而糖尿病肾病已经成为终末期肾病的首位病因 [3] 目前, 临床上治疗糖尿病的药物主要是化学药, 如 : 磺酰脲类双胍类噻唑烷二酮类糖苷酶抑制剂等遗憾的是迄今为止尚无治疗糖尿病慢性并发症的特效药物, 所以, 临床上亟需防治或延缓糖尿病并发症的药物 [4] 中药具有多组分多靶点多因素多效

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贵方
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1 年月第卷第期中国现代中药ＭＣＭＪＶＮ基础研究糖宁通络胶囊对小鼠高血糖症以及视网膜肾脏病变的疗效研究卢珊王婷婷李永吉黑龙江中医药大学药学院黑龙江哈尔滨哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心黑龙江哈尔滨摘要目的探索糖宁通络胶囊对型糖尿病动物模型小鼠高血糖症以及视网膜肾脏病变的影响方法将周龄小鼠分为组分别为模型组二甲双胍组糖宁通络胶囊高剂量组糖宁通络胶囊中剂量组和糖宁通络胶囊低剂量组以同窝野生型小鼠为周检测空腹血糖和葡萄糖耐量并检测血清糖化血红蛋白水平观察糖正常对照组每天灌胃给药次连续宁通络胶囊对小鼠高血糖症的影响采用Ｄ荧光血管造影仪器检测视网膜微血管瘤观察糖宁通络胶囊对小鼠视网膜病变的影响使用试剂盒检测尿蛋白水平ＢＵＮ和ＣＲＥ观察糖宁通络胶囊对小鼠肾脏小鼠空腹血糖和糖化血红蛋白水平显著增加葡萄糖耐量功能病变的影响结果糖宁通络胶囊显著降低明显减少微血管瘤数量并显著减少尿蛋白ＢＵＮ和ＣＲＥ水平结论糖宁通络胶囊具有显著的降血糖作用以及对糖尿病视网膜和肾脏并发症的预防作用关键词小鼠糖尿病视网膜病变糖尿病肾病ＥＴＣＨｍＤＲＮＭＬＵＳＷＡＮＧＴＬＩＹＨＵＣＭＨＣＣＲＤｍＬＳＥｍＳＨＵＣｍｍＨＣＡＩＴＴＮＴＬｍｍｗＤｍｗｍｍｍｍＴＮＴＬｍＴＮＴＬｗＴＮＴＬＴｗｍｗｍＭｍＴＮＴＬｗｍｗｋＴｍｍｗｍｍＴＮＴＬＨＡｍｍｍＢＵＮＣＲＥＩＴＮＴＬｘｍｍＫｗｍ糖尿病ｍ是一种基于胰岛素抵抗的以持续性的高血糖状态为主要临床特征的慢性代谢障碍性疾病人类生命健康的世界性公共卫生问题糖尿病慢性并发症是糖尿病患者致残或致死的近年来随着生活方式的改变主要原因其中以微循环障碍为病理基础的视网膜和人口老龄化的加剧糖尿病的患病率在我国以及病变和肾脏病变是糖尿病最常见的慢性并发症视全球范围内呈现逐步增高的趋势已成为严重危害网膜病变是成人获得性视力损害与失明的重要病因通信作者李永吉教授研究方向中药药剂学Ｅｍｍ

