2017 年 5 月第 19 卷第 5 期 ModChinMed May2017 Vol 19 No 5 病害防治仍主要依赖化学杀菌剂, 长期使用不仅严重破坏自然生态环境, 导致人参农药残留超标, 也给人参用药安全带来重大安全隐患 随着人们对中药材农药残留问题的认识日益深刻以及环保理念的逐渐深化,

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1 年 月 第 卷 第 期 M C M M V N 中药农业 人参致病菌拮抗菌株的筛选及鉴定 邵天蔚 丁万隆 李勇! 中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 北京 摘要 目的 筛选对人参黑斑菌 人参锈腐菌等人参致病菌有较好抑菌活性的微生物菌株 为人参病害生防 防治提供参考依据 方法 采用平板稀释法从人参栽培土壤和菌剂产品中分离菌株 以人参致病菌为靶标 采用对 峙培养法筛选拮抗菌 分别采用 S DNA和 S DNA序列分析方法鉴定细菌和真菌菌株的分类学地位 结果 共 计从人参栽培土壤中分离到 株菌 其中菌株 X对人参致病菌表现较好抑菌活性 从商品化菌剂中分离出 株 菌 其中菌株 QM BM HZ GG HC和 DD对人参致病菌表现较好抑菌活性 经鉴定 菌株 X为解淀粉芽孢杆 菌 B m QM BM和 HZ为甲基营养型芽孢杆菌 Bm GG为枯草芽孢杆菌 HC为棘孢木霉 T m m DD为平展木霉 T m 结论 筛选出的 株拮抗菌对 B 多种人参致病菌有较好抑菌活性 菌株 X可用于生防菌剂开发 与菌株 QM BM HZ GG HC和 DD对应的商 品化菌剂可用于人参病害防治 关键词 人参 病害 拮抗菌 筛选 鉴定 S I A S P P x S HAOT w DI NGW LIY I M P D m C A m M S P k U M C B C A O T C A P M S w x m mm m m C m w P A w S S m DNA R I w m Am m X w P A w m mm m w QM BM HZ GG HC DD P H m w Xw B m QM BM HZw B GGw B HCw T m m DDw T mc S m P w S X m w mm QM BM HZ GG HC DD P K w P x 人参 P x CAM 是五加科多年生 量 在 世 界 人 参 产 业 中 具 有 举 足 轻 重 的 地 宿根植物 我国传统名贵中药材 我国人参栽培面 位 人参根部发病率平均约 左右 重者高达 积居世界首位 吉林省长白山区作为我国人参主产 以上 严重影响人参的产量和品质 土传根 出口量占世界总 区 年人参产量超过全国 病防治一直是人参生产中的难点问题 目前 人参 基金项目 中医药行业科研专项 中国医学科学院医学与健康科技创新工程 I M 通信作者 李勇 研究员 研究方向 药用植物病害生物防治技术研究 E m m

2 2017 年 5 月第 19 卷第 5 期 ModChinMed May2017 Vol 19 No 5 病害防治仍主要依赖化学杀菌剂, 长期使用不仅严重破坏自然生态环境, 导致人参农药残留超标, 也给人参用药安全带来重大安全隐患 随着人们对中药材农药残留问题的认识日益深刻以及环保理念的逐渐深化, 中药材病害生物防治逐渐被愈来愈多的人所认可 [4 5] 针对中药材病害, 筛选高效 稳定的生防菌株对中药材病害防治具有重要意义 本研究以人参常见病害为靶标, 从人参根围土和市售菌剂中筛选对人参致病菌具有较好抑菌活性的菌株, 借助 16SrDNA 或 28SrDNA 序列分析对菌株进行分类学鉴定, 本研究结果对开展菌株抑菌机理研究以 及菌剂产品合理应用等均具有很好的指导作用 1 材料与方法 1 1 材料 供试菌株和土壤人参锈腐菌 Cylindrocarpon destructans 人参黑斑菌 Alternariapanax 人参根腐菌 Fusarium solani 人参灰霉菌 Botrytiscinerea 