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詹勇石
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1 DO: /cjcb Chinese Journal of Cell Biology 216, 38(5): U TH CUONG1 陈伟东1 杨平2* 利用秀丽隐杆线虫建立灵芝学功效的评价方法费俭1,2* 摘要 (1同济大学生命科学与技术学院, 上海 292; 2上海南方模式研究中心, 上海 2123) 中药的质量评价是中药应用的关键目前, 大部分中药的活性物质尚不清楚且其成分较为复杂, 使得以化学检测为手段的中药质量标准的建立存在很大的盲目性建立学功效的检测方法, 可以为中药的质量评价提供一条新的路径该文利用秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)评价了五种不同产地灵芝水提取物对提高野生型线虫和foxo(forkhead box O)转录因子突变体抗氧化应激能力的效果结果表明, 不同产地灵芝均能够提高线虫抗氧化应激的能力, 但功效差异显著同时, 不同产地灵芝提高线虫氧化应激能力的机制也存在差异, 这提示了灵芝中存在不同的起效活性物质该文的研究结果证明了利用模式秀丽隐杆线虫可以有效地区分不同产地灵芝的活性, 并可以将其作为探索评价灵芝活性的一个研究方向关键词灵芝; 中药; 质量评价; 氧化应激; 秀丽隐杆线虫 Establishment of Quality Evaluation ndicator System for Ganoderma lucidum by Enhancing the Antioxidant Capacity of Caenorhabditis elegans U TH CUONG1, Chen Weidong1, Yang Ping2*, Fei Jian1,2* (1School of Life Sciences and Technology, Tongji University, Shanghai 292, China; 2 Shanghai Research Center for Model Organisms, Shanghai 2123, China) Abstract Quality evaluation of TCM (traditional Chinese medicine) is the key to its application. Currently, the chemical method such as Mass Spectrometry is the main method to quantify the traditional Chinese medicine. But the TCM has a complicated composition, and the functional components of most TCM remains unclear, which makes it sightless to establish the quality standard of traditional Chinese medicine by chemical methods. So, using living organism may provide a new approach to evaluate TCM s quality. n this work, we treat both wild type and FOXO (forkhead box O) transcription factor mutant Caenorhabditis elegans with water extracts of five Ganodorma lucidum from different area. The 收稿日期: 接受日期: 上海市科委项目(批准号: 13DZ2286)资助的课题 *通讯作者 Tel: , 45p_yang@tongji.edu.cn; jfei@tongji.edu.cn Received: March 2, 216 Accepted: April 5, 216 This work was supported by the Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (Grant No.13DZ2286) *Corresponding authors. Tel: , 45p_yang@tongji.edu.cn; jfei@tongji.edu.cn 网络出版时间: :7:51 URL:

2 5 研究论文 results show that all of the extracts can enhance the antioxidant capacity, but the work concentration of these five extracts differs greatly from each other. Moreover, after treating with the extracts from different area or the same extract of different concentration, the mechanism is different, indicating that the water extracts of Ganoderma lucidum have various bioactive components. Our work proved that we could use Caenorhabditis elegans to efficiently detect the biological activity of Ganoderma lucidum, and it also provided a new method to evaluate the bioactivity of Ganoderma lucidum from different areas. Keywords Ganoderma lucidum; taditional Chinese medicine; quality evaluation; oxidative stress; Caenorhabditis elegan 利用化学检测方法对中药的成分进行分析和定量, 是目前中药质量评价的主要研究方向但是, 中药的成分较为复杂, 大多数中药的活性物质至今尚不清楚, 这样就给化学定量为基础的中药质量评价带来了困难同时, 中医开具的中药多是复方, 其在体内的药理作用被认为是多组分协同作用的效果, 用单一或少数几个成分的比较来定量中够产卵 3 多个, 并且方便在实验室培养早在药的质量可能过于片面灵芝 (Ganoderma lucidum) 是一味常用的中药材关于灵芝的作用本草纲目有记载, 灵芝性平, 味苦, 无毒, 主胸中结, 益心气, 补中, 增智慧, 不忘, 久服轻身不老, 延年神仙近年的研究也表明, 灵芝及其提取物对肝炎高胆固醇血症关节炎支气管炎糖尿病肿瘤等疾病均能起 [1-4] 到治疗作用对肝炎模型小鼠生化指标进行检括多糖三萜蛋白质多酚等, 其中主要是多糖和三萜 [8-9] 不同灵芝及不同的提取方法得到的多糖种类也不尽相同, 目前已分离的灵芝多糖有 2 [11] 135 种, 其他种类的成分还没有计算在内如此多的成分, 对化学方法定量灵芝品质也可谓一种考验秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditis elegans) 是低等的无脊椎动物, 体型很小, 成虫只有 1 mm 左右其后代多, 一条野生型雌雄同体成虫一生能 7 年代, 线虫就已经作为模式被用于凋亡个体发育等方面的研究近些年的研究表明, 人类中与氧化应激相关的信号通路如线粒体呼吸链胰岛素信号通路磷脂酰肌醇 -3 激酶 (phosphatidylinositol-3 kinase, P3K) 信号通路叉头转录因子 (forkhead box O, FOXO) 靶向雷帕霉素信号等在线虫中都非常保守 [12-14] 如促衰变因子 -16(decay acceleration factor-16, daf-16) 就测表明, 灵芝提取物能够提高小鼠谷胱甘肽的表是人类叉头转录因子在线虫中的同源基因, 该基 [1] 达水平, 进而起到保护肝脏的作用灵芝还具有因在线虫抗氧化抗衰老能力上有非常重要的作羟基和超氧自由基的清除活性, 能够抑制脂质的用当机体受到外界压力如高温食物匮乏氧 [2-4] 过氧化化等恶劣环境时, DAF-16 去磷酸化, 进入核目前对灵芝质量的评价主要基于灵芝本身中, 结合到靶基因上, 增强线虫的抗逆性根据生含有的活性成分的比较, 即依赖于化学方法如苯物信息学分析, DAF-16 下游有 1 多个靶基因, 包酚硫酸法色谱技术和指纹图谱技术如高效液括超氧化物歧化酶谷胱甘肽 -S- 转移酶小热休相层析 (high performance liquid chromatography, 克蛋白基因等, DAF-16 入核后促进这些抗逆基因 HPLC) 等对灵芝提取物的各种成分进行分离和定表达上调, 从而提高线虫的抗氧化能力, 并延缓衰 [5-7] [15-17] 量已有研究表明, 灵芝中含有的活性成分包老本文研究了不同产地灵芝的水提取物对提高线虫抗氧化能力的作用及差异, 从而探讨建立一个以学效用为基础的灵芝质量评价体系, 丰 [1] 多种, 从赤芝中分离得到的三萜类化合物多于富中药质量评价的方法, 并对现有的化学评价给

3 51 U TH CUONG等: 利用秀丽隐杆线虫建立灵芝学功效的评价方法 M9缓冲液洗3遍, 除去灵芝提取液成分大肠杆予补充菌OP5后, 将线虫分配在48孔板的孔中, 空白对 1 材料与方法照组()及每种浓度药物处理组线虫均设置3 1.2 模式动物野生型秀丽隐杆线虫Bristol(N2) DAF-16突变系线虫CF138 大肠杆菌株系线虫OP5均由美国明尼苏达大学线虫遗传中心提供 1.3 实验方法灵芝水提物制备方法五种灵芝各称取 3 g, 用小型食品粉碎机将灵芝粉碎成小块, 并用纱布包裹, 加入42 ml的ddh 2O(14倍)煮沸2 h, 收集液体, 再加入36 ml的ddh 2O(12倍)煮沸2 h, 将2次得到的液体合并, 用旋转蒸发仪将液体浓缩至1 ml 最后得到的药液浓度按生药计算为 3 mg/ml 实验中所有浓度标注均以该浓度为依据个孔, 每个孔不少于3条线虫, 百草枯终浓度为 5 mmol/l 每隔5 h统计一次存活率死亡的标准, 是以震动强光照射后, 线虫身体不动为准 [18] 空白对照组()为不加灵芝提取液组, 即为 mg/ml 重金属Cr 6+ 应激实验培养线虫及分配线虫方法同百草枯应激实验, K 2 Cr 2 O 7 终浓度 1 mmol/l 每隔5 h统计一次存活率, 空白对照组 ()为不加灵芝提取液组, 即为 mg/ml 死亡的标准同上[19] 灵芝基因型鉴定五种灵芝各取5 