24 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No [20] 微生物发酵过程染菌以及分离纯化酶的高成本都是制约其工业应用的关键问题本实验以 Mycobacteriumsp.MS136 为出发菌株, 首次提出用分枝杆菌细胞裂解液生产甾药前体, 并阐明了底物

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2017,37(8):23 30 DOI: /j.cb 分枝杆菌细胞裂解液催化甾体激素 C 1,2 位脱氢反应的研究秦梦菲孙鸿宋浩 ( 天津大学化工学院系统生物工程教育部重点实验室天津化学化工协同创新中心合成生物学平台天津 ) 摘要 9β,11β 环氧 17α,21 二羟基 16β 甲基孕 1,4 二烯 3,20 二酮 (Ⅳ) 是生产 9 氟甾体激素的关键前体, 以 9β,11β 环氧 17α,21 二羟基 16β 甲基孕 4 烯 3,20 二酮 21 醋酸酯 (Ⅰ) 为底物合成 Ⅳ 是工业化生产 Ⅳ 的重要方法通过比较分枝杆菌全细胞转化法与细胞裂解液转化法, 发现分枝杆菌全细胞只能将 Ⅰ 转化为 9β,11β 环氧 17α,21 二羟基 16β 甲基孕 4 烯 3,20 二酮 (Ⅱ), 而细胞裂解液可以有效地将 Ⅰ 转化为 Ⅳ, 其反应机制为底物 Ⅰ 自发水解为中间体 Ⅱ,Ⅱ 在 C 1,2 位脱氢酶 (KSTD) 的催化作用下发生 C 1,2 位脱氢反应生成产物 Ⅳ 为进一步提高产物 Ⅳ 的转化率, 利用基因工程手段在分枝杆菌中分别过表达编码 KSTD 的关键基因 :kstd kstd3 和 kstd M, 提高脱氢反应效率, 结果表明 1g/L 底物 Ⅰ 在 ph7.0 的重组菌株 MS136 kstd M 细胞裂解液中反应 45 h,Ⅳ 的转化率为 78.4%, 比出发菌株提高了 38.9%; 并优化缓冲液 ph, 提高反应速率, 结果表明 1g/L 底物 Ⅰ 在 ph7.5 的重组菌株 MS136 kstd M 细胞裂解液中反应 45h,Ⅳ 的转化率为 92.8%, 比出发菌株提高了 63.4% 关键词 9β,11β 环氧 17α,21 二羟基 16β 甲基孕 1,4 二烯 3,20 二酮 C 1,2 位脱氢酶分枝杆菌细胞裂解液中图分类号 G819 甾体激素药物作为抗生素之后的第二大类药物广泛用于治疗和预防许多疾病 [1], 例如消炎, 利尿, 避孕, 促孕, 抗雄激素和抗癌剂等 [2 3] 甾药的高需求促生了另一重要产业的蓬勃发展甾药中间体 ( 甾药前体 ) 的提取与制备微生物法制备甾药前体的工艺因其环境污染小, 反应步骤少产品损失低收率高等突出优势 [4 5], 广泛应用于工业生产 [6] 近年来, 通过微生物的生物转化对甾体化合物进行脱氢氧化羟化及侧链切割等反应而获得多种药物中间体 [7 9] 如图 1 所示, Ⅳ 是用于生产 9 氟甾体激素 ( 如地塞米松, 倍他米松, 曲安西龙等 ) 的关键前体 [10 11], 以 Ⅰ 为底物生产 Ⅳ 的生物转化过程包括水解反应和 C 1,2 位脱氢反应, 根据反应顺序不同可区分为 Ⅰ Ⅱ Ⅳ 和 Ⅰ Ⅲ (9β,11β 环氧收稿日期 : 修回日期 : 国家青年千人基金资助项目 (SQK13001) 通讯作者, 电子信箱 :hsong@tju.edu.cn 17α,21 二羟基 16β 甲基孕 1,4 二烯 3,20 二酮 21 醋酸酯 ) Ⅳ 两种可能的反应机制但是关于 9(11) 环氧甾体生物转化的研究还未见报道, 反应机制也没有完全阐明分枝杆菌 (Mycobacteriumsp.) 是重要的工业菌株, 能够利用甾体作为唯一的碳源, 将其开环降解为自身提供能量 [12 14] 分枝杆菌可以表达 KSTD,Wang [15 16] 等为使植物甾醇降解后的中间体 9 OHAD(9α 羟基雄甾 4 烯 3,17 二酮 ) 大量积累且稳定存在, 敲除了编码 KSTD 的关键基因 :kstd1 kstd2 kstd3 和 kstd M ; [17] Zhang 等为积累 ADD( 雄甾 1,4 二烯 3,17 二酮 ), 从 Mycobacterium neoaurum JC 12 获得编码 KSTD 的 ksdd 基因并在 Bacilussubtilis168 中表达目前, 对于甾体化合物的生物转化大多都基于基因工程改造的微生物或分离纯化的酶催化 [18] 这些方法可以使甾体化合物的转化率有一定的提高, 但甾体底物溶解度差 [19]

