298 第 38 卷 1 材料与方法 1.1 原料和试剂新鲜鸡肝 : 购于福建圣农集团, -18 冷冻备用.Alcalase(32.1 万 U g -1 ) Neutrase(4.5 万 U g -1 ) Protamex(10.6 万 U g -1 ) Flavourzyme(1.6 万 U g

Size: px

Start display at page:

Download "298 第 38 卷 1 材料与方法 1.1 原料和试剂新鲜鸡肝 : 购于福建圣农集团, -18 冷冻备用.Alcalase(32.1 万 U g -1 ) Neutrase(4.5 万 U g -1 ) Protamex(10.6 万 U g -1 ) Flavourzyme(1.6 万 U g"

层阅饮衡
7 years ago
Views:

1 第 38 卷第 2 期 2010 年 4 月 JournalofFuzhouUniversity(NaturalScience) Vol.38No.2 Apr.2010 文章编号 : (2010) 酶法水解鸡肝的工艺研究鞠红英, 陈建辉, 倪莉 ( 福州大学食品科学技术研究所, 福建福州 ) 摘要 : 采用 5 种蛋白酶分别对鸡肝进行水解, 以水解度为指标, 通过单因素试验, 对原料预处理方法酶解温度 ph 酶用量 (E/S) 底物浓度及酶解时间等酶解条件进行优化, 确定了 Alcalase Neutrase Protamex Fla vourzyme 以及木瓜蛋白酶水解鸡肝的工艺条件. 综合比较酶解产物的水解度氮回收率感官质量和胆固醇含量发现,Alcalase 水解能力最强, 且产物苦味较弱 ; 而 Flavourzyme 所得水解产物感官质量最好, 无苦味, 且具有较好的鲜味 ; 酶解产物中均不含胆固醇. 优选 Alcalase 用于单酶水解鸡肝, 通过正交实验优化确定其最佳水解条件为 : 温度 60,pH 值 8.0, 加酶量 1.25%, 水解时间 2.5h, 底物浓度 7.5%. 在此条件下所得酶解液水解度为 52.62%, 氮回收率为 85.32%. 关键词 : 鸡肝 ; 酶解 ; 水解度 ; 氮 ; 回收率 ; 胆固醇中图分类号 :TS251.9 文献标识码 :A Studyonenzymatichydrolysisofchickenliver JUHong-ying,CHENJian-hui,NILi (InstituteofFoodScienceandTechnology,FuzhouUniversity,Fuzhou,Fujian350108,China) Abstract:Alcalase,Neutrase,Protamex,FlavourzymeandPapainwereusedtohydrolyzechicken livertoproducehydrolysisanimalprotein(hap).takingthedegreeofhydrolysis(dh)asanindex, singlefactorexperimentwasdesignedtoscreenthehydrolysisconditions,includingpretreatment,hy drolysistemperature,ph,enzyme-substrateratio(e/s),substrateconcentrationandreactiontime. Comprehensivelyanalysisofthedegreeofhydrolysis,therecoveryofnitrogen,thesensoryqualityand thecontentofcholesterolofthehydrolysates,alcalaseshowedthestrongesthydrolysiscapacity,and thehydrolyzateshadlesbiternes,whiletheflavourzymehydrolyzateshadthebestsensoryquality withdeliciousflavorandwithoutbiternes,andnocholesterolexistedinthehydrolysates.alcalase wasselectedasthebestenzyme,andtheoptimalconditionswasdeterminedasfolows:temperature 60,pH8.0,enzymeconcentration1.25%,hydrolysistime2.5h,substrateconcentration7.5%. Undertheoptimalconditions,theDHandnitrogenrecoveryrateofAlcalasehydrolyzatescouldreach 52.62% and85.32% respectively. Keywords:chickenliver;enzymatichydrolysis;hydrolysisdegree;nitrogen;recoveryrate;cholesterol 2008 年, 中国鸡肉产量在全球排名第二, 达 1015 多万 t [1]. 鸡肝占每羽鸡体重的 2.0% ~2.5% [2], 因此, 我国每年鸡肝产量达几十万 t. 鸡肝含有丰富的蛋白质钙磷铁锌维生素 A 及 B 族维生素, 虽然在食品药用饲料方面得到一定的应用 [2-4], 但由于鸡肝腥味较重且胆固醇含量较高, 市场消费量不大, 鸡肝中有价值成分未得到充分利用. 水解蛋白是一种优质的蛋白资源, 蛋白质水解物的主要成分是氨基酸和小分子多肽等. 为了充分利用蛋白质资源, 越来越多的研究者开始对廉价的下脚料蛋白开展研究, 如动物下脚料鱼鳞鱼皮鸡骨 [5-9] 羊骨猪血等. 鸡肝中蛋白质含量占鸡肝干重的 70% ~80%, 是理想的优质蛋白质来源. 本研究采用蛋白酶水解鸡肝, 通过单因素实验和正交实验, 以水解度为指标, 优化酶解条件, 制备无胆固醇氮回收率较高且感官质量较好的鸡肝酶解产物. 收稿日期 : 通讯作者 : 倪莉 (1972-), 副教授, nili@fzu.edu.cn

