674 邻苯二甲酸二 -2- 乙基己酯 (di-2-ethylhexylph 原 thalate,dehp), 又名邻苯二甲酸二异辛酯, 是邻苯二甲酸酯类化合物 (PAE) 的重要成员, 是塑料材料中使用量最大的增塑剂, 在 PVC 材料中 DEHP 含量高达 3 豫耀 5 豫 [1] DEHP

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寂庄
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1 圆园 18,37(4): 农业环境科学学报允燥怎则灶葬造燥枣粤早则燥鄄耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼杂糟蚤藻灶糟藻 218 年 4 月韩佳萦, 苏伊玲, 熊丽, 等. 塑化剂 DEHP 暴露对小鼠巨噬细胞的免疫毒性作用 [J]. 农业环境科学学报,218,37(4): HAN Jia-ying, SU Yi-ling,XIONGLi, et al.immunotoxicity of di(2-ethylhexyl)phthalate to macrophages[j]. 允燥怎则灶葬造燥枣粤早则燥 - 耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼杂糟蚤藻灶糟藻,218, 37 (4): 塑化剂 DEHP 暴露对小鼠巨噬细胞的免疫毒性作用韩佳萦 1, 苏伊玲 2, 熊丽 2, 耿辉 2 (1. 华中师大一附中, 武汉 43223;2. 华中师范大学生命科学学院, 武汉 4379) 摘要 : 为了研究邻苯二甲酸二乙基己酯 (DEHP) 对巨噬细胞的免疫毒性, 采用不同浓度剂量 DEHP 处理小鼠巨噬细胞株 RAW264.7 细胞和腹腔巨噬细胞, 通过检测细胞吞噬细胞因子分泌及活性氧水平变化探讨 DEHP 暴露对免疫系统的毒性作用结果表明 : 高浓度 (2 4 8 mg L -1 )DEHP 处理 48 h 后对 RAW264.7 细胞可造成急性损伤低浓度 (1 5 1 mg L -1 )DEHP 连续染毒处理 1 代后,RAW264.7 细胞吞噬红细胞百分率及吞噬指数显著抑制 (P<.5) RAW264.7 细胞分泌 TNF- 琢 IL-12 和 IL-23 等细胞因子能力明显降低, 并表现出一定的剂量 - 效应关系随着 DEHP 暴露浓度的增加,DEHP 染毒造成 RAW264.7 细胞内活性氧产生, 受损加剧除此之外,DEHP 暴露还能明显抑制小鼠腹腔巨噬细胞对红细胞的吞噬能力 (P<.5) 以上结果表明,DEHP 暴露对巨噬细胞具有免疫抑制作用, 损伤了巨噬细胞正常免疫功能发挥关键词 : 邻苯二甲酸二乙基己酯 ( 阅耘匀孕 ); 巨噬细胞 ; 砸粤宰圆远源援苑细胞 ; 免疫毒性中图分类号 :X53.22 文献标志码 :A 文章编号 : (218) doi: /jaes Immunotoxicity ofdi(2-ethylhexyl)phthalate to macrophages HAN Jia-ying 1,SU Yi-ling 2,XIONG Li 2,GENG Hui 2 (1.High School Affliated to Huazhong Normal University, Wuhan 43223, China; 2.College of Life Science, Huazhong Normal University, Wuhan4379,China) Abstract:To evaluate the potential immunotoxicity of di(2-ethylhexyl)phthalate(dehp), RAW264.7 cells and peritoneal macrophages were treated with different concentrations of DEHP. Further, the phagocytosis efficiency and cytokine secretion and reactive oxygen species (ROS)production ability of RAW264.7 cells, and adherence ability and phagocytosis efficiency of peritoneal macrophages were determined. The results