2 而糖尿病肾病已经成为终末期肾病的首位病因 [3] 目前, 临床上治疗糖尿病的药物主要是化学药, 如 : 磺酰脲类双胍类噻唑烷二酮类糖苷酶抑制剂等遗憾的是迄今为止尚无治疗糖尿病慢性并发症的特效药物, 所以, 临床上亟需防治或延缓糖尿病并发症的药物 [4] 中药具有多组分多靶点多因素多效应网络化的作用特点, 决定了其在改善糖尿病并发症等复杂性疾病防治方面的优势如果能充分发挥中药对糖尿病并发症的防治作用, 将会对人类健康作出重要贡献糖宁通络胶囊为医院制剂, 属传统苗药, 主要由科夭罗曲车前草仙鹤草和山银花组成, 主治生津止渴, 活血通络, 清热泻火, 用于气阴两虚所致的消渴病糖宁通络胶囊用于 2 型糖尿病及糖尿病并发症的治疗, 临床观察效果较好但是, 糖宁通络胶囊对 db/db 小鼠高血糖症和糖尿病并发症是否具有疗效, 国内外未见报道本研究采用目前国际公认的 2 型糖尿病动物模型 db/db 小鼠, 探索糖宁通络胶囊对 db/db 小鼠高血糖症视网膜和肾脏病变的影响, 为临床治疗糖尿病并发症提供新的治疗思路和途径 1 材料 1 1 药品盐酸二甲双胍片 (Metformin, 中美上海施贵宝制药有限公司, 批号 : ); 糖宁通络胶囊 ( 贵州百灵集团制药股份有限公司, 批号 : ), 已获贵州省药品监督管理局批准授权 ( 授权号 :QYZZ ); 稳豪型血糖试纸 ( 批号 : ) 和稳豪型血糖仪 [ 强生 ( 上海 ) 医疗器材有限公司 ]; 葡萄糖 ( 北京化工厂, 批号 : ); 小鼠糖化血红蛋白 (HaemoglobinA1c,HbA1c)ELISA 试剂盒 ( 美国 CrystalChem 公司, 批号 : ); 尿蛋白试纸条 ( 批号 : ), 尿素氮 (BloodUreaNitrogen, BUN; 批号 : ) 和肌酸酐 (Serum creatinine, CRE; 批号 : ) 试剂盒, 均购自日立高科技贸易 ( 上海 ) 有限公司 1 2 动物 8 周龄雄性 C57BL/KsJ/db / 小鼠 (db/db 小鼠 ) 和同窝野生型 C57BL/KsJ/db+/+ 小鼠 ( 上海斯莱克实验动物有限责任公司 ), 许可证号 :SCXK( 沪 ) 遵循国家实验动物管理条例, 依据北京实验动物管理规定将小鼠置于 SPF 级实验动物室进行饲养, 温度 : (23±2), 湿度 : (50± 10)%, 予以 12h 明暗交替光照, 自由进食饮水实验方案由中国医学科学院北京协和医学院动物伦理委员会审查批准 2 方法 2 1 分组及给药将 db/db 小鼠随机分为 5 组, 分别为模型组阳性药二甲双胍组 (0 14g kg -1 ) 糖宁通络胶囊高剂量组 (1 8g kg -1 ) 糖宁通络胶囊中剂量组(0 9g kg -1 ) 和糖宁通络胶囊低剂量组 (0 45g kg -1 ), 将野生型 C57BL/KsJ/db+/+ 小鼠作为正常对照组, 每组 10 只每天灌胃给药 1 次, 共给药 20 周, 正常对照组和模型组均给予相同体积的 0 9% 氯化钠溶液 2 2 测定小鼠空腹血糖水平给药期间每周测定各组小鼠 (n=10) 空腹血糖, 小鼠禁食不禁水 5h 后, 用稳豪型血糖仪测定各组小鼠尾静脉血的空腹血糖水平 2 3 荧光血管造影在给药 133d, 各组小鼠 (n=10) 经腹腔注射麻醉 (10% 乌拉坦和 5% 水合氯醛等量混合, 15mL kg -1 ), 固定于 4Doct 荧光血管造影仪器 (Optoprobe 公司, 加拿大 ) 的实验台上, 然后使用复方托吡卡胺滴眼液散瞳, 调整小鼠眼睛靠近显微镜头腹腔注射 20% 荧光素钠 (2mg kg -1 ) 后, 观察并拍照荧光血管造影图荧光血管造影图中在视网膜血管分枝的末端, 可见局部的末端膨大, 我们将其确认为微血管瘤, 在对微血管瘤计数时, 我们将视网膜分为 4 个区域, 左上对应颞上方左下对应颞下方右上对应鼻上方右下对应鼻下方在每个方向计数时, 均将视盘影像置于各个象限的固定部位, 其中左上方计数时视盘位于 4 30 处, 右上方计数时视盘位于 7 30 处, 左下方计数时视盘位于 1 30 处, 右下方计数时视盘位于处 4 个方位计数的总和为该视网膜的微血管瘤总数所有视网膜放大倍率均一致 (20x), 以保证计数的可比性为了确保计数的准确性, 共有 3 人参与了微血管瘤的计数, 分别是动物操作人员荧光血管造影操作人员以及另外非本课题相关人员,3 个人员的计数平均值为该视网膜的微血管瘤总数