2 298 第 38 卷 1 材料与方法 1.1 原料和试剂新鲜鸡肝 : 购于福建圣农集团, -18 冷冻备用.Alcalase(32.1 万 U g -1 ) Neutrase(4.5 万 U g -1 ) Protamex(10.6 万 U g -1 ) Flavourzyme(1.6 万 U g -1 ) 木瓜蛋白酶 (6.1 万 g -1 ): 由诺维信酶制剂公司提供. 其它实验试剂均为分析纯. 1.2 主要仪器设备 AG264 型电子天平 ( 瑞士 Metler 公司 );868 型 ph 计 (OrionResearch 公司 ); J-1 型电动搅拌器 ( 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 );TDL-5-A 低速离心机 ( 上海安亭科学仪器厂 );DKZ-2 恒温水浴振荡器 ( 上海精宏实验设备公司 ). 1.3 测定方法水分的测定 : 常压干燥法 [10] ; 粗蛋白 : 凯氏定氮法 [10] ; 脂肪 : 索式抽提法 [10] ; 总糖含量 : 苯酚 - 硫酸法 [10] ; 灰分 : 高温灼烧灰化法 [10] ; 胆固醇含量 : 比色法 [11] ; 氨基态氮 : 甲醛电位滴定法 [12]. 1.4 酶解工艺的研究方法酶解工艺流程水解度 (DH,%)=( 上清液中氨基态氮质量 / 样品中总氮质量 ) 100 氮回收率 (NR,% )=( 上清液中氮含量 / 原料中总氮含量 ) 100 酶解工艺流程为 : 鸡肝搅碎成泥稀释预处理调 ph 值加酶恒温酶解灭酶离心分离过滤蛋白质水解液预处理条件优化底物浓度为 5%( 质量百分比 ) 的鸡肝液分别在不同温度下水浴加热 20min. 冷却后, 分别加入 Fla vourzyme( 酶解条件 : 温度 50,pH6.5, 加酶量为 2%( 质量百分比 ), 时间 4h) 和 Alcalase( 酶解条件 : 温度 60,pH8.5, 加酶量为 1.25%( 质量百分比 ), 时间 2h) 单因素实验设计 1) 温度的选择. 设定鸡肝底物浓度为 5%, 反应时的 ph 为鸡肝自然 ph 值 ( 约 ph6.5), 加酶量为 0.75%,5 种蛋白酶分别在各自最适温度范围内酶解鸡肝 2h, 确定各酶的最适反应温度. 2) 反应 ph 的选择. 设定鸡肝底物浓度为 5%, 加酶量为 0.75%, 调节反应体系 ph 值, 各酶在最适温度下酶解鸡肝 2h, 分别确定各酶的最适反应 ph. 3) 加酶量的选择. 设定鸡肝底物浓度为 5%, 选取各酶的最适反应温度和最适反应 ph, 分别添加不同加酶量 ( 酶质量 / 底物干重,%), 酶解鸡肝 2h, 分别确定各酶的最适加酶量. 4) 底物浓度的选择. 将鸡肝稀释至不同浓度, 选取各酶最适温度 ph 以及加酶量, 酶解鸡肝 2h, 确定最适底物浓度. 5) 酶解时间的选择. 选取各酶最适温度 ph 加酶量以及底物浓度, 对鸡肝酶解不同时间, 确定各酶的最佳酶解时间不同蛋白酶对鸡肝酶解效果的比较在各酶单因素实验优化条件下制备鸡肝酶解产物, 以酶解产物的水解度氮回收率感官质量和胆固醇含量为指标, 比较 5 种蛋白酶的酶解效果正交试验优化单酶水解工艺条件综合考虑水解能力及感官质量, 选取 Alcalase 对鸡肝进行单酶水解实验. 以水解度为指标, 在单因素实验的基础上, 采用 L 25 (5 6 ) 正交设计确定 Alcalase 的最佳反应条件. 2 结果与讨论 2.1 鸡肝主要营养成分分析鸡肝中含有较高的蛋白质等营养成分, 且原料丰富价格低廉, 是一种不可多得的优质蛋白质资源

