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1 大麦与谷类科学 2018,35(03): Barley and Cereal Sciences doi: /j.cnki /s 微信公众号 :damkx1984 水稻纹枯病菌拮抗芽孢杆菌的筛选及鉴定 杨金松 1,2, 王爱军 3, 张再君 (1. 湖北省农业科学院粮食作物研究所, 湖北武汉 ;2. 粮食作物种质创新与遗传改良湖北省重点实验室, 湖北武汉 ;3. 四川农业大学水稻研究所, 四川成都 ) 1,2* 摘要 : 为充分发掘利用水稻田已有的有益微生物资源, 获得水稻纹枯病菌 Rhizoctonia solani 的拮抗芽孢杆菌菌株, 本研究从湖北农业科学院水稻试验田中采集根际土样, 采用稀释平板法在 LB 培养基上分离得到 96 株芽孢杆菌菌株 采用平板对峙法, 将水稻纹枯病菌标准菌株 R. solaniag1ia 与待测芽孢杆菌菌株共培养, 得到 1 株对 R. solaniag1ia 具有强拮抗作用的芽孢杆菌菌株 Q901, 并以形态学特征 生理生化特性为基础, 结合 gyrb 基因序列分析, 将其鉴定为短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus) 关键词 : 水稻 ; 立枯丝核菌 ; 短小芽孢杆菌 ;gyrb 基因中图分类号 :S 文献标识码 :A 文章编号 : 水稻纹枯病是由立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani) 引起的一种土传性真菌病害, 该病原菌可产生抗逆性强 在土壤中存活和传播中起关键作用的菌核结构, 防控难度极大, 严重发病时可造成减产 50%, 现已成为制约我国南方水稻高产的第一大病害 [12] 生产中长期单一使用化学药剂, 不仅使病原菌产生抗药性 污染环境, 高剂量的农药残留还会危及人类健康, 同时对土壤中有益微生物也产生抑制作用 [3] 生物防治对环境 生态和人类健康安全, 因此在防治水稻纹枯中发挥着越来越重要的作用, 开发新的有益微生物资源是生物防治的前提 芽孢杆菌 (Bacillus spp.) 能产生耐热抗逆的内生芽胞, 不仅分泌多种抑菌化合物, 还可以促进植物生长和诱导植物产生系统抗性, 目前性状优良的菌株资源已成功用于植物病害的防控 [45] 李全胜等研究发现, 枯草芽孢杆菌 S12 的发酵液对棉花黄萎病病原大丽轮枝菌具有明显的抑制效果 [6] ; 黄秋斌等研究表明, 蜡样芽孢杆菌 B37 在大田条件下对小麦纹枯病菌具有良好防治效果 [7] ; 乔俊卿等研究了枯草芽孢杆菌 Bs916 对番茄青枯病的防治作用, 发现菌株 Bs916 可以影响番茄根表及茎内青枯病菌种群的数量, 且对番茄植株具有促生作用 [8] 湖北是我国水稻种植大省, 由立枯丝核菌 (R. solani) 引起的纹枯病是湖北水稻种植区的主要病害 为充分发掘利用水稻田已有的生防微生物资源, 筛选出强拮抗水稻纹枯病菌的芽胞杆菌菌株, 本研究从水稻田植株周围耕作层土壤中分离并筛选对立枯丝核菌具有抑制作用的芽胞杆菌菌株, 为水稻纹枯病的防治和生防制剂的研发提供试验依据 收稿日期 : 基金项目 : 国家重点研发计划课题 (2016YED ); 国家农作物种质资源平台项目 (NICGR201531) 作者简介 : 杨金松 (1964 ), 男, 副研究员, 主要从事水稻资源创新育种工作 @qq.com * 通讯作者 : 张再君 (1964 ), 男, 研究员, 主要从事水稻资源创新育种工作 zjzhang0459@aliyun.com

2 1 材料与方法 1.1 土样采集采用 5 点取样法, 采样点位于四川农业大学水稻试验田中, 于水稻扬花期采集根际 0~20 cm 的土样用于分离芽孢杆菌菌株 每个种植小区采集 5 个点, 混匀, 共 16 份土样, 保存于 20 冰箱, 备用 1.2 供试靶标病原菌供试靶标病原菌为水稻纹枯病强致病力菌株 R. solani AG1 IA, 用于筛选生防芽孢杆菌菌株, 由四川农业大学水稻研究所植物病理实验室提供 1.3 培养基 LB 培养基 : 称取 10 g NaCl 10 g 胰蛋白胨 5 g 酵母膏 16 g 琼脂加入 1000 ml 蒸馏水中溶解,115 高压灭菌 