2 24 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No [20] 微生物发酵过程染菌以及分离纯化酶的高成本都是制约其工业应用的关键问题本实验以 Mycobacteriumsp.MS136 为出发菌株, 首次提出用分枝杆菌细胞裂解液生产甾药前体, 并阐明了底物 Ⅰ 转化为产物 Ⅳ 的反应机理通过在分枝杆菌中分别过表达 kstd kstd3 和 kstd M 基因提高 KSTD 的活性, 并优化缓冲液 ph, 从而提高甾药前体 Ⅳ 的转化率, 为将来的工业化生产提供理论依据图 1 Ⅰ 转化为 Ⅳ 的反应机制 Fig.1 Thereactionmechanism ofⅠ toⅣ 1 材料与方法 1.1 材料菌株质粒和培养基本文涉及的所有质粒和菌株信息详见表 1 质粒 pmv261 购自 Biosci 公司, 基因 kstd,kstd3 和 kstd M 由 Genewiz 公司合成分枝杆菌液体培养基 : 甘油 10g/L 酵母提取物 10 g/l 磷酸氢二铵 1.5g/L 磷酸氢二钾 0.5g/L 磷酸二氢钾 0.5g/L 吐温 802.5g/L 无水硫酸镁 10g/L 硫酸亚铁 0.5g/L 硫酸锌 0.2g/L,pH7.2~7.3; 固体培养基添加 15g/L 琼脂粉表 1 实验中涉及的菌株和质粒 Table1 Strainsandplasmidsusedinthisresearch Strainorplasmid Relevantgenotypeanddescription Referenceorsource Strains Mycobacteriumsp.MS136 Mycobacteriumsp.CGMCC13532 Thiswork E.coliBL21(DE3) usedtoexpresforeignprotein Thiswork Plasmids puc57 kstd puc57 kstd3 puc57 kstd M pmv261 Amp r,carieskstd Amp r,carieskstd3 Amp r,carieskstd M Kan r,shutlevectorofmycobacterium ande.coli,caryingtheheat shockhsp60promoter Thiswork Thiswork Thiswork Telentietal.(1997) pmv261 kstd Kan r,carieskstd Thiswork pmv261 kstd3 Kan r,carieskstd3 Thiswork pmv261 kstd M Kan r,carieskstd M Thiswork pet 28a Kan r,e.coliexpresionvector Novagen pet kstd Kan r,carieskstd Thiswork pet kstd3 Kan r,carieskstd3 Thiswork pet kstd M Kan r,carieskstd M Thiswork

3 2017,37(8) 秦梦菲等 : 分枝杆菌细胞裂解液催化甾体激素 C 1,2 位脱氢反应的研究试剂及仪器 T4DNA 连接酶限制酶 BamHI PMS( 吩嗪硫酸甲酯 ) 购于 Solarbio 公司所用仪器 : 超和 Hind I 购自 Fermentas 公司 ;Gibson 组装预混液购于 NEB 公司 ; 质粒小提试剂盒普通 DNA 产物纯化试剂声破碎仪 (SCIENTZ) 高效液相色谱仪 (Waters) 电转仪 (Ependorf) 盒琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒购自天根公司 ;Ⅰ Ⅱ 和 Ⅳ 均购自上海博顿生物化工有限公司 ; 氢化可的松引物用于 PCR 的引物见表 2 表 2 PCR 引物序列 Table2 Primersusedforamplification Primers kstd F kstd R kstd3 F kstd3 R kstd M F kstd M R pmv261 F pmv261 R T7 T7ter Sequences(5 ~3 ) CCCGATCCGGAGGAATCACGGATCCATGACCACCGAAACCGCTGG AACTACGTCGACATCGATAAGCTTTTAAGACGGCTGAGCAGATTC CCCGATCCGGAGGAATCACGGATCCATGTCTGACTCTGACCTGGAATTC TAACTACGTCGACATCGATAAGCTTTTATTCAGCAGAAGACTGGGTAGC CCCGATCCGGAGGAATCACGGATCCATGTTCTACATGACCGCTCAGG TAACTACGTCGACATCGATAAGCTTTTAAGCTTTACCAGCCAGGTGC