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4 目录 第一篇绪论 1 第一章基础医学概述 1 第二章人体的基本结构 4 第二篇细胞的基本结构与功能 14 第一章细胞的基本结构 14 第一节细胞的分子基础 14 一 细胞中的生物小分子 14 二 细胞中的生物大分子 15 第二节细胞的形态和基本结构 16 一 细胞膜 18 二 细胞质 21 三 细胞核 26 第三节细胞分裂 30 第四节细胞周期 31 一 G 1 期 31 二 S 期 32 三 G 2 期 32 第二章细胞的基本功能 33 第一节细胞膜的物质转运功能 33 一 单纯扩散 33 二 易化扩散 34 三 主动转运 36 四 入胞和出胞 38 第二节细胞的生物电现象及其原理 40 一 细胞生物电现象的观察和记录 40 二 细胞生物电现象的物理化学基础 42 三 细胞生物电活动及其产生机制 43 四 兴奋的引起和兴奋传导的机制 49 五 兴奋性及其影响因素 54 第三节细胞的信号传递与转导功能

5 一 细胞间的信号传递 56 二 细胞的跨膜信号转导 58 第三篇基本组织与人体胚胎早期发生 64 第一章概述 64 第二章上皮组织 65 第一节被覆上皮 65 一 单层上皮 65 二 复层上皮 67 第二节腺上皮和腺 69 一 外分泌腺和内分泌腺 69 二 腺的发生 69 三 外分泌腺的一般结构及分泌方式 70 第三节上皮组织的特殊结构 71 一 上皮细胞的游离面 71 二 上皮细胞的侧面 73 三 上皮细胞的基底面 73 第四节上皮组织的再生 74 第三章结缔组织 75 第一节固有结缔组织 75 一 疏松结缔组织 75 二 致密结缔组织 81 三 脂肪组织 81 四 网状组织 82 第二节软骨与骨 82 一 软骨 82 二 骨 85 第四章肌肉组织 92 第一节骨骼肌结构和生理特性 92 一 骨骼肌纤维的光镜结构 92 二 骨骼肌纤维的超微结构 93 三 肌丝的分子结构 95 四 骨骼肌细胞收缩的引起和收缩机制 97 五 骨骼肌收缩的形式和力学分析 101 第二节心肌的结构和生理特性 106 一 心肌的结构 106 二 心肌的生理特性

6 第三节平滑肌的结构和生理特性 108 一 平滑肌的结构 108 二 平滑肌的分类 110 三 平滑肌的生理特性 110 四 平滑肌的收缩机制 111 五 平滑肌活动的控制 111 第五章人体胚胎的早期发生 113 第一节受精 113 一 受精的准备 113 二 受精的过程 114 三 受精的意义 115 第二节卵裂和胚泡形成 116 一 卵裂 116 二 胚泡形成 117 第三节植入 117 一 植入的时间和地点 117 二 植入的过程 118 三 蜕膜形成 118 四 完成植入的条件 118 五 人工授精和胚胎移植 120 第四节胚层的形成 120 一 二胚层胚盘的形成 120 二 三胚层胚盘的形成 120 三 胚体形成的三胚层分化 122 第五节胎膜与胎盘 125 一 胎膜 125 二 胎盘 128 第六节双胎 多胎和联胎 130 一 双胎 130 二 多胎 131 三 联胎 131 第七节胚胎各期外形演变和胚胎的推算 131 一 胚胎外形的演变 131 二 胚胎龄的测定方法 131 第六章颜面 腭和颈的发生 133 第一节鳃器官的发生 133 第二节颜面的发生

7 第三节腭的发生 135 第四节颈的发生 135 第五节颜面和颈部的先天性畸形 136 第七章咽囊的发生与衍化 137 第四篇细胞适应 损伤与组织修复 139 第一章细胞信号转导及其异常 139 第一节细胞信号转导的主要途径 139 一 G 蛋白介导的细胞信号转导途径 139 二 酪氨酸蛋白介导的信号转导途径 141 三 鸟氨酸环化酶信号转导途径 142 四 核受体及其信号转导途径 142 第二节信号转导异常 143 一 信号转导异常的原因 143 二 信号转导异常的发病机制 144 三 细胞信号转导异常的结果 145 第二章细胞凋亡 146 第一节概述 146 第二节细胞凋亡的过程与调控 147 一 细胞凋亡的过程 147 二 凋亡时细胞的主要变化 147 三 细胞凋亡的调控 148 第三节细胞凋亡的发生机制 151 第三章细胞 组织对损伤的反应 154 第一节细胞损伤的原因 154 第二节细胞损伤的机理 156 第三节适应 158 一 萎缩 158 二 肥大 159 三 增生 159 四 化生 160 第四节细胞 组织损伤常见形态学 161 一 变性 161 二 细胞死亡 165 第五节细胞 组织对损伤的修复 171 一 再生 171 二 纤维性修复

8 三 创伤愈合 178 第四章自由基与组织损伤 184 第一节生物体中的主要自由基及其生理学意义 184 一 生物体中的主要自由基 184 二 自由基的生理学意义 187 第二节自由基损伤 190 一 自由基对核酸的损害 190 二 自由基对蛋白的损伤 190 三 自由基对脂质的损伤 191 第五篇疾病概论 193 第一章疾病的病因发病学 193 第一节健康与疾病 193 一 健康 193 二 疾病 193 第二节病因学 194 一 疾病发生的原因 194 二 疾病发生的条件 196 第三节发病学 197 一 疾病发生的基本机制 197 二 疾病发病学的一般规律 198 三 疾病转归 200 第二章先天性畸形 202 第三章炎症 205 第一节概述 205 一 炎症的概念 205 二 炎症的原因 206 第二节炎症的基本病理变化 207 一 变质 207 二 渗出 207 三 增生 220 第三节炎症的组织学类型 220 一 变质性炎 220 二 渗出性炎 220 三 增生性炎 223 第四节炎症的经过和结局 225 一 炎症的经过

