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1 大鼠心肌细胞 ATP/ADP/AMP 含量高效液相色谱法定量检测试剂盒 产品说明书 ( 中文版 ) 主要用途 大鼠心肌细胞 ATP/ADP/AMP 含量高效液相色谱法定量检测试剂盒是一种旨在通过高氯酸酸性处理, 碱性中和后, 在高效液相色谱仪和紫外光度仪下 (254nm 波长 ) 检测分析, 分离出 ATP ADP 或 AMP 波峰, 以定量测定样品中腺嘌呤核苷酸含量的权威而经典的技术方法 该技术经过精心研制 成功实验证明的 其适用于各种动物或人体纯化线粒体样品中 ATP ADP AMP 的含量检测 产品严格无菌, 即到即用, 操作简捷, 性能稳定 技术背景 腺嘌呤核苷酸 (adenine nucleotides), 简称腺苷, 包括单磷酸腺苷 二磷酸腺苷和三磷酸腺苷, 是一种单体单位, 为核糖核酸 (RNA) 和脱氧核糖核酸 (DNA) 的组成成分, 并提供化学能量, 在能量代谢通路中维护诸如肌肉 胞膜等组织细胞结构的生化和生理功能, 调节细胞糖酵解 三羧酸循环 电子传递系统 氧化磷酸化活动 腺嘌呤核苷酸在细胞中浓度低, 且不稳定, 通常通过其类型不同 浓度差异 分布状况, 来评价细胞的代谢情况和能量状态 单磷酸腺苷 (Adenosine monophosphate;amp), 又称为 5'- 腺嘌呤核苷酸或腺苷酸 (5'-adenylic acid), 是一种在 ( 脱氧 ) 核糖核酸中发现的核苷酸 它是一种磷酸及核苷腺苷的酯, 并由磷酸基团 戊糖核酸糖及碱基腺嘌呤所组成 分子式为 C10H14N5O7P, 分子量 347 AMP 可以通过腺苷酸激酶 (adenylate kinase) 催化 2 分子 ADP 生成, 或通过 ATP 以及 ADP 水解产生 AMP 常以腺苷 -3',5'- 环化一磷酸 (camp) 形式存在于细胞中 AMP 与 ATP 之比反映细胞 ATP 生成状况以及脂肪酸氧化程度 二磷酸腺苷 (adenosine diphosphate;adp), 参与 ADP-ATP 循环, 提供热能转换和动态平衡, 尤其在线粒体需氧呼吸 光合成等实现 三磷酸腺苷 (Adenosine triphosphate;atp) 存在于所有代谢活跃的细胞内, 是细胞活力的标志 一旦细胞凋亡或坏死,ATP 浓度急遽下降 通过高氯酸酸性处理, 排除蛋白质干扰, 碱性中和后, 在高效液相色谱仪和紫外光度仪下 (254nm 波长 ) 检测分析, 分离出 ATP ADP AMP 波峰, 以定量其含量 产品内容 清理液 (Reagent A) 裂解液 (Reagent B) 酸性液 (Reagent C) 中和液 (Reagent D) 流相液 A(Reagent E) 流相液 B(Reagent F) 标准液 (Reagent G) 产品说明书 100 毫升 100 毫升 5 毫升 1 毫升 500 毫升 500 毫升 500 微升 1 份 1

2 保存方式 保存标准液 (Reagent G) 在 -20 冰箱里, 其余的保存在 4 冰箱里 ; 酸性液 (Reagent C) 和中和液 (Reagent D) 具有腐蚀性, 注意操作安全 ; 有效保证 6 月 用户自备 HANK 平衡盐缓冲溶液 (GMS12028) 或 PBS 缓冲溶液 (GMS12033): 用于清理细胞胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液 (GMS12024): 用于细胞脱离完全细胞培养液 (GMS12052): 用于细胞处理所需的培养基 15 毫升锥形离心管 : 用于样品操作的容器 50 毫升锥形离心管 : 用于样品操作的容器 1.5 毫升离心管 : 用于样品操作的容器 4 ( 微型 ) 台式离心机 : 用于样品操作 DOUNCE 匀浆器 : 用于裂解细胞高效液相色谱仪 (HPLC): 用于定量测定 实验步骤 一 样品准备 1) 组织线粒体制备 1. 手术取出动物组织, 并秤重以确定 1 克组织重量 ( 实验前最好使动物空腹 12 至 24 小时 ) 2. ( 选择步骤 ) 放进预冷的 50 毫升锥形离心管 3. ( 选择步骤 ) 加入 5 毫升清理液 (Reagent A) 清洗 1 次 4. 即刻用刀片切碎组织 5. 放进一个预冷的 15 毫升锥形离心管 6. 加入 5 毫升预冷的裂解液 (Reagent B) 7. 涡旋震荡 5 秒, 充分混匀 8. 即刻放入预冷的 DOUNCE 匀浆器 9. 在冰槽里用匀浆棒匀化组织 ( 约 80 下 )( 注意 : 参见注意事项 8) 10. 将所有组织匀浆物移入 15 毫升锥形离心管 11. 放进 4 台式离心机离心 10 分钟, 速度为 1500g 12. 小心移出上清液到另一个新的预冷的 15 毫升锥形离心管 13. 放进 4 超速离心机离心 10 分钟, 速度为 10000g 14. 小心抽去上清液, 保留沉淀颗粒 15. 加入 200 微升预冷的酸性液 (Reagent C) 16. 涡旋震荡 1 分钟 17. 转移到 1.5 毫升离心管 18. 放进 4 微型台式离心机再次离心 10 分钟, 速度为 6000g 19. 小心移取上清液到新的 1.5 毫升离心管 20. 加入 31 微升中和液 (Reagent D), 充分混匀 21. 置于冰槽里静置 30 分钟 2