CAGCGAGGACAACTTGAGCCGT ACATCAGAGATTTTGAGACACA ACATCCACTTTGCCTTTCTC TGCTAGTTATTGCTCAGCGG 1.2 方法全细胞转化底物 Ⅰ 培养 Mycobacterium sp. MS136 的方法如下 : 将 Mycobacteriumsp.MS136 细胞接种于 5ml 液体培养基中,30 过夜培养转接到另一装有 50ml 液体培养基的 250ml 锥形瓶中, r/min 培养 5h(OD 600 达到 0.5~0.6), 添加终浓度为 0.1g/L 的诱导剂氢化可的松,30 200r/min 培养 24h 10000r/min 离心 5min 收集菌体, 用 ph 7.0 的 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤两次后重悬菌体至 OD 600 达到 2.0 取 50ml 细胞悬浮液转入 250ml 锥形瓶中, 加入 1g/LⅠ 2.5mmol/LPMS 和 7% 乙醇,30 200r/min 反应细胞裂解液转化底物 Ⅰ 取 40 ml Mycobacteriumsp.MS136 细胞悬浮液进行超声破碎, 超声功率 500W, 破碎时间 5s, 间歇时间 5s, 总共需要 20 min, 全程冰上操作如果破碎后的细胞出现混浊现象, 应重复超声操作将破碎后的细胞裂解液转入 250ml 锥形瓶中, 加入 1g/LⅠ 2.5mmol/LPMS 和 7% 乙醇,30 200r/min 反应 KSTD 氨基酸序列分析利用 DNAman 软件对已获的 C 1,2 位脱氢酶氨基酸序列新金分枝杆菌 Mycobacteriumneoaurum ATCC25795(kstDGenbankID: GQ kstd3genbankid:kf772210) 和新金分枝杆菌 MycobacteriumneoaurumNwIB 01(kstD M GenbankID: GQ228843) 与耻垢分枝杆菌 Mycobacterium smegmatis (MSMEG5941) 的 C 1,2 位脱氢酶氨基酸序列进行多序列对比分析重组质粒的构建如图 2 所示, 以 pmv261 kstd 的构建为例, 以合成的质粒 puc57 kstd 为模板, 按照表 2 的引物扩增各目的基因片段并纯化回收所得 PCR 产物 kstd 基因片段分别与线性化的 pmv261 载体 (Hind I 和 BamHI 限制性酶切 ) 通过 Gibsonasembly 无缝连接法组装在一起, 从而构建重组质粒 pmv261 kstd, 使基因片段置于 hsp60 启动子的控制下重组质粒 pmv261 kstd3 和 pmv261 kstd M 的构建方法相同将质粒 pet 28a 及上述 PCR 产物 kstd kstd3 和 kstd M 基因分别进行 Hind I 和 BamHI 双酶切, 胶回收相应基因片段和同时双酶切的 pet 28a 质粒, 按照比例连接获得重组质粒 pet kstd pet kstd3 和 pet kstd M 重组质粒的转化将菌体用无菌水洗 2 次, 5000r/min 离心, 最终重悬于无菌水中利用电转化 [21] 法将重组质粒 pmv261 kstd,pmv261 kstd3 和 pmv261 kstd M 导入宿主菌株 Mycobacteriumsp.MS136, 电转化条件 : 电压 1.8kV, 电击杯孔径 1mm, 电击两次 ; 确认电击频率 4~5/ms 范围, 电击处理后的感受态于冰上放置 5min, 利用终浓度为 50μg/ml 卡那霉素抗性

4 26 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No g/L 底物 Ⅳ 在细胞裂解液中反应 45h 后,Ⅳ 剩余 0.92 g/l, 说明以 Ⅳ 为底物时, 细胞裂解液不能将其进一步降解表 3 全细胞与细胞裂解液以 Ⅰ 为底物的转化情况 Table3 ConversionresultofⅠ bywhole celandcelularlysates 转化 45h 全细胞转化法细胞裂解液转化法 Ⅰ(g/L) Ⅱ(g/L) Ⅲ(g/L) NT NT Ⅳ(g/L) NT NT:nottested 图 2 重组质粒 pmv261 kstd 的构建 Fig.2 Theconstructionoftherecombinant plasmidpmv261 kstd 平板筛选转化子将上述获得的重组质粒 pet kstd pet kstd3 和 pet kstd M 转化至新鲜制备的表达宿主 BL21(DE3) 感受态细胞中, 