9 二 炎症的结局 226 第五节影响炎症过程的诸因素 227 第四章肿瘤 229 第一节肿瘤的概念 229 第二节肿瘤的特征 229 一 肿瘤的一般形态和结构 229 二 肿瘤的异型性 231 第三节肿瘤的生长与扩散 232 一 肿瘤生长的生物学 232 二 肿瘤的生长方式和扩散 234 三 肿瘤的分级与分期 238 四 肿瘤的复发 238 第四节肿瘤与机体的相互影响 239 一 肿瘤对机体的影响 239 二 机体对肿瘤的影响 239 第五节良性肿瘤与恶性肿瘤的区别 240 第六节肿瘤的命名与分类 241 一 肿瘤的命名原则 241 二 肿瘤的分类 242 第七节常见肿瘤 243 一 上皮性肿瘤 243 二 间叶组织肿瘤 247 三 神经外胚叶源性肿瘤 250 四 多种组织构成的肿瘤 250 第八节肿瘤的病因学和发病学 251 一 肿瘤的发病学 251 二 肿瘤的病因学 253 三 影响肿瘤发生 发展的内在因素及其作用机制 255 第六篇疾病药物治疗学基础概论 257 第一章药物效应动力学 257 第一节药物的基本作用 257 一 药物作用与效应 257 二 治疗效果与不良反应 258 第二节药物剂量与效应关系 259 第三节药物作用机制 262 第四节药物与受体

10 一 受体动力学 263 二 受体类型 267 三 第二信使 268 四 受体的调节 270 第二章药物代谢动力学 271 第一节药物的跨膜转运 271 一 被动转运 272 二 主动转运 273 第二节药物体内过程 273 一 吸收 273 二 分布 274 三 生物转化 275 四 排泄 277 第三节药动学过程 278 一 药物浓度 - 时间曲线 278 二 药物消除动力学 279 三 药动学模型 281 四 药动学参数计算及意义 282 五 多次用药 284 第三章影响药物效应的因素及合理用药 286 第一节药物方面的因素 286 一 药物剂型和给药方法 286 二 联合用药及药物相互作用 286 第二节机体方面的因素 287 一 年龄 287 二 性别 288 三 遗传异常 288 四 病理情况 288 五 心理因素 289 六 长期用药后机体对药物反应的变化 289 第三节合理用药原则 289 第四章抗恶性肿瘤药物 291 第一节抗恶性肿瘤药的药理学基础 291 一 抗恶性肿瘤药的分类 291 二 对细胞增殖动力学的影响 292 三 抗肿瘤药的耐药性 294 第二节常用的抗肿瘤药物

11 一 干扰核酸生物合成的药物 295 二 影响 DNA 结构与功能的药物 297 三 干扰转录过程阻止 RNA 合成的药物 299 四 影响蛋白质合成的药物 300 五 调节体内激素平衡的药物 301 第三节抗恶性肿瘤药的毒性反应与合理应用 302 一 抗恶性肿瘤药的毒性反应 302 二 抗肿瘤药物的合理应用原则

12 第一篇绪论 第一章基础医学概述 按我国的学科分类, 基础医学是医学学科的一级学科, 包括人体解剖学与组织胚胎学 病原生物学 免疫学 病理学与病理生理学等学科 作为临床医学的基础课程, 基础医学还包括生理学 生物化学和分子生物学 药理学等学科 这些学科之间有着广泛和密切的联系, 共同构成临床医学的基础课程 同时, 基础医学也是研究人体和生命奥秘的重要组成部分 按照基础医学课程的特点, 大体上可以归入形态学科和机能学科 人体解剖学 组织学与胚胎学 病理学属于形态学科 ; 生理学 病理生理学 免疫学 药理学属于机能学科 ; 病原生物学 ( 包括医学微生物学和医学寄生虫学 ) 既是形态学科, 也是机能学科 生物化学和分子生物学也属于机能学科, 由于分子生物学是从生物化学中发展出来的, 并且近年来发展非常迅速, 因此我们将生物化学和分子生物学列入分子与细胞生物学课程中另述 在 基础医学教程 中, 主要包括按器官和系统进行教学的学科, 如人体解剖学 组织学与胚胎学 人体生理学 病理学 病理生理学和药理学等 人体解剖学 (human anatomy) 是研究正常人体形态结构的科学, 是学习其他基础医学和临床医学课程的基础 人体解剖学课程包括系统解剖学 (systematic anatomy) 和局部解剖学 (regional anatomy) 此外, 根据医学临床的需要, 又分为神经解剖学 运动解剖学 功能解剖学 断层解剖学 放射解剖学 成长解剖学和临床应用解剖学等 在 基础医学教程 中, 主要以系统解剖学为主线, 按人体基本功能来学习研究器官和组织的形态结构 同时通过局部解剖学的学习, 掌握和了解各器官组织的位置 毗邻 以及相互关系 在人体解剖学的学习过程中要通过标本观察和尸体解剖, 准确地辨认人体的器官组织和重要结构, 理论联系实际, 切忌脱离实物标本的死记硬背 学习人体解剖学必须注意用进化发展的观点, 形态与功能相结合的观点, 局部与整体相统一的观点, 才能掌握解剖学知识 组织学与胚胎学中包括组织学 (histology) 和胚胎学 (embryology) 两门学科, 它们既密切相关又各具独立性, 在我国的医学教学中习惯将其合为一门课程, 简称为组织胚胎学 在医学教学中, 组织学和胚胎学的研究对象是人体 人体组织学是研究人体细微结构及其相关功能的学科 组成人体的基本结构功能单位是细胞 人体细胞数量众多, 种类也有成百上千种, 其形态结构和功能也各有差异 在机体中, 一些形态结构相类似 功能相关的细胞和细胞间质组合在一起, 构成人体四大组织, 即上皮组织 结缔组织 肌肉组织和神经组织, 几种组织按一定规律组成器官和系统 研究组织 器官和系统的形态结构及其相关功能的联系是组织学的主要内容