3 2 4 测定尿蛋白 BUN CRE 和 HbA1c 水平给药 d, 接取各组小鼠 (n=10) 尿液, 用尿蛋白试纸条检测尿蛋白水平给药 140d, 将小鼠脱颈处死后, 腹主动脉取血 1 ml 血液经 3000r min -1 离心 15min 后取血清, -80 冻存, 根据试剂盒操作说明测定肾脏功能相关指标 BUN 和 CRE 水平以及 HbA1c 水平 2 5 测定小鼠葡萄糖耐量在给药 140d, 各组小鼠 (n=10) 禁食不禁水 5h, 灌胃给予小鼠葡萄糖溶液 (2 5g kg -1 ) 分别于 min 用稳豪型血糖仪测定各组小鼠尾静脉血血糖值, 以时间为横坐标, 血糖值为纵坐标作图, 并计算血糖曲线下面积 (Areaunder thecurve,auc) 2 6 统计学方法实验结果以 ( x±s) 珋表示, 采用 SPSS19 0 统计软件进行单因素方差分析, 多样本两两比较采用 Duncan 检验, 以 P<0 05 为差异具有统计学意义小鼠的 HbA1c 水平显著降低 (P<0 01), 表明糖宁通络胶囊能够降低糖化血红蛋白水平图 1 糖宁通络胶囊对 db/db 小鼠空腹血糖的影响 3 结果 3 1 糖宁通络胶囊对 db/db 小鼠空腹血糖的影响由图 1 所示, 与正常对照组比较,db/db 小鼠血糖值随时间延长逐渐增加 ; 与模型组比较, 二甲双胍和糖宁通络胶囊处理组 ( g kg -1 ) 小鼠的血糖值随给药时间延长逐渐下降糖宁通络胶囊处理组 ( g kg -1 ) 给药 1 周后小鼠的空腹血糖值显著下降 (P<0 01) 糖宁通络胶囊处理组 (0 45g kg -1 ) 给药 4 周后小鼠的空腹血糖值显著下降 (P<0 01), 糖宁通络胶囊各剂量组在给药 4 周后的降血糖效果与二甲双胍组 (0 14g kg -1 ) 相当 3 2 糖宁通络胶囊对 db/db 小鼠葡萄糖耐量的影响由图 2 所示, 与正常对照组比较,db/db 小鼠血糖时间曲线下面积 (AUC) 显著增加 (P<0 01) 与模型组比较, 二甲双胍和糖宁通络胶囊处理组 ( g kg -1 ) 小鼠的 AUC 显著减少 (P<0 01), 说明糖宁通络胶囊能够显著提高 db/db 小鼠葡萄糖耐量 3 3 糖宁通络胶囊对 db/db 小鼠 HbA1c 水平的影响由图 3 所示, 与正常对照组比较,db/db 小鼠 HbA1c 水平显著升高 (P<0 01) 与模型组比较, 二甲双胍和糖宁通络胶囊处理组 ( 和 0 45g kg -1 ) 注 : 与正常对照组比较, ## P<0 01; 与模型组比较, P<0 01 图 2 糖宁通络胶囊对 db/db 小鼠葡萄糖耐量的影响注 : 与正常对照组比较, ## P<0 01; 与模型组比较, P<0 01 图 3 糖宁通络胶囊对 db/db 小鼠 HbA1c 水平的影响 553

3 4 糖宁通络胶囊对 db/db 小鼠视网膜病变的影响由图 4 所示, 荧光血管造影结果表明, 与正常对照组小鼠比较, 模型组 db/db 小鼠微血管瘤的数量显著增加 (P<0 01), 提示 db/db 小鼠视网膜微血管发生病理性改变

水平 (P<0 01), 提示糖宁通络能够抑制糖尿病肾脏功能损伤二甲双胍对 db/db 小鼠糖尿病肾脏功能损伤没有明显改善作用表 1 糖宁通络胶囊对 db/db 小鼠肾功能指标的影响组别剂量尿蛋白 /g kg -1 水平 ( 珋

+++ 59 782±8 633 13 200±0 886 糖宁通络胶囊高剂量组糖宁通络胶囊中剂量组糖宁通络胶囊低剂量组 1 8 + 52 511±14 254 11 512±2 473 0 9 ++ 56 345±18 298 11

