µg) 所 有 陽 性 測 試 樣 品 將 重 複 八 次, 因 此 每 種 HPV 質 體 DNA 濃 度 會 產 生 24 個 數 據 依 據 CLSI 文 件 EP17-A 評 估 LoB 和 LoD 26 每 種 HPV 類 型 的 偵 測 極 限 請 參 閱 表 17, 極 限 是 依 FAM FOZ 比 和 複 製 數 範 圍 進 行 說 明 根 據 測 得 的 FAM FOZ 比 值, 其 中 95% 高 於 LoB 值 的 複 製 數 範 圍, 即 為 每 反 應 複 製 數 的 LoD 值 24

25 表 17:Cervista HPV HR 測 試 分 析 靈 敏 度 摘 要 LoD LoD HPV DNA 類 型 ( 複 製 數 / 反 應 ) (FAM FOZ 比 ) SD s 平 均 除 了 上 述 的 分 析 靈 敏 度 研 究 外, 另 準 備 細 胞 株 稀 釋 樣 品 以 評 估 Cervista HPV HR 測 試 的 性 能, 使 用 兩 種 HPV 陽 性 細 胞 株 (HeLa 和 SiHa), 再 以 HPV 陰 性 細 胞 株 (Jurkat) 進 行 稀 釋, 在 PreservCyt 溶 液 的 最 終 濃 度 為 100,000 細 胞 /ml 使 用 的 臨 床 FAM FOZ 比, 臨 界 值 為 SiHa 細 胞 濃 度 約 2,500 細 胞 /ml,hela 細 胞 約 1,000 細 胞 /ml 的 情 況 下,95 % 的 比 值 會 高 於 臨 床 臨 界 值 Cervista HPV HR 測 試 的 臨 床 臨 界 值 27 根 據 靈 敏 度 和 特 異 性 無 偏 差 估 計 的 參 考 文 獻 中 所 說 明 的 方 法, 對 臨 床 臨 界 值 進 行 評 估 簡 單 地 說, 臨 界 值 是 根 據 用 於 偵 測 CIN2 組 織 而 預 先 指 定 的 臨 床 靈 敏 度 目 標 進 行 評 估, 相 當 接 近 先 前 在 分 析 研 究 中 定 義 的 臨 界 值 基 於 上 述 標 準, 針 對 選 用 的 三 種 反 應 混 合 物, 以 HPV FOZ 比 臨 界 值 或 HPV FOZ 最 小 值 1.93, 作 為 測 試 的 臨 界 值 精 確 度 Cervista HPV HR 測 試 的 重 複 性 和 實 驗 室 內 精 確 度, 已 歷 經 21 天 的 研 究 證 實, 有 三 位 輪 替 的 操 作 員, 每 種 樣 品 在 單 獨 指 定 的 設 備 組 每 天 進 行 兩 批 測 試 每 批 檢 測 包 括 四 個 測 試 盤 同 一 天 內 的 測 試 會 使 用 不 同 的 測 試 盤 配 置 每 批 測 試 的 樣 品 包 括 從 兩 種 HPV 陽 性 細 胞 株 (SiHa - 16 型 和 HeLa - 18 型 ) 分 離 出 來 的 染 色 體 DNA 樣 品, 一 種 HPV 陰 性 細 胞 株 (Jurkat), 和 人 為 樣 品 包 含 HPV16 HPV18 HPV31 HPV33 HPV35 HPV39 HPV45 HPV51 HPV52 HPV56 HPV58 HPV59 HPV66 或 HPV68 質 體 DNA 和 Jurkat DNA 每 種 樣 品 在 三 種 濃 度 中 重 複 進 行 測 試 每 種 樣 品 的 總 測 量 總 次 數 為 84 次 (21 天, 每 天 測 試 兩 批, 每 批 重 複 兩 次 ) 25

26 表 18:21 天 精 確 度 研 究 的 統 計 摘 要 a b a 目 標 複 製 數 / 反 應 或 細 胞 /ml b HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 SiHa/ Jurkat Hela/ Jurkat Jurkat 次 數 平 均 HPV FOZ 比 批 內 ( 重 複 性 ) 批 間 異 日 間 不 同 操 作 員 間 總 計 ( 實 驗 室 內 精 確 度 ) SD %CV SD %CV SD %CV SD %CV SD %CV 5,000 a % % % % % 10,000 a % % % % % 5,000 a % % % % % 10,000 a % % % % % 5,000 a % % % % % 10,000 a % % % % % 5,000 a % % % % % 10,000 a % % % % % 5,000 a % % % % % 10,000 a % % % % % 5,000 a % % % % % 10,000 a % % % % % 5,000 a % % % % % 10,000 a % % % % % 5,000 a % % % % % 10,000 a % % % % % 5,000 a % % % % % 10,000 a % % % % % 5,000 a % % % % % 10,000 a % % % % % 5,000 a % % % % % 10,000 a % % % % % 5,000 a % % % % % 10,000 a % % % % % 5,000 a % % % % % 10,000 a % % % % % 5,000 a % % % % % 10,000 a % % % % % 20,000 SiHa / 80,000 Jurkat b % % % % % 2500 HeLa / 97,500 Jurkat b % % % % % 10,000 HeLa / 90,000 Jurkat b % % % % % 10,000 b % % % % % 20,000 b % % % % % 100,000 b % % % % % 指 定 濃 度 ( 複 製 數 / 反 應 ) 的 HPV 質 體 DNA 與 100ng/ 反 應 的 HPV 陰 性 染 色 體 DNA(Jurkat) 混 合 從 HPV 陽 性 細 胞 (SiHa 和 HeLa) 分 離 出 來 的 染 色 體 DNA 和 / 或 HPV 陰 性 細 胞 (Jurkat) 的 指 定 濃 度 ( 細 胞 /ml) 26