由本课题组保存 土壤样品于 2015 年 7 月采自吉林省靖宇县水库屯试验地 板石参场 镇郊参场和药用植物研究所内试验田的人参栽培土壤 商品化菌剂及其生产厂家如表 1 所示 表 1 微生物菌剂来源 菌剂商品名 编号 剂型 生产公司 启明微生物菌剂 1 号 QM 有机质 湖北启明生物工程有限公司 极靓保姆菌 BM 粉 剂 泰安市西北隆基生物科技有限公司 地衣芽孢杆菌发酵菌剂 HB 粉 剂 邓州市汇邦生物科技有限公司 金中元微生物菌剂 HZ 粉 剂 威海金中元生物肥有限公司 春回大地 ( 枯黄萎清 ) KH 粉 剂 撒尔夫农化有限公司 果根保 GG 液 体 刘氏果业集团公司 ( 河北微生物所 ) 康地龙 KD 粉 剂 郑州沙隆达植物保护技术有限公司 信诺特立克木霉菌 XN 可湿性粉剂 山东泰诺药业有限公司 霉克定 MK 粉 剂 香港帅克 拜沃哈茨木霉菌 HC 可湿性粉剂 美国拜沃股份有限公司 灰绝 LN 水分散粒剂 石家庄领农生物科技有限公司 多多生物菌种菌剂 DD 粉 剂 厦门多多生物科技有限公司 培养基 PDA 培养基 : 马铃薯 200g 葡萄糖 20g 琼脂 15~20g 水 1000mL,pH7 0;NA 培养基 : 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g NaCl5g 琼脂 20g 水 1000mL ph 7 4~7 6;LB 培养基 : 蛋白胨 10g,NaCl10g, 酵母粉 5g, 琼脂 10~15g, 蒸馏水 1000mL,pH 方法 菌株分离 纯化与保存采用梯度稀释法分离土壤样品中的微生物菌株 采回土样编号分组, 风干后过 20 目筛, 分别称取 10g 置于三角瓶中, 加入 90mL 无菌水及玻璃珠振荡 10~30min 得到土壤样品悬液 1mL 悬浊液, 加入 9mL 无菌水后 40 热浴 20min, 得菌悬液 取 1mL 菌悬液体, 梯度稀释 , 分别取 100μL, 均匀涂布在 NA 培养基表面,3 次重复 28 恒温培养 2~3d, 挑取性状差异明显的单菌落进行编号, 划线法纯化培养,4 保藏, 备用 拮抗细菌分离采用 LB 培养 694 基,35 暗培养 3~5d, 拮抗木霉菌分离采用 PDA 培养基,25 暗培养 5~7d, 分离得到的拮抗菌株纯化后,4 保存 抑菌活性筛选以四种人参致病菌为靶标, 采用对峙培养法筛选拮抗菌株 将预先培养好的人参致病菌菌饼置于 PDA 培养基中心, 四周距平板边缘 1cm 处对称接种拮抗菌株, 每种处理 3~5 次重复 28 暗培养 5~7d, 观察, 记录对照及处理组人参致病菌菌落直径 抗菌株的鉴定采用 16SrDNA 序列分析方法鉴定所得细菌菌株 取适量细菌至无菌水中, 充分震荡成细菌悬浊液, 用引物 fd1(5 AGAGTTTGATC CTGGCTCAG 3 ) 和 rp1(5 ACGGTTACCTTGT TACGACTT 3 ) 扩增细菌 16S rdna 扩增体系 25μL, 包括 :10 PCRBufer(100mmol L -1 Tris, 500mmol L -1 KCl,20mmol L -1 Mg 2+,pH 8 3) 2 5μL,dNTP(2 5mmol L -1 )1μL, 引物各 1μL, TaqDNA 聚合酶 (2 5U μl -1 )1μL, 模板 DNA( 菌

3 2017 年 5 月第 19 卷第 5 期 ModChinMed May2017 Vol 19 No 5 悬液 )1μL, 重蒸水补足 25μL 扩增程序:94 预变性 5min;94 变性 1min,55 退火 1min, 72 延伸 1min,30 次循环,72 延伸 10min 扩增产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 FungalDNAKit (OMEGA) 用于真菌基因组提取, 通用引物 NL 1 (5 GCATATCAATAAGCGGAG 3 ) 和 NL 4(5 GGTCCGTGTTTCAAGACGG 