revealed that the phagocytosis efficiency of RAW264.7 cells treated with 1, 5mg L -1 and 1 mg L -1 DEHP was significantly in 原 hibited. The concentration of tumor necrosis factor(tnf)- 琢,interleukin(IL)-12, and IL-23 decreased significantly in the cell culture su 原 pernatant. Furthermore, there was adose-effect relationship between DEHP exposure and concentration of TNF- 琢,IL-12, and IL-23. The production of ROS in DEHP-treated RAW264.7 cells was inhibited significantly with increase in the concentration of DEHP. Further, DEHP inhibited the adhesion ability and phagocytosis efficiency of peritoneal macrophages collected form DEHP-treated mice. These re 原 sults indicate that DEHP treatment can inhibit the normal function of both RAW264.7 cells and peritoneal macrophages. Keywords:di(2-ethylhexyl)phthalate;macrophage; RAW264.7 cell; immunotoxicity 收稿日期 : 圆园 17 原 9 原 29 录用日期 : 圆园 18 原 2 原 8 作者简介 : 韩佳萦 (21 ), 女, 湖北武汉人 hanjiaying3639@163.com 通信作者 : 耿辉 genghui@mail.ccnu.edu.cn 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( 猿园怨苑圆远怨猿 ); 湖北省自然科学基金重点项目 ( 圆园员源悦云粤园苑怨 ); 中央高校基本科研业务费资助项目 ( 悦悦晕哉员远粤园圆园源源 ) Projectsupported: 栽澡藻晕葬贼蚤燥灶葬造晕葬贼怎则葬造杂糟蚤藻灶糟藻云燥怎灶凿葬贼蚤燥灶燥枣悦澡蚤灶葬 ( 猿园怨苑圆远怨猿 ); 匀怎遭藻蚤孕则燥增蚤灶糟藻晕葬贼怎则葬造杂糟蚤藻灶糟藻运藻赠云燥怎灶凿葬贼蚤燥灶孕则燥躁藻糟贼 ( 圆园员源悦云粤园苑怨 ); 云怎灶凿葬皂藻灶贼葬造砸藻泽藻葬则糟澡云怎灶凿泽枣燥则贼澡藻悦藻灶贼则葬造哉灶蚤增藻则泽蚤贼蚤藻泽 ( 悦悦晕哉员远粤园圆园源源 )

2 674 邻苯二甲酸二 -2- 乙基己酯 (di-2-ethylhexylph 原 thalate,dehp), 又名邻苯二甲酸二异辛酯, 是邻苯二甲酸酯类化合物 (PAE) 的重要成员, 是塑料材料中使用量最大的增塑剂, 在 PVC 材料中 DEHP 含量高达 3 豫耀 5 豫 [1] DEHP 在塑料中以游离的形式存在, 其与塑料成分之间不是以共价化学键结合, 而是通过氢键或范德华力相连, 因此极容易释放到环境中据文献报道,DEHP 在长江黄河珠江辽河和海河等我国主要水系流域均有高浓度检出有文献报道重庆市和三峡库区水环境中 DEHP 最高浓度达到滋 g L -1, 对浙江省 1 个水厂的源水进行抽样分析, 发现每个水厂均有邻苯二甲酸酯类检出, 其中 DEHP 最高含量达到 17 滋 g L -1[2] 而且 DEHP 很难降解, 在环境中存留时间较长, 在生物体内具有富集效应, 对人体健康和环境安全造成极大的威胁 DEHP 受到广泛的关注还与其多重毒性作用有关许多动物毒理学研究表明,DEHP 具有肝脏毒性生殖毒性发育毒性和致癌性等多种毒性, 并具有类雌性激素活性 [1,3-7] 目前有关 DEHP 对免疫系统作用, [8] 特别是介导超敏反应发生已有一些研究 Lee 等报道 DEHP 可诱导 CD4 + T 细胞向 Th2 型细胞分化并分泌 IL-4,IL-4 刺激 B 细胞产生 IgE 型抗体并通过介导炎症级联反应导致超敏反应流行病学调查研究证实, 