27 表 19:21 天 精 確 度 研 究 的 陽 性 測 試 結 果 摘 要 目 標 HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 SiHa/ Jurkat Hela/Jurkat Jurkat a 複 製 數 / 反 應 或 萃 取 的 細 胞 /ml b 次 數 平 均 HPV FOZ 比 HPV 陽 性 %(n) 操 作 員 1 操 作 員 2 操 作 員 3 總 計 5,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 10,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 5,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 10,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 5,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 10,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 5,000 a % (25) 100% (28) 100% (28) 96% (81) 10,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 5,000 a % (17) 71% (20) 82% (23) 71% (60) 10,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 5,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 10,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 5,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 10,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 5,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 10,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 5,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 10,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 5,000 a % (27) 100% (28) 100% (28) 99% (83) 10,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 5,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 10,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 5,000 a % (23) 100% (28) 100% (28) 94% (79) 10,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 5,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 10,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 5,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 10,000 a % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 20,000 SiHa / 80,000 Jurkat b % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 2500 HeLa / % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) b 10,000 HeLa / % (28) 100% (28) 100% (28) 100% (84) 10,000 b b % (1) 0% (0) 4% (1) 2% (2) 20,000 b % (0) 0% (0) 0% (0) 0% (0) 100,000 b % (0) 0% (0) 0% (0) 0% (0) a 指 定 濃 度 ( 複 製 數 / 反 應 ) 的 HPV 質 體 DNA 與 100ng/ 反 應 的 HPV 陰 性 染 色 體 DNA (Jurkat) 混 合 b 從 HPV 陽 性 細 胞 (SiHa 和 HeLa) 分 離 出 來 的 染 色 體 DNA 和 / 或 HPV 陰 性 細 胞 (Jurkat) 的 指 定 濃 度 ( 細 胞 /ml) 濃 度 為 5000 複 製 數 / 反 應 時, 質 體 DNA 樣 品 產 生 97.2%(1143/1176) 的 預 期 陽 性 結 果 濃 度 為 10,000 複 製 數 / 反 應 時, 質 體 DNA 樣 品 產 生 100.0%(1176/1176) 的 預 期 陽 性 結 果 ( 請 參 見 表 19) 27