mg 加入液氮充分碾磨, 用植物基因组DNA提取试剂 1.1 试剂与仪器百草枯(36541) 重铬酸钾(P2588) 5-氟脱氧尿苷(5-ﬂuoro-2 -deoxy-β-uridine, FUDR, F53)均购自Sigma公司五种灵芝分别命名为至是桔泉牌瓶装灵芝, 产地为湖南, 振兴中药饮片实业有限公司出品; 是恒修堂瓶装, 产地为山西, 亳州市永刚饮片厂有限公司出品; 是同仁堂瓶装, 产地为福建浦城; 是同仁堂散装, 产地为海南; 的产地为越南生化培养箱(MR254)购自日本SANYO公司, 体视显微镜(SZ61)购自日本OLYMPUS公司, PCR仪 (Eppendorf Mastercycler pro)购自德国 Eppendorf 公司线虫同步化及培养用M9缓冲液将成虫洗至无菌EP管中, 1 r/min离心1 min后, 去上清盒(DP35, TANGEN BOTECH CO., LTD)提取五种灵芝的基因组DNA PCR扩增内转录间隔区(internal transcribed spacer, TS)区域所用为真菌通用引物上游引物为TS1F(5 -CTT GGT CAT TTT AGA GGA AGT AA-3 ), 下游引物为 TS4(5 -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3 )[2], 引物是由苏州金唯智科技有限公司合成的 1.4 数据处理及统计学分析实验至少重复2次, 实验数据均采用的是 mean±s.d.表示实验采用GraphPad Prism5.软件进行数据统计分析和作图, 生存曲线之间的差异分析采用Log-rank(Mantel-Col) Test, 半数致死时间差异比较采用t检验 P<.5为差异显著 P<.1为差异极显著加适量裂解液(.5%次氯酸钠,.5mol/L氢氧化钠) 裂解线虫, 得到卵后用M9缓冲液冲洗3次, 离心弃 2 结果 12 µmol/l 发育到成虫后, 加入不同浓度灵芝水 2.1 灵芝样品的基因型鉴定真菌rDNA序列内转录间隔区被广泛用于真菌的种内和种间的系统学研究, 利用灵芝的 TS序列可对其进行种属分类[2] 我们利用针对提物, 培养5 d后, 用于接下来的毒理分析, 百草枯 TS序列的特异性引物对五种灵芝DNA样品进上清后, 加入适量S-complete培养过夜, 次日加入线虫食物大肠杆菌OP5 线虫发育到L4末期后, 加入 5-氟去氧尿苷 FUDR(5-Fluoro-2 -deoxyuridine) 6+ 行PCR扩增及测序鉴定并将测序结果提交到及重金属Cr 应激实验将在灵芝提取液中 NCB( 处理5 d的线虫用M9缓冲液冲洗到EP管中, 用列比对后, 发现与基因库中灵芝DNA序列的符合率百草枯应激实验

研究论文 52 9 1 11 12 13 Consensus JQ781855.1和GU21348.1代表NCB已道灵芝品系 JQ781855.1 and GU21348.1 represent published G. lucidum on NCB. 14 15 16 JQ781855.1 GU21348.1 dentity=99% 图1 五种灵芝与已知灵芝TS序列比对结果 Fig.

4 研究论文 Consensus JQ 和GU 代表NCB已道灵芝品系 JQ and GU represent published G. lucidum on NCB JQ GU dentity=99% 图1 五种灵芝与已知灵芝TS序列比对结果 Fig.1 The blast result of ﬁve G. lucidum,,,, and known G. lucidum TS sequence 达到99%(Sequence D: gb JQ 和Sequence 线虫对百草枯的耐受(图3) 表1是百草枯处理后 D: gb GU ), 五种灵芝样品相互之间的同不同浓度的灵芝对线虫生存时间的影响, 为评价不源性高达到99%(图1), 其中, 和序列一致, 和同来源灵芝的学总体效应, 我们定义药物累序列一致积总效应 (eﬀect of total drug concentration, ET)为药 2.2 灵芝对线虫的毒理检测将五种灵芝水提取物分别稀释成 mg/ml, 处理线虫5 d后, 存活率统计如下图2所示浓度为12 mg/ml时, 无物浓度效应图中的线下面积 ET的计算公式如下所示: 论哪种灵芝处理, 线虫均死亡; 浓度为6 mg/ml 时, 只有号灵芝处理的线虫存活率达3%左右, 其中, 式中e代表平均生存时间长短(h); c代表浓度其他灵芝水提取物培养的线虫的存活率均低于值(mg/mL) 1%; 浓度为3 mg/ml时, 和表现最好, 线虫每种灵芝ET计算结果如表2所示由数据可存活率达到1%, 号灵芝处理的线虫知, 在促进线虫抗氧化能力方面, 五种灵芝从强到存活率都在8%以下; 浓度小于15 mg/ml(包括弱顺序依次是: >>>> 15 mg/ml)时, 不同种灵芝对线虫存活率的影响 2.4 灵芝抗重金属胁迫能力比较利用重金属Cr 6+ 应激模型, 对不同浓度灵芝处理的野生型线虫的抗重金属胁迫能力进行比较结果表明, 不同产地的灵芝均可以显著增强线虫对重金属的耐受能力(图4) 表3是1 mmol/l 重铬酸钾处理后, 不同浓度的灵芝水提取物对线虫生存时间的影响按药物累积总效应(E T)的计没有差异, 都为1% 按照灵芝浓度从高到低的线虫存活率的表现, 毒性从低到高的顺序为: <<<< 我们后续实验的使用浓度采用 15 mg/ml及以下 2.3 灵芝抗氧化能力比较利用百草枯应激模型, 对不同浓度灵芝提取物处理后的野生型线虫的抗氧化能力进行比较五种灵芝在 mg/ml浓度下均能增强算结果(表4)进行比较, 结果显示, 在提高线虫抗重金属能力方面, 五种灵芝从强到弱顺序依次是:

53 U TH CUONG等: 利用秀丽隐杆线虫建立灵芝学功效的评价方法 1.2.8.6 1..4.2 Concentration (mg/ml) 3.75 mg/ml 7.5 mg/ml 15 mg/ml 3 mg/ml 6 mg/ml P<.1, 与空白对照组比较 P<.1 compared with group. 图2 五种灵芝在不同浓度下处理线虫5 d后的存活率统计结果 Fig.

5 53 U TH CUONG等: 利用秀丽隐杆线虫建立灵芝学功效的评价方法 Concentration (mg/ml) 3.75 mg/ml 7.5 mg/ml 15 mg/ml 3 mg/ml 6 mg/ml P<.1, 与空白对照组比较 P<.1 compared with group. 图2 五种灵芝在不同浓度下处理线虫5 d后的存活率统计结果 Fig.2 Worms survival condition after being treated with diﬀerent concentration of ﬁve G. lucidum for 5 days 表1 灵芝增强百草枯处理线虫存活时间 Table 1 C. elegans treated with G. lucidum show increased resistance to paraquat 存活时间(h) 浓度(mg/mL) Survival time (h) Concentrations (mg/ml) a 28.92a 28.92a 28.92a 28.92a 51.72b 62.2b 54.46b 65.91b 62.9b 66.72c 63.17b 56.61b 69.19b 75.37c 69.51d 67.36b 73.68c 81.77c 72.47c 同列数据上标不含有相同字母表示差异显著(*P<.5) The value in the same column with diﬀerent superscripts represented a signiﬁcant diﬀerence (*P<.5). 表2 五种灵芝在百草枯模型中的药物累积总效应 Table 2 Eﬀect of total drug concentration (ET) of G. lucidum in paraquat model 不同灵芝的药物累积总效应(mg h/ml) 指标 Eﬀect of total drug concentration (ET) (mg h/ml) ndex ET

6 研究论文 Hours.5 LT Paraquat-5 mmol/l Ganoderma lucidum-3.75 mg/ml (B) LT5 6 (A) Paraquat-5 mmol/l Ganoderma lucidum-7.5 mg/ml (C) LT Paraquat-5 mmol/l Ganoderma lucidum-15 mg/ml A: 3.75 mg/ml的号灵芝增强了野生型线虫对百草枯的耐受 B: 7.5 mg/ml的号灵芝增强了野生型线虫对百草枯的耐受 C: 15 mg/ml的号灵芝增强了野生型线虫对百草枯的耐受 *P<.5, 与空白对照组比较每组线虫数均 >9条 A: worms (N2) treated with 3.75 mg/ml G. lucidum,,,, show increased resistance to paraquat. B: worms (N2) treated with 7.5 mg/ml G. lucidum,,,, show increased resistance to paraquat. C: worms (N2) treated with 15 mg/ml G. lucidum,,,, show increased resistance to paraquat. *P<.5 compared with. The number of worms used > 9 each group. 图3 灵芝提取物增强野生型线虫(N2)对百草枯的耐受 Fig.3 Worms (N2) treated with G. lucidum show increased resistance to paraquat

7 55 U TH CUONG等: 利用秀丽隐杆线虫建立灵芝学功效的评价方法 (C) LT5 4 K2Cr2O7-1 mmmol/l Ganoderma lucidum-7.5 mg/ml LT K2Cr2O7-1 mmol/l Ganoderma lucidum-3.75 mg/ml 5 2 (B) LT5 1. (A) K2Cr2O7-1 mmmol/l Ganoderma lucidum-15 mg/ml A: 3.75 mg/ml的号灵芝增强了野生型线虫对Cr6+胁迫的耐受五种灵芝培养的野生型线虫的半数生存时间与空白对照组相比没有差异 B: 7.5 mg/ml的号灵芝增强了野生型线虫对Cr6+胁迫的耐受 *P<.5, 与空白对照组比较 C: 15 mg/ml的号灵芝增强了野生型线虫对Cr6+胁迫的耐受 *P<.5, 与空白对照组比较每组线虫数均>9条 A: worms (N2) treated with 3.75 mg/ml G. lucidum,,,, show increased resistance