职业性接触 DEHP 的人群发生哮喘的几率大幅增 [9] 加 Hoppin 等报道 DEHP 及其体内代谢产物邻苯二甲酸单苄酯 (Monobenzyl phthalate,mbzp) 能够诱导与哮喘花粉热关节炎等疾病密切相关的 19 种特异性 IgE 抗体的产生, 提示 DEHP 接触与哮喘花粉热关节炎等超敏反应及关节炎为代表的自身免疫性疾病的发病有关 DEHP 可明显增加人和大鼠免疫细胞膜表面分子 CD11b 的表达,CD11b 专司免疫细胞从血管至炎症部位的迁移与附着, 表明 DEHP 能够影响免 [1] [11] 疫炎症反应 Kuo 等发现 DEHP 通过抑制 MAPK- MEK1/2-ERK-ELK1 和 NF 资 B 信号传导途径, 抑制髓系 DC 细胞分泌 IFN- 琢 /IFN- 茁, 从而削弱 DC 细胞对 T 细胞的辅佐作用, 诱导免疫应答反应向 Th2 方向发 [3] 展 Eljezi 等发现.1 滋 g L -1 浓度剂量的 DEHP 对鼠细胞系 L929 表现明显的细胞毒性作用人角膜内皮细胞 B4G12 体外暴露于 DEHP 后, 炎症相关因子 IL-1 茁 IL-8 和 IL-16 的分泌增加, 基因表达水平也升高 [12] 以上研究提示 DEHP 暴露可能从多方面影响免疫应答由于 DEHP 在日常用品中的广泛使用, 土壤水农业环境科学学报第 37 卷第 4 期体等均已受到不同程度的 DEHP 污染 DEHP 可以通过食品摄入呼吸空气饮用水皮肤吸收等多种途径进入人体 29 年美国 CDC 开展的第四次针对环境化合物暴露检测报告显示, 接受检查的 2636 例受检者体内都可以检测到 DEHP 及其代谢产物的存在 ( 本文选用小鼠巨噬细胞株 RAW264.7 细胞和腹腔巨噬细胞作为研究材料, 通过检测 DEHP 对巨噬细胞吞噬活性细胞因子产生活性氧水平的变化, 探讨 DEHP 暴露对机体免疫系统的毒性作用, 为 DEHP 暴露对免疫系统干扰 / 毒性风险评价提供参考 1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器 DEHP 购于上海阿拉丁试剂公司 ( 纯度逸 98%), DMEM 培养基购于 Gibco 公司, 胎牛血清购于杭州四季青公司,Giemsa 染色试剂购自南京建成生物公司, TNF- 琢 IL-12 IL-23 ELISA 检测试剂盒购自三鹰生物,2,7- 二氯荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA) 购自江苏凯基生物公司, 其他相关试剂均为国产分析纯二氧化碳培养箱型号为 Thermo-BB15, 倒置显微镜及照相系统型号为 Olympus IX-5,Spectra Max M5 多功能酶标仪型号为 Molecular Devices-SpectraMax i3x 1.2 巨噬细胞系 RAW264.7 细胞培养巨噬细胞系 RAW264.7 细胞系华中科技大学基础医学院生物化学教研室惠赠复苏冻存的 RAW264.7 细胞方法如下 : 从液氮罐中取出保存 RAW264.7 细胞的冻存管, 立即将其置于 4 益的温水中快速解冻 7% 酒精喷洒细胞冻存管消毒, 置于超净工作台内, 移液器吸取将细胞转移至 15 ml 离心管中, 再补加 1 倍体积的 1 豫胎牛血清 -DMEM 培养基,1 r min -1 离心 8min, 弃上清, 重新加入含有 1% 血清的 DMEM, 轻轻吹打混匀, 转移至 25 cm 2 细胞培养瓶, 放入 37 益 5% CO 2 培养箱静置培养定时观察培养基颜色变化及细胞状态, 及时更换新鲜培养基, 待细胞长满整个培养瓶底部, 进行传代培养 1.3 DEHP 处理 RAW264.7 细胞将正常 RAW264.7 细胞接种到培养瓶中, 待培养细胞的密度达到 8 豫后进行 DEHP 暴露设置 mg L -1 DEHP 处理组.5 豫的溶剂和 DMEM 对照组 DEHP 暴露 48 h 更换正常培养基培养 24~48 h, 连续细胞传代和贴壁再生