13 人体胚胎学是研究人体发生 生长及其发育机制的一门学科 胚胎的发生 发育表现为一个连续发育过程, 始于受精卵, 即合子, 具有旺盛的生命力, 在母体内不断增殖和分化, 最初形成三个胚层, 并在此基础上分化形成各种组织和一系列器官系统, 再经过生长发育, 最终形成胎儿直至分娩 因此对男女两性生殖细胞受精 胚胎早期发生及器官系统发育的研究是人体胚胎学的主要内容 生理学 (physiology) 是生物学的一个分支学科, 是研究生物机体生命活动规律的科学 人体生理学 (human physiology) 是研究正常人体功能活动规律的科学, 是一门机能学科 它主要的任务是阐明正常人体及其器官 组织等所表现的各种生命活动现象或生理功能活动的机制及其变化规律 为进一步学习其他基础医学和临床医学课程, 为在临床医疗和护理实践以及预防医学的工作中有效地防治各种疾病, 促进人类健康长寿提供必要的理论基础 人体生理学的研究内容是人体生理功能活动的规律和机制, 以及内 外环境发生变化对这些生命活动的影响 因此我们可以从不同的结构基础出发, 对人体的生理功能活动进行细胞及分子 器官 整体这三个不同水平的研究 生理学也是一门实验性科学 生理学的知识是来源于生活实践 实验研究的实践和临床研究的实践 在实践过程中, 生理学的研究方法可区分为急性实验和慢性实验两大类 应当指出, 生理学的知识大部分是从动物实验中获得, 这是研究人体生理学所不可缺少的手段 但是, 在应用实验动物所获得的结论时, 应当充分考虑人和动物之间的差别, 千万不可简单地将其结论机械地套用到人体上 同时, 还应当注意到急性实验 慢性实验以及无创伤性实验三者所得到的结果, 彼此之间还是有所差异的 因此, 我们在评估实验所得的结果时, 必须进行充分的分析和综合, 全面考虑问题, 方能得出正确的认识和结论 病理学 (pathology) 是研究疾病本质的学科 它研究疾病为什么发生 ( 病因 ) 怎样发生 ( 发病机制 ) 会出现哪些变化 ( 代谢 功能和形态方面 ) 以及怎样的转归 病理学的任务是为临床医学提供诊断 治疗和预防疾病的理论基础 ; 参与临床疾病的诊断 ; 与临床共同进行对新疗法的评价及发现和认识新的疾病 病理学与病理生理学是互相配合的科学 在教学内容上, 前者较侧重疾病的形态变化 ( 病变,lesion), 后者更侧重于功能 代谢方面的变化 病理学的研究方法非常注重实验研究 主要研究方法有尸体解剖 (autopsy), 简称尸检 ; 活体组织检查 ; 动物实验 ; 组织培养与细胞培养 ; 病理学观察, 包括大体标本观察和组织切片的观察等 病理生理学 (pathophysiology) 是一门研究疾病发生发展规律和机制的学科 在医学教学中, 病理生理学的教学内容与研究范畴与国外的临床生理学 (clinical physiology) 医学生理学 (medical physiology) 或疾病生理学 (physiology of disease) 相近 病理生理学的主要任务是研究疾病发生发展的一般规律与机制, 研究患病机体的功能 代谢的变化和机制, 从而探讨疾病的本质, 为疾病的防治提供理论根据 因此, 它是一门理论性较强的学科, 它需要应用正常人体中形态 功能 代谢方面的各种有关知识加以综合 分析, 再通过科学思维用到患病机体, 从而正确地认识疾病中出现的各种变化, 因此, 它和许多基础医学学科有关 既然病理生理学的研究对象是疾病, 作为一门研究疾病的基础课程, 它必须引导学生从正常人体有关知识, 逐渐引向对疾病机体的

14 认识 病理生理学是基础课程中围绕疾病进行探讨的学科之一, 并且是沟通基础学科与临床学科的桥梁学科 药理学 (pharmacology) 是研究药物的学科之一, 也是一门为临床合理用药和防病治病提供基本理论的医学基础学科 药理学主要研究药物与机体 ( 主要是人体, 也包括病原体 ) 相互作用的规律和作用原理 所谓药物 (drug) 是指用以防治及诊断疾病的物质, 在理论上说, 凡能影响机体器官生理功能及 ( 或 ) 细胞代谢活动的化学物质都属于药物范畴, 也包括避孕药 药理学研究的内容可分为药物效应动力学 (pharmacodynamics, 简称药效学 ) 和药物代谢动力学 (pharmacokinetics, 简称药动学 ) 药效学主要研究药物对机体的作用和作用原理, 药动学主要研究机体如何对药物的处理, 包括药物的吸收 分布 生物转化和排泄 由此可见, 药理学研究的主要对象是机体, 属于广义的生理科学范畴, 与主要研究药物本身的药学学科, 如生药学 药物化学 药剂学 制剂学等学科有明显的区别 药理学是以生理学 生物化学 病理学 病原生物学 免疫学等为基础, 为指导临床各科合理用药提供理论基础的桥梁学科 药理学的学科任务是要为阐明药物作用机制 改善药物质量 提高药物疗效 开发新药 发现药物新用途, 并为探索细胞生理生化及病理过程提供实验资料 药理学的方法是实验性的, 即在严格控制的条件下观察药物对机体或其组成部分的作用规律并分析其客观作用原理 近年来逐渐发展而设立的临床药理学 (clinical pharmacology) 是以临床病人为研究对象和服务对象的应用科学, 其任务是将药理学基本理论转化为临床用药技术, 即将药理效应转化为临床实际效应, 是基础药理学的后继部分 学习药理学的主要目的是要了解药物有什么作用 作用机制及如何充分发挥药物临床疗效和避免药物不良反应, 要理论联系实际了解药物在发挥疗效过程中的因果关系, 特别要掌握药物的适应症和禁忌症 在临床上, 疾病的治疗方法包括药物治疗 手术治疗和放射治疗等, 药物治疗在临床各科均有应用 对于不同的疾病以及在疾病的不同阶段应该采取适当治疗措施和方法, 疾病药物治疗的基础是药理学 为了能够使基础医学各学科的相关知识能够更加密切的相互联系, 本教科书将上述六门课程的总论内容进行整合, 编写成为 基础医学教程 ( 导论 ) 在 基础医学教程 ( 导论 ) 中, 我们首先扼要介绍人体的基本结构, 之后介绍细胞基本结构与功能以及细胞信号转导, 接着介绍人体基本组织 ( 包括上皮组织 结缔组织 软骨 肌肉组织 ) 与胚胎早期发生, 其后再介绍细胞适应 组织损伤与修复以及疾病的概论, 最后介绍疾病药物治疗的一些共同规律 通过对 基础医学教程 ( 导论 ) 的学习, 使同学们对基础医学有一个全面而概括的了解, 便于进一步学习 基础医学教程 ( 各论 ) 基础医学教程 ( 各论 ) 是将基础医学的有关课程的各论内容按器官系统进行编排, 每一器官系统原则上按解剖学 组织胚胎学 生理学 病理学 病理生理学和药理学的顺序进行教学, 以加强基础医学各学科有关内容的横向联系, 也使基础医学知识与临床疾病的联系更加密切, 有利于医学生的学习 ( 陈季强 )