并将其涂布于含有 50μg/ml 卡那霉素抗性平板,37 恒温隔夜培养样品的提取检测与定量反应液混匀后, 迅速吸取适量, 用稀释剂 ( 乙腈水 =5 5) 稀释 10 倍后经 0.25μm 滤膜过滤, 取滤液上紫外液相检测色谱条件 : 色谱柱 :BDSHYPERSILC18 色谱柱 (150mm 4.6mm,5μm); 检测器 :Waters2489UV/Vis; 泵 :Waters e2695; 流动相乙腈水 =3 7; 柱温 :40 ; 检测波长为 240nm; 流速 1.2ml/min 定量方法: 使用相同的色谱条件测定 Ⅱ 和 Ⅳ 标准品的标准溶液, 绘制浓度峰面积标准曲线, 对 Ⅱ 和 Ⅳ 定量用生成产物的摩尔数除以底物的摩尔数即可得生成物的转化率 2 结果与讨论 2.1 比较全细胞转化法与细胞裂解液转化法分别用 Mycobacteriumsp.MS136 全细胞和细胞裂解液转化底物 Ⅰ 表 3 中, 利用分枝杆菌 MS136 全细胞转化 1g/L 底物 Ⅰ 反应 45h, 底物 Ⅰ 只残余 5% 的量, 对产物 Ⅱ 的转化率为 60.3%, 反应体系中检测不到产物 Ⅳ 的积累 ; 表明分枝杆菌 MS136 菌株有可能将底物 Ⅰ 水解后进一步代谢, 导致产物 Ⅳ 无法积累而细胞裂解液转化 1g/L 底物 Ⅰ 反应 45h, 底物 Ⅰ 残余量为 20%, 反应体系中产物 Ⅳ 转化率为 56.8% 由图 3 可知, 图 3 分枝杆菌细胞裂解液转化 Ⅳ 的产物生成曲线 Fig.3 TimecoursesoftheconversionⅣ by celularlysatesofmycobacterium sp.ms 研究分枝杆菌细胞裂解液转化底物 Ⅰ 的反应机制 1g/L 底物 Ⅰ 在 ph7.0 的分枝杆菌细胞裂解液中反应, 分别在 2h,5h,10h,21h,33h 45h 和 76h 取样, 检测产物的生成情况如图 4 所示, 产物 Ⅳ 随时间不断增加,45hⅣ 的转化率达到最高值 56.8%, 而 Ⅱ 的转化率始终较低在产物中始终未检测到 Ⅲ, 说明分枝杆菌细胞裂解液转化 Ⅰ 的反应顺序是 Ⅰ Ⅱ Ⅳ 1g/L 底物 Ⅰ 在 ph7.0 的 PBS 中反应, 只有产物 Ⅱ 的生成,45h 后,Ⅱ 的转化率为 6.7%( 图 5) 说明 Ⅰ 发生 C 21 脱乙酰化反应即水解反应是自发进行的, 而 C 1,2 脱氢反应是酶催化反应分枝杆菌细胞裂解液分别以 Ⅰ 和 Ⅱ 为底物进行生物转化, 如图 6 所示,45hⅣ 的转化率几乎相同 ( 分别是 56.8% 和 57.3%) 以上数据说明在分枝杆菌细胞裂解液转化 Ⅰ 的反应中 :(1) 反应顺序为 Ⅰ 自发水解形成 Ⅱ,Ⅱ 经 KSTD 催化为 Ⅳ;(2) 从 Ⅱ 到 Ⅳ 的 C 1,2 脱氢酶催化反应是关键步骤

2017,37(8) 秦梦菲等 : 分枝杆菌细胞裂解液催化甾体激素 C 1,2 位脱氢反应的研究 27 图 4 分枝杆菌细胞裂解液转化 Ⅰ 的产物生成曲线 Fig.4 TimecoursesoftheconversionⅠ toⅡand ⅣbycelularlysatesofMycobacterium sp.ms136 图 5 磷酸盐缓冲液转化 Ⅰ 的产物生成曲线 Fig.

5 2017,37(8) 秦梦菲等 : 分枝杆菌细胞裂解液催化甾体激素 C 1,2 位脱氢反应的研究 27 图 4 分枝杆菌细胞裂解液转化 Ⅰ 的产物生成曲线 Fig.4 TimecoursesoftheconversionⅠ toⅡand ⅣbycelularlysatesofMycobacterium sp.ms136 图 5 磷酸盐缓冲液转化 Ⅰ 的产物生成曲线 Fig.5 TimecourseoftheconversionⅠ toⅡ bypbs 图 6 分枝杆菌细胞裂解液转化 Ⅰ 和 Ⅱ 的产物生成曲线 Fig.6 TimecoursesoftheconversionⅠ andⅡ to Ⅳ bycelularlysatesofmycobacterium sp.ms KSTD 氨基酸序列分析已获得的 KSTD 氨基酸序列与耻垢分枝杆菌 Mycobacteriumsmegmatis 的 C 1,2 位脱氢酶氨基酸序列比对分析结果如图 7 所示,MSMEG5941 和 kstd M 的氨基酸序列同源性最高, 为 88%; 与 kstd3 和 kstd 的同源性较低, 分别为 36% 和 12% kstd3 和 kstd M 的黄素腺嘌呤二核苷酸结合位点 (Flavin adenine [22] dinucleotidebinding,fad binding) 与 Van 等推测的 KSTD 的 FAD binding 