畜 牧 兽 医 学 报 卷.! (#+ $ %//!!!! "-$ "!!).! #)(#+ ( +(-8(-+!),)!-".,#", ") +. (.!- +!#! "!!).! #01&1& "-)&1010 ',#(+(!.! #!!)(#+ ( +!)(-+! "#( " " +"-) (

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1 畜牧兽医学报 鸡 探针制备及其在鸡十二指肠黏膜的原位杂交反应 覃君慧 侯放亮 张 晖 包慧君 周 强 李梅英 初晓红 陈秋生 南京农业大学动物医学院 南京 陕西省家畜改良站 泾阳 西北农林科技大学动物医学院 杨凌 摘 要 应用 方法从鸡胚中扩增 基因片段 将其连接于!"#$ 分别利用!"#$ 中 和 % & 启动子及其 ' 聚合酶 以线性化的!"#$ 为模板转录合成正 反义 标记 ' 探针 以合成的地高辛 标记的 ' 为探针 进一步应用原位杂交组织化学方法 $()(*" +(,- (#+,.! (#+ $ %// 探查 ' 在鸡十二指肠黏膜的分布 结果表明 成年鸡十二指肠肠腺上皮细胞中有丰富的 ' 的转录 其中 ' 探针杂交阳性细胞在肠腺基底部和小肠绒毛中部分别占上皮细胞总数的 01&1& 和 &1010 原位杂交阳性产物大部分分布于十二指肠肠腺上皮 干细胞部 和 增生部 细胞的胞质和胞核 肠腺基底部杂交信号由下至上逐渐减弱 至小肠绒毛下部消失 转为阴性 在黏膜肌层以及肌肉层杂交反应呈阴性 本研究从基因水平证明了鸡十二指肠黏膜肠腺上皮 干细胞部 和 增生部 细胞中有 ' 的存在 表明该区域有活跃的增殖过程 以补充绒毛上端死亡脱落的细胞 关键词 鸡十二指肠黏膜 ' 探针合成 原位杂交中图分类号 %01& 文献标识码 文章编号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收稿日期 0& 基金项目 国家自然科学基金 & 作者简介 覃君慧 0 女 壮族 硕士 主要从事发育生物学研究 "( )("-)("-$",,.,.- 通讯作者 陈秋生 "(.!- # $",,.,.-

2 畜 牧 兽 医 学 报 卷.! (#+ $ %//!!!! "-$ "!!).! #)(#+ ( +(-8(-+!),)!-".,#", ") +. (.!- +!#! "!!).! #01&1& "-)&1010 ',#(+(!.! #!!)(#+ ( +!)(-+! "#( " " +"-) ())!, +(,-, ),)!-".,#", ") +. (.!-#!#!.+(! $,#+, +!#! "!!).! #!!,#(+(!(-+!!8(,-#, +!#+!.! "-), (! " +(,-!,#(+(!#(8-" #!!,+ (-+!.$+, "# "-).! -.!#!#(8-" #,%//!! )!.!"#!),"#( " " ++,! (-+!. $+,(!! -"-))(#"!"!)(-+!(-! (,, ( (, # " (-+!#+(-!! "!!).! #!!,+ -!8"+(!(-+! " (-" #. " (#.,#"!"-) #. ""$!-.,-. #(,-+!#!-#!"-)"-+(#!-#! "!!) ',!#,%//,!!!"!)#..!## $(-+ (#!! (!-+(., ()!)"-",". +,#+)$ +! +!,."+(,-, ' (-. (.!-!!# +#,%//.,- (!)+!! (#+!-.!, ' "-)"+!+(., (! "+(,-".+( (+(!#(-+!),)!-".,#", ") +. (.!