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李仰
7 years ago
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1 ( 裝釘線 ) 封面格式公務出國報告 ( 出國類別 : 考察 ) ( 學習性病相關分子生物檢驗技術之出國報告 ) 服務機關 : 臺北市立性病防治所出國人職稱 : 檢驗組主任姓名 : 張安隆出國地區 : 美國亞特蘭大 (CDC) 出國期間 : ~ 報告日期 :

2 學習性病相關分子生物檢驗技術之出國報告目次一前言... 4 二過程... 5 三心得... 7 四建議... 8 五相片六附件 14

3 研習性病相關分子生物檢驗技術之出國報告一前言經過二次轉機, 於十月三日經過十四小時的飛行, 於當地時間上午八時抵達美國喬治亞州, 亞特蘭大市 CDC 幾乎可說全球無論現有疾病或新興疾病如 SARS 碳疽桿菌等的研究重鎮, 其研究單位分布在全美國境內或是全球其他位置, 這次前來學習檢驗新技術是在它位於亞特蘭大 (Atlanta) 的總部 1600 Clifton Rd. Atlanta,GA30333, 希望將這次的學習經驗帶回台灣讓台灣的檢驗技術能跟上美國的水準愛滋病毒的檢驗及治療, 台灣已經是屬於世界級的, 但是其他性病相關的檢驗並沒有顯著的進步, 依然還是使用傳統方法來診斷, 近年來分子生物技術可說是突飛猛進 His,Liu( 劉曦 ), 他來自台灣的年輕博士, 將會是這次我來 CDC 學習性病分子檢驗技術的主要指導者, 當然還有其他的人員共同協助, 梅毒單純皰疹軟性下甘會是此次的重點自從 911 事件美國受到恐怖份子攻擊後, 美國政府對於重要的場所都加強其安全管制,CDC 也不例外, 對於所有進出的人員除加強核對身分外, 大門除加上路障同時也增加警力駐守, 主要是為了確保機關及人員的任務能正常繼續運作二過程 PCR 可以分為傳統法利用分子量不同, 將檢體之 DNA 或 RNA 萃取後加入 Primer 及 Proble, 經過熱循環放大 DNA 或 RNA 後由 (1) 電泳 (gel electrophoresis) 讓分子量因重量不同分別在膠片上沉澱, 進而使用特殊螢光

4 染料將要偵測的基因染上, 利用紫外線照相後即可得到結果,(2) 基因掃描設備 (GeneScan), 將放大複製後的結果呈現在圖普上, 這種方式使用時間較長, 但卻是目前最標準的分子生物檢測方式, 另外就是使用即時 PCR(Real-time-PCR), 它利用自動化設備將要檢測的基因快速放大, 在全自動的設備內同時進行放大及偵測, 定性及定量都可利用同一套設備進行 ( 附件一 ), 好處就是整個過程時間很短, 傳統的方法大約需要 5 小時才能得到結果, 但是利用 Real-time PCR 在短短的約 90 分鐘就可以得到檢測結果由於利用 PCR 來偵測無論是 DNA 或是 RNA 最怕的就是偽陽性及偽陰性的結果產生, 要如何正確的使用 PCR 檢測 DNA 或 RNA 而不造成判讀困難, 這是操作 PCR 人員的一大挑戰四月份台北才遭受 SARS 侵襲, 讓台北造成重大傷亡,CDC 因此特別成立一實驗在專門尋找如何快速且正確的診斷 SARS, 雖然這次來 CDC 目的是學習性病相關的分子生物技術, 但在劉博士的特別安排下有幸參觀 SARS 實驗室, 在這裡萃取 SARS 的 DNA 或 RNA 利用兩種全自動設備, 一為 QIagen 的 Bio Robot 系統, 它可以在 1.5 小時同時萃取 96 之檢體, 無論是血液體液鼻腔沖洗液糞便等, 另一種是使用 NASBA 的 Nuclisens 萃取系統 ( 附件二 ), 由於它每次能萃取的檢體較少 (10 隻檢體 ), 但是這兩套系統都能快速將檢體內的 DNA 或 RNA 萃取出來,Dr.Dean 計劃主持人特別利用 SRAS 病毒的三個基因來製造 primer, 主要就是希望能正確且快速的診斷出 SARS 病毒, 由於檢測 SARS 是一高度危險的試驗, 因此我只能看過程而無法親自操作, 這是唯一的遺憾, 但計劃主持人很熱心的將 SARS 檢測結果及操作流程影印一份供我參考 ( 附件三 ) 由於在這裡學習的時間有限 Dr. Liu 介紹梅毒及披衣菌 PCR 的試驗, 利用傳統方法做梅毒 PCR 及 Real-Time PCR 做披衣菌試驗由於 CDC 是一

5 個以研究為主的單位, 因此 Primer 及 Proble 都是由計劃研究人員自行設計及製作, 梅毒及披衣菌都是由 Dr.Liu 所設計的而 DNA 或 RNA 的萃取方法都是利用現有上市的試劑來萃取, 步驟如下 : Blood and Body Fluid Spin Protocol(QIAanp DNA Kit)( 附件四 ) 1. Pipet 200ul sample to microcentrifuge tube. 2. Add 20ul QIAGEN protease to microcentrifuge. 3. Add 200ul AL buffer and mix after vortex 15 sec. 4. Incubate at 56 for 10 min. 5. Add 200ul ethanol(100 %) into microcentrifuge tube,and vortex 15 sec. 6. Centrifuge 6000 x g 1 min. 7. Do stap times. 8. After stap 7. add 500ul AW1 buffer,centrifuge 6000 x g 1min. 9. Add 500ul AW2 buffer. 10. Put in spin colume and add 200ul buffer AE. 11. Centrifuge 6000 x g for 1 min. 以上步驟所收集的 DNA 或 RNA 就可以放在熱循環器內 (Thermocycles) 放大複製, 總共做 45 週次的循環, 做完放大所收集的 DNA 或 RNA 利用電泳來跑膠片 (gel electrophoresis), 最後經由螢光染色後就可在紫外線下出現結果, 我也親自製作一片梅毒檢體檢驗的膠片 ( 附件照片 ) 以上步驟萃取並放大複製後的 DNA 或 RNA, 也可經由 Geng Scan 全自動設備來偵測定性或定量的結果 ( 附件結果 ) 以分子生物檢驗步驟中最重要的就是如何設計一個適合且正確的 Primer 及利用何種 Proble 來偵測, 這些對一個研究單位是最重要的, 如果