to Cr6+, the median lethal time shows no diﬀerence between worms treated with ﬁve diﬀerent G. lucidum and. B: worms (N2) treated with 7.5 mg/ml G. lucidum,,,, show increased resistance to Cr6+. *P<.5 compared with. C: worms (N2) treated with 15 mg/ml G. lucidum,,,, show increased resistance to Cr6+. *P<.5 compared with. The number of worms used > 9 each group. 图4 较高浓度的灵芝提取物增强野生型线虫(N2)对Cr6+胁迫的耐受 Fig.4 Worms (N2) treated with high concentration of G. lucidum show increased resistance to Cr6+

8 研究论文 56 表3 灵芝增强Cr6+处理线虫存活时间 Table 3 C.elegans treated with G. lucidum show increased resistance to Cr6+ Survival time (h) Concentrations (mg/ml) b 3.1b 32.84b c 31.18b 33.29b d 36.88c a 同列数据上标不含有相同字母表示差异显著(*P<.5) a 38.97c a 23.87a 35.1b 38.8b 33.76b 37.3b 42.63c 36.9b a 存活时间(h) 浓度 (mg/ml) The value in the same column with diﬀerent superscripts represented a signiﬁcant diﬀerence (*P<.5). 表4 五种灵芝在Cr6+枯模型中的药物累积总效应 Table 4 Eﬀect of total drug concentration (ET) of G. lucidum in Cr6+ model 不同灵芝的药物累积总效应(mg h/ml) 指标 Eﬀect of total drug concentration (ET) (mg h/ml) ndex ET >>>> 依赖于DAF-16(图5B) 2.5 灵芝抗氧化机制研究 DAF-16是影响线虫抵抗环境压力的重要基因, 胰岛素信号通路 P3K信号通路所引起的抗氧化能力的改变都依赖于它的功能[21] 我们对五种的测试动物, 测定了不同产地灵芝增强线虫抗氧化灵芝在不同应激模型中的学功能是否依赖于能力和抗重金属能力的作用效果, 并研究了相关的 FOXO/DAF-16进行了分析线虫株系CF138是分子机制, 提出了基于学功效的灵芝质量评价 daf-16的突变体, 用浓度为7.5 mg/ml的五种灵芝方法的概念研究表明, 在五种灵芝样本中, 来自海提取物处理该种株系的线虫, 通过百草枯模型和重南和越南的灵芝具有最强的提升线虫抗氧化和抗重 6+ 3 讨论我们利用秀丽隐杆线虫作为灵芝学功效金属Cr 模型进行抗压能力检测结果发现, 在百金属能力的效果, 而来自湖南样本的作用效果最弱草枯模型中, 和灵芝处理的CF138株系线虫, 对五种灵芝的TS序列比较也表明, 尽管彼此的同源其抗氧化能力好于空白对照组, 而处理的性极高, 但仍然可以分为三组, 其中, 海南和越南的线虫与空白对照组没有显著差异, 该结果表明, 灵芝属于一组, 山西和福建的灵芝属于一组, 来自湖和含有的物质作用途径不依赖于(或部分不依赖南的灵芝单独为一组基因型的聚类和功效的相似于)DAF-16/FOXO信号通路, 而含有的物性非常一致对灵芝抗氧化作用的分子机制研究表质作用途径则依赖于该信号通路( 图5A) 在重金属Cr6+模型中, 用7.5 mg/ml浓度的不同灵芝处理明, 灵芝水提物中至少有两种物质在抗氧化过程中起作用, 其中一种是依赖于DAF-16起效, 另一种不的CF138株系线虫, 除号灵芝外, 其他灵芝抗重依赖于DAF-16 从图5中可见, daf-16突变株系线虫金属能力均好于空白对照组, 上述结果表明, 其他在氧化压力的作用下, 与相比, 来自海南() 灵芝对线虫抗重金属的作用均不依赖于或部分不和越南()的样本处理的线虫表现出更强的耐受性,

9 57 U TH CUONG等: 利用秀丽隐杆线虫建立灵芝学功效的评价方法 LT Paraquat-5 mmmol/l Strain-CF138 Ganoderma lucidum-7.5 mg/ml 7 1. (B) LT5 (A) 6 K2Cr2O7-1 mmol/l Strain-CF138 Ganoderma lucidum-7.5 mg/ml A: 7.5 mg/ml的和号灵芝增强了cf138株系线虫对百草枯的耐受; B: 7.5 mg/ml的号灵芝增强了CF138株系线虫对Cr6+胁迫的耐受 *P<.5, 与空白对照组比较 A: worms (CF138) treated with 7.5 mg/ml G. lucidum and show increased resistance to paraquat; B: worms (CF138) treated with 7.5 mg/ml G. lucidum,,, show increased resistance to Cr6+. *P<.5 compared with. 