序列一致, 即 GSG(G/A)(G/A) (G/A)X 17 E 根据 KSTD 氨基酸序列比对分析结果, 与 kstd 和 kstd3 相比,kstD M 和 MSMEG5941 的氨基酸序列同源性最高, 可能其脱氢酶活性最高图 7 KSTD 氨基酸序列分析 Fig.7 AminoacidsequencealignmentsofKSTD 2.4 重组质粒的构建与验证分枝杆菌中 kstd kstd3 和 kstd M 的基因长度分别为 1200bp 1560bp 和 1713bp, 以合成的质粒为模板进行扩增 PCR, 产物经 1% 琼脂糖电泳检测, 在 2000bp 以下可见 3 条明显的特异性条带 ( 图 8), 与目的片段的大小位置相符将目的基因连接到载体 pmv261 上, 转入 E.coliDH5α 中, 提取重组质粒 pmv261 kstd pmv261 kstd3 和 pmv261 kstd M, 采用质粒测序引物 pmv261 F 和 pmv261 R 进行 PCR 验证和测序验证, 结果表明各重组质粒构建成功通过测序引物 T7 和 T7ter 对重组质粒 pet kstd pet kstd3 和 pet kstd M 进行 PCR 验证和测序验证, 结果表明各重组质粒构建成功 2.5 分枝杆菌重组菌株的转化对分枝杆菌重组菌株 MS136 kstd,ms136 kstd3,

6 28 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 图 8 kstd kstd3 和 kstd M 的 PCR 产物 Fig.8 PCRproductionsofkstD kstd3andkstd M MS136 kstd M 细胞裂解液的转化特性进行研究, 考察其对 Ⅰ 的转化效率, 用 HPLC 法检测产物 Ⅳ 的生成情况, 同时以导入 pmv261 空白载体的出发菌株细胞裂解液作对照如图 9 所示,1g/L 底物 Ⅰ 在 ph7.0 的分枝杆菌细胞裂解液中反应 45h 后, 重组菌株 MS136 kstd, MS136 kstd3 和 MS136 kstd M Ⅳ 的转化率分别为 60.6%,69.5% 和 78.4%, 出发菌株 Ⅳ 的转化率为 56.8%, 最多提高了 38.9% 以上数据表明过表达 kstd 基因 ( 特别是 kstd M ) 后,KSTD 的活力明显提高, 加速脱氢反应, 导致 Ⅳ 大量积累图 10 ph 对产物 Ⅳ 转化率的影响 Fig.10 TheefectofpH onconversionrateofⅣ 2.7 大肠杆菌重组菌株的转化对大肠杆菌重组菌株 BL21(DE3) kstd,bl21 (DE3) kstd3,bl21(de3) kstd M 细胞裂解液的转化特性进行研究, 考察其对 Ⅰ 的转化效率, 用 HPLC 法检测产物 Ⅳ 的生成情况如图 11 所示,1g/L 底物 Ⅰ 在 ph7.5 的大肠杆菌细胞裂解液中反应 45h 后, 重组菌株 BL21(DE3) kstd,bl21(de3) kstd3,bl21(de3) kstd M Ⅳ 的转化率分别为 48.7%,71.6% 和 79.5%, 比分枝杆菌重组菌株 MS136 kstd M (92.8 %),BL21 (DE3) kstd M Ⅳ 的转化率低, 其原因可能是分枝杆菌 Mycobacteriumsp.MS136 自身含有编码 C 1,2 位脱氢酶的基因, 且能翻译出有活性的脱氢酶, 而大肠杆菌 BL21 (DE3) 则不能图 9 出发菌与重组菌的转化率比较 Fig.9 TimecoursesoftheconversionⅠ toⅣ by celularlysatesofmycobacterium sp.ms 不同 ph 的缓冲液对产物 Ⅳ 转化率的影响缓冲液的 ph 不同会影响底物 Ⅰ 的转化本实验对比了重组菌株 MS136 kstd M 细胞裂解液 ph 值分别为 6,6.5,7,7.5,8 时 Ⅳ 的转化率, 反应条件为底物投料量 1g/L 反应 45h 由图 10 可知,pH7.5 最佳, 此时 Ⅳ 的转化率达到 92.8%, 其原因可能是碱性条件加速水解反应, 使 Ⅰ 更易水解为 Ⅱ, 再由 KSTD 酶催化为 Ⅳ; 也可能是 ph7.5 时 KSTD 酶活更高, 而 ph8 的裂解液降低了 KSTD 酶活, 导致 Ⅳ 的转化率有所下降图 11 大肠杆菌重组菌的转化率比较 Fig.11 TimecoursesoftheconversionⅠ toⅣ bycelularlysatesofe.colibl21(de3) 3 结论产物 Ⅳ 是用于生产 9 氟甾体激素 ( 如地塞米松, 倍他米松, 曲安西龙等 ) 的关键前体 [10 11] 本实验以 Mycobacteriumsp.MS136 为出发菌株, 通过细胞裂解液转化 Ⅰ 生产 Ⅳ, 并阐明了 Ⅰ 转化为 Ⅳ 的反应机理, 即 Ⅰ 先自发水解为中间体 Ⅱ,Ⅱ 经 KSTD 催化发生 C 1,2 位脱