3 第 2 期鞠红英, 等 : 酶法水解鸡肝的工艺研究 299 ( 表 1). 但鸡肝中胆固醇含量较高, 限制其广泛应用. 利用酶技术水解鸡肝, 制备的水解蛋白可充分利用鸡肝中的优质蛋白质资源. 表 1 鸡肝成分分析 Tab.1 Compositionanalysisofchickenliver 成分 100g 原料中的含量 /g 在干基中的含量 /% 水分 78.73± 蛋白质 15.86± 脂肪 3.82± 灰分 0.65± 总糖 0.87± 胆固醇 ± 图 1 预处理温度对水解度的影响 Fig.1 Efectsofpretreatmenttemperature onthedegreeofhydrolysis 2.2 预处理温度的确定由图 1 可知, 预处理温度在 50~80 时, 随温度的上升, 水解度急剧下降,80~100 时, 水解度下降趋于平缓. 这是由于受热后, 鸡肝中内源酶失活, 且蛋白质变性而凝集聚合成团, 不利于底物蛋白质分子与酶的接触, 水解度随之降低. 故鸡肝酶解工艺不需要经过预热处理工序. 2.3 单因素实验优化各蛋白酶酶解条件酶解温度的确定水解度随着温度的上升均呈现先上升后下降的趋势 ( 图 2).Alcalase 的最适温度在 60 附近 ; Neutrase 和木瓜蛋白酶的最适温度均在 55 附近 ;Protamex 和 Flavourzyme 的最适温度均在 50 附近反应 ph 值的确定由图 3 可知, 水解度随 ph 的上升均呈现先上升后下降的趋势.Alcalase 最适 ph 值为 8.5;Neu trase 最适 ph 值为 7.0;Protamex 最适 ph 值为 7.5;Flavourzyme 最适 ph 值为 6.0; 木瓜蛋白酶的最适 ph 值为 5.5. 图 2 水解温度对水解度的影响 Fig.2 Efectsoftemperatureondegreeofhydrolysis 图 3 ph 值对水解度的影响 Fig.3 EfectsofpHondegreeofhydrolysis 加酶量的确定由图 4 可知, 当 Alcalase Neutrase Protamex Flavourzyme 和木瓜蛋白酶的加酶量分别达到 1.25% 1.25% 2.0% 4.0% 和 2.25% 时, 继续增加加酶量, 水解效果几乎不变, 考虑到生产成本, 故选取此时的加酶量为各酶的最适加酶量底物浓度的确定由图 5 可知, 底物浓度高于 5% 时, 水解度均随底物浓度的提高而下降, 而底物浓度低于 5% 时, 继续加水稀释, 水解度变化不明显, 故底物浓度定为 5% 左右时较适宜.