15 第二章人体的基本结构 智人 我们人类赋予自己的名称, 是与许多动物有着共同特征的生物体 因为人类具有独特的特征, 所以, 以结构特征上同源为基础进行分类的物种中, 人类是单独的一个分支 人类与其他动物一样也要呼吸 摄入和消化食物 排泄废物 繁殖子代 作为有机体, 人死后, 肉体可被其他生物 ( 主要是微生物 ) 分解 消耗 人体产生 储存和利用能量的过程与所有生命体相同 整个自然界都有着与人类共同的遗传密码 在许多物种中观察到的基本发育模式在人类胚胎中同样存在 人体的构造非常复杂 人体的结构可分为化学层面和细胞层面, 分别从基本结构和功能上反映人体 人体结构的每一层面均表明了与上一层面的关系 ( 图 1-2-1) 化学 细胞 组织层面是微观的, 而器官 系统和生物水平是宏观的 图 人体的层面 细胞 (cell) 是构成人体的基本单位, 虽然成人的体细胞数以亿计, 但细胞的类型却只有几百种 细胞主要由细胞膜 (cell membrane) 细胞质 (cytoplasm) 细胞核 (cell nucleus) 以及许多细胞器 (cell organ, organelle) 组成 ( 图 1-2-2), 其主要成分是蛋白质 核酸 脂质和水等, 它们与自然界的其他物质一样也是由原子和分子组成的 细胞与细胞间质组合在一起构成细胞群体, 形成组织 几种组织构成器官, 两个或两个以上的器官及相关结构组合形成系统

16 图 细胞的构造 一 组织 组织 (tissue) 是由发挥特定功能的 以支持基质结合起来的相同细胞的集合 组织学是研究组织的显微形态科学 人体的基本组织分为上皮组织 结缔组织 肌肉组织和神经组织四种基本类型 上皮组织 (epithelial tissue) 亦即上皮 (epithelium)( 图 图 1-2-4), 覆盖身体和器官表面, 内衬体腔和器官内腔 ( 身体管道的空腔部分 ), 并构成各种外分泌腺 ( 图 1-2-5) 上皮组织负责保护 吸收 排泄和分泌 图 单层上皮组织

17 图 (a) 复层磷状上皮 ;(b) 移行上皮 图 外分泌腺构造 结缔组织 (connective tissue) 起连接 支持和保护作用 结缔组织又可以分为疏松结缔组织 致密结缔组织和固有结缔组织等 ( 图 1-2-6) 肌肉组织 (muscular tissue) 通过收缩完成身体各部分的运动 根据肌肉组织的特点和功能又可以分为骨骼肌 心肌和平滑肌 ( 图 1-2-7) 神经组织 (nervous tissue) 始发并传导神经冲动, 协调身体各种活动 神经组织包括神经细胞 ( 神经元 ) 和神经胶质细胞 ( 图 图 1-2-9)

18 图 结缔组织的类型 图 肌肉组织的类型

19 图 神经元的结构 图 存在于中枢神经中的神经胶质类型 二 器官 器官 (organ) 是由几种类型的组织构成而发挥特定功能的集合体 骨就是一个器官, 例如股骨, 其成分包括骨组织 神经组织 血管 ( 血液 ) 组织和软骨组织 ( 一般在关节上 ) 股骨作为骨骼系统的一部分, 辅助支撑身体 ; 作为运动系统的一部分, 为肌肉提供附着点 ; 作为循环系统的一部分, 红骨髓可以造血

20 生命器官是发挥关键功能的器官 例如, 心脏泵血 ; 肝脏储存糖原并分解衰老的血细胞 ; 肾脏过滤血液 ; 肺交换呼吸的气体 ; 脑有控制和协调身体的功能 生殖器官不是生命本身必须的器官, 也不是附属器官, 但是没有生殖器管, 生命就不能自然延续 当一个或多个生命器官功能衰竭时, 人就会死亡 三 系统 系统 (system) 是由两个和两个以上的器官及相关结构形成的一个功能整体, 行使一种或一系列的相同功能的组合 例如循环系统推动血液流动 有些器官不止参与一个系统, 例如胰腺既产生消化酶 ( 胰酶 ) 参与消化系统, 又产生激素 ( 胰岛素和胰高血糖素 ) 参与内分泌系统 根据人体的诸多器官的功能差异, 可以分类组成多个系统, 主要人体系统的基本结构和功能如下 : 骨骼系统 (skeletal system) 由骨 (bone, 成人共有 206 块骨 ) 软骨 (cartilage) 和韧带 (ligment, 在关节处连接骨 ) 组成 ( 图 ) 其功能是支持 保护 运动和力量 造血 贮存矿物质 肌肉系统 (muscular system) 由骨骼肌 (skeletal muscles) 和附着的肌腱 (muscle tendon) 组成 ( 图 ) 其功能是身体运动 保持姿势 产生身体热量 骨骼系统与肌肉系统一起构成运动系统, 共同执行躯体的运动功能 图 骨骼系统 图 肌肉系统 神经系统 (nervous system) 可分为中枢神经系统 (central nervous system, CNS) 和周围神经系统 (peripheral nervous system, PNS)( 图 ) CNS 包括脑 (brain) 和脊髓 (spinal cord);pns 包括与脑相连的脑神经和与脊髓相连的脊神经,PNS 还包括神经节和神经丛 神经系统的功能是感觉并对内外环境的变化作出反应 推理和记忆 协调身体活动等