20min LB 培养液 :LB 培养基不加琼脂 PDA 培养基 : 称取马铃薯 240 g 去皮, 切成 1cm 左右方块, 加 1000mL 蒸馏水煮沸 10min, 过滤, 加入葡萄糖 10g 琼脂 15g,115 高压灭菌 20min 1.4 芽孢杆菌的分离纯化每份土样称取 1 g 置于无菌三角瓶中, 加入无菌蒸馏水 99 ml, 混匀,80 水浴处理 10 min [9], 制得土壤悬浮液 根据预试结果, 采用 10 倍稀释法 [10], 将土壤悬浮液稀释 10 5 倍 取 10 5 倍稀释液 0.5 ml 均匀涂布于 LB 培养基上, 重复 3 次 30 恒温培养箱中放置 2d, 挑取单菌落纯化培养 24 h, 置于 60% 甘油中保存, 放于 20 冰箱备用, 以上试验均在无菌条件下操作 1.5 拮抗芽孢杆菌的筛选采用平板对峙培养法筛选对病原菌有拮抗作用的芽孢杆菌菌株 将靶标菌于 PDA 培养基上活化, 打取菌落边缘直径为 6mm 菌饼, 倒置于 PDA 培养基中央, 培养 24h 后, 在距菌饼 20 mm 处上 下 左 右分别对称点接 4 株待测芽孢杆菌菌株, 重复 3 皿 于 26~28 培养箱内培养,4 d 后观察芽孢杆菌抑菌情况, 测量抑菌圈半径并拍照处理 1.6 拮抗芽孢杆菌菌株的鉴定 形态特征与生理生化特性 参照 常见细菌系统鉴定手册 [11] 拮抗芽孢杆菌菌株基因组 DNA 的提取及检测 将纯化的芽孢杆菌菌株接种于 LB 液体培养基中, 150r/min 培养 16h, 取 1mL 菌液,10000r/min 离心 1 min 收集菌体 采用离心柱型细菌基因组 DNA 提取试剂盒 [ 生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司提供 ] 提取菌株 DNA,1% 琼脂糖凝胶电泳对 DNA 质量进行检测 1.6.3gyrB 序列分析 以 节中提取的拮抗芽孢杆菌菌株 DNA 为模板,gyrB1 (TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT) gyrb2(tccdccstcagartcwccctc) 为正 反向引物进行 PCR 扩增菌株的 gyrb 片段 [12],1% 琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检测, 送成都擎科生物科技有限公司进行测序 采用 BLAST 程序, 将测序所得序列与 GenBank 中核酸数据库序列进行同源性比对, 利用 DNAstar 软件中的 MegAlign 程序将比对结果同源性较高的芽孢杆菌登记菌株序列与所得序列构建系统发育树 2 结果与分析 2.1 拮抗菌株的筛选结果从 16 份土样中共筛选到 96 株芽孢杆菌菌株, 通过平板对峙试验, 得到 1 株抑菌带宽度大于 5 mm 的菌株 Q901( 图 1),5 株 4~5 mm 的菌株,14 株 3~4 mm 的菌株,26 株 2~3 mm 的菌株,50 株 0~2 mm 的菌株 ( 表 1)

3 抑菌带宽度 (mm) 0~2 2~3 3~4 4~5 5~6 表 1 拮抗芽孢杆菌菌株筛选结果菌株数 ( 株 ) 分离比例 52.1% 27.1% 14.6% 5.2% 1.0% 2.2 菌株 Q901 的鉴定 菌株 Q901 的形态态学与生理生生化特征 将拮拮抗芽孢杆菌菌菌株 Q901 在 LB 琼脂平平板上培养 24 h 后的菌落形态为不规规则形, 直径 2 mm 左右, 显微黄色, 表面有突起或或褶皱, 产生生椭圆形芽孢孢 其生理生生化指标测定结果见表 菌株 Q901 的 gyrb 序列分析 PCR 扩增后, 得到了 bp 左右清清晰的条带 ( 图 2) 经测测序, 得到了大小为 bp 的碱基序序列 将所得得序列与 GenBank 中核酸数数据库序列进进行同源性比比对, 结果表表明拮抗菌株 Q901 与 Genbank 登记的 B. pumilus( (AUEM104) B. pumilus(auem12) ) B. pumilus(aues82) B. pumilus (KYC24) B. pumilus(atcc 27142) B. pumilus(lnxm12) B. pumilus( NMTD17) B. pumilus (MZGC1) 和 