7 2017,37(8) 秦梦菲等 : 分枝杆菌细胞裂解液催化甾体激素 C 1,2 位脱氢反应的研究 29 氢反应转化为产物 Ⅳ 为提高产物 Ⅳ 的转化率, 在分枝杆菌中分别过表达编码 KSTD 的关键基因 :kstd kstd3 和 kstd M, 并优化缓冲液 ph, 结果表明 1g/L 底物 Ⅰ 在 ph7.5 的重组菌株 MS136 kstd M 细胞裂解液中反应 45h, 产物 Ⅳ 的转化率为 92.8%, 比优化前提高了 63.4% 本研究首次提出用分枝杆菌细胞裂解液生产甾药前体, 为甾体激素类药物的定向转化和工业化生产提供了理论依据参考文献 [1] Tong W Y, Dong X. Microbialbiotransformation: recent developmentsonsteroiddrugs.recentpatbiotechnol,2009,3 (2): [2]CroxatoHB.Progestinimplants.Steroids,2000,65(10 11): [3] Hughes D T, Sperandio V. Inter kingdom signaling: communication between bacteria and theirhosts. NatRev Microbiol,2008,6(2): [4] Bragin J, Saowakhon S, ManosroiA. A novelone step biotransformation ofcortexolone 21 acetate to hydrocortisone acetate using Cunninghamela blakesleana ATCC 8688a. EnzymeMicrobTechnol,2007,41(3): [5] FunderJW. Minireview: aldosteroneand mineralocorticoid receptors:past,present,andfuture.endocrinology,2010,151 (11): [6]GarcíaJL,UhíaI,GalánB.Catabolism andbiotechnological applications of cholesterol degrading bacteria. Microb Biotechnol,2012,5(6): [7]BraginEY,ShtratnikovaVY,DovbnyaDV,etal.Comparative analysisofgenesencodingkeysteroidcoreoxidationenzymesin fast growingmycobacteriumspp.strains.jsteroidbiochemmol Biol,2013,138(10): [8] XieR,ShenY,QinN,etal.GeneticdiferencesinksdD influenceontheadd/adratioofmycobacterium neoaurum.j IndMicrobiolBiotechnol,2015,42(4): [9] CruzA, Angelova B, FernandesP, etal. Study ofkey operationalparametersfortheside chaincleavageofsitosterolby free mycobacterial cels in bis (2 ethylhexyl) phthalate. BiocatalBiotransform,2004,22(3): [10]FokinaVV,Sukhodol skayagv,gulevskayasa,etal.the1 (2) dehydrogenation ofsteroid substrates by Nocardioides simplexvkm Ac 2033D.Microbiology,2003,72(1): [11]FokinaVV,DonovaM V.21 Acetoxy pregna 4(5),9(11),16 (17) triene 21 ol 3,20 dione conversion by Nocardioides simplexvkm Ac 2033D.JSteroidBiochem MolBiol,2003, 