21 自主神经系统 (autonomic nervous system, ANS) 是神经系统的功能性分类, 脑内的某些结构是 ANS 的控制中心, 并通过特殊神经通路传导 ANS 冲动,ANS 的功能是自主的加速或减缓机体的内在活动 内分泌系统 (endocrine system) 由产生激素的内分泌腺组成 ( 图 ) 和其他系统各个器官集中在一起的形式不同, 内分泌腺广泛分布在全身各处, 没有连续性, 例如垂体 下丘脑和松果体位于颅腔内 ; 甲状腺和甲状旁腺在颈部 ; 胰腺和肾上腺在腹部 ; 女性卵巢在盆腔 ; 男性睾丸在阴囊 内分泌腺分泌特殊的化学物质 激素进入血液或周围的细胞间液, 控制和整合人体功能, 调控人体全身各个系统器官活动的协调和统一 内分泌系统在机体的调节和整合过程中的功能和神经系统类似, 不同的是, 激素只改变特殊细胞的代谢活性, 而神经冲动引起肌肉收缩或腺体分泌 激素的作用相对缓慢持久, 而神经冲动作用快, 持续时间短 图 神经系统 图 内分泌系统 消化系统 (digestive system) 由消化吸收食物的器官组成 ( 图 ) 可以分为管性的胃肠道 (gastrointestinal tract) 及附属消化器官 (accessory digestive organs), 消化道包括口腔 咽 食管 胃 小肠和大肠 附属消化器官包括齿 舌 唾液腺 肝 胆 胰等 临床上常说的 上消化道 指食管和胃 ; 下消化道指小肠和大肠 消化系统的功能主要是消化食物 吸收营养物质 排除食物残渣 呼吸系统 (respiratory system) 由与进出肺部血液的气体 (O 2 和 CO 2 ) 运送有关的器官组成 ( 图 ) 呼吸系统的主要通道包括鼻腔 (nasal cavity) 咽 (pharynx) 喉 (larynx) 气管 (trachea) 和支气管 (bronchi) 在肺 (lung) 内, 支气管 - 再分支最终形成肺泡 (pulmonary alveoli) 其功能是执行气体交换, 给血液提供 O 2 并排出 CO 2, 帮助调节酸碱平衡, 并具有内分泌功能

22 图 消化系统 图 呼吸系统 循环系统 (circulatory system) 由心脏和运送血液或血液成分的血管组成 ( 图 ), 包括心血管系统 (cardiaovascular system) 和淋巴系统 (lymphatic system) 前者由心脏 (heart) 动脉 (artery) 毛细血管 (capillary) 静脉 (vein) 组成, 后者淋巴组织 (lymph tissue) 由淋巴管 (lymphatic vessel) 和淋巴器官 (lymph organs) 组成 其功能是输送血液在体内循环流动, 运送呼吸的气体 营养物质 废物和激素 ; 帮助调节体温和酸碱平衡 泌尿系统 (urinary system) 由消除血液中的废物及排尿的器官组成 ( 图 ), 包括肾脏 (kidney) 输尿管 (ureter) 膀胱 (urinary bladder) 及尿道 (urethra) 四部分 其功能是从血液中排出机体内溶于水的代谢产物如尿素 尿酸等 ; 调节化学成分 容积和血液的电解质平衡 ; 帮助保持人体的酸碱平衡 图 循环系统 图 泌尿系统

23 男性和女性生殖系统 (male and female reproductive system) 由产生 贮存并运送生殖细胞 ( 配子, 即精子或卵子 ) 的人体器官组成 ( 图 ) 主要执行生殖繁衍后代和产生激素的功能 图 男性和女性生殖系统 除生殖系统外, 构成人体系统的所有器官均在胚胎发育的六周内形成 ( 从第三周开始至第八周结束 ) 生命器官和系统不仅在这个时期形成, 而且许多已开始发挥功能 例如在受精后 25 天, 心脏通过循环系统泵血 生殖系统的器官在受精后 10 至 12 周形成, 但直到青春期 12 或 13 岁才成熟并发挥功能 四 人体的局部 人体由上述系统有机结合构成一个统一的整体 从外型上, 人体可分成 10 个局部 : 头部 ( 包括颅 面部 ) 颈部 ( 包括颈 项 ) 背部 胸部 腹部 盆会阴部 ( 后四部合称为躯干部 ) 和左 右上肢与左 右下肢, 每个局部又可分成若干小的部分 ( 图 ) 头与躯干的基本结构大致相同, 均由皮肤 浅筋膜 深筋膜 肌和骨骼等共同构成腔或管, 容纳并保护中枢神经 感觉器官和内脏器官等 四肢是以骨骼为支架, 肌肉跨越关节附于骨骼, 深筋膜包盖着肌肉, 浅筋膜位于皮下 全身各局部 器官均有血管和神经分布

24 图 主要人体局部 (a) 前面观 ;(b) 后面观 ( 陈季强 )