4 300 第 38 卷图 4 加酶量对水解度的影响 Fig.4 Efectsofenzymedosageondegreeofhydrolysis 图 5 底物浓度对水解度的影响 Fig.5 Efectsofsubstrateconcentrationondegreeofhydrolysis 酶解时间的确定从图 6 可知, 当反应进行一定时间时, 继续提高酶解时间, 水解度趋于平缓. 考虑水解时间太短, 达不到最佳水解效果, 而水解时间太长, 会增加能源消耗, 且可能给产品带来微生物污染问题, 影响产品品质, 故选取水解度开始趋于平缓时的时间点为最佳酶解时间. 则 Alcalase Neutrase Protamex Flavourzyme 和木瓜蛋白酶的最佳酶解时间分别为和 3h. 2.4 比较不同蛋白酶的水解效果图 6 水解时间对水解度的影响 Alcalase 水解能力最强 ( 表 2), 其酶解产物水解度 Fig.6 Efectsoftimeondegreeofhydrolysis 和氮回收率最高,Flavourzyme 所得的酶解产物感官质量最好, 其次是 Protamex 和 Alcalase, 而木瓜蛋白酶和 Neutrase 酶解产物感官质量最差, 综合考虑 5 种蛋白酶的水解能力以及水解液的感官质量, 从中选取 Alcalase 用于单酶水解鸡肝. 经检测,5 种蛋白酶酶解产物均不含胆固醇. 较现有的鸡肝制品加工工艺, 利用鸡肝酶解制备动物水解蛋白, 不仅得到附加值更高的产品, 且解决了鸡肝因胆固醇含量高而应用受限的问题, 无胆固醇产品品质更高, 应用范围更广. 表 2 不同蛋白酶水解效果的比较 Tab.2 Compariononhydrolysisefectsamongdiferentproteases 蛋白酶 DH/% NR/% 感官结果 Alcalase 48.52± ±0.52 鲜味较重微苦 Neutrase 35.63± ±0.55 淡鲜味很苦 Protamex 42.82± ±0.45 淡鲜味微苦 Flavourzyme 41.09± ±0.78 鲜味较好无苦味木瓜蛋白酶 42.47± ±0.59 鲜味较重较苦 2.5 正交试验优化 Alcalase 的水解工艺条件 Alcalase 单酶水解鸡肝的正交试验方案及试验结果见表 3. 方差分析结果见表 4. 从表 3 中极差 R 值可知, 各因素对水解效果的影响从大到小依次为 :A>B>D>C>E, 即 : 温度 > ph> 时间 > 加酶量 > 底物浓度. 由表 4 方差分析可知, 温度和 ph 对水解度影响高度显著, 水解时间影响显著, 而加酶量和底物浓度影响均不显著. 考虑到反应 2.5h, 加酶量为 1.25% 时, 水解度已趋于平缓, 因此确定 Alcalase 的最佳工艺条件为 : 温度 60,pH 值 8.0, 加酶量为 1.25%, 水解时间 2.5h, 底物浓度 7.5%. 在此条件下, 重复实验 3 次, 测得酶解液水解度平均值为 52.62%, 氮回收率为 85.32%.

5 第 2 期鞠红英, 等 : 酶法水解鸡肝的工艺研究 301 表 3 Alcalase 正交设计方案及实验结果 Tab.3 TheorthogonaldesignandexperimentalresultsofAlcalase 试验号 A B C D E θ 水解 / ph (E/S)/% t/h w 底物 /% 空列 DH /% 1 1(50) 1(7.0) 1(0.75) 1(1.5) 1(2.5) (7.5) 2(1.0) 2(2.0) 2(5.0) (8.0) 3(1.25) 3(2.5) 3(7.5) (8.5) 4(1.5) 4(3.0) 4(10.0) (9.0) 5(1.75) 5(3.5) 5(12.5) (55) (60) (65) (70) K K K K K R 表 4 方差分析表 Tab.4 Analysisofvariance 方差来源偏差平方和自由度 f 均方和 S F 值显著性 A B C D E Δ 误差 e e Δ 总和注 :F 0.05 (4,8)=3.84,F 0.01 (4,8)=7.01