图5 灵芝增强线虫对百草枯和Cr6+的耐受依赖于不同的机制 Fig.5 The enhanced resistance to paraquat and Cr6+ by diﬀerent concertation of G. lucidum shows not dependent on FOXO signaling pathway for the most part 说明和号灵芝中对DAF-16不依赖的起效物质大的顺序依次是<<<< 虽然在线虫上的毒含量更高, 而其余三种灵芝样本的起效物质是依赖性对于人体的意义还不清楚, 但从结果来看, 毒性的 DAF-16的灵芝提高线虫抗重金属损伤的物质主物质基础和起功效的活性物质至少是不重叠的要不依赖于DAF-16, 并且来自海南和越南的两个样本显示出更好的效果 Chuang等[22]利用线虫对灵芝多糖延长寿命的机制进行了研究, 结果显示, 多糖组分3通过Toll/白利用不同浓度灵芝处理后的存活率高低, 我们细胞介素-1受体(Toll-interleukin-1 receptor, TR-1) 对五种灵芝的毒性大小也进行了比较, 毒性从小到和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein

10 58 研究论文 kinase, MAPK) 激活 DAF-16 的表达, 从而延长线虫寿命, 说明多糖组分 3 延长线虫寿命是依赖 DAF-16 功能的由于我们的实验中所用灵芝是水提物, 成分比较复杂另外, 衰老和抗氧化的机制也有所不 [18] 同, 目前已知的与抗氧化和衰老相关的信号通路 [23] 如靶向雷帕霉素信号与线粒体呼吸链相关的信号饮食限制信号等都是独立于 FOXO/DAF-16 [24-25] 信号通路, 这些信号通路将是进一步揭示灵芝提高抗氧化抗胁迫机制的研究方向中药成分复杂作用机制多样, 观察到的药物学功效常常是不同物质的综合效果同一药材因为种质差异种植条件不同以及采摘时间有别, 都会影响药材的化学组成, 最后导致学功效出现不同在我们的实验中, 同种模型五种灵芝水提物在不同浓度条件下处理的线虫, 其抗氧化排序结果不一致 ; 不同模型相同浓度的灵芝, 抗氧化的结果排序也有不一致并且, 是否依赖于 FOXO/DAF- 16 信号通路也根据药物浓度和模型不同而产生差异这些都暗示着不同浓度时, 呈现的效果应该是多种成分综合结果的体现不同的灵芝浓度下, 促发了不同的作用机制, 进而得到了不同的实验结果, 以上这些结果也体现了对灵芝等中药进行质量评价的复杂性参考文献 (References) 4 Chien YL, Ho CT, Chiang BH, Hwang LS. Effect of fermentation time on antioxidative activities of Ganoderma lucidum broth using leguminous plants as part of the liquid fermentation medium. Food Chem 211; 126(4): Lin MS, Yu ZR, Wang BJ, Wang CHCH, Weng YM, KOO M. Bioactive constituent characterization and antioxidant activity of Ganoderma lucidum extract fractionated by supercritical carbon dioxide. Sains Malaysiana 215; 44(12): Xie J, Zhao J, Hu DJ, Duan JA, Tang YP, Li SP. Comparison of polysaccharides from two species of Ganoderma. Molecules 212; 17: Su CH, Yang YZ, Ho HO, Hu CH, Shen MT. High-performance liquid chromatographic analysis for the characterization of triterpenoids from Ganoderma. J Chromatogr Sci 21; 39(3): Hsieh TC,Wu JM. Suppression of proliferation and oxidative stress by extracts of Ganoderma Lucidum in the ovarian cancer cell line OCAR-3. nt J Mol Med 211; 28(6): Kohda H, Tokumoto W, Sakamoto K, Fuj Ⅱ M, Hirai Y, Yamasaki K, et al. The biologically active constituents of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst. Histamine release-inhibitory triterpenes. Chem Pharm Bull (Tokyo) 1985; 33(4): 刘博, 高宁. 灵芝多糖药理学研究进展. 