25 第二篇细胞的基本结构与功能 细胞 (cell) 是人体形态结构 生理功能和生长发育的基本单位 细胞也是生命进化过程中的产物 它的发生经历了漫长的岁月 先是从无机物演变出有生命的蛋白质, 进而逐渐变成细胞 细胞经过了原核细胞 真核细胞等单细胞阶段, 又经过漫长的进化过程才演变成多细胞生物, 并逐渐由低级向高级发展, 在动物界最终出现人类 人类对细胞的认识始于 1665 年, 英国人 Hook 用放大镜对软木塞薄片的观察, 首次描述了由细胞壁分隔成的小室, 并命名为 Cell 实际上当时 Hook 所观察到的细胞只是死亡的植物细胞 至 1674 年荷兰生物学家 Leeuwenhoek 用放大倍数较高的显微镜发现了动物精子 肌细胞 神经细胞等, 才算真正观察到生活状态的细胞 此后, 随着科学技术的不断发展, 研究工具的不断完善, 至 20 世纪 50 年代, 高分辨力的电子显微镜的应用, 使人们对细胞的认识不断深化, 近代对细胞的形态结构 生命活动的调控等的研究, 已上升到分子水平, 对医学科学乃至整个生命科学研究的发展, 起到了极大的推动作用 第一章细胞的基本结构 第一节细胞的分子基础 生活的细胞中所有的生命物质总称为原生质 (protoplasm), 它可分无机化合物和有机化合物两部分 无机化合物包括水 无机盐等 ; 有机化合物包括蛋白质 核酸 脂类 糖类等 蛋白质和核酸由于其分子量巨大, 结构复杂, 决定着生物体重要的生命活动, 因而称为生物大分子, 其他物质则称为生物小分子 ( 一 ) 水 一 细胞中的生物小分子 水是细胞中含量最多的成分, 也是细胞进行生命活动的重要基本成分, 在细胞内作为溶剂, 溶解细胞内所有水溶性成分 细胞所有的生命活动均需在水这个介质中进行 在不同的细胞中水的含量不等, 平均约占细胞重量的 70% 细胞中的水可有游离水和结合水两种存在形式, 其中结合水常以氢键与蛋白质结合, 构成细胞的结构成分 体内各种细胞水的含量保持相对恒定, 过多或过少均可导致细胞的异常乃至死亡 ( 二 ) 无机盐 无机盐参与构成细胞的重要成分, 也是维持细胞生存环境中的重要物质 除了与一些有机物质结合构成一些重要化合物外, 大部分无机盐多以离子状态存在, 其中含量较

26 多的阳离子有 Na + K + Ca 2+ Fe 3+ Mg 2+ 等, 阴离子主要有 Cl - SO 4 2- PO 4 3- HCO - 等 它们对维持细胞内 外的 ph 值 渗透压及保持生活物质的胶体状态等, 均起着重要作用, 同时也是细胞完成某些功能活动的必需物质, 如一些酶的激活 肌肉收缩和神经冲动的传导等, 都是在无机离子参与下进行的 ( 三 ) 糖类 糖类又称碳水化合物 (carbohydrate) 是机体细胞主要活动能源之一, 含有碳 氢 氧三种元素 细胞中的糖类分子有单糖 双糖 低聚糖和多糖 单糖中的葡萄糖含 6 个碳原子, 分子式为 C 6 H 12 O 6, 是细胞的能源物质 1 克分子葡萄糖分解成 CO 2 和 H 2 O 时, 能产生 686 大卡的能量 单糖中的戊糖 (5 碳糖 ) 包括核糖和脱氧核糖是组成遗传物质 DNA 和 RNA 的主要成分 双糖中两个糖单位由糖苷键连接而成 常见的双糖有蔗糖 麦芽糖和乳糖 双糖不能直接被人体利用, 必须被水解成单糖后才能利用 双糖主要存在于植物细胞中, 人乳汁中含有乳糖 低聚糖一般是由 3~15 个单糖聚合而成的分支或不分支的链状结构 常与其他物质结合成复合物, 例如与蛋白质结合成糖蛋白, 与脂类结合成糖脂, 分布于细胞表面形成细胞衣 与细胞的识别 代谢的调节 免疫等功能相关 动物细胞内的多糖常为糖原 它是由 5000 个左右的单糖分子聚合而成, 主要存在于肝细胞和肌细胞中, 分别称为肝糖原和肌糖原, 作为贮存的能源物质 此外, 常见的的多糖还有纤维素 粘多糖 ( 糖胺多糖 ) 等 ( 四 ) 脂类 脂类也是细胞重要的组成成分, 可分为单纯脂类和复合脂类 单纯脂类主要是脂肪即甘油三酯, 大多存在于脂肪细胞中作为能源物质 复合脂类主要是磷脂 类固醇和糖脂 磷脂和糖脂是构成生物膜的主要成分 类固醇分为胆质酸和胆固醇等 其中胆固醇是人体内固醇类激素的合成原料, 同时也是生物膜的结构成分 ( 一 ) 蛋白质 二 细胞中的生物大分子 蛋白质 (protein) 是组成细胞的最主要成分, 约占细胞干重的 50%, 广泛分布于细胞的各个部分 其中一类蛋白质称为酶 (enzyme), 是生物催化剂, 细胞和机体所有的代谢活动均在酶的催化下进行 可以说细胞的一切功能活动都是在蛋白质的参与下完成的, 因此, 蛋白质是细胞结构和功能的基础 蛋白质是由氨基酸构成的, 若干氨基酸结合形成多肽链, 经卷曲 折叠, 形成各种空间构型不同的巨大分子 可分为仅有氨基酸组成的单纯蛋白 ( 如清蛋白 组蛋白等 ) 和与其他成分组合而成的结合蛋白 ( 如糖蛋白 脂蛋白和核蛋白等 ) ( 二 ) 核酸 核酸 (nucleic acid) 是细胞中最重要的化学成分之一, 它作为遗传物质与细胞及机体的生长 发育 繁殖 遗传 变异有直接的关系 核酸是由许多核苷酸聚合而成的大分子物质, 核苷酸是由磷酸 戊糖和含氮碱基三

