厦门大学学位论文原创性声明兹呈交的学位论文, 是本人在导师指导下独立完成的研究成果本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果, 均在文中以明确方式标明本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任声明人 ( 签名 ): 2006 年月日

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1 学校编码 :10384 分类号密级学号 : UDC 厦门大学硕士学位论文 60 Co-γ 诱变坛紫菜的海区栽培选育及品质性状分析与利用 RAPD 对减数分裂发生时期初步探索 Radiation selection and breeding by 60 Co-γ induced Porphyra haitanesis and analysis on its characters and preliminary exploration on its position of meiosis with RAPD 黄秋指导教师姓名 : 陈奕欣教授专业名称 : 动物学论文提交日期 :2006 年 09 月 30 日论文答辩时间 :2006 年 11 月 04 日学位授予日期 :2006 年月日答辩委员会主席 : 黄邦钦教授评阅人 : 齐雨藻教授王广策教授 2006 年月

2 厦门大学学位论文原创性声明兹呈交的学位论文, 是本人在导师指导下独立完成的研究成果本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果, 均在文中以明确方式标明本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任声明人 ( 签名 ): 2006 年月日

3 厦门大学学位论文著作权使用声明本人完全了解厦门大学有关保留使用学位论文的规定厦门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版, 有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅, 有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索, 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在解密后适用本规定本学位论文属于 1 保密 ( ), 在年解密后适用本授权书 2 不保密 ( ) ( 请在以上相应括号内打 ) 作者签名 : 日期 : 年月日导师签名 : 日期 : 年月日

4 目录目录中文摘要...1 Abstract...2 一前言坛紫菜分类地位与分布及其经济价值紫菜的生活史坛紫菜的品质性状光合色素蛋白质藻体厚度坛紫菜在生产中所存在的问题及解决的思路坛紫菜在栽培中所存在的问题解决思路随机扩增多态 DNA RAPD 技术在生物学研究中的应用 RAPD 技术在紫菜研究中的应用课题的研究目的及意义...13 二材料与方法实验材料实验仪器常用试剂实验方法突变体的获得突变体的海上栽培坛紫菜经济性状的测定室内贝壳丝状体采苗和催熟坛紫菜基因组 DNA 的提取基因组 DNA 的 RAPD 扩增...24 三结果与分析...26 I

5 目录 1 第一年 (2004 a) 海区栽培实验的突变株系品质性状的分析藻体厚度及生长速度曲线蛋白质和光合色素的含量突变株系叶状体的活体吸收光谱特征小结第二年 (2005 a) 海区栽培实验的突变株系品质性状的分析藻体厚度及生长速度蛋白质和光合色素的含量蛋白质光合色素含量之间的相关性分析突变株系叶状体的活体吸收光谱特征小结减数分裂发生时期的初步探索实验室内贝壳丝状体的采苗和催熟坛紫菜基因组 DNA 提取结果 RAPD 扩增结果遗传相似系数与聚类图谱小结...40 四讨论坛紫菜突变体的生长情况和品质性状的分析与比较坛紫菜突变株系的生长情况坛紫菜突变株系的蛋白质性状分析坛紫菜突变株系光合色素性状的分析坛紫菜突变株系在育种上的应用坛紫菜生活史中减数分裂发生时期的初步探索贝壳丝状体的实验室内发育诱导实验坛紫菜丝状体 DNA 提取 RAPD 扩增结果...46 五结论与展望...47 参考文献...48 II

6 目录 Content Abstract (in Chinese)...1 Abstract...2 I Preface The systematic status, geographical distribution and the economic values of P. haitanensis Life history of Porphyra Quality characters of P. haitanensis Photosynthetic pigment Protein The thickness of thallus Problem existing and settlement in planting Problem existing in planting of P. haitanensis Methods solved Random Amplified Polymorphic DNA Application of RAPD in biology Application of RAPD in the research on Porphyra The aim and significance of this research...13 II Materials and methods Materials Experiment instruments Common reagent Methods The acquisition of mutants Cluture of mutants in sea area Mensuration of economic characters on P. haitanensis The rippen experiment of conchocelises in lab conditions The extraction of genomic DNA from P. haitanensis...22 III