- /,0% (),)!-".,#",. (.!-',!#$-+!#(# $()(*"+(,- (#+,.! (#+ $ 磷酸酶家族是一类在生物进化过程中 高度保守的细胞周期调控因子 调节早期胚胎发育 在成体 的异常活化会导致人类一系列高发性肿瘤的发生 近年来对 磷酸酶的研究成为发育生物学和肿瘤医学的一个热点 许多研究认为它与多种肿瘤的发生 发展以及预后有 关 检测 的表达有望成为判断肿瘤细胞有丝分裂指数和增殖能力的一个可靠的分子指 标 鸡是发育生物学研究的重要模式生物之一 对其保守基因结构和功能的研究不但可以阐述其在发育生物学中的作用 而且得到的结果还可运用到 人和哺乳动物疾病的预防和控制上 作者应用地高辛标记的 ' 探针在鸡成体组织上进行原位杂交试验 检测 基因转录体在鸡十二指肠黏膜的表达情况 以期能与哺乳动物中 在成体组织上的表达情况进行比较 为研究禽类消化特征和发育的分子机制提供实验依据 并为研究 的致瘤机理以及合成其抑制剂提供一定的理论依据 1 材料与方法 1 1 试验材料 只健康成年三黄鸡 体质量 11 8 购自南京市卫岗农贸中心 (*, 试剂购于 - (+, 8!- 公司 1 ' 聚合酶 限制性内切酶购于 "<" " 公司!"#$ 质粒购于北京天为时代公司 地高辛 ' 标记试剂盒 % & 碱性磷酸酶标记的地高辛抗体及 ' 显色试剂购于,.! 公司 1 鸡! + "(, 质粒的构建 参照鸡 '!- "- 序列号 3 设计引物 上游引物 = = 对应于 3000 下游引物 = = 对应于 3 由上海 - (+,8!- 公司合成 用 (*, 试剂盒提取鸡胚总 ' 进行 扩增 获得 的. ' 目的片段 用 克隆的方法将目的片段连接至!"#$ 将此质粒转化大肠杆菌 / 株感受态细胞 挑取阳性克隆进行扩增培养 小量提取质粒 再根据目的片段本身的酶切位点和!"#$ 的多克隆酶切位点 选用 0 酶进行酶切鉴定 然后测序验证 1 地高辛标记鸡 正 反义 探针的合成 将阳性株扩增后提取的质粒分别用限制性内切酶 & 和 ( 进行酶切 使其完全线性化 回收酶切片段 作为合成正 反义 ' 探针的模板 按,.! 地高辛标记试剂盒说明书分别用 %& 和 转录酶进行体外转录 合成地高辛标记的正 反义 ' 探针 合成的 ' 探针用变性琼脂糖电泳和紫外分光光度计测定浓度 1 原位杂交试验 -- 正常鸡经颈动脉放血处死 迅速取十二指肠于 多聚甲醛中固定 然后于含 8 ; > 蔗糖的 % 中? 过夜 冰冻切片 并融裱于多聚赖氨酸预处理过的载玻片上 分别用于原位杂交试验和 / 染色 杂交前后的处理过程参考前人介

3 期 覃君慧等 鸡 ' 探针制备及其在鸡十二指肠黏膜的原位杂交反应 绍的方法 并稍加改进 切片依次经 % 漂洗 (- 次 1,; > 甘氨酸 % 漂洗 (- 1 (+,- % 漂洗 (- 蛋白酶 < 8 ; > 溶液? 消化 (- 多聚甲醛? 再固定 (-% 漂洗 (- 次 1 乙酸酐 用 1,; > 三乙醇胺新鲜配置 中漂洗 (-%% (- 预杂交液中? 预杂交 杂交液中 含地高辛标记 ' 反义 ' 探针 8; >? 杂交 0 杂交后切片经过 %% 洗 (- 次 %% (- 次 然后 1%%(- 次 洗液温度均为? 再经!(- 次,. (-8#, +(,- 内? (-! (- 次 A 稀释的碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体? 