6 302 第 38 卷 3 结语 1) 鸡肝酶解不需要经过预热处理工序, 单因素实验优化得到 5 种蛋白酶水解鸡肝的工艺条件分别为 : Alcalase: 温度 60,pH8.5, 加酶量 1.25%, 底物浓度 5%, 时间 2.5h;Neutrase: 温度 55,pH7.0, 加酶量 1.25%, 底物浓度 5%, 时间 3h;Protamex: 温度 50,pH7.5, 加酶量 2.0%, 底物浓度 5%, 时间 3.5h;Flavourzyme: 温度 50,pH6.0, 加酶量 4.0%, 底物浓度 5%, 时间 5h; 木瓜蛋白酶 : 温度 55, ph5.5, 加酶量 2.25%, 底物浓度 5%, 时间 3h. 2)5 种蛋白酶中,Alcalase 水解能力最强, 其产物水解度达 48.52%, 氮回收率达 84.13%, 且酶解产物具有较强鲜味, 苦味较弱 ;Flavourzyme 水解产物感官质量最好, 具较好的鲜味, 无苦味 ;5 种酶解产物均不含胆固醇, 该发现提高了鸡肝酶解产物的利用价值. 确定 Alcalase 用于单酶水解鸡肝. 3) 以水解度为指标, 正交实验优化得到 Alcalase 的最佳水解条件为 : 温度 60,pH 值 8.0, 加酶量为 1.25%, 水解时间 2.5h, 底物浓度 7.5%. 在此条件下水解, 水解度达 52.62%, 氮回收率达 85.32%. 参考文献 : [1] 周蛟. 禽病防控的出路与思考 [J]. 现代畜牧兽医,2009(2):11. [2] 陈冠如. 鸡肝也美味被忽视的价廉营养食品 [J]. 中国禽业导刊,2006,23(11):33. [3] 严英. 动物肝的营养保健作用 [J]. 药膳食疗,2004(6):18. [4] 杨振才, 牛草娟, 孙儒泳. 鸡肝脏和配合饲料对稚鳖生长的影响 [J]. 水利渔业,2000,20(4): [5] 刘艳, 刘章武. 酶解淡水鱼鳞制备水解胶原蛋白的研究 [J]. 武汉工业学院学报,2009,28(2): [6] 王海英, 宋永相, 孙谧. 酶解鳕鱼皮制备血管紧张素转换酶抑制剂 ACEI 的研究 [J]. 现代食品科技,2008,24(10): [7] 杨铭铎, 龙志芳. 鸡骨泥的酶解工艺及其酶解液中游离氨基酸和脂肪酸分析的研究 [J]. 食品科学,2008,29(5): [8] 杨华, 刘玉花, 马俪珍, 等. 羊骨蛋白酶解物免疫活性及酶解条件的研究 [J]. 中国农业科学,2008,41(10): [9] 董清平, 方俊, 蒋红梅, 等. 猪血红蛋白的酶解及氨基酸含量的研究 [J]. 现代生物医学进展,2008,8(7): [10] 许安邦, 林维宣. 食品分析 [M]. 北京 : 中国轻工业出版社,1994. [11] 马建明, 龚文杰, 邬晨阳, 等. 直接皂化硫酸铁铵比色法快速测定鸡蛋中胆固醇 [J]. 中国卫生检验杂志,2001,11 (3):378. [12]Adler-NisenJ.Enzymatichydrolysisoffoodproteins[M].London:ElsevierAppliedSciencePublishers,1986. ( 责任编辑 : 杨青 )

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

298 第 38 卷 1 材料与方法 1.1 原料和试剂 新鲜鸡肝 : 购于福建圣农集团, -18 冷冻备用.Alcalase(32.1 万 U g -1 ) Neutrase(4.5 万 U g -1 ) Protamex(10.6 万 U g -1 ) Flavourzyme(1.6 万 U g

298 第 38 卷 1 材料与方法 1.1 原料和试剂新鲜鸡肝 : 购于福建圣农集团, -18 冷冻备用.Alcalase(32.1 万 U g -1 ) Neutrase(4.5 万 U g -1 ) Protamex(10.6 万 U g -1 ) Flavourzyme(1.6 万 U g