与正常对照组比较, ## P<0 01; 与模型组比较, P<0 01 图 4 糖宁通络胶囊对 db/db 小鼠微血管病变的影响 3 5 糖宁通络胶囊对 db/db 小鼠肾脏病变的影响由表 1 所示, 肾脏功能指标检测结果表明,

糖尿病慢性并发症, 尤其是视网膜病变和肾脏病变, 已经成为糖尿病致死致残的主要原因目前, 临床上对糖尿病的治疗手段主要是使用化学药控制血糖, 然而, 仅控制血糖并不能有效地防治糖尿病慢性并发症 [5] 如果在糖尿病早期及时使用药物干预,

疗效显著本研究利用 db/db 小鼠探索了糖宁通络的降血糖作用及其对糖尿病并发症的防治作用研究发现,db/db 小鼠在 6~8 周龄时开始自发性出现高血糖, 空腹血糖水平随时间延长而逐渐增加, 糖化血红蛋白水平也显著增加,

4 3 4 糖宁通络胶囊对 db/db 小鼠视网膜病变的影响由图 4 所示, 荧光血管造影结果表明, 与正常对照组小鼠比较, 模型组 db/db 小鼠微血管瘤的数量显著增加 (P<0 01), 提示 db/db 小鼠视网膜微血管发生病理性改变糖宁通络胶囊各剂量组都能显著减少视网膜微血管瘤的数量 (P<0 01), 表明糖宁通络能够改善 db/db 小鼠视网膜微血管病变二甲双胍对 db/db 小鼠视网膜微血管病变没有明显改善作用 db/db 小鼠尿蛋白 BUN 和 CRE 水平 (P<0 01), 提示糖宁通络能够抑制糖尿病肾脏功能损伤二甲双胍对 db/db 小鼠糖尿病肾脏功能损伤没有明显改善作用表 1 糖宁通络胶囊对 db/db 小鼠肾功能指标的影响组别剂量尿蛋白 /g kg -1 水平 ( 珋 x±s,n=10) CRE /mg dl -1 BUN /mg dl -1 正常对照组 ± ±1 409 模型组 ±9 972 ## ±0 940 ## 二甲双胍组 ± ±0 886 糖宁通络胶囊高剂量组糖宁通络胶囊中剂量组糖宁通络胶囊低剂量组 ± ± ± ± ± ±4 518 注 : 与正常对照组比较, ## P<0 01; 与模型组比较, P< 讨论注 :(1) 微血管瘤如箭头所示 ;(2) 与正常对照组比较, ## P<0 01; 与模型组比较, P<0 01 图 4 糖宁通络胶囊对 db/db 小鼠微血管病变的影响 3 5 糖宁通络胶囊对 db/db 小鼠肾脏病变的影响由表 1 所示, 肾脏功能指标检测结果表明, 与正常对照组小鼠比较, 模型组 db/db 小鼠尿液的尿蛋白水平血清中 BUN 和 CRE 水平均显著增加 (P<0 01) 而糖宁通络各剂量组可显著减少 554 糖尿病的危害不仅仅是高血糖症, 更大的危害是慢性并发症糖尿病慢性并发症, 尤其是视网膜病变和肾脏病变, 已经成为糖尿病致死致残的主要原因目前, 临床上对糖尿病的治疗手段主要是使用化学药控制血糖, 然而, 仅控制血糖并不能有效地防治糖尿病慢性并发症 [5] 如果在糖尿病早期及时使用药物干预, 阻断和逆转糖尿病并发症的发生, 可能对降低糖尿病致残致死率具有重要意义但是, 目前化学药在防治糖尿病并发症方面效果并不理想因此, 临床上迫切需要防治糖尿病并发症的新型药物糖宁通络胶囊为苗药配方, 临床上主要用于 2 型糖尿病的治疗, 疗效显著本研究利用 db/db 小鼠探索了糖宁通络的降血糖作用及其对糖尿病并发症的防治作用研究发现,db/db 小鼠在 6~8 周龄时开始自发性出现高血糖, 空腹血糖水平随时间延长而逐渐增加, 糖化血红蛋白水平也显著增加, 葡萄糖耐量显著降低而阳性药二甲双胍和糖宁通络胶囊 ( g kg -1 ) 能够显著降低 db/db 小鼠空腹血糖和糖化血红蛋白水平, 并显著提高葡萄糖耐量这些实验结果表明, 糖宁通络胶囊具有明显的降血糖作用文献报道,db/db 小鼠逐渐自发性出现 2 型糖