7 目录 4.6 RAPD amplication...24 III Results and analysis The analysis on quality characters of P. haitanensis in The thickness and growing curves Contents of protein and photosynthetic pigment Characteristic of in vivo absorption spectrum Brief summary The analysis on quality characters of P. haitanensis in The thickness and growth speed Contents of protein and photosynthetic pigment Corralation analysis of protein and pigmentation Characteristic of in vivo absorption spectrum Brief summary Preliminary exploration on the phase of occurrence of meiosis in P. haitanensis The artificial rippen experiment of conchocelises in lab conditions The results of extraction of genomic DNA from conchocelises The results of RAPD Genetic similarity coefficient and dendrogram Brief summary...40 IV Discussion Analysis and comparation on the growth and quality characters of mutants The growth of mutants Analysis on trait of protein in mutants Analysis on trait of photosynthetic pigment in mutants Application of mutants in breeding Preliminary study on the phase of meiosis in life history of P. haitanensis The artificial rippen experiment of conchocelises in lab conditions...44 IV

8 目录 2.2 Extraction of genomic DNA from conchocelises The results of RAPD...46 V Conclusion and expectation...47 Reference...48 V

9 中文摘要中文摘要紫菜是我国最重要的经济海藻之一, 年产值居各经济海藻之首目前紫菜资源开发应用中, 关键问题之一是种质问题, 并且最终目的是选育出优良品系应用于生产上 1. 本文对经不同剂量 60 Co-γ 辐射诱变的福建平潭县野生坛紫菜的第二代和第三代进行海区栽培试验, 对其生长速度藻体厚度及蛋白质叶绿素藻胆蛋白含量等品质性状进行定量分析两年的海区实验结果表明, 经过诱变后, 不同株系各项主要指标都发生了变化其中 NO.9 的藻体厚度有较大的改善, 与养殖品种差异显著, 在各突变样品中也是最薄的, 而且比较稳定 ; 生长速度快的是 NO.1 NO.2 和 NO.12; 蛋白质含量高的 NO.1 NO.2 和 NO.9; 藻胆蛋白高的是 NO.1 和 NO.2 2. 本实验以纯化培养的平潭野生坛紫菜纯合株系和杂合株系的不同发育阶段 ( 自由丝状体, 膨大藻丝, 壳孢子囊枝和叶状体 )8 种不同坛紫菜基因组 DNA 为材料, 进行 RAPD 扩增, 利用扩增条带数目倍性关系判断杂合株系不同时期样品的倍性从而推断减数分裂发生时期实验结果表明, 自由丝状体膨大藻丝壳孢子囊枝所处的发育时期还都是二倍体时期, 此期间没有发生减数分裂, 排除了这些时期发生减数分裂的可能性, 可以初步判断减数分裂发生应该是在壳孢子到叶状体之间的壳孢子的萌发的时期, 其萌发时进行的最初两次细胞分裂是减数分裂关键词 : 60 Co-γ 射线 ; 坛紫菜诱变 ; 减数分裂 1