3 第 32 卷第 1 期 218 年 4 月长, 待培养细胞的密度达到 8 豫后进行 DEHP 暴露, 如此重复 1 代染毒 DEHP 暴露 1 代后收获细胞, 用于红细胞吞噬实验细胞因子分泌活性氧水平检测巨噬存活率经.4% 台盼蓝染色确定细胞存活 1.4 腹腔巨噬细胞分离培养 BALB/c 小鼠购于湖北省疾病预防医学科学院小鼠暴露浓度设计依据体外实验结果确定选取 3 只 8~12 周龄雄性健康 BALB/c 小鼠随机分成 5 组, 分别设置为 mg L -1 DEHP 处理组.5 豫的溶剂和蒸馏水对照组, 采用自由饮水方式喂饲小鼠, 连续饲养 2 周后颈椎脱臼处死小鼠,75% 酒精浸泡 5min, 剪开腹下部皮肤打开腹腔, 用吸管吸取 PBS 反复冲洗腹腔, 收集腹腔渗出液,1 r min -1 离心 8 min, 弃上清,PBS 洗涤 2 遍用 1 豫胎牛血清 -DMEM 培养基调节细胞浓度至 5 伊 1 6 细胞 ml -1, 接种于 24 孔板中, 每孔 2mL, 置 37 益 5 豫 CO 2 培养箱培养, 每 2 h 定时取出培养板于倒置显微镜下观察巨噬细胞贴壁情况 1.5 红细胞吞噬实验向培养有巨噬细胞的培养板中按 1 颐 5 比率加入绵羊红细胞, 放回 CO 2 培养箱中孵育,3 h 后取出培养板,PBS 反复冲洗未被巨噬细胞吞噬的红细胞, 自然干燥后加入冷溶液固定 5min 滴加 Giemsa 染液 1 min, 自来水冲干净, 在显微镜下观察计数吞噬百分率和吞噬指数吞噬百分率 = 吞噬红细胞的巨噬细胞 /1 个巨噬细胞伊 1% 吞噬指数 = 被吞噬的红细胞 /1 个巨噬细胞 1.6 ELISA 检测 TNF- 琢 IL-12 IL-23 细胞因子表达将经过 DEHP 处理的 RAW264.7 细胞浓度调至 1 伊 1 7 ml -1, 培养于 24 孔板中, 每孔加入 1mL 细胞悬液和 2 伊 1-3 滋 g L -1 LPS 刺激 ( 每种剂量浓度 DEHP 均设 3 个重复孔 ), 培养 72 h 后, 吸取培养上清液用于细胞因子的测定以双抗体夹心 ELISA 法, 测定培养上清液中 TNF- 琢 IL-12 IL-23 细胞因子浓度操作步骤按三鹰生物公司提供的检测试剂盒中说明书进行 1.7 活性氧 (ROS) 水平检测韩佳萦, 等 : 塑化剂 DEHP 暴露对小鼠巨噬细胞的免疫毒性作用 675 将经过 DEHP 连续处理 1 代的 RAW264.7 细胞浓度调至 1 伊 1 7 ml -1, 接种于 24 孔板, 加入 2 伊 1-3 滋 g L -1 LPS 刺激 2h 后, 按照凯基活性氧检测试剂盒的操作说明, 采用对 ROS 敏感的荧光探针 DCFH-DA 标记细胞, 利用荧光酶标仪在 488nm 激发波长 525nm 发射波长下测定不同细胞样品中 DCF 的荧光值, 检测 DEHP 不同浓度处理组细胞内活性氧的变化 1.8 统计学处理应用 GraphPad Prism 5 统计软件进行单因素方差分析 (One-Way ANOVA), 实验数据以 X 依 SD 表示, 两组间计量资料的比较采用 t 检验 P<.5 为差异显著 2 结果与分析 2.1 DEHP 对 RAW264.7 细胞的毒性作用为评估 DEHP 暴露对巨噬细胞的毒性作用, 首先用不同浓度剂量的 DEHP( mg L -1 ) 处理巨噬细胞株 RAW264.7 细胞 RAW264.7 细胞暴露于 mg L -1 DEHP 48 h 后, 未发现细胞活力状态及死亡细胞数目发生变化 ( 图 1) 然而经 mg L -1 DEHP 处理后,RAW264.7 细胞的活力状态变弱, 死亡细胞的数目显著增加 ( 图 2) 2.2 DEHP 对 RAW264.7 细胞吞噬能力的影响鉴于动物与人体接触环境中 DEHP 的实际情况是低剂量长时间暴露, 我们采用 mg L -1 浓度剂量的 DEHP 对巨噬细胞株 RAW264.7 进行持续染毒经连续染毒处理 1 代后,RAW264.7 细胞的活力形态以及繁殖传代时间未见显著变化 ( 结果未显示 ) 细胞吞噬功能测定显示, 向 DMEM 和对照组 RAW264.7 细胞中加入绵羊红细胞 2h 后, 可观察到巨噬细胞吞噬红细胞, 被吞噬红细胞及巨噬细胞形态轮廓清晰可辨, 被吞噬红细胞数目从一个到多个不等, 有部分红细胞粘附在巨噬细胞外围将要被吞噬 ( 图 3) 而经 DEHP 连续处理 1 代后, 完全培养基图 2 RAW264.7 细胞接受不同浓度剂量 DEHP 处理后的死亡率 (n=3) Figure2 The mortality ofraw264.7 cellsby treated with differentdosagesofdehp(n=3)

7 cellstreated with differentdosagesofdehpafter48 htreatment(magnification: 伊 2) DMEM 1mg L -1 DEHP 5mg L -1 DEHP 1mg L -1 DEHP 图 3 RAW264.