孵育! (- 次! (- 然后于 ' 显色液中室温 1 避光显色 封片观察 设计 个阴性对照 用地高辛标记的 ' 正义探针代替反义探针进行杂交 用普通羊血清代替羊抗地高辛抗体 其他步骤相同 取鸡十二指肠段冰冻切片 常规 / 染色 / 显微镜下观察 1 数据统计 在 倍视野下 在原位杂交切片上 随机选取并统计 个视野中的 ' 阳性细胞数量 同时统计与其相邻切片对应视野中 / 染色的细胞数量 每只鸡选取 个视野 共统计 只鸡 -B 以相邻切片的 / 染色结果为参照 计算鸡十二指肠的肠腺基底部和小肠绒毛中部 ' 阳性细胞的百分率 并统计平均百分率及标准差 结果与分析 1! + "(, 质粒的构建和酶切鉴定 从鸡胚中提取 ' 用 成功扩增出 的目的片段 图 阳性克隆菌株扩增培养 提取质粒 再用 0 进行酶切鉴定 图 探针浓度的测定 合成好的 ' 探针用 变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计进行浓度鉴定 正义探针浓度为 00-8 ; > 反义探针浓度为 0-8 ; > 一般原位杂交 ' 探针浓度要求为 1-8 ; > 表明成功合成 的地高辛标记 1,).+ 1 ; "! 图 1 扩增目的片段 $2 1 * * #%! %($(%'# '"2 &#'% 1!"#$)(8!#+!) (+ 0 ; "! 图! + "(, 质粒的 酶切鉴定 $2 &#$'$ "#$%&%'! + "(,0$# ' 探针 进一步将探针稀释成 -8 ; > 分装 >? 保存 用于下一步原位杂交试验 原位杂交试验结果 禽类消化道黏膜表面的绒毛上皮有吸收细胞 杯状细胞和内分泌细胞 肠腺除有上述 种细胞外 还有未分化细胞和潘氏细胞 未分化细胞分布于肠腺下半部 分裂间期的未分化细胞呈柱状 胞质嗜碱性 核位于近基底面 如图 ' 与反义探针结合后的阳性产物呈蓝紫色 阳性杂交信号主要位于十二指肠固有层肠腺的中下段未分化细胞中 如图 至 低倍镜下观察 可见小肠腺上皮的杂交反应在基底部由下至上呈强弱趋势 腺体底部反应最强 甚至使细胞间的界限消失 小肠绒毛上皮中部杂交信号逐渐减弱 反应渐渐消失 小肠绒毛黏膜上皮反应为阴性 黏膜肌层和肌肉层的反应结果呈阴性 如图 高倍镜下发现 阳性细胞集中分布在肠腺基

4 ))# 畜!牧!兽!医!学!报 底部的 )潘 氏 细 胞!干 细 胞 部*和 肠 腺 体 部 的 )增 生 L& 卷! 部*!该区大部分为未分化细胞所在的区域& $!U#代替反义探 针 进 行 原 位 杂 交 结 果 为 阴 性%用 普 通羊血清代替羊抗地高辛抗体原位杂交结果也为阴!<*9: 正义探针"图!! 用地高辛标记的 -.-#(/ 性!未见任何蓝紫色深染的细胞& :I 十 二 指 肠 黏 膜 "GM 染 色 #!d"&&%/ I 十 二 指 肠 黏 膜 "GM 染 色 #!d #I 肠腺%$I 阳性细胞% #&&% I 十二指肠 黏 膜 ; 7GG 反 应!9/+'/-;, 显 色!dL&%. I 十 二 指 肠 黏 膜; 7GG 反 应!9/+' /-;, 显色!d"&&% M I 十二指肠 黏 膜 ; 7GG 反 应!9/+'/-;, 显 色!d#&&%U I 阴 性 对 照 "正 义 探 针#!d#&& 3 V A%$I, [3F 3 %:I.RA3 "GM V#!d"&&%/ I.RA3 #I; " #! % <RF GM V d#&& I *3 F \; 7GG =3ARA3!9/+'/-;, V I *3 F \; 7GG =3ARA3!9/+'/-;, V!d"&&%M I *3 F \ dl&%. ; 7GG =3ARA3!9/+'/-;, V d#&&%u I 93V [3F?!d#&& 图 M! 鸡十二指肠黏膜 ()(!%* 的原位杂交试验结果 O JM!) 1 =A 787 9()(!%* +,-./ 8 : 2>A7> 28 B,A ; 7 7 9(: ;< 28=? P