10 Abstract Abstract Porphyra, one of the most important economic algae, is abundant in China. Now, one of the key factors in exploitation of Porphyra haitanensis resource is germplasm, and the final purpose is to gain excellent breeds and strains for application in culture. 1. In this thesis, 60 Co-γ ray was used to induce mutation on protoplast of wild P. haitanensis in Pingtan County and the induced protoplast was cultivated and selected.then the characters of samples cultivated in lab conditions were analyzed for initial screening out. The second and third generations of selected samples were cultured in the sea in PingTan County till samples were collected. The samples were analyzed in growth speed, the thickness of thallus and the content of phycobiliprotein, total protein and chlorophyll. The results of the sea area cultivation experiment showed that the major characters in the mutated samples were different. Totally, the thickness of thallus NO.9 had a biggish improvement,it was thinnest and the trait was comparatively stable;no.1, NO.2 and NO.12 were growing faster;no.1, NO.2 and NO.9 had higher content of total protein;no.1 and NO.2 had higher content of phycobiliprotein. 2. In this experiment, homozygous line was established in wild P. haitanensis in PingTan County and heterozygous line was established by cultivating GL1 together with Wt1. Eight kinds of different genomic DNA of homozygous line and heterozygous line samples from different phases (free-living conchocelises phase, sporangium branches phase, conchosporangial branches phase and thallus phase) were used for RAPD (random amplified polymorphic DNA). Then percentage of polymorphic markers was applied to examine whether different developing phases of heterozygous line samples was haploidy or diploidy.the result showed that, free-living conchocelises, sporangium branches and conchosporangial branches were diploidy, so meiosis didn t happen among these phases, excluding the possibility of meiosis occurrence in these periods, preliminary conclusion was that meiosis could happen in the period of conchospores germination between conchospores phase and 2

11 Abstract thallus phase. Thus, it indirectly indicated that the meiosis of P. haitanensis occured during the first two cell divisions of the germinating conchospore. Key words : 60 Co-γ-ray;Porphyra haitanesis mutation;meiosis 3

12 前言一前言 1 坛紫菜分类地位与分布及其经济价值坛紫菜 (Porphyra haitanensis Chang et Zheng) 属红藻门 (Rhodophyta) 红藻纲 (Rhodophyceae) 红毛菜亚纲 (Bangiophycidae) 红毛菜目 (Bangiales) 红毛菜科 (Bangiacea) 紫菜属红毛菜亚纲总共包含 7 科 24 属 [1] 据不完全统计, 现在世界上紫菜属约有一百三十多种, 中国有十九种在日本韩国和中国栽培利用的主要种类为坛紫菜和条斑紫菜 (P. yezoensis) 在我国, 条斑紫菜主要在辽宁山东等北方省份栽培坛紫菜主要在福建和浙江沿海栽培, 并盛产于福建的平潭莆田惠安等县野生坛紫菜多生长在风浪大的潮间带的岩礁上栽培坛紫菜的海区的底质应为沙质, 滩面平坦, 比降小紫菜是目前世界上人工栽培经济价值最高的一种栽培海藻, 其全世界的总产值近 20 亿美元, 约占人工养殖海藻的 2/3 紫菜含有丰富的蛋白质 ( 食用干紫菜的蛋白质含量约为 40%) 丰富的维生素矿物质和许多具有特殊功效的生物活性物质, 其食用和药用价值很高, 在食品工业精细化工化妆品工业免疫荧光技术抗肿瘤药物开发和医疗保健药物开发具有很重要的应用前景 [2] 其中, 藻胆蛋白中含有丰富的人体必需氨基酸近年来的研究显示紫菜多糖具有多种生 [3] 物活性, 具有增强免疫功能抗衰老抗凝血降血脂抑制血栓形成等作用 -[6] 此外, 紫菜富含多糖琼胶岩藻多糖琼脂糖与硫琼糖及琼脂可作为工业原料加以利用因此具有重要的经济价值 2 紫菜的生活史英国藻类学家 Drew 在 1949 年首次证明脐形紫菜 (P. umbilicalis) 果孢子萌发的结果并非成为紫菜的叶状体, 而是成为一种微小丝状的很少人注意到的生长在软体动物贝壳里的壳斑藻, 即通常所说的丝状体 [7] Magne 研究指出, 有几种紫菜的果孢子是 2 倍体, 其萌发的丝状体 (Conchocelis) 阶段也是 2 倍体时期 [1] 德国 Esser 的隐花植物学依据 Dixon 的 1970 年的文献评论都认为紫菜生活史中减数分裂是在壳孢子产生时发生 [8] 紫菜的生活史中, 减数分裂是丝状体 ( 壳斑藻 Conchocelis) 在产生壳孢子 ( 即静孢子 ) 时发生, 壳孢子 (n) 萌发后产生的叶状体为单倍体 (n), 即配子体而合子经有丝分裂产生的果孢子 (2n), 萌发后 4