6 設計錯誤那萃取的 DNA 或 RNA 就無法被檢測出來, 至於要如何設計一個好的 Primer 及 Proble, 就是要了解設計原理 : Principles for Designing Primers: 1. Good clamps at the end 2 or 3 G s or C s. 2. Tm(melting temperature) calculation: 4 for every G and C. 2 for every A or T. Would like to be around 68 to 72. Ratio of G&C to A&T=2:1 3. Watch out for hairpins. e.g. GCGATAGTCGATATGCGA 4. When sequencing an entire genome make primers between 300 to 400 bps apart to make sure that there is an overlap of each sequence. 5. To make reverse primers, must pick the region then reverse and complenent the primer sequence. 以上設計原理清楚了解後, 要製造任何疾病檢驗的 Primer 都可以勝任由於分子生物檢驗技術最怕的就是污染, 在實驗室內要如何避免污染也是一種重要的因素, 就算操作技術再好或再純熟, 一但操作環境被污染那所做的檢驗都將會是網然的, 因此對於實驗室操作環境保持, 在 CDC 是十分重要的, 在研習過程中發現 CDC 與台灣對於實驗室環境還是有很大的差異手套隨時更新, 有時還需使用雙層, 一經可能碰觸污染物立即更換, 實驗桌上都保有二瓶消毒用液體, 酒精及次祿酸納都隨手可及, 實驗用的設備如微量吸管生物操作檯吸管尖頭及冷凍冰櫃都是各自獨立, 互相不混著使用, 這些經驗都可讓台灣的實驗室作為參考

7 十月九日上午參加一場 CDC 部門研討會, 由 Dr.Daive 部門主任親自主持, 由他說明梅毒得過去現在及未來, 在一小時的演講中讓我受益頗多, 我當場請他將講義內容影印給我, 讓我帶回台灣 ( 附件五 ) 時間真快離回台的時間越來越近, 發現 STD 要學習的東西真多, 不是二星期可以學完的因此特別請教 Dr.Liu, 如果臺北市立性病防治所也想要進行 PCR 研究及診斷是否能給予協助,Dr.Liu 也很快的答應, 如有需要他可以來台灣幫助性病防治所一起建立 PCR 診斷實驗室, 甚至於我們也可將有疑問的檢體寄來 CDC 給他, 他會幫助我們診斷在結束 CDC 的研習的前一日參觀了 CDC 號稱對付生物戰劑的實驗室, 多套自動且移動式 Real-time PCR 及 BBL-3(P3 級 ) 實驗室, 自從恐怖主義在美國進行自殺式攻擊及生物戰劑攻擊, 如同 SARS 一樣快速的建立新的實驗室三心得無論是在性病方面或是新興疾病的診斷及研究, 都必須投入大量人力及金費, 就以 CDC 為例能在全球各地發生 SARS 疫情後的四個月就發展出診斷試劑, 另外已知的疾病也一直不斷的在進行研究臺北市立性病防治所有機會改為疾病管制院, 雖然功能不能像 CDC 一樣, 但是對於傳染病如梅毒愛滋病毒淋病等都需要做進一步的研究, 以了解台灣的菌珠或病毒珠, 以目前性防所在做的除愛滋病毒有較多的探討外其餘都僅止於篩檢工作, 還有很多的檢驗都無法進行, 因此要成為疾病管制院還有很大的改善及進步的空間, 除了人員在學識上要進步外, 最重要的就是財政上的支援, 分子生物的儀器設備都十分昂貴, 另外與國外先進實驗室相互合作也十分重要的四建議臺北市立性病防治所為全國唯一的性病防治機構, 對於性病檢驗屬初

8 步篩檢而已分子生物科技將會是許多重要產業的主軸, 往後醫學應用分子生物科術無論在診斷治療等將會佔有越來越重要的地位性病防治所除對性病傳統檢驗外, 也應該朝向生物科技檢驗或研究來邁進, 利用分子生物技術來診斷性病, 對於目前有些診斷不易或容易引發糾紛的性病可以正確且迅速的作診斷, 利用全自動的設備也可減少人為的錯誤, 同時對於性傳染病的調查研究也可經由分子生物檢驗取的正確的檢驗結果, 對於報告的可靠性大大增加

9 CDC 指導老師 : 來自台灣的年輕博士 His,Liu 全自動基因定序設備

10 Gen Scan gel electrophoresis

11 Real-Time PCR 前者 :Dr. Liu 後者 : 來自大陸的科學家孫博士全自動基因定序儀儀

12 CDC 會議廳 CDC 大門

Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, MERS-CoV WHO Qatar 2013 MERS MERS 耗費巨大的社會成本 MERS V

54 2015 1 505 新興的中東呼吸症候群冠狀病毒 Those who cannot remember the past are condemned to repeat it. 忘記過去的人, 注定要重蹈覆轍 2012 4 Zarqa 13 2 2012 9 WHO Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, MERS 11 MERS 9 2