28 再 現 性 在 三 個 外 部 檢 驗 站, 使 用 一 組 HPV 陽 性 和 陰 性 培 養 細 胞 與 HPV 陽 性 和 陰 性 子 宮 頸 樣 本, 評 估 Cervista HPV HR 測 試 的 再 現 性 從 2 ml PreservCyt 保 存 液 中 懸 浮 的 子 宮 頸 樣 本 或 培 養 細 胞 萃 取 DNA, 使 用 Genfind DNA 萃 取 套 組 進 行 萃 取 萃 取 出 16 個 DNA 樣 品, 並 在 三 個 檢 驗 站 使 用 Cervista HPV HR 進 行 檢 測, 在 兩 個 星 期 內 完 成 五 天 的 測 試 ( 非 連 續 ) 該 研 究 在 三 個 檢 驗 站 使 用 了 兩 組 Cervista HPV HR 套 件 和 三 組 Genfind DNA 萃 取 套 組 每 種 樣 品 的 測 量 總 數 為 15 次 (3 個 站 5 天 每 天 1 批 ) 所 有 檢 驗 站 預 期 和 觀 察 結 果 之 間 的 一 致 性 百 分 比 摘 要, 如 表 20 所 示 跨 站 的 個 別 樣 品 結 果 與 HPV FOZ 比 的 累 計 平 均 值 和 標 準 差, 如 表 21 所 示 表 20:Cervista HPV HR 測 試 的 多 中 心 再 現 性 研 究 之 數 據 摘 要 預 期 結 果 結 果 數 結 果 一 致 性 一 致 性 百 分 比 95% CI 下 限 陽 性 % 96.6% 陰 性 % 88.7% 表 21: 多 中 心 再 現 性 研 究 中 每 種 樣 品 的 Cervista HPV HR 結 果 摘 要 樣 品 樣 品 類 型 和 濃 度 ( 細 胞 /ml) 次 數 HPV FOZ 比 HPV 陽 性 %(n) 平 均 SD 檢 驗 站 1 檢 驗 站 2 檢 驗 站 3 總 計 (n) 1 陰 性 100,000 Jurkat (0) 0 (0) 0 (0) 0 2 陽 性 10,000 HeLa 90,000 Jurkat (5) 100 (5) 100 (5) 15 3 陽 性 5,000 HeLa 95,000 Jurkat (5) 100 (5) 100 (5) 15 4 陽 性 2,500 HeLa 97,500 Jurkat (5) 100 (5) 100 (5) 15 5 陽 性 20,000 SiHa 80,000 Jurkat (5) 100 (5) 100 (5) 15 6 陽 性 10,000 SiHa 90,000 Jurkat (5) 100 (5) 100 (5) 15 7 陽 性 5,000 SiHa 95,000 Jurkat (5) 60 (3) 100 (5) 13 8 陽 性 5,000 SiHa 2,500 HeLa 12,500 Jurkat (5) 100 (5) 100 (5) 15 9 陽 性 子 宮 頸 (A5/A6 陽 性 ) (5) 100 (5) 100 (5) 陽 性 11 陽 性 子 宮 頸 (A5/A6 陽 性 ) (5) 100 (5) 100 (5) 15 子 宮 頸 (A7 陽 性 ) (5) 100 (5) 100 (5) 15 28

29 12 陽 性 13 陽 性 14 陽 性 15 陽 性 16 陰 性 子 宮 頸 (A7 陽 性 ) (5) 100 (5) 100 (5) 15 子 宮 頸 (A9 陽 性 ) (5) 100 (5) 100 (5) 15 子 宮 頸 (A9 陽 性 ) (5) 100 (5) 100 (5) 15 子 宮 頸 ( 混 合 陽 性 ) (5) 100 (5) 100 (5) 15 子 宮 頸 ( 陰 性 ) (0) 0 (0) 0 (0) 0 干 擾 物 質 表 22 中 描 述 的 四 種 子 宮 頸 樣 本 ( 一 種 HPV 陰 性, 三 種 HPV 陽 性 ) 和 三 種 細 胞 株 樣 品 ( 一 種 HPV 陰 性, 兩 種 HPV 陽 性 ), 與 干 擾 物 質 一 同 進 行 測 試 該 干 擾 物 質 可 能 存 在 子 宮 頸 樣 本 中, 或 使 用 Genfind DNA 萃 取 套 組 萃 取 樣 品 時 不 慎 混 入 ( 表 23) 若 取 樣 前 子 宮 頸 未 清 潔, 選 用 濃 度 等 級 代 表 樣 本 採 集 過 程 中 可 能 發 生 的 極 端 情 況 使 用 Genfind DNA 萃 取 套 組, 從 純 和 不 純 的 的 樣 品 分 離 出 DNA, 並 進 行 Cervista HPV HR 測 試, 以 評 估 引 入 物 質 所 造 成 的 干 擾 表 22: 干 擾 物 質 樣 品 說 明 樣 品 子 宮 頸 樣 本 HPV 陽 性 子 宮 頸 樣 本 HPV 陰 性 Jurkat SiHa/Jurkat HeLa/Jurkat 說 明 儲 存 於 PreservCyt 保 存 液 的 子 宮 頸 樣 本 PCR/ 定 序 結 果 : 陽 性 儲 存 於 PreservCyt 保 存 液 的 子 宮 頸 樣 本 PCR/ 定 序 結 果 : 陰 性 儲 存 於 PreservCyt 保 存 液 的 細 胞 系 樣 品, 包 含 100,000 細 胞 /ml Jurkat(HPV 陰 性 ) 細 胞 儲 存 於 PreservCyt 保 存 液 的 細 胞 系 樣 品, 包 含 10,000 細 胞 /ml SiHa 細 胞 (HPV 陽 性 ) 和 90,000 細 胞 /ml Jurkat 細 胞 儲 存 於 PreservCyt 保 存 液 的 細 胞 系 樣 品, 包 含 5,000 細 胞 /ml HeLa 細 胞 (HPV 陽 性 ) 和 95,000 細 胞 /ml Jurkat 細 胞 29