4 676 农业环境科学学报第 37 卷第 4 期 DMEM 1mg L -1 DEHP 5mg L -1 DEHP 1mg L -1 DEHP 2mg L -1 DEHP 4mg L -1 DEHP 8mg L -1 DEHP 图 1 不同浓度剂量 DEHP 处理 RAW264.7 细胞 48h 后的镜检结果 ( 放大倍数 : 伊 2) Figure1 Microscopic imagesofraw264.7 cellstreated with differentdosagesofdehpafter48 htreatment(magnification: 伊 2) DMEM 1mg L -1 DEHP 5mg L -1 DEHP 1mg L -1 DEHP 图 3 RAW264.7 细胞吞噬红细胞镜检结果 ( 放大倍数 : 伊 4) Figure 3Microscopic examination ofphagocytosisefficiencywith RAW264.7 cell(magnification: 伊 4) RAW264.7 细胞的吞噬红细胞能力显著减弱 ( 图 3) 每组实验重复 3 次, 统计结果显示 DMEM 与对照组相比, 吞噬百分率和吞噬指数无统计学差异 ( 表 1), 而 1 5 1mg L -1 DEHP 各暴露组与对照组相比, 吞噬百分率和吞噬指数均呈现显著下降趋势 (P<.5) 2.3 DEHP 对 RAW264.7 细胞分泌 TNF- 琢 IL-12 IL- 23 细胞因子的影响 1 5 1mg L -1 DEHP 连续处理 1 代后, 换用正常培养基继续培养 24~48 h, 再接受 LPS 刺激 72 h 后

第 32 卷第 1 期 218 年 4 月韩佳萦, 等 : 塑化剂 DEHP 暴露对小鼠巨噬细胞的免疫毒性作用 677 表 1 不同剂量 DEHP 暴露对 RAW264.7 细胞吞噬活性的影响 Table 1 Effectsofdifferentdose DEHPexposure on phagocytosisofraw264.

33 依 6.15 <.5.14 依.9 <.5 收集细胞上清液,TNF- 琢 IL-12 IL-23 的变化趋势见图 4 由图 4 可以看出, 经 1 5 1mg L -1 的 DEHP 连续处理后,RAW264.7 细胞分泌 TNF- 琢 IL-12 IL-23 1.5 1..5 2. 1.5 1..5 1..8.6.4.2 1 5 1 图 4DEHP 暴露对 RAW264.