3 ) 用于真菌菌株 28S rdna 序列扩增 扩增体系 25μL, 包括 :2 PCR PremixTaq TM (Verdion2 0TakaRa)12 5μL,ddH2O 5 5μL,DNA 模板 5μL,NL 1 和 NL 4 各 1μL PCR 程序 :95 预变性 5min,94 变性 1min, 52 退火 30s,72 延伸 1min,32 次循环,72 延伸 10min PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物送三博远志公司测序, 测得序列与 GenBank 数据库进行 BLAST 分析,MEGA6 0 软件分析序列同源性, 以 Neighbor joining 方法构建系统发育树,Bootstrap(1000 次重复 ) 进行检验 1 3 数据分析用 Excel2010 对统计数据进行计算和制作图表 2 结果与分析 2 1 拮抗菌株分离 纯化共计从人参栽培土和菌剂产品中分离到 83 株菌 由人参栽培土壤分离到 66 株, 从商品化菌剂中分离到 17 株 ( 表 2) 2 2 拮抗菌株筛选研究发现, 对人参致病菌有抑菌活性的菌株共计 13 株 其中, 对人参黑斑菌有抑菌作用的菌株 13 株, 占拮抗菌总株数的 100%; 对人参锈腐菌有抑菌作用的菌株 9 株, 占拮抗菌总株数的 69 23%; 对人参根腐菌有抑菌作用的菌株 8 株, 占拮抗菌总株数的 61 54%; 对人参灰霉菌有抑菌作用的菌株 7 株, 占拮抗菌总株数的 53 85%( 表 3) 表 2 分离所得菌株编号与数目 样品编号 采集地点 / 来源 菌株编号 菌株数 EX0 水库屯试验地对照样土 e1~e7 7 EX1 水库屯试验地改良样土 e8~e20 13 BS1 板石二年生参地土样 b1~b27 27 BS2 板石四年生参地土样 b28~b32 5 ZJ0 镇郊参场土样 z1~z13 13 X 所内试验田土样 X 1 QM 启明微生物菌剂 1 号 QM 1 BM 极靓保姆菌 BM1,BM2 2 HB 地衣芽孢杆菌发酵菌剂 HB1,HB2 2 HZ 金中元微生物菌剂 HZ1~HZ3 3 KH 春回大地 ( 枯黄萎清 ) KH 1 GG 果根保 GG 1 KD 康地龙 KD 1 XN 信诺特立克木霉菌 XN 1 MK 霉克定 MK 1 HC 拜沃哈茨木霉菌 HC 1 LN 灰绝 LN 1 DD 多多生物菌种菌剂 DD 1 在上述 13 株具有抑菌效果的微生物菌株中, QM BM2 HZ3 GG X HC 和 DD 对 4 种供试人 参致病菌均有较好的抑菌活性 ( 表 4) 2 3 拮抗菌株鉴定 5 株拮抗细菌同源性分析结果表明, 菌株 QM BM2 HZ3 与甲基营养型芽孢杆菌 B methylotrophicus (KC790324,JF460743) 的序列同源性最高 (99%), 它们位于系统发育树同一分支上 ( 图 1), 综合同源 性比对结果,QM BM2 HZ3 属于甲基营养型芽孢 杆菌 B methylotrophicus 菌株 GG 与枯草芽孢杆菌 B subtilis(ab924083) 的序列同源性达 99%, 二者位 于系统发育树同一分支上 ( 图 1) 综合同源性比对 结果,GG 属于枯草芽孢杆菌 B subtilis 菌株 X 与 解淀粉芽孢杆菌 B amyloliquefaciens(hq003407) 的同 人参致病菌 表 3 分离菌株的抑菌活性 拮抗菌株 QM BM1 BM2 HB1 HB2 KH GG KD HZ2 HZ3 HC DD X 锈腐菌 黑斑菌 根腐菌 灰霉菌 注 : + 菌株对病原菌具有抑菌效果 ; - 菌株对病原菌无抑菌作用 695