30 a 表 23: 干 擾 物 質 測 試 結 果 干 擾 物 質 測 試 濃 度 是 否 觀 察 到 來 源 類 型 干 擾 現 象? 血 視 覺 可 見 否 子 宮 頸 樣 本 Genfind DNA 萃 取 套 組 取 樣 過 程 黏 液 視 覺 可 見 否 血 / 黏 液 視 覺 可 見 否 陰 道 沖 洗 液 0.5%, 2% 否 a 避 孕 凝 膠 0.5%, 2% 是 抗 黴 菌 乳 膏 包 含 2% clotrimizole 抗 黴 菌 乳 膏 包 含 4% miconazole a 0.5%, 2% 是 a 0.5%, 2% 是 PreservCyt 保 存 液 0.5%, 2% 否 b 70% 乙 醇 5%, 10% 是 b 磁 珠 5%, 10% 是 造 成 測 試 失 敗 所 需 的 干 擾 物 質 濃 度 (2%) 極 高, 不 應 存 在 於 實 際 臨 床 樣 本 中 b 可 能 造 成 測 試 失 敗 的 干 擾 物 質 濃 度 極 高, 不 應 存 在 於 純 化 的 DNA 樣 品 中 DNA 萃 取 時, 避 孕 凝 膠 會 對 10 mm Tris 緩 衝 液 中 的 磁 珠 分 離 造 成 視 覺 可 見 的 干 擾, 導 致 DNA 回 收 率 低 和 不 足 的 DNA 測 試 樣 品 造 成 測 試 失 敗 所 需 的 干 擾 物 質 濃 度 極 高, 若 臨 床 醫 師 遵 循 正 確 的 子 宮 頸 細 胞 取 樣 程 序, 採 集 子 宮 頸 細 胞 樣 品 前 先 清 理 子 宮 頸, 實 際 臨 床 樣 本 中 不 應 出 現 高 濃 度 的 干 擾 物 質 交 叉 反 應 女 性 的 肛 門 生 殖 道 經 常 存 在 一 些 細 菌 黴 菌 和 病 毒, 以 及 數 種 低 風 險 或 未 確 定 風 險 的 複 製 人 類 乳 突 病 毒 類 型, 以 Cervista HPV HR 檢 測 法 進 行 測 試, 以 評 估 潛 在 的 交 叉 反 應 ( 請 參 閱 表 24-26) 表 24: 下 列 生 物 體 以 大 約 1x10 5 cfu/ml 和 1x10 7 cfu/ml 的 濃 度 添 加 至 PreservCyt 溶 液 中 使 用 Genfind DNA 萃 取 套 組 從 下 列 有 機 體 和 陰 性 細 胞 株 (Jurkat,1x10 5 細 胞 /ml) 萃 取 DNA 所 有 樣 品 經 過 Cervista HPV HR 檢 測 後, 皆 為 陰 性 結 果 白 色 念 珠 菌 Candida albicans 棒 狀 桿 菌 Corynebacterium pseudodiptheriticum 糞 腸 球 菌 Enterococcus faecalis 大 腸 桿 菌 Escherichia coli 嗜 酸 乳 桿 菌 Lactobacillus acidophilus 普 通 變 形 桿 菌 Proteus vulgaris 金 黃 色 葡 萄 球 菌 Staphylococcus aureus 表 皮 葡 萄 球 菌 Staphylococcus epideridis 緩 症 鏈 球 菌 Streptococcus mitis 化 膿 性 鏈 球 菌 Streptococcus pyogenes 30

31 表 25: 從 下 列 生 物 體 取 得 的 純 化 DNA, 以 1x10 5 複 製 數 / 反 應 和 1x10 7 複 製 數 / 反 應 的 濃 度, 使 用 Cervista HPV HR 檢 測 法 進 行 測 試 所 有 樣 品 皆 出 現 陰 性 結 果 單 純 皰 疹 病 毒 第 一 型 Herpes simplex virus, type 1 (HSV-1) 單 純 皰 疹 病 毒 第 二 型 Herpes simplex virus, type 2 (HSV-2) 人 類 免 疫 缺 陷 病 毒 第 一 型 Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1, pol 和 env 區 域 ) 砂 眼 披 衣 菌 Chlamydia trachomatis 淋 病 雙 球 菌 Neisseria gonorrhoeae 腦 膜 炎 雙 球 菌 Neisseria meningitides 人 型 黴 漿 菌 Mycoplasma hominis 表 26: 以 下 樣 品 的 複 製 DNA 或 PCR 擴 增 子, 以 1x10 5 複 製 數 / 反 應 和 1x10 7 複 製 數 / 反 應 或 標 明 的 濃 度 進 行 測 試 Cervista HPV HR 檢 測 對 一 般 低 風 險 型 HPV( 和 53 型 ) 並 未 顯 示 任 何 交 叉 反 應 樣 品 HPV 1a 型 和 內 部 對 照 組 皆 產 生 陰 性 測 試 結 果 人 類 乳 突 病 毒 1a 型 人 類 乳 突 病 毒 6 型 人 類 乳 突 病 毒 11 型 人 類 乳 突 病 毒 42 型 人 類 乳 突 病 毒 43 型 人 類 乳 突 病 毒 44 型 人 類 乳 突 病 毒 53 型 人 類 乳 突 病 毒 67* 型 人 類 乳 突 病 毒 70* 型 人 類 內 部 對 照 基 因 * 人 類 乳 突 病 毒 67 型 和 70 型, 以 1x10 5 和 1x10 7 複 製 數 / 反 應 的 濃 度, 採 用 Cervista HPV HR 檢 測 法 進 行 測 試, 結 果 產 生 陽 性 反 應 將 上 述 樣 品 進 一 步 進 行 滴 定, 結 果 分 別 於 1000 複 製 數 / 反 應 和 10,000 複 製 數 / 反 應 時, 得 到 Cervista HPV HR 檢 測 的 陰 性 結 果 此 外, 將 從 12 個 子 宮 頸 樣 本 萃 取 的 DNA 存 放 於 PreservCyt 保 存 液, 並 事 先 透 過 PCR/ 定 序 確 認 樣 品 包 含 低 風 險 或 未 確 定 風 險 的 HPV 類 型 (HPV 或 70 型 ), 再 以 Cervista HPV HR 檢 測 法 進 行 測 試, 結 果 會 產 生 陰 性 反 應 參 考 文 獻 另 外 針 對 砂 眼 披 衣 菌 淋 病 雙 球 菌 腦 膜 炎 雙 球 菌 和 人 型 黴 漿 菌 進 行 額 外 的 交 叉 反 應 研 究, 將 所 有 的 生 物 體 攙 入 含 有 HPV 陰 性 Jurkat 細 胞 (100,000 細 胞 /ml ) 的 PreservCyt 保 存 液 中 每 種 生 物 體 準 