5 期 覃君慧等 鸡 ' 探针制备及其在鸡十二指肠黏膜的原位杂交反应 阳性细胞数据统计结果 以与杂交切片相邻的另一张切片 / 染色的细胞数量为参照 分别统计了 只鸡十二指肠的肠腺底部和小肠绒毛中部 ' 反义探针 %// 阳性细胞百分率并进行分析 其中 ' 探针杂交阳性细胞在肠腺基底部和小肠绒毛中部分别占上皮细胞总数的 01&1& 和 &1010 由于小肠绒毛顶部阳性细胞极少 故未进行统计 从统计结果可以看出 小肠腺上皮的杂交反应从肠腺基底部由下至上呈由强到弱的趋势 讨 论 1 同源物调控有丝分裂期的启动主要是通过去磷酸化 使特异性 < 复合物发生激活来调节细胞分裂周期和转变的进程 除了植物 在所有真核生物组织中均发现有 磷酸酶的存在 哺乳动物中已鉴定出 种 的同源物分别为 和 在非洲蟾蜍中发现有 和 而在鸡胚试验中发现 鸡胚中仅存在 种磷酸酶 和 至今还没发现有关鸡 的 & 报道 早期认为它们中的任何一个仅在细胞周期 的某个阶段发挥作用 但近来研究表明 所有 异构体都协同调控正常细胞分裂 促进细胞 0 周期运转 作为有丝分裂的激活剂 主要在 期通过对 < 激酶的 $ 和 去磷酸化而激活 < 促进细胞进入有丝分裂 期 有关 在鸡体内的表达 仅见 -"* " 等在早期鸡胚试验的报道 在鸡成体组织中还未见有关 在消化道上皮表达的报道 为了探究 的表达水平与正在增殖的细胞的关系 作者通过对!- "- 数据库中 基因 3 进行分析 设计合成了一对引物 通过 技术获得 的 ' 片段 利用随机引物法 将纯化的 ' 片段标记成地高辛探针 用于分析鸡十二指肠黏膜中的 ' 水平 反义 ' 原位杂交显示 基因广泛表达于鸡十二指肠黏膜 尤其是正在分裂的干细胞中表达量相当丰富 基因分布广泛 提示该基因在禽类小肠黏膜上皮的增殖 迁移和分化中可能起重要作用 哺乳动物小肠的黏膜上皮与肠腺上皮均为单层柱状上皮 在黏膜表面的绒毛上皮有吸收细胞 杯 状细胞和内分泌细胞 而肠腺还有未分化细胞和潘氏细胞 未分化细胞分布于肠腺下半部 常见分裂相 它可增生 分化和补充从绒毛顶端脱落的吸收细 胞和杯状细胞 一般认为 肠内分泌细胞与潘氏细胞也源于未分化细胞 故这种细胞是肠上皮的干细胞 又称增殖细胞 他们与前述的未分化细胞结构是一致的 未分化细胞增殖分化并向绒毛顶部移动 以更新肠腺及绒毛的各种细胞 根据小肠上皮细胞的更新过程 将哺乳动物小肠黏膜上皮分为 部分 包括肠腺基部的 潘氏细胞 干细胞部 肠腺中段的 增生部 肠腺上部的 成熟部 以及绒毛大部分的 功能部 绒毛顶端 脱落部 或 脱落带 作者应用地高辛标记的 ' 探针在成年鸡十二指肠黏膜进行原位杂交染色 检测到 基因转录体在小肠隐窝上皮中的表达情况 在中下段的未分化细胞中大量表达 其中在肠腺底部阳性细胞占上皮细胞总数的 01& 1& 上升到小肠绒毛中段的阳性细胞比例降至 &1 010 而在小肠绒毛顶端 仅见个别阳性细胞 该表达在小肠腺上皮由基底部下部至上呈由强到弱的趋势 底部反应最强 细胞着色也较深 甚至使上皮细胞间的界限消失 而至绒毛中段黏膜上皮反应渐弱 ' 在鸡十二指肠黏膜分布与表达的规律 说明在肠腺底部至中段的细胞正在进行着活跃的增殖 这与小肠隐窝具有增殖性的说法是对应的 而且其增殖趋势恰与哺乳动物分区相一致 故也可将鸡的肠腺和黏膜上皮分为肠腺基部的 潘氏细胞 干细胞部 和中部的 增生部 肠腺上部 成熟部 绒毛大部分的 功能部 以及绒毛顶端的 脱落部 存在不同的亚型 不同的亚型可能与细胞的定位有关 关于 在不同的细胞周期阶段定位仍具有很大的争议 可能是因为每种剪接形式有不同的定位 有 种可供选择的剪切形式 他们在人类细胞和哺乳动物细胞中以不 0 同的水平存在 这些形式的生理学差异还不清楚 大部分的研究都未区分剪接体 然而 已经有研究证实 % 期和期 的剪接体在细胞核和细胞质之间来回穿梭 并且该过程是被 结合蛋白和 中的核输出信号 ' % 和核定位信 & 号 ';% 的存在联合介导 属于短半衰期蛋白 它的 ' 蛋白水平 激酶活性及在细胞中的分布变化不大 不完全随细胞周期时相的转