4 年 月 第 卷 第 期 表 株分离菌对人参致病菌生长的抑制情况 菌落直径 mm 人参黑斑菌 人参根腐菌 M V N 源性达 二者位于系统发育树同一分支上 图 综合同源性比对结果 X应属于解淀粉芽孢杆 处理 人参锈腐菌 M C M 人参灰霉菌 菌 Bm ± 株拮抗真菌同源性分析结果表明 菌株 HC与 ± ± ± ± 棘孢木霉 T m KF 的序列 同 源 性 达 BM ± ± ± ± 它们位于系统发育树同一分支上 图 综 GG ± ± ± ± 合同源性比对结果和 HC与棘孢木霉在发育系统中 HZ ± ± ± ± 的位置 该 菌 应 属 于 棘 孢 木 霉 T m 菌 株 HC ± ± ± ± DD ± ± ± ± X ± ± ± ± CK QM ± ± ± DD与平展木霉 T m KC 序列同源性达 二者位于系统发育树同一分支上 图 综 合同源性比对结果和 DD与平展木霉在发育系统中 的位置 该菌应属于平展木霉 T m 图 细菌菌株 QM GG BM HZ和 X系统发育树 图 真菌菌株的系统发育树

5 年 月 第 卷 第 期 M C M 讨论 M V N 参考文献 芽孢杆菌属是普遍用于防治植物病害的菌属 具有抗逆性强 耐高温 易贮 存 对 人 畜 无 毒 害 环境友好等优点 是较为理想的生防微生物资源 研究表明 芽孢杆菌对人参锈腐菌和人参黑斑菌抑 菌效果明显且防治效果稳定 甲基营养型芽孢杆 菌是 年才被鉴定的新种 刘利强等 利用 杨利民 陈长宝 王秀全 等 长白山区参后地生态恢复 与再利用模式及其存在的问题 J 吉林农业大学学报 安 美 花 安 金 花 人 参 研 究 进 展 J 宁 夏 农 林 科 技 李玉 农业植物病理学 M 长春 吉林科学技术出版 社 该菌种防治黄瓜灰霉病 枯草芽孢杆菌和解淀粉芽 H R H P D SS B C 孢杆菌作为芽孢杆菌属的重要成员 在防治传统农 m P x B 业产品病害的同时 也逐渐用于人参病害生物防治 HK CS M J J G R 胡陈云等 分离出的枯草芽孢杆菌分泌的抑菌脂肽 能够导致人参黑斑菌和人参锈腐菌菌丝体的形态异 J CM S J L L YL I A 常和发育畸形 贾斌等 利用解淀粉芽孢杆菌拮抗 m B 人参黑斑病菌 抑菌率达到 本实验筛选出的 株拮抗细菌均为芽孢杆菌 实验结果表明 人参 病原菌与拮抗细菌对峙培养时抑菌带明显 推测可 能是拮抗细菌生成的次生代谢产物及几丁质酶 纤 维素酶 葡聚糖酶等降解酶类对病原菌生长产生的 抑制作用 应用于植物病害防治的生防真菌主要有木霉 T m 小 盾 壳 霉 C m m J F C 刘秀花 芽孢杆菌生物学及其应用 M 郑州 河南大学 出版社 李勇 赵东岳 丁万隆 等 人参内生细菌的分离及生防 菌株的筛选 J 中国中药杂志 刘敏 人参内生细菌 抑菌机理及病害防治效果评 价研究 D 北京 北京协和医学院 M M P S L JS B m 和链霉菌 S m 等 据已有研究报 m J A L w 道 木霉对人参锈腐菌等引发的人参根部病害有较 k 好的防治效果 丁万隆等 研究发现 木霉菌 剂可显著降低西洋参立枯病的发病率 本实验结果 表明 人参病原菌受到木霉菌抑制后有明显的生长 停滞甚至萎缩现象 据已知木霉菌生防机制 推测 可能是木霉菌生长速度快 对病原菌形成营养和空 间的双重竞争 使病原菌因缺乏营养和空间而萎缩 刘利强 杨士玲 陈强 等 亿个 甲基营养型芽孢杆 菌可湿性粉剂防治黄瓜灰霉病田间药效试验 J 现代 农业科技 胡陈云 李勇 刘敏 等 枯草芽孢杆菌 对两种人参 病原菌的抑制作用及脂肽类抑菌代谢产物的鉴定 J 中国生物防治学报 贾斌 赵贞丽 沈国娟 等 人参黑斑病生防用内生拮抗 另外也可能是木霉对病菌菌丝得重寄生作用 导致 菌分离鉴定及发酵浓缩液的性质 J 中国森林病虫 病菌菌丝生长的抑制作用 对于本实验筛选出的 株拮抗菌对四种人参致 强薇 郭帅 张爱华 等 人参根际土壤中生防人参病害 病菌均有较强的抑菌活性 证明其在人参病害生物 微生物的筛选 J 华 南 农 业 大 学 学 报 防治领域有较大的应用潜力 后续将深入探索上述 菌株对人参致病菌的抑菌作用机理 结合田间病害 防效测定 为人参病害生物防治提供科学依据 丁万隆 程惠珍 陈君 应用木霉制剂防治几种药用植物 病害的研究 J 中国中药杂志 收稿日期

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