5 第 32 卷第 1 期 218 年 4 月韩佳萦, 等 : 塑化剂 DEHP 暴露对小鼠巨噬细胞的免疫毒性作用 677 表 1 不同剂量 DEHP 暴露对 RAW264.7 细胞吞噬活性的影响 Table 1 Effectsofdifferentdose DEHPexposure on phagocytosisofraw264.7 组别剂量吞噬百分率 /% P 值 ( 吞噬百分率 ) 吞噬指数 P 值 ( 吞噬指数 ) DMEM 依 > 依 1.41 >.5 /% 依依.93 DEHP/mg L 依 6.31 <.5.62 依.45 < 依 7.63 <.5.37 依.26 < 依 6.15 <.5.14 依.9 <.5 收集细胞上清液,TNF- 琢 IL-12 IL-23 的变化趋势见图 4 由图 4 可以看出, 经 1 5 1mg L -1 的 DEHP 连续处理后,RAW264.7 细胞分泌 TNF- 琢 IL-12 IL 图 4DEHP 暴露对 RAW264.7 细胞因子分泌的影响 (OD: 光密度,n=3, P<.5) Figure 4 EffectsofdifferentdosagesofDEHPon cytokines secretionofraw264.7(od:opticaldensity,n=3,p<.5) 等细胞因子的能力较对照组比较显著降低并且 TNF- 琢 IL-12 IL-23 下降趋势与 DEHP 暴露浓度呈现剂量 - 效应关系, 提示 DEHP 能抑制 RAW264.7 细胞分泌 TNF- 琢 IL-12 IL-23 等细胞因子 2.4 DEHP 对 RAW264.7 细胞 ROS 产生的影响 1 5 1mg L -1 DEHP 连续处理 1 代后, 换用正常培养基继续培养 48 h, 加入 2 伊 1-3 滋 g L -1 LPS 刺激 2h 后, 用 DCFH-DA 荧光探针标记 RAW264.7 细胞, 测定细胞内荧光强度以反映 ROS 的产生量图 5 显示, 经 mg L -1 浓度剂量的 DEHP 连续染毒后, RAW264.7 细胞内的 ROS 水平与对照组相比显著下降, 随着 DEHP 浓度的加大,DEHP 对 RAW264.7 细胞 ROS 水平的抑制作用逐渐增强, 当 DEHP 浓度达到 1 mg L -1 时, 细胞内 ROS 水平降至对照组水平的 34.69% 2.5 DEHP 对腹腔巨噬细胞贴壁及吞噬能力的影响为进一步验证 DEHP 对巨噬细胞免疫功能的影响, 我们还选用了小鼠腹腔巨噬细胞作为研究材料采用 mg L -1 DEHP 喂饲小鼠, 连续饲养 2 周后收集小鼠腹腔巨噬细胞, 隔 2h 于倒置显微镜下观察巨噬细胞粘附贴壁情况及形态变化对照组腹腔巨噬细胞于体外培养 2h 后逐渐伸展增大,4 h 后能粘附到 24 孔培养板上, 形状呈梭形或不规则形并有伪足或突起伸出而各剂量浓度 DEHP 对巨噬细胞黏附伸展能力均有一定的影响, 其中 5 1 mg L -1 DEHP 暴露组巨噬细胞黏附伸展能力下降显著, 分别需要 12 14h 才能完全贴壁红细胞吞噬实验显示, 各剂量浓度 DEHP 暴露与对照组相比, 巨噬细胞吞噬红细胞数目吞噬百分率及吞噬指数均显著降低 ( 表 2) 3 讨论 DEHP 是日常生活中使用和接触最多的增塑剂, DEHP 可不断地从塑料中释放从近年来我国各大水系的检测结果来看, 水环境中 DEHP 的含量已经超出我

6 678 表 2 不同剂量 DEHP 暴露对小鼠腹腔巨嗜细胞吞噬活性的影响农业环境科学学报 Table2 Effectsofdifferentdose DEHPexposure on phagocytosisofmurine peritonealmacrophages 第 37 卷第 4 期组别剂量吞噬百分率 /% P 值 ( 吞噬百分率 ) 吞噬指数 P 值 ( 吞噬指数 ) ddh 2O 45.5 依 2.3 >.5.58 依.16 >.5.5 豫 42.5 依依.22 DEHP/mg L 依 1.9 <.5.39 依.15 < 依 1.6 <.5.23 依.8 < 依 1.5 <.5.14 依.9 < 图 5 DEHP 对 RAW264.7 细胞 ROS 产生的影响 (n=3, 重复检测次数 :2 次,P<.5) Figure 5DEHP inhibited ROSproduction in RAW264.7 cells (n=3,repeateddetection times:2, P<.5) 国水环境中允许的浓度范围 [13] 由于 DEHP 具有较高的脂 - 水分配系数, 可被土壤吸附并且可被生物富集, 因此生物体中 DEHP 的含量要远高于水体和土壤 [14] 自 1981 年首次报道 DEHP 诱发啮齿类动物肿瘤以来, 关于 DEHP 毒性研究的文献日渐增多巨噬细胞是机体内重要的免疫效应细胞, 具有多种免疫功能, 包括免疫防御免疫监视免疫调节以及抗原呈递等, 在机体的免疫系统中起着重要作用 [15] 由于巨噬细胞株 RAW264.7 细胞已经成功建系, 易于体外传代培养, 因此本研究首先选用 RAW264.7 细胞作为研究对象, 探讨 DEHP 对巨噬细胞功能的影响结果显示, 虽然较低浓度剂量 (1 5 1 mg L -1 )DEHP 暴露并没有急性毒性作用, 然而经连续 1 代持续暴露后, DEHP 对细胞株 RAW264.7 吞噬功能有明显抑制作用接受外来抗原刺激后分泌细胞因子 ( 如 TNF- 琢 IL-12 IL-23) 是巨噬细胞应答的基本反应 [16] 本研究证实,DEHP 对 RAW264.7 细胞接受 LPS 刺激后分泌 TNF- 琢 IL-12 IL-23 等细胞因子有明显的抑制作用, 且呈一定的剂量 - 效应关系细胞内 ROS 水平也是反映巨噬细胞功能的指标之一 [17] 吞噬细胞受到刺激时通过呼吸暴发机制, 产生大量 ROS,ROS 是吞噬细胞发挥吞噬和杀伤作用的主要介质在机体免疫防御过程中, 巨噬细胞通过产生一定量的 ROS, 破坏细菌的细胞膜和病毒的蛋白质, 从而消灭外来病原微生物本研究发现,DEHP 连续处理巨噬细胞株 RAW264.7 后, 再接受 LPS 刺激 2h 后, 用 DCFH-DA 荧光探针法检测 ROS 的产生, 显示细胞 ROS 的产生受到抑制, 并且随着 DEHP 浓度的增大, 细胞内 ROS 水平下降愈加明显这些结果说明 DEHP 对巨噬细胞正常功能发挥具有显著的抑制作用由于腹腔巨嗜细胞游离存在于腹腔的腹水中, 易于获得, 因此本研究还选用腹腔巨噬细胞作为研究对象结果表明 DEHP 对腹腔巨噬细胞粘附贴壁及吞噬能力均有显著抑制作用粘附贴壁能力反应巨噬细胞的活力状态, 吞噬能力是反映其免疫防御能力的一个 [18] 重要指标,DEHP 抑制腹腔巨噬细胞的粘附贴壁及吞噬能力, 表明 DEHP 可影响巨噬细胞的免疫防御功能, 从而对机体的免疫能力产生抑制作用 4 结论 (1) 高浓度 (2 4 和 8 mg L -1 )DEHP 暴露可对巨噬细胞株 RAW264.7 细胞造成急性损伤 (2) 低浓度 (1 5 1 mg L -1 )DEHP 长时间暴露对 RAW264.7 和腹腔巨噬细胞有免疫毒性作用 (3) 本研究评估了 DEHP 对巨噬细胞的免疫毒性作用, 这对全面了解 DEHP 的毒性具有十分重要的意义, 研究结果可为 DEHP 的免疫毒性风险评估提供一定的科学依据参考文献 : [1] Erythropel HC, Maric M, Nicell JA, et al. Leaching of the plasticizer di (2-ethylhexyl)phthalate(DEHP)fromplastic containersand the ques 原 tion of human exposure[j]. Apply Microbiol Biotechnol, 214, 98(24): [2] Liu XW, Shi JH, Bo T, et al. Occurrence of phthalic acid esters in sourcewaters:anationwidesurveyinchinaduringtheperiodof [J]. EnvironmentalPollution, 214, 184:

7 第 32 卷第 1 期 218 年 4 月 [3] Eljezi T,PintaP,RichardD,et al. Invitro cytotoxiceffectsofdehp-al 原 ternative plasticizers and their primary metabolites on al929 cell line [J]. Chemosphere, 217, 173: [4] Nardelli TC, Erythropel HC,Robaire B.Toxicogenomic screening of re 原 placements for di(2-ethylhexyl)phthalate(dehp)using the immor 原 talizedtm4sertolicellline[j]. PLoSOne, 215, 1(1):e [5] Qureshi MS, Yusoff AR, Wirzal MD, et al. Methods for the determina 原 tionofendocrine-disruptingphthalateesters[j]. CriticalReviews inana 原 lyticalchemistry,216,46(4): [6] Mallow EB, Fox MA. Phthalates and critically ill neonates:device-re 原 lated exposures and non-endocrine toxic risks[j]. Journalof Perinatolo 原 gy,214, 34(12): [7] 刘瑾, 叶萍英, 蔡军, 等. 邻苯二甲酸二 (2 原乙基己基 ) 酯对小鼠子宫发育的毒性作用 [J]. 