27 种小分子物质构成的 戊糖包括核糖和脱氧核糖 含氮碱有腺嘌呤 (A) 鸟嘌呤 (G) 胞嘧啶 (C) 胸腺嘧啶 (T) 和尿嘧啶 (U) 五种 细胞中的核酸主要有两大类, 即核糖核酸 (ribonucleic acid, RNA) 和脱氧核糖核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA) 两类核酸在组成 功能和在细胞中的分布不相同 ( 表 2-1-1,DNA 分子的双螺旋结构, 图 2-1-1) 表 DNA 和 RNA 的区别 类别核苷酸组成核苷酸种类结构存在部位功能 RNA DNA 磷酸核糖碱基 (A G C U) 磷酸脱氧核糖碱基 (A G C T) 腺嘌呤核苷酸鸟嘌呤核苷酸胞嘧啶核苷酸尿嘧啶核苷酸 腺嘌呤脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸 单链 双螺旋链 主要存在于细胞质中 主要存在于细胞核中 与遗传信息的表达有关 遗传信息的载体 图 DNA 双链的碱基互补示意图和 DNA 分子双螺旋结构模型 第二节细胞的形态和基本结构 人体的细胞一般都很小, 须经显微镜放大才能看到 光镜下常用的细胞长度单位为微米 (micrometer, µm) 即 10-6 米, 电镜下为纳米 (nanometer, nm) 即 10-9 米 各种细胞大小 形态均不相同, 然而, 无不与其功能相适应 如流动血液中的血细胞均为较小的球形 ; 能舒缩的肌细胞为长梭形或长圆柱形 ; 接受刺激并传导冲动的神经细胞均有长的突起, 脊髓前角运动神经细胞直径可 100µm, 其最长的突起可达 1 米左右 ( 图 2-1-2) 细胞的形态虽各不相同, 但其在结构上都是由细胞膜 细胞质和细胞核三部分构成 ( 图 2-1-3)

28 图 人体细胞的几种形态 图 细胞模式图

29 一 细胞膜 细胞膜 (cell membrane) 又称质膜 (plasma membrane), 是包围在细胞质外面的一层生物膜 它是细胞的屏障, 使细胞内物质与外界环境分隔开来, 保持细胞内相对稳定的内环境 同时细胞膜是一种具有高度选择性的半透膜, 担负着细胞内外的物质运输和维持细胞内外不同的离子浓度 此外, 细胞膜还是接受外界信号的传感器, 使细胞对外环境的变化作出适当的反应 动物细胞膜的外面存在着一层厚约 200nm 的绒毛状糖萼 (glycocalyx), 称为细胞衣 (cell coat), 它是细胞结构成分中糖蛋白和糖脂的糖链向外伸展而成的 细胞膜内侧是一层胞质的溶胶层 细胞衣 细胞膜和膜下的溶胶层, 三者构成细胞表面 (cell surface), 这是一个多功能的复合结构体系, 是细胞与细胞 细胞与外环境相互作用并产生各种复杂功能的部位 ( 图 2-1-4) 图 细胞表面结构模式图 ( 一 ) 细胞膜的化学成分 组成细胞膜的化学成分主要有脂类 蛋白质和糖类, 分别称为膜脂 膜蛋白和膜糖类 在不同类型的细胞膜中, 这三类物质的构成比例存在着差异 1. 膜脂主要包括磷脂和胆固醇, 此外还有糖脂 膜脂中以磷酯酰胆碱 ( 卵磷脂 ) 的含量最高 膜脂都是兼性分子 ( 双亲媒性分子 ), 其分子结构中含有亲水和疏水两部分 以卵磷脂分子立体模型为例, 其头部为亲水部分, 尾部疏水部分由二条平行的脂肪酸链构成 因此, 在水溶液中会自动形成亲水头部朝向膜两面, 疏水尾端朝向膜中央的双层分子结构 电镜下观察到单位膜的内 外两个致密层, 即为膜脂分子的亲水部分排列而成 ( 图 2-1-4) 在单位膜中, 膜脂分子具有以下两个特性 : (1) 流动性 : 实验证明膜脂分子在膜中能进行侧向移动 二层间翻转 旋转和弯曲等多种形式的运动 ( 图 2-1-5) 膜脂分子的适当流动性对生物膜的功能至关重要 当其流动性低于一定阈值时, 许多跨膜运输和膜上的酶活动均会停止 而膜脂流动性过高时, 膜将发生溶解 膜脂中的胆固醇分子, 由于其分子结构的特殊性, 对膜的流动性发生微妙

30 的双相影响, 一方面能阻止磷脂烃链尾部的集聚, 抑制膜脂由于温度变化引起由液态到晶态的相变, 有效地防止温度降低时膜流动性的突然降低 ; 另一方面又使脂双层的流动性不至太大 图 膜脂的几种运动方式 (2) 不对称性 : 膜脂双层结构的不对称性主要体现在膜的两个单层所含磷脂种类的较大差别和糖脂全部分布在非胞质层中, 其糖基都位于质膜的外侧或腔面 2. 膜蛋白约占细胞总蛋白量的 25% 膜的各种功能主要由膜蛋白完成 其中有些是运输蛋白, 能转运特殊的分子和离子出入细胞 ; 有些是酶, 能催化各部分的代谢反应 ; 有些是连接蛋白, 能把细胞骨架与相邻细胞或细胞外基质连接起来 ; 还有些是受体蛋白, 能接收和转导细胞外的化学信号等 这些种类繁多的膜蛋白, 根据其与膜脂的关系可分为膜内在蛋白和膜周边蛋白二大类 (1) 膜内在蛋白 : 也称整合蛋白 其中大部分也是兼性分子, 其疏水部分插入细胞膜内直接与脂双层的疏水区域相互作用, 其亲水的极性部分露于膜的外面或内面, 称为镶嵌蛋白 有的疏水部分跨越脂双层疏水区与脂肪链共价连接, 而亲水的极性部分位于膜的内 外两侧, 称为跨膜蛋白 膜内在蛋白与脂类结合的主要方式有单次穿膜 多次穿膜 非穿越性共价键和肽链与磷脂酰肌醇结合 4 种 (2) 周边蛋白 : 大多溶解于水, 附着在膜的内 外表面, 非共价地结合于镶嵌蛋白上 ( 图 2-1-6) 图 膜蛋白与脂双层结合的几种形式