87(4 5): [12] DonovaM V.Transformationofsteroidsbyactinobacteria:a review.appliedbiochemistryandmicrobiology,2007,43(1): [13]DonovaM V,EgorovaO V.Microbialsteroidtransformations: Curentstateandprospects.ApplMicrobiolBiotechnol,2012, 94(6): [14]FernandesP,CruzA,AngelovaB,etal.Microbialconversionof steroid compounds: Recentdevelopments. Enzyme Microb Technol,2003,32(6): [15] WangF Q, YaoK, XuL Q, etal. Characterization and engineering of 3 ketosteroid 1 dehydrogenase and 3 ketosteroid 9α hydroxylaseinmycobacterium neoaurum ATCC 25795toproduce9α hydroxy 4 androstene 3,17 dionethrough thecatabolism ofsterols.metabolicengineering,2014,24: [16] Wang F Q, WeiW, Fan S Y, etal. Inactivation and augmentationoftheprimary3 ketosteroid Δ1 dehydrogenasein MycobacteriumneoaurumNwIB 01:biotransformationofsoybean phytosterolsto4 androstene 3,17 dioneor1,4 androstadiene 3,17 dione.applenvironmicrobiol,2010,76(13): [17]ZhangW Q,ShaoM L,RaoZM,etal.Bioconversionof4 androstene 3,17 dione toandrost 1,4 diene 3,17 dione by recombinantbacilussubtilisexpresingksddgeneencoding3 ketosteroid Δ 1 dehydrogenasefrom Mycobacterium neoaurum JC 12.JSteroidBiochemMolBiol,2013,135(1): [18]LiY,LuF,SunT,etal.ExpresionofksdDgeneencoding3 ketosteroid Δ 1 dehydrogenase from Arthrobacter simplex in Bacilussubtilis.LetApplMicrobiol,2007,44(5): [19] Malaviya A, Gomes J. Androstenedione production by biotransformation of phytosterols. Bioresource Technology, 2008,99(15): [20]ShaoM,ZhangX,RaoZ,etal.Enhancedproductionofandrost 1,4 diene 3,17 dionebymycobacteriumneoaurumjc 12using three stagefermentationstrategy.plosone,2015,10(9): e [21]FletF,MersiniasV,SmithCP.Higheficiencyintergeneric conjugaltransferofplasmiddnafromescherichiacolitomethyl DNA restrictingstreptomycetes.femsmicrobiollet,1997, 155(2): [22]VanDG,HeselsGI,VanGR,etal.Targeteddisruptionof the kstd geneencoding 3 ketosteroid Δ 1 dehydrogenase isoenzyme ofrhodococus erythropolis SQ1. ApplEnviron Microbiol,2000,66(5):