5 年月第卷第期中国现代中药ＭＣＭ尿病的慢性并发症如视网膜病变和肾脏病变ＪＶＮ参考文献本研究也发现小鼠在周时视网ＲＭＳＳｋＺＡＭｍ膜出现大量微血管瘤肾脏功能指标蛋白尿和血清ｍｍｍＢＵＮＣＲＥ水平也显著升高提示小鼠出现ｗｍ等糖尿病视网膜和肾脏病变而糖宁通络胶囊灌胃给药周能够显著改善小鼠的视网膜病变和肾脏病变具体体现在糖宁通络胶囊能够显著减少微血管瘤和抑制肾脏功能损伤这些实验结果表明糖宁通络能够预防糖尿病视网膜和肾脏病变二甲双胍被国际组织和许多国家制定的糖尿病诊治指南推荐为型糖尿病控制高血糖的一线用药二甲双胍也被国内糖尿病专家作为型糖尿病的治疗药物文献报道二甲双胍除具有降糖功能外还具有改善心肌损伤减少心肌纤维化改善血管内皮功能和改善血管舒缩功能等心血管保护作用另有文献报道目前二甲双胍不能降低型糖尿病心血管风险二甲双胍是否对糖尿病视网膜病变或肾脏病变具有防治作用国内外未见小鼠报道我们通过实验发现二甲双胍对出现的糖尿病视网膜微血管瘤和肾脏病变没有表现出明显的防治效果与二甲双胍比较糖宁通络在防治糖尿病视网膜和肾脏病变方面有一定的优势但是糖宁通络胶囊降血糖预防糖尿病视网膜和肾脏病变的分子机制是什么还需后续实验进一步探索综上所述糖宁通络胶囊具有显著的降血糖作ＬｋｓＹＷＬＪＷＪＰｍＮＥＪＭｍｗｍＣＲＭＣＭＤｍＷＭＷＭＫＣＺＺＳＹＣＮｍＥｘＯＤＤＣＳＧＩｍＢＦＨｑｎＲｍｍｗｍｍＡＩＭＳｍｋｍＰＤＳＲＤｋｍＡｍＪＰＲＰＦＦＩｍＭＳＡｍｍＪＤＲ中国型糖尿病防治指南年版中国糖尿病杂志母义明纪立农宁光等二甲双胍临床应用专家共识中国糖尿病杂志陈丽莉周亚茹二甲双胍对型糖尿病大血管病变的保护作用机制中国动脉硬化杂志ＳＳＴｍｍ用并对糖尿病视网膜和肾脏病变具有显著的防治ＣＤＲ作用可能成为治疗糖尿病的候选药物收稿日期

息披露实验基本情况 : 1 实验药物名称: 糖宁通络胶囊 2 实验单位: 中国医学科学院药用植物研究所 3 实验内容: 糖宁通络胶囊给药 38 周对 db/db 自发性糖尿病小鼠降糖作用及糖尿病并发症的影响 4 研究目的: 采用国际公认的 db/db 自发性糖尿病小鼠模型, 进行糖宁通络胶囊的降糖

息披露实验基本情况 : 1 实验药物名称: 糖宁通络胶囊 2 实验单位: 中国医学科学院药用植物研究所 3 实验内容: 糖宁通络胶囊给药 38 周对 db/db 自发性糖尿病小鼠降糖作用及糖尿病并发症的影响 4 研究目的: 采用国际公认的 db/db 自发性糖尿病小鼠模型, 进行糖宁通络胶囊的降糖证券代码 :002424 证券简称 : 贵州百灵公告编号 :2015-010 贵州百灵企业集团制药股份有限公司糖宁通络研发项目进展公告本公司及董事会全体成员保证信息披露的内容真实准确和完整, 没有虚假记载误导性陈述或重大遗漏风险提示 : 鉴于新药研发项目的复杂性风险性和不确定性, 糖宁通络研发项目具有周期长投入较大的情况, 研究工作各阶段均具有风险性, 公司将及时履行信息披露义务, 请投资者注意投资风险