備 三 組 樣 品, 而 所 有 樣 品 皆 使 用 Genfind DNA 萃 取 套 組 分 離 DNA 本 研 究 證 實,Cervista HPV HR 測 試 與 從 PreservCyt 樣 品 ( 含 有 高 達 cfu/ml 的 淋 病 雙 球 菌 和 腦 膜 炎 雙 球 菌,5x10 6 cfu/ml 的 人 型 黴 漿 菌 和 cfu/ml 的 砂 眼 披 衣 菌 ) 分 離 的 DNA 不 會 產 生 交 互 反 應 1. Wallboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA, Shah KV, Snijders PJ, Peto J, Meijer CJ, Muñoz N Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide.j Pathol 189(1): National Cancer Institute website: (2008). 3. Meijer CJ, Snijders PJ, and Castle PE Clinical utility of HPV genotyping. Gynecol Oncol 103:

32 4. Plummer M, Schiffman M, Castle PE, Maucort-Boulch D, Wheeler CM; ALTS Group A 2-year prospective study of human papillomavirus persistence among women with a cytological diagnosis of atypical squamous cells of undetermined significance or low-grade squamous intraepithelial lesion. J Infect Dis Jun 1;195(11): Epub 2007 Apr Castle PE, Wacholder S, Sherman ME, Lorincz AT, Glass AG, Scott DR, Rush BB, Demuth F, Schiffman M Absolute risk of a subsequent abnormal Pap among oncogenic human papillomavirus DNA-positive, cytologically negative women. Cancer Nov;95(10): Sherman ME, Schiffman M, and Cox TJ Effects of age and human papilloma viral load on colposcopy triage: data from the randomized Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance/Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion Triage Study (ALTS). Jour Nat Can Inst 94(2): Wright TC, Jr., Cox JT, Massad LS, Twiggs LB, Wilkinson EJ Consensus Guidelines for the management of women with cervical cytological abnormalities. JAMA 287: Solomon D, Schiffman M, and Tarone R Comparison of three management strategies for patients with atypical squamous cells of undetermined significance: baseline results from a randomized trial. Jour Nat Can Inst 93(4): Davey DD, Neal MH, Wilbur DC, Colgan TJ, Styer PE, and Mody DR Bethesda 2001 implementation and reporting rates: 2003 practices of participants in the college of American Pathologists Interlaboratory Comparison Program in Cervicovaginal Cytology. Arch Path Lab Med 128: Mayrand MH, E Duarte-Franco, I Rodrigues, SD Walter, J Hanley A Ferenczy, S Ratnam, F Coutlée, EL Franco. Human Papillomavirus DNA versus Papanicolaou Screening Tests for Cervical Cancer. N Engl J Med 357(16): Wheeler CM, WC Hunt, M Schiffman, PE Castle Human papillomavirus genotypes and the cumulative 2-Year risk of cervical cancer. J Infect Dis 194: Bosch FX, Lorincz A, Munoz N, Meijer CJLM, Shah KV The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer. J Clin Pathol Apr;55(4): Woodman CBJ, Collins S, Winter H, Bailey A, Ellis J, Prior P, Yates