6 畜 牧 兽 医 学 报 卷 换而改变 在细胞周期各阶段均有 的表达 在细胞间期 没有活性的 ).$. (- 定位在细胞质 而 存在于细胞核中 在 期 定位于细胞质和细胞核中 % 和 期则定位于细胞质 在 % 期达到峰值 在 期的末期 被转运进入细胞质 活化的 能够在体内去除 < 中的酪氨酸残基 使 ).$. (- 复合物去磷酸化并使其激活 促进细胞分 0 裂 而在期 又由细胞质转向核 区 本试验显示的阳性信号分布于细胞核和细胞质 胞质和胞核均呈紫蓝色 这一结果在分子形态学上支持如下观点 存在于细胞周期的不同时相 在 % 期后期以及 前期积累并在 % 转换时达到峰值 并在核质中来回穿梭 参考文献 ' %%' /77 ''!.$.!!8 "+(,- $ +! ).,# "+"#! " ( $ 3! / ;;;< %'!.$.!.,-+, "-)."-.!3 &&00& 翟德忠 黄 强 细胞周期蛋白依赖性激酶.). 与恶性肿瘤发生发展的研究 3 肿瘤 && 0 ;! (. 8!"+,)! #$#+!.,!-+" $!.,!#!!-8!"+!3( 0 冯亚玫 柳金雄 陈秋生 等 鸡 % ' 探针制备及其在 ' 的杂交反应 3 畜牧兽医学报 0 &% ; 3 % ',# "+"#!#(-."-.!.! #!$ "$! #,,)+" 8!+#3 ;;< 77,+!(-#",.#,-."-.! "-) "-)(#!"#! 3 + " $ % %!# && 0%9 '!!-"-)!!#,).,# "+"#!# 3 ( 2!#&0 马云彤 齐 浩 在细胞周期运行和细胞周期检验点应答中的作用和调控机制 3 西安文理学院学报 自然科学版 & ; %!.).,# " +"#!(#!##!-+(", +! "#!+ "-#(+(,-(- "-.! # 3 + " 0 ' 9 7/ ' 2%!.,!+")!-+( (."+(,-, "--!!.+!) (-!+!!-+!%"+"$ "-)"!8 "+, +!,# "+"#! 3 ( 2!#& 成令忠 钟翠平 蔡文琴 等 现代组织学 上海 上海科学技术文献出版社 布卢姆 组织学 北京 科学出版社 0 ; ' /%/ 77 3!+"-(+("+(,-, ".!.,(-+" +! + " (,!+ ")("+(,-! (!# 0 (-"#! 3 & &0 ; ' 2 %< ;;% / % ' / ;< " ".+! (#"+(,-, ).,." (#"+(,- "-) -.!"!, +) (-8+!.!.$.!"-)(-!#,-#!+,#+!## 3 + & / %/ % %/!+" '.!"!, +#(8-" ( ( #&& ;;%9 ;; <!+" $+, "# (.".. "+(,-,.).,# "+"#!(- (+,#(#+ (88! #.!-+,#, "(.,+!-.!"+(,-(- /!;".! # 3 + &0 0 ; ' 2 % < ;;% / ;' '!+".,,! "+!# (+ +,(- ).! (+,#(# + "#"-(!,!(-".+( "+(-8.$. (- ) "++!.!-+,#,! % % ' '%!+ "!!!##(,-, "-)(-!") "-)-!.."-.! # 3 &&&0

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