3 22. 即刻移入上清液到新的 1.5 毫升离心管 ( 注意 : 避免移取沉淀颗粒 ) 23. 放进 -70 冰箱里保存或置于冰槽里待测 2) 细胞线粒体制备 1. 准备 1 瓶 75cm 2 细胞培养瓶的细胞 (1 X 10 7 ), 直至细胞生长铺满整个培养表面 2. 加入 10 毫升用户自备的 HANK 平衡盐缓冲溶液或 PBS 缓冲溶液到每个细胞培养瓶, 覆盖培养瓶表面, 然后抽去 3. 重复实验步骤 2 一次 4. 加入 3 毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液, 铺满整个细胞生长表面 5. 置入 37 培养箱 3 分种 6. 轻轻手击震动培养瓶, 使细胞脱落, 7. 分别加入 10 毫升用户自备的完全细胞培养液 8. 移入一个 50 毫升锥形离心管 ( 注意 : 悬浮细胞从此步骤开始 ) 9. 放进台式离心机离心 10 分钟, 速度为 200g 10. 小心抽去上清液 11. 加入 5 毫升预冷的清理液 (Reagent A), 混匀细胞 12. 放进台式离心机离心 10 分钟, 速度为 300g 13. 小心抽去上清液 14. 加入 5 毫升预冷的裂解液 (Reagent B) 15. 涡旋震荡 5 秒, 充分混匀细胞颗粒群 16. 即刻放进预冷的 DOUNCE 匀浆器 17. 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞 ( 约 40 下 ) 18. 将所有细胞匀浆物移入 15 毫升锥形离心管 19. 放进 4 台式离心机离心 10 分钟, 速度为 1500g 20. 小心移出上清液到另一个新的预冷的 15 毫升锥形离心管 21. 放进 4 超速离心机离心 10 分钟, 速度为 10000g 22. 小心抽去上清液, 保留沉淀颗粒 24. 加入 200 微升预冷的酸性液 (Reagent C) 25. 涡旋震荡 1 分钟 26. 转移到 1.5 毫升离心管 27. 放进 4 微型台式离心机再次离心 10 分钟, 速度为 6000g 28. 小心移取上清液到新的 1.5 毫升离心管 29. 加入 31 微升中和液 (Reagent D), 充分混匀 30. 置于冰槽里静置 30 分钟 31. 即刻移入上清液到新的 1.5 毫升离心管 ( 注意 : 避免移取沉淀颗粒 ) 23. 放进 -70 冰箱里保存或置于冰槽里待测 二 测定准备 1. 开启仪器预热 15 分钟 2. 根据下表设置高效液相色谱仪 (HPLC) 参数 3

4 参数 推荐 补充说明 色谱柱 长度 :25cm 直径 :4.6mm Waters 仪器或 Agilent 仪器 固定相 ODS 流动相 流相液 A(Reagent E) 和流相液 B(Reagent 参见运行程序 F) 流速 1.3 毫升 / 分钟 注射容量 50 微升 10 微升至 100 微升 检测 紫外 波长 254nm 柱温 25 出峰时间 (retention) 5.6 分钟 (ATP);6.5 分钟 (ADP);10 分钟 (AMP) 参考 运行时间 15 分钟 参考 3. 运行程序 运行时段 程序 时间 开机后预运行 100% 流相液 A(Reagent E) 总 10 分钟 检测运行时段 100% 流相液 A(Reagent E) 0 至 9 分钟 0% 流相液 B(Reagent F) 100% 流相液 A(Reagent E) 至 9 至 15 分钟 75% 流相液 A(Reagent E) 0% 流相液 B(Reagent F) 至 25% 流相液 B (Reagent F) 关机前运行 100% 流相液 A(Reagent E) 总 10 分钟 0% 流相液 B(Reagent F) 三 标准样品配制 1. 准备好 5 个 1.5 毫升离心管, 标记为 1 至 5 号管 2. 分别加入 100 微升流相液 A(Reagent E) 到 1 至 5 号管 3. 移取 100 微升标准液 (Reagent G) 到 1 号管, 混匀 4. 小心移取 100 微升 1 号管稀释的标准液 (Reagent G) 到 2 号管, 混匀 5. 小心移取 100 微升 2 号管稀释的标准液 (Reagent G) 到 3 号管, 混匀 6. 小心移取 100 微升 3 号管稀释的标准液 (Reagent G) 到 4 号管, 混匀 7. 将 1 至 5 号管放进冰槽里备用, 避免光照 ; 标准管浓度见下表 管号 流相液 A(Reagent E) 标准液 (Reagent G) 标准 ATP/ADP/AMP 浓度 微升 100 微升 100 微摩尔 / 升 微升 100 微升 1 号管 50 微摩尔 / 升 微升 100 微升 2 号管 25 微摩尔 / 升 微升 100 微升 3 号管 12.5 微摩尔 / 升 微升 0 0 4