环境与健康杂志 212,29(1): LIU Jin, YE Ping-ying, CAI Jun, et al. Toxic effect of DEHP on uterus developmentinmice[j]. Journalof EnvironmentlHealth, 212,29(1): [8] Lee MH, Park J, Chung SW, et al. Enhancement of interleukin-4 pro 原 duction in activated CD4 + Tcells by diphthalate plasticizers via in 原 creased NF-AT binding activity[j]. Internation Archievs of AllergyIm 原 munology,24, 134(3): 韩佳萦, 等 : 塑化剂 DEHP 暴露对小鼠巨噬细胞的免疫毒性作用 679 [9] Hoppin JA, Jaramillo R, London SJ,et al. Phthalate exposure and aller 原 gy in the U. S.population:ResultsfromNHANES 25 26[J]. Env 原 ironhealth Perspect,213,121(1): [1] Gourlay T, Samartzis I, Stefanou D, et al. Inflammatory response of rat and human neutrophils exposed to di-(2-ethyl-hexyl)-phthalateplasticizedpolyvinyl chloride[j]. ArtifOrgans,23,27(3): [11] Kuo CH, Hsieh CC,Kuo HF, et al. Phthalates suppress type 玉 inter 原 feron in human plasmacytoid dendritic cells via epigenetic regulation [J]. Allergy,213, 68(7): [12] Kruger T, Cao Y, Kjaergaard SK, et al. Effectsof phthalateson the hu 原 mancornealendothelialcelllineb4g12[j]. InternationalJournalofTox 原 icology,212, 31(4): [13] 陈济安, 邱志群, 舒为群, 等. 我国水环境中邻苯二甲酸酯污染现状及其生物降解研究进展 [J]. 癌变畸变突变,212, 19(3): CHEN Ji-an, QIU Zhi-qun, SHU Wei-qun, et al. Pollution of PAEs in water and the biodegradations studies in China [J]. Carcinogenesis, Teratogenesis &Mutagenesis, 212, 19(3): [14] Fromme H, Kuchler T, Otto T, et al. Occurrence of phthalates and bisphenol Aand Fin the environment[j]. Water Research, 22, 36 (6): [15] 金柏泉. 医学免疫学 [M]. 5 版. 人民卫生出版社,28. JINBo-quan. Medical immunology[m]. Fifth Edition. People 忆 smedical Press, 28. [16] 周宪宾, 姚成芳. 巨噬细胞 M1/M2 极化分型的研究进展 [J]. 中国免疫学杂志,212,28(1): ZHOU Xian-bin, YAO Cheng-fang. Advances in M1/M2 polarization typing of macrophages[j]. Chinese Journal of Immunology, 212, 28 (1): [17] 黄行许, 马晓冬, 乔东访, 等.ROS 对小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的影响 [J]. 免疫学杂志 2,16(5): HUANG Xing-xu, MA Xiao-dong, QIAO Dong-fang, et al. Effects of ROS on apoptosis in murine peritoneal macrophage[j]. Journal of Im 原 munology,2,16(5): [18]MurrayPJ,WynnTA.Protectiveandpathogenicfunctionsofmacrophage subsets[j]. Natural Review Immunology, 211, 11(11):

7 北京大学学报医学版 # +94* 4 ' % 论著!! "# $ #% %"&!%'!! $ "( )& * $ +,-.)/ ) 01 " * ). " 2")3 )01 ( /" 433% /1 " 0 "51 " -.)/$ 6',)") 4.))%) 0

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674 邻苯二甲酸二 -2- 乙基己酯 (di-2-ethylhexylph 原 thalate,dehp), 又名邻苯二甲酸二异辛酯, 是邻苯二 甲酸酯类化合物 (PAE) 的重要成员, 是塑料材料中使 用量最大的增塑剂, 在 PVC 材料中 DEHP 含量高达 3 豫耀 5 豫 [1] DEHP

674 邻苯二甲酸二 -2- 乙基己酯 (di-2-ethylhexylph 原 thalate,dehp), 又名邻苯二甲酸二异辛酯, 是邻苯二甲酸酯类化合物 (PAE) 的重要成员, 是塑料材料中使用量最大的增塑剂, 在 PVC 材料中 DEHP 含量高达 3 豫耀 5 豫 [1] DEHP