M, Rollason TP Natural history of cervical human papillomavirus infection in young women: a longitudinal cohort study. Lancet Jun;357(9271): Wallin K-L, Wiklund F, Angstrom T, Bergman F, Stendahl U, Wadell G, Hallmans G, Dillner J Type-specific persistence of human papillomavirus DNA before the development of invasive cervical cancer. N Engl J Med Nov;341(22): Wright TC Jr, Schiffman M, Solomon D, Cox JT, Garcia F, Goldie S, Hatch K, Noller KL, Roach N, Runowicz C, Saslow D Interim guidance for the use of human papillomavirus DNA testing as an adjunct to cervical cytology for screening. Obstet Gynecol 103: Kjaer S, Hogdall E, Frederiksen K, et al The absolute risk of cervical abnormalities in highrisk human papillomavirus-positive, cytologically normal women over a 10-year period. Cancer Res 66:

33 17. Saslow D, Runowicz CD, Solomon D, Moscicki A-B, Smith RA, Eyre HJ, Cohen C American Cancer Society guideline for the early detection of cervical neoplasia and cancer. CA Can Jour Clin 53: Wright TC, Jr., Massad LS, Dunton CJ, Spitzer M, Wilkinson EJ, and Solomon D consensus guidelines for the management of women with abnormal cervical cancer screening tests. Am J Obstet Gynecol 197(4): Hall JG, Eis PS, Law SM, Reynaldo LP, Prudent JR, Marshall DJ, Allawi HT, Mast AL, Dahlberg JE, Kwiatkowski RW, de Arruda M, Neri BP, and Lyamichev VI Sensitive detection of DNA polymorphisms by the serial invasive signal amplification reaction. PNAS 97(15): Revzina N, DiClemente R Prevalence and incidence of human papillomavirus infection in women in the USA: a systematic review. Int J of STD & AIDS Peyton C, Gravitt P, Hunt W, Hundley R, Zhao M, Apple R, Wheeler C Determinants of Genital Human Papillomavirus Detection in a US Population. J Infect Dis 183: Dunne E, Unger E, Sternberg M, McQuillan G, Swan D, Patel S, Markowitz L Prevalence of HPV Infection Among Females in the United States. JAMA Feb;297(8): Sherman M, et al Baseline Cytology, Human Papillomavirus Testing, and Risk for Cervical Neoplasia: A 10-Year Cohort Analysis. Jour Nat Can Inst 95: Giuliano AR, Pepenfuss M, Abrahamsen M, et al Human papillomavirus infection in the United States-Mexico border: implications for cervical cancer prevention and control. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 10: Liaw K, et al., Detection of Human Papillomavirus DNA in Cytologically Normal Women and Subsequent Cervical Squamous Intraepithelial Lesions. J Natl Cancer Inst 91: CLSI document EP17-A. Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation; Approved Guideline. 