13 前言产生的丝状体为双倍体 (2n), 即孢子体 [1][8][9][10] 1982 年, 曾呈奎与孙爱淑报道,6 种中国分布的紫菜 ( 不包括坛紫菜 ) 的细胞分裂和核相研究, 叶状体营养细胞分裂产生不动精子和产生果孢子的分裂以及果孢子萌发时的分裂都是有丝分裂, 该 6 种紫菜的叶状体营养细胞和不动精子分裂中期的染色体数目为 3 或 5, 而果孢子和其萌发体 ( 丝状体 ) 分裂中期的染色体数目为 6 或 10; 因此, 虽然尚未直接观察到减数分裂, 但根据以上染色体数目双相与单相变化的事实, 可以认为在丝状体产生壳孢子时发生减数分裂 [9] 坛紫菜的分布的地理位置, 生长最适水温等与其它紫菜不同, 坛紫菜生活史与其它紫菜也有所不同坛紫菜的生活史属于异型世代交替, 生活史中只有有性生殖而无无性生殖, 而条斑紫菜有性生殖和无性生殖同时存在坛紫菜的生活史由叶状体和丝状体两个阶段组成, 坛紫菜叶状体发育成熟后, 其边缘的营养细胞转化为雌雄生殖细胞, 雌性生殖细胞称果胞, 为鲜红色雄性生殖细胞称为精子囊, 为淡黄色或灰白色果胞受精之后, 分裂成一定数量的果孢子, 此时果孢子为球形, 一般 10~13 μm, 具有星状或弥散状色素体, 无细胞壁而能做变形运动, 具有溶解碳酸钙的特殊能力果孢子散落到贝壳上后, 钻入贝壳便纵横生长, 形成丝状体根据丝状体的生长发育情况, 从形态上大体可分为 : 丝状藻丝膨大藻丝形成壳孢子囊枝形成壳孢子放散四个不同时期 [11] 条斑紫菜除了具有与坛紫菜相同的有性生殖以外, 还可以放散出单孢子, 直接萌发成紫菜叶状体关于坛紫菜幼苗能否形成单孢子一直是多年来悬而未决的理论问题王素娟 [12] 对这一问题进行了反复多方面的研究, 特别是对于幼苗释放细胞的条件, 细胞的发育分化趋势及超微结构作了重点研究, 并将研究结果与真正放散单孢子的条斑紫菜作了比较, 实验结果证明坛紫菜生活史中不产生单孢子梅俊学等究中报道坛紫菜不能释放单孢子但是, 李勇斌等 [14] [13] 也在其研在 MNNG(N- 甲基 -N- 硝基 -N- 亚硝基胍 ) 诱变坛紫菜原生质体处理 20 d 后发现一些细胞团放散出类似条斑紫菜单孢子的颗粒状细胞坛紫菜生活史中的减数分裂的研究还比较少, 减数分裂发生时期还没有确定, 存在很多争议减数分裂由相当于两次连续有丝分裂的减数分裂 I 和减数分裂 Ⅱ 组成, 其中减数分裂 I 在细胞学水平上明显地分为细线期偶线期粗线期双线期和终变期 5 个时期在偶线期, 同源染色体配对, 形成联会复合体 ; 在粗 5