5 四 色谱分析 1. 将上述配制的标准液 (Reagent G) 和待测样品放进冰槽里等待 2. 每次 ( 每个样品 ) 注射 50 微升 3. 按照检测运行程序每次 ( 每个样品 ) 运行 15 分钟 4. 获得色谱波峰图 : 波峰面积 (peak area) 或峰值, 保存记录 五 计算样本 ATP/ADP/AMP 浓度 1. 方法一 : 通过仪器中的软件进行测算 2. 方法二 : 构建标准曲线 : 纵座标 (Y 轴 ) 为波峰面积 (peak area); 横座标 (X 轴 ) 为标准 ATP/ADP/AMP 浓度 ( 微摩尔 / 升 ), 根据标准曲线获得样品对应 ATP/ADP/AMP 浓度 ( 微摩尔 / 升 ) 3. 方法三 : 公式计算 ( 选择单一浓度的标准液 ) 样本 ATP/ADP/AMP 浓度 ( 微摩尔 / 升 )= 样本波峰面积 (peak area)x 标准 ATP/ADP/AMP 浓度 对应 标准 ATP/ADP/AMP 浓度的波峰面积 注意事项 1. 本产品为 25 次操作, 包括标准液 2. 操作时, 须戴手套 3. 系统操作过程中, 标准液测定只需 1 次 4. 试剂具有挥发性, 注意密闭瓶盖或使用封口膜 5. 酸性液 (Reagent C) 和中和液 (Reagent D) 具有腐蚀性, 注意操作安全 6. 建议使用流相液 A(Reagent E) 作为阴性对照或作为基准线 7. 色谱柱的异物残留 气泡产生 温度未达均衡等将导致异常波峰 时间偏移等 8. 用户可以使用已知浓度的标准液 (Reagent G) 作为内参标准加入到样品中, 然后进行萃取, 检测回收率 (recovery) 9. 腺嘌呤核苷酸的出峰时间 (retention) 以用户操作时, 使用的标准液 (Reagent G) 实际出峰为准 10. 用户可以根据要求, 计算实际浓度为 : 纳摩尔 / 毫升 纳摩尔 / 毫克蛋白等 11. 如果待测样品浓度过高或过低, 可以调整样品浓度 12. 腺嘌呤核苷酸 HPLC 的参考图谱如下 : 5

6 13. 本公司提供系列腺嘌呤核苷酸检测试剂产品 质量标准 1. 本产品经鉴定性能稳定 2. 本产品经鉴定检测敏感 6

H N H CH 2 要 C要 COOH NH 2 H HN CH 2 要 C要 COOH N NH 2 R 1 O R 2 H 2 N 要 C 要 C 要 OH+H 要 N 要 C 要 COOH -H 2O R 1 O R 2 H 2 N 要 C 要 C 要 N 要 C 要 COOH H H H 氨基酸 H 肽键 H H 氧分压高 Hb-Fe 2+ +O 2 Hb-Fe 2+ -O 2

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內 容 及 試 題 範 例 術 科 評 量 規 範 評 分 標 準 一 (, 工 具 與 材 料 由 本 校 提 供, 考 生 無 須 自 備 ) ( 一 ) 基 本 焊 接 工 具 操 作 及 辨 識 基 本 手 工 具 設 備 ( 二 ) 測 驗 時 間 50 分 鐘 ( 三 ) 工 具 與 材 104 學 年 度 高 級 中 等 學 校 特 色 招 生 職 業 類 科 甄 選 入 學 內 容 審 查 表 學 校 名 稱 ( 全 銜 ) 私 立 治 平 高 中 日 期 104 年 4 月 25 日 ( 六 ) 科 班 名 資 訊 科 特 色 班 項 目 基 本 焊 接 工 具 操 作 辨 識 基 本 手 工 具 設 備 一 可 聯 接 性 : 術 科 命 題 規 範 命 題 內 容 基 本

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