27. Kondratovich M, Yousef W. (2005) Evaluation of Accuracy and Optimal Cut-off of Diagnostic Devices in the Same Study. Proceedings of the 2005 Joint Statistical Meeting, Biopharmaceutical Section, p Arbyn M, et al Virologic Versus Cytologic Triage of Women With Equivocal Pap Smears: A Meta-analysis of the Accuracy To Detect High-Grade Intraepithelial Neoplasia. J Natl Cancer Inst: 96: 製 造 廠 名 稱 : Hologic, Inc. 製 造 廠 地 址 : 502 South Rosa Road, Madison, WI 53719, USA 藥 商 名 稱 : 保 佳 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司 藥 商 地 址 : 新 北 市 中 和 區 中 山 路 二 段 348 巷 8 號 10 樓 33

34 護 妳 身 高 危 險 型 人 類 乳 突 病 毒 去 氧 核 醣 核 酸 檢 測 套 組 Cervista HPV HR REF: Genfind DNA 萃 取 試 劑 盒 衛 署 醫 器 輸 字 第 號 使 用 前 請 務 必 詳 閱 原 廠 之 使 用 說 明 書 並 遵 照 指 示 使 用 用 途 Genfind DNA 萃 取 試 劑 盒 用 於 從 新 柏 氏 細 胞 學 測 試 用 保 存 液 保 存 的 子 宮 頸 樣 本 中 萃 取 DNA, 供 Cervista HPV HR 測 試 使 用 提 供 的 試 劑 與 儲 存 要 求 表 1:Genfind DNA 萃 取 試 劑 盒 (95 449) 內 容 與 儲 存 要 求 試 劑 標 籤 縮 寫 成 分 描 述 儲 存 要 求 K 蛋 白 酶 PK 凍 乾 酶 (1ml 瓶 裝 ) 超 純 30 C 到 15 C 冷 凍 保 存 裂 解 緩 衝 液 LB 細 胞 裂 解 液 ( 透 明 瓶 裝 ) 0.45μm 過 濾 15 C 到 30 C 室 溫 保 存 結 合 緩 衝 液 BB 磁 珠 溶 液 ( 棕 色 瓶 裝 ) 0.45μm 過 濾 2 C 到 8 C 冷 藏 保 存 沖 洗 緩 衝 液 WB DNA 沖 洗 緩 衝 液 ( 藍 色 條 紋 標 記 的 標 籤 ) 0.45μm 過 濾 15 C 到 30 C 室 溫 保 存 警 告 與 注 意 事 項 1. 操 作 任 何 人 體 組 織 或 體 液 時 應 採 用 常 規 安 全 注 意 事 項 請 根 據 當 地 要 求 處 理 樣 本 2. 產 品 成 分 ( 剩 餘 產 品 包 裝 ) 可 作 為 實 驗 室 廢 棄 物 處 理 未 使 用 的 試 劑 與 廢 液 的 處 理 應 遵 循 相 關 法 規 3. 疊 氮 化 鈉 會 與 重 金 屬 形 成 爆 炸 性 化 合 物 此 產 品 含 有 <0.1%(w/w) 的 疊 氮 化 鈉, 其 與 鉛 和 銅 的 反 覆 接 觸 可 能 在 下 水 道 中 形 成 對 震 動 敏 感 的 化 合 物 限 制 1. Genfind DNA 萃 取 試 劑 盒 不 應 用 於 新 柏 氏 細 胞 學 試 驗 系 統 PreservCyt 保 存 液 保 存 的 子 宮 頸 樣 本 以 外 的 其 他 任 何 樣 本 2. Genfind DNA 萃 取 試 劑 盒 不 應 用 於 除 Cervista HPV HR 與 Cervista HPV 16/18 測 試 以 外 的 其 他 試 驗 所 需 但 未 提 供 的 材 料 消 耗 品 : 一 次 性 吸 頭 96 孔 盤 封 口 礦 油 96 孔 2.2ml 盤 適 當 大 小 的 無 核 酸 酶 的 一 次 性 試 管, 帶 螺 旋 帽 試 劑 2M Tris, ph 7.5 無 核 酸 酶 水 70% 乙 醇 ( 分 子 生 物 級 )

35 設 備 移 液 器 震 盪 器 微 孔 盤 離 心 機 與 轉 子 SPRI 盤 96R 超 級 磁 性 盤 Thermomixer R (Eppendorf) MTP Block (Eppendorf) 與 96 孔 適 配 盤 試 劑 的 準 備 使 用 前 請 將 全 部 試 劑 恢 復 至 室 溫 不 可 將 製 備 的 試 劑 混 合 物 保 存 至 日 後 使 用 1. 從 2M Tris 溶 液 中 準 備 一 份 ph mM 的 Tris 溶 液 表 2 中 列 出 了 建 議 的 製 備 方 法, 以 處 理 96 孔 盤 樣 本 表 2:pH7.5 10mM Tris 溶 液 的 製 備 成 份 體 積 2M Tris, ph μl 無 核 酸 酶 水 19.9 ml 總 體 積 20 ml 2. 根 據 表 3, 在 一 個 適 當 大 小 的 錐 形 試 管 中 混 合 裂 解 緩 衝 液 與 K 蛋 白 酶 (96μg/μL ) 並 充 分 混 勻 表 3: 裂 解 緩 衝 液 的 製 備 成 分 體 積 樣 本 數 量 (x) 總 體 積 裂 解 緩 衝 液 400 μl x (400 μl)(x)(1.2) K 蛋 白 酶 9 μl x (9 μl)(x)(1.2) LB/PK 溶 液 409 μl x (409 μl)(x)(1.2) 使 用 說 明 1. 使 用 震 盪 器 劇 烈 混 合 PreservCyt 中 的 子 宮 頸 樣 本 每 個 樣 本 加 入 2.0ml 至 2.2ml 96 孔 盤 2. 以 1107RCF 離 心 2.2ml 96 孔 盤 分 鐘 3. 