齐齐哈尔医学院学 (Liu Bo, Gao Ning. Progress of Ganoderma lucidum polysaccharides in pharmacology. Journal of Qiqihar University of Medicine) 213; 34(11): Baby S, Johnson AJ, Govindan B. Secondary metabolites from Ganoderma. Phytochemistry 215; 114: Kenyon C.The first long-lived mutants: Discovery of the insulin/ GF-1 pathway for ageing. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 211; 366(1561): Chen D, Li PW, Goldstein BA, Cai W, Thomas EL, Chen F, et al. Germline signaling mediates the synergistically prolonged longevity produced by double mutations in daf-2 and rsks-1 in C. elegans. Cell Rep 213; 5(6): Dancy BM, Sedensky MM, Morgan PG. Effects of the mitochondrial respiratory chain on longevity in C. elegans. Exp Gerontol 214; 56: Ha do T, Oh J, Khoi NM, Dao TT, Dung le, Do TN, et al. n vitro and in vivo hepatoprotective effect of ganodermanontriol against t-bhp-induced oxidative stress. J Ethnopharmacol 213; 15(3): oh SW, Mukhopadhyay A, Dixit BL, Raha T, Green MR, Tissenbaum HA. dentification of direct DAF-16 targets controlling longevity, metabolism and diapause by chromatin immunoprecipitation. Nat Genet 26; 38(2): Hasnat A, Pervin M, Lim BO. Acetylcholinesterase inhibition and in vitro and in vivo antioxidant activities of Ganoderma lucidum grown on germinated brown rice. Molecules 213; 18(6): Baumeister RE, Schaffitzel, Hertweck M. Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity. J Endocrinol 26; 19(2): Brunet A. Aging and the control of the insulin-foxo signaling 3 Pan D, Zhang D, Wu J, Chen C, Xu Z, Yang H, et al. A novel proteoglycan from Ganoderma lucidum fruiting bodies protects kidney function and ameliorates diabetic nephropathy via its antioxidant activity in C57BL/6 db/db mice. Food Chem Toxicol 214; 63: pathway. Med Sci (Paris) 212; 28(3): Li J, Ebata A, Dong Y, Rizki G, wata T, Lee SS. Caenorhabditis elegans HCF-1 functions in longevity maintenance as a DAF-16 regulator. PLoS Biol 28; 6(9): e233. Yang P, Sun R, Yao M, Chen W, Wang Z, Fei J. A C-terminal truncated mutation of spr-3 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 213; 45(7): Gardes M, Bruns TD, Mol Eeol. TS primers with enhanced specifieity for basidiomyeetes-applieation to the identifieation of myeorrhizae and rusts. Mol Ecol 1993; 2:

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第期王兴涛等猪流行性乙型脑炎病毒种猪精液分离株的鉴定及进化分析病料毒株及细胞试剂引物设计提取及基因克隆及测序河南农业科学王兴涛罗俊滕蔓樊剑鸣鄂巍禹斌刘力张改平利用技术对河南省某规模化猪场乙脑疑似病例的种猪精液进行分析从部分样本中扩增出与流行性乙型脑炎病毒基因和基因具有高度同源性的预期产物在日龄乳鼠脑内接种种猪