8 30 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No Studiesonthe3 Ketosteriod 1 DehydrogenationofSteroid HormonebyCelularlysatesofMycobacterium QINMeng fei SUNHong SONGHao (SchoolofChemicalEngineeringandTechnology,KeyLaboratoryofSystemsBioengineering,MinistryofEducation, SynBioResearchPlatform,ColaborativeInnovationCenterofChemicalScienceandEngineering, TianjinUniversity,Tianjin ,China) Abstract 9β,11β Epoxypregn 4 ene 17α,21 diol 3,20 dione21 acetate(Ⅰ)isasubstrateforthe productionof9β,11β Epoxypregn 1,4 diene 17α,21 diol 3,20 dione(Ⅳ),whichisakeyprecursorforthe productionofmany9 fluoro substitutedcorticosteroidhormones.bycomparingwholecelscatalysisandcelular lysatesconversion,itwasfoundthatwholecelsofmycobacteriumsp.ms136couldonlyconvertⅠto9β,11β Epoxypregn 4 ene 17α,21 diol 3,20 dione(Ⅱ),andⅠ canbeefectivelyconvertedtoⅣ bycelularlysates. ThereactionorderisthatⅠ isspontaneouslyhydrolyzedtoⅡ andⅡundergoesc 1,2 dehydrogenationreactionto Ⅳ.InordertoimprovetheproductivityofⅣ,thekeygeneskstD,kstD3andkstD M encodingc 1,2 dehydrogenase (KSTD)wereoverexpresedinMycobacteriumsp.MS136toenhancetheC 1,2 dehydrogenationreactionrate,and theresultsshowedthat1g/lsubstrateⅠ canbeconvertedbyrecombinantstrainms136 kstd M celularlysatesat ph7.0,theproductivityofⅣ reached78.4% after45h,whichis38.9% higherthanoriginalstrain.the reactionrateisenhancedbyoptimizingtheph,andtheresultsshowedthat1g/lsubstrate(Ⅰ) canbe convertedbyrecombinantstrainms136 kstd M celularlysatesatph7.5,theproductivityofⅣreached92.8% after45h,whichwas63.4% higherthanoriginalstrain. Keywords 9β,11β Epoxypregn 1,4 diene 17α,21 diol 3,20 dionecelular LysatesofMycobacterium 3 ketosteriod 1 dehydrogenase

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

24 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No [20] 微生物发酵过程染菌以及分离纯化酶的高成本都是制约其工业应用的关键问题 本实验以 Mycobacteriumsp.MS136 为出发菌株, 首次提出用分枝杆菌细胞裂解液生产甾药前体, 并阐明 了底物

24 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No [20] 微生物发酵过程染菌以及分离纯化酶的高成本都是制约其工业应用的关键问题本实验以 Mycobacteriumsp.MS136 为出发菌株, 首次提出用分枝杆菌细胞裂解液生产甾药前体, 并阐明了底物