14 前言线期, 完全配对的非姐妹染色单体之间发生同源重组, 形成交叉交叉在双线期特别明显减数分裂 I 完成后, 同源染色体移向两极, 每极细胞的染色体数目减半减数分裂 Ⅱ 与一般的有丝分裂相似的是姐妹染色体之间的分离性母细胞经过两次连续的分裂, 形成 4 个单倍体细胞受精后, 合子中的染色体数目恢复到二倍体, 保持了生物体遗传的稳定性同时, 在减数分裂过程中, 同源染色体的联会与重组产生了一些新的可遗传的变异, 这些可遗传的变异是生物进化和多样性的基础虽然减数分裂的机制研究比较透彻, 但是由于坛紫菜的生活史中不同时期形态变化大, 特别是丝状体的不同时期的细胞核染色观察染色体变化比较困难 ; 也难以分离单个细胞, 用流式细胞仪分析也存在困难, 直接观察难以实现, 所以关于减数分裂发生于何时期, 难有定论因此, 希望通过其它途径来直接或者间接证明坛紫菜减数分裂发生的确切位置图 1 坛紫菜的生活史 Fig. 1 Life history of p. haitanensis 叶状体阶段 4 细胞幼体果胞精子囊 ( 减数分裂 )? 合子曾呈奎 [15] 壳孢子丝状体阶段果孢子认为坛紫菜的生活史如图 1, 认为坛紫菜的减数分裂最可能发生在壳孢子的萌发时期, 但是没有确切的证据严兴洪等 [16] 利用坛紫菜人工色素突变体与野生型进行杂交试验, 通过观察 F1 叶状体中是否出现颜色分离和颜色嵌合体来证明坛紫菜减数分裂发生的确切位置, 发现坛紫菜杂合丝状体产生的壳孢子, 其萌发时进行的最初两次细胞分裂是减数分裂为了进一步验证坛紫菜减数分裂的发生确切时期需要更多的证据, 但是, 一方面由于坛紫菜的丝状体的各个时期的染色体的染色观察非常困难, 难以从形态学上判断减数分裂发生时期 ; 另一方面由于理想的色素突变体的获得也比较困难, 因此利用色素突变体来验证减数分 6

15 前言裂也相对比较困难, 本文希望能够尝试利用 RAPD 分子标记技术通过对杂合株系样品的不同发育时期的基因组 DNA 的扩增位点数目的不同来判断其是单倍体还是二倍体, 从而推断减数分裂发生时期 3 坛紫菜的品质性状目前紫菜的质量鉴定和检查主要限于对产品的颜色光泽口味外形进行感官鉴定, 它虽然有直观快速的优点, 但是可能会由于工作人员的经验工作场地不同而产生较大的误差, 而难以量化紫菜商品指标如颜色光泽口感和它的色素蛋白质氨基酸等含量具有高度一致性 [17], 因此紫菜的的蛋白质, 氨基酸色素等成分是反映紫菜品质的另一个重要指标, 可以作为客观科学的方法来判别质量 3.1 光合色素紫菜含三种主要的光合色素, 即叶绿素 A(chlorophyll A,Chl.A) 藻红蛋白 (phycoerythrin,pe) 和藻蓝蛋白 (phycocyanin,pc), 紫菜的色彩变化主要由这三种色素的含量和它们间的比例来决定商品紫菜饼的质量好坏也主要取决于这三种色素的含量高低 [18], 对突变育种和改良养殖品种均具重要意义叶绿素叶绿素是藻类光合作用的基本色素 ( 叶绿素类胡萝卜素和藻胆素 ) 之一. 叶绿素有 a b c d e 五种类型, 其中叶绿素 a 是所有进行放氧光合作用生物的基本光合作用色素, 存在于所有藻类和除光合细菌之外的所有光合生物中, 常作为水域生态系统生产性能的重要指标, 我国海洋淡水水体的叶绿素已有较多研究 [19]-[22] 紫菜叶状体中主要的捕光色素( 叶绿素 a 和类胡萝卜素 ) 的多少决定了它吸收光能的能力, 继而也就影响到了紫菜幼苗的生长速度叶绿素 a 在光合作用中扮演重要的角色, 其中光反应中心外围叶绿素 a 的作用是作为捕光色素吸收光能, 并以电子传递即电子得失引起的氧化还原) 或共振传递 ( 直接传递能量 ) 的方式向反应中心传递少数叶绿素 a 分子处于光反应中心的中心位置, 具有将光能转化为电能的功能, 这是光合作用的中心问题 [23] 叶绿素是坛紫菜重要的光合色素, 含量的高低与藻体本身的营养生长旺盛与否密切相关同时, 植物的叶绿素和动物的血红素卟琳环结构相似, 因此人体在摄入叶绿素后, 能提高血红蛋白的合成, 此外还发现它能预防消化道溃疡增 7