將 2.2ml 盤 放 在 SPRI 盤 96R 超 級 磁 性 盤 上 使 用 多 通 道 移 液 器 或 96 孔 盤 吸 液 器 將 上 清 液 吸 出 (96 孔 盤 吸 液 器 泵 壓 應 為 100 毫 米 汞 柱 左 右 ) 吸 出 約 1.9ml 的 上 清 液, 留 下 μL 的 溶 液 小 心 操 作, 只 可 吸 出 上 清 液, 不 要 吸 出 細 胞 物 質 注 意 : 如 果 使 用 吸 液 器, 使 用 新 鮮 蒸 餾 水 按 照 與 14 步 驟 中 所 述 沖 洗 4. 每 個 樣 本 孔 中 加 入 400μL 的 裂 解 液 與 K 蛋 白 酶 的 混 合 液 注 意 : 所 有 的 液 體 轉 移 過 程 中, 均 需 使 用 新 吸 頭 5. 使 用 恆 溫 混 勻 器 在 37 C +/ 2 C 與 1000rpm 下 作 用 15 分 鐘 注 意 : 此 步 以 後, 關 閉 恆 溫 混 勻 器 的 恆 溫 器 後 續 所 有 步 驟 都 應 保 持 恆 溫 混 勻 器 的 恆 溫 器 關 閉 6. 重 點 注 意 : 多 次 上 下 反 轉 結 合 緩 衝 液 瓶 以 充 分 混 勻, 確 保 磁 珠 均 勻 懸 浮 混 勻 後, 加 200μL 結 合 緩 衝 液 至 包 含 樣 本 的 每 個 孔 7. 將 微 孔 盤 放 在 恆 溫 混 勻 器 上, 以 1000rpm 混 勻 2 3 分 鐘 8. 將 SPRI 盤 96R 超 級 磁 性 盤 放 在 墊 片 上, 然 後 將 2.2mL 盤 放 在 磁 鐵 上 4 6 分 鐘 或 直 到 磁 珠 形 成 一 個 清 晰 的 環 並 且 上 層 溶 液 呈 現 透 明 狀 小 心 地 吸 出 全 部 上 清 液, 不 要 碰 到 磁 珠 注 意 : 如 果 使 用 96 孔 吸 液 器 必 須 使 用 墊 片 9. 從 磁 鐵 上 取 下 微 孔 盤, 給 每 個 包 含 磁 珠 的 微 孔 盤 孔 內 加 400μL 沖 洗 緩 衝 液 10. 將 微 孔 盤 放 在 恆 溫 混 勻 器 上, 以 1000rpm 混 勻 4 6 分 鐘 11. 將 SPRI 盤 96R 超 級 磁 性 盤 放 在 墊 片 上, 然 後 將 2.2mL 盤 放 在 磁 鐵 上 4 6 分 鐘 或 直 到 磁 珠

36 形 成 一 個 清 晰 的 環 並 且 溶 液 呈 透 明 狀 小 心 地 吸 出 全 部 上 清 液, 不 要 碰 到 磁 珠 注 意 : 微 孔 盤 應 於 步 驟 維 持 在 磁 鐵 及 墊 片 上 12. 給 每 個 包 含 磁 珠 的 孔 加 400 μl 70% 的 乙 醇 並 孵 育 秒 磁 珠 應 形 成 一 個 清 晰 的 環 吸 出 上 清 液 13. 給 每 個 孔 添 加 400 μl 70% 乙 醇, 重 複 70% 乙 醇 的 清 洗, 並 孵 育 秒 磁 珠 應 形 成 一 個 清 晰 的 環 吸 出 上 清 液 14. 風 乾 磁 珠 3 4 分 鐘 注 意 : 繼 續 下 列 步 驟 以 前 去 除 所 有 剩 餘 乙 醇 非 常 重 要 15. 從 磁 鐵 上 取 下 微 孔 盤, 給 每 個 包 含 磁 珠 的 孔 內 添 加 120 μl 10 mm ph 7.5 的 Tris HCl 16. 將 微 孔 盤 放 在 恆 溫 混 勻 器 上, 輪 流 以 下 列 條 件 混 勻 : i. 1000rpm,2 3 分 鐘 ii. 靜 置 2 3 分 鐘 iii. 1000rpm,2 3 分 鐘 17. 將 微 孔 盤 放 置 在 磁 鐵 上 10 分 鐘, 或 直 到 磁 珠 形 成 一 個 清 晰 的 環 並 且 溶 液 透 明 18. 微 孔 盤 仍 在 磁 鐵 上 時, 將 110μL 的 DNA 溶 液 轉 移 到 乾 淨 的 96 孔 PCR 盤 中 19. 如 果 DNA 溶 液 中 仍 可 見 磁 珠, 將 96 孔 PCR 盤 放 在 磁 鐵 上 以 使 顆 粒 沉 降 微 孔 盤 仍 在 磁 鐵 上 時, 將 110μL 的 DNA 溶 液 轉 移 到 乾 淨 的 96 孔 PCR 盤 中 使 用 礦 油 封 盤 器 封 盤 20. 萃 取 的 DNA 可 在 4 8 C 條 件 下 保 存 四 週 如 需 保 存 更 久, 將 樣 本 DNA 保 存 在 20 或 80 C 的 無 霜 冰 箱 中 操 作 程 式 注 意 事 項 用 於 體 外 診 斷 1. 多 種 儲 存 條 件 ; 見 表 1 2. 請 遵 循 優 良 實 驗 室 操 作 規 範 操 作 樣 本 與 試 劑 盒 試 劑 時 佩 戴 拋 棄 式 手 套 穿 著 實 驗 室 服 裝 並 採 取 適 當 的 眼 睛 防 護 措 施 操 作 樣 本 與 試 劑 後 充 份 洗 手 3. 不 同 批 次 的 試 劑 不 可 倒 在 一 起 使 用, 也 不 可 將 不 同 瓶 裝 的 同 一 批 試 劑 倒 在 一 起 使 用 4. 不 要 使 用 過 期 試 劑 5. 在 使 用 前, 應 將 K 蛋 白 酶 的 冷 凍 乾 燥 粉 末 用 無 核 酸 酶 水 溶 解 將 1mL 水 加 入 每 個 小 瓶 懸 于 水 中 時,K 蛋 白 酶 的 1ml 小 瓶 應 可 分 成 若 干 等 分, 並 可 再 次 在 -30 C 到 15 C 的 無 霜 冰 箱 中 冷 凍 保 存 按 需 要 溶 解 K 蛋 白 酶 用 於 DNA 萃 取 反 復 冷 凍 溶 解 酶 可 能 引 起 效 果 下 降 6. 如 果 沖 洗 緩 衝 液 中 形 成 白 色 沉 澱, 在 使 用 前 輕 輕 搖 晃 沖 洗 緩 衝 液 瓶, 或 者 在 室 溫 下 攪 拌, 直 到 沉 澱 物 溶 解 不 可 用 加 熱 的 方 式 溶 解 沉 澱 製 造 廠 名 稱 : Hologic, Inc. 製 造 廠 地 址 : 502 S. Rosa Road Madison, WI, USA 藥 商 名 稱 : 保 佳 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司 藥 商 地 址 : 新 北 市 中 和 區 中 山 路 二 段 348 巷 8 號 10 樓