B. pumilus(kyc18) )9 株菌株的的同源性达 99% M CK A 图 1 芽孢杆菌菌 图 2 芽孢杆菌菌菌 R. solaniag1 IA Q901 株 Q901( 右 ) 对立枯丝核菌的 株 Q901PCR 扩增条带 ( 左图 ) 拮抗效果 ( 左图 ) 表 2 菌株 Q901 的生理理生化特性 试验项目 结果 试验项目 结果 革兰氏染色 柠檬酸 接触酶 丙酸盐 葡萄萄糖氧化发酵 卵黄卵磷酶 淀粉水解 VP 测定 硝酸盐还原 吲哚 L 阿拉伯糖 苯丙氨酸 D 甘露醇 酪元 注 : 表中 D 木糖 明胶水解 表示阳性或 D 葡萄糖 7%NaCl 能利用 ; 表示阴性或不能利用

4 选取这 9 株菌株与菌株 Q901 构建系统发育树, 由图 3 可知 Q901 与菌株 B. pumilus(lnxm12) 处于最小分支, 亲缘关系最近 结合其形态特征与生理生化测定, 将其鉴定为短小芽孢杆菌 (B. pumilus) [11] 图 3 菌株 Q901 的系统发育树 3 讨论土壤中含有大量的有益微生物资源, 部分可以通过人工培养分离获得 本研究从水稻根际分离到 96 株芽孢杆菌菌株, 通过对水稻纹枯病菌的拮抗筛选, 得到 49 株抑菌带宽度大于 2mm 的菌株, 占分离总数的 51%, 这些菌株都可以进一步开发利用, 有望应用于农作物的生产中 对细菌的分类鉴定是细菌研究的重要基础性工作之一,16S rdna 序列分析是对细菌进行分子鉴定的标准方法 [13] 但是, 由于 16S rdna 序列具有高度的保守性, 其分析鉴定细菌的方法有一定的局限性, 难以分辨亲缘关系较近的种 [14] gyrb 基因编码 DNA 促旋酶的 β 亚单位蛋白在不改变氨基酸序列前提下, 其特有的遗传密码子兼并性可使 DNA 序列发生较多的变异,gyrB 基因序列较非蛋白编码基因 16S rdna 更能精确区分和鉴定芽孢杆菌的近缘种 Wang 等使用 16S rdna 序列分析了 8 个枯草芽孢杆菌群的系统发育, 无法准确区分相识度在 98% 以上的亚群, 而采用 gyrb 基因序列可精确区分其亚群 [15] 利用有益微生物对植物病虫害进行防控已经成为目前农业生产的趋势, 芽孢杆菌属细菌因其独特的生物学特性更具有广泛的应用前景, 已有多种芽孢杆菌制剂成功用于农作物病虫防治中 张学君等报道了生防菌 B3 制剂对小麦纹枯病具有较好的田间防效 [16] ; 枯草芽孢杆菌可湿性粉剂 ( 百抗 ) 可用于水稻纹枯病 三七根腐病 烟草黑胫病的防治, 并已推广至多个省份, 施用面积达 4667hm 2[17] 本研究筛选到的短小芽孢杆菌 Q901 菌株在室内平板条件下对水稻纹枯病菌有较强的拮抗作用, 可进一步验证其田间防治效果, 为生物农药的开发利用提供了一种有效的菌种资源 参考文献 : [1]LEE F N, RUSH M C. Rice sheath blight: a major rice disease [J]. Plant Disease,1983,67(7): [2] 任小平, 谢关林, 赵丽涵. 水稻纹枯病拮抗细菌的筛选与利用 [J]. 植物保护学报,2005,32(4): [3] 刘薇, 杨超, 邹剑锋, 等. 水稻纹枯病生物防治研究进展 [J]. 广西农业科学,2009,40(5): [4] 陈中义, 张杰, 黄大昉. 植物病害生防芽孢杆菌抗菌机制与遗传改良研究 [J]. 植物病理学报,2003,33(2): [5] 齐爱勇, 赵绪生, 刘大群. 芽孢杆菌生物防治植物病害研究现状 [J]. 中国农学通报,2011,27(12): [6] 李全胜, 谢宗铭, 张国丽, 等. 棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌 S12 的筛选鉴定及拮抗机制的分析 [J]. 南京农业大学学报,2015,38(3): [7] 黄秋斌, 张颖, 刘凤英, 等. 蜡样芽孢杆菌 B37 在大田小麦根部的定殖动态及其对小麦纹枯病的防治效果 [J]. 生态学报,2014,34(10): [8] 乔俊卿, 陈志谊, 梁雪杰, 等. 枯草芽孢杆菌 Bs916 防治番茄青枯病 [J]. 中国生物防治学报,2016,32(2):

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