16 前言强组织细胞活性 [24] 藻胆蛋白藻胆蛋白作为评价紫菜品质的参数之一, 主要有以下几方面的作用 1 在紫菜的生长阶段, 藻胆蛋白是紫菜光合作用中重要的辅助色素, 影响紫菜的光合作用效率 2 在紫菜的加工过程中, 影响干紫菜的光泽和质地 3 其本身具有很高的营养价值和应用前景藻胆蛋白是大量出现于红藻 (Rhodophyta) 蓝绿藻 (Cyanophyta) 和隐藻 (Cryptophyta) 中的捕光色素蛋白, 主要包括藻红蛋白藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白三种在藻胆体内, 能量传递的方向是藻红蛋白藻蓝蛋白别藻蓝蛋白, 最终高效传递给作用中心色素叶绿素 a, 用于光合作用 [25] 藻胆蛋白的吸收光谱是藻胆蛋白分类的基础依据藻胆蛋白光谱的最大吸收范围, 可将藻胆蛋白分为四类 : 藻红蛋白 (PE) 在 540~570 nm, 藻蓝蛋白 (PC) 在 610~620 nm, 别藻蓝蛋白 (APC) 在 650~655 nm, 藻红蓝蛋白在 575 nm [26][27] 根据吸收光谱的特点, 藻红蛋白 (PE) 又可分为三类 :R- 藻红蛋白 ( 在 499 nm 和 565 nm 有吸收峰, 在 545 nm 有吸收肩峰 ),B- 藻红蛋白 ( 有 545 nm 和 565 nm 的吸收峰,499 nm 为吸收肩峰 ),C- 藻红蛋白 ( 只有 565 nm 的吸收峰 ) [28][29] 从外观看, 藻红蛋白是红色的, 藻蓝蛋白颜色在粉红与深蓝之间变化, 别藻蓝蛋白是蓝色略显绿色藻胆蛋白对可见光辐射的吸收是由于藻胆色素的存在, 它们之间吸收光谱的差异即反映它们的藻胆色素的组成一般认为, 在蓝藻和红藻中, 藻胆蛋白除了有在光合作用中作为捕光色素系统进行吸收和传递能量的功能外, 还可以作为细胞中的贮存蛋白 [30] 3.2 蛋白质由于条斑紫菜的种植范围比较广, 研究得比较深入, 很多品质鉴定指标一般都是依照条斑紫菜确立的蛋白质含量是衡量坛紫菜营养价值的重要指标, 是鉴别紫菜品质的重要参数之一 [31] 紫菜是蛋白质含量最丰富的海藻之一, 紫菜中的蛋白质含量随着藻的种类及生长时间地点等而有所不同, 通常蛋白质质量分数占紫菜干质 25~50% Noda H 和 Laurence J 对日本产条斑紫菜的结合态及游离态氨基酸的含量的研究结果显示, 日本产条斑紫菜富含丙氨酸天冬氨酸谷氨酸和甘氨酸紫菜中还含有大量的牛磺酸, 其含量超过藻体干质量的 1.2%, 牛磺酸为磺酸化的氨基酸, 是由胱氨酸衍生而来, 可以通过形成牛磺胆酸促进胆酸的肠 8

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10384 -------- 9601008 UDC---------------------- 1999 1999 1999 ------------------------ ------------------------ 1 2 .4...4 7 14.14..18..22..22..24 3 4.27.32.39 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 5 12 6 1 2 3 4