31 膜蛋白在脂双层中分布是不对称的, 各种膜蛋白都有其特定的位置, 并且许多膜蛋白能在脂膜中作侧向运动 3. 膜糖类细胞膜中糖类约占膜脂总重量 2%~5% 但糖类并不单独存在, 而是与膜蛋白和膜脂结合成糖蛋白 糖脂的形式存在 其糖基都暴露于细胞膜的外表面或细胞内膜系统的腔面 膜糖类是由各种已糖通过糖苷键聚合而成, 一般不超过 10 个糖基的分支或不分支的低聚糖或寡糖 主要有半乳糖 甘露糖 岩藻糖 葡萄糖 半乳糖胺 葡萄糖胺和唾液酸等 这些糖大部分结合在膜脂上 一个膜蛋白分子可结合许多低聚糖分子, 而一个膜脂分子只可结合一个糖基或低聚糖的侧链 由于各种糖基的结合方式 排列顺序和分枝连接的样式千变万化, 使糖链极具多样性, 这是细胞相互识别的分子基础 唾液酸带有负电荷, 是形成细胞表面净负电荷的主要因素 糖链中的各种亲水基团吸引水分子和阳离子, 使细胞外被维持一定的 PH 值, 形成稳定的微环境 因而膜糖类在细胞的识别 粘着和迁移过程中起重要作用 ( 二 ) 细胞膜中的分子结构模型 电子显微镜下, 细胞膜呈二暗夹一明的三层式结构, 厚约 7~10mm, 这样三层结构的膜不仅普遍存在于各种细胞的表面, 而且细胞内的膜管系统一般也由类似三层结构的膜构成, 因此常称为单位膜 (unit membrane) 关于细胞膜的分子结构, 目前较公认的是液态镶嵌模型 (fluid mosaic model) 这个学说把生物膜看成是嵌有球形蛋白质的脂类二维排列的液态体 双层的膜脂构成膜的主体, 它既有固体分子排列的有序性, 又有液态的流动性, 呈液晶态 膜中球形嵌入蛋白分子以各种形式与膜脂双分子结合, 并可横向移动 其中每个类脂分子的亲水端都朝向细胞膜的内 外表面, 疏水端都朝向膜中央部 蛋白质分子不同程度嵌入类脂分子之间称嵌入蛋白, 另一部分蛋白质附在类脂分子的表面称表在蛋白 暴露于细胞外表面的蛋白质和部分膜脂分子, 可与多糖分子结合成糖蛋白和糖脂, 它们的糖链均伸向膜的外侧, 有些细胞表面的糖链密集, 称细胞衣 ( 图 2-1-7) 图 细胞膜分子结构模式图

32 二 细胞质 细胞质 (cytoplasm) 是细胞膜与细胞核之间的部分 生活状态中为透明的胶状物, 包括基质 细胞器和包含物 ( 一 ) 基质 基质 (matrix) 是指细胞质中的液态部分, 也是胞质的基本成分 由蛋白质 糖 无机盐 水和一些吸收入胞的物质等组成 基质内含有肌动蛋白 (actin) 和微管蛋白 (tubulin), 它们与胞质的溶胶 凝胶的可逆性变化有一定的关系 ( 二 ) 细胞器 细胞器 (cell organelles) 分布于胞质中具有一定的形态结构, 在细胞的生理活动中起重要作用 包括线粒体 核蛋白体 内质网 高尔基复合体 溶酶体 微体 微丝 中间纤维 微管和中心体等 1. 线粒体 (mitochondrion) 除成熟的红细胞外, 所有细胞均含有线粒体 它是细胞内物质氧化磷酸化 产生能量的重要结构 光镜下呈颗粒状或小杆状, 一般长约 1.5~ 3.0µm, 直径 0.5~1.0µm 电镜下为大小不等的圆形或圆柱形的小体 ( 图 2-1-8) 表面有单位膜包裹, 外膜平整, 内膜向内部折叠, 形成许多呈板状或管状的小嵴称线粒体嵴 嵴的排列方向可与线粒体的长轴垂直, 亦可由周边伸向中央 嵴的数目多少不定, 一般说, 氧化代谢功能强的细胞 ( 如心肌等 ), 其线粒体嵴密集 内膜和嵴的基质面上有许多带柄的颗粒称为基粒, 是含 ATP 酶的多组分复合体, 是氧化磷酸化的关键结构, 也是线粒体中的能量转换单位 嵴与嵴之间为嵴间腔, 充满了线粒体的基质, 其中含有丰富的酶, 包括有催化三羧酸循环 脂肪氧化 氨基酸分解和蛋白质合成的众多相关酶等 基质中并可见到直径为 32nm~50nm 的球形基质颗粒 颗粒内含 Ca 2+ Mg 2+ Zn 2+ 等离子 图 线粒体超微结构模式图 线粒体内含有的多种酶, 参与细胞内的物质氧化, 并将氧化所产生的能量形成高能磷酸化合物三磷酸腺苷 (ATP) 贮存起来, 当 ATP 分解成 ADP 时释出能量供细胞活动需要 因而线粒体是细胞的 供能站

33 2. 核糖体 (ribosome) 是细胞内蛋白质合成的场所, 为直径 15~25nm 的致密颗粒 其化学成分为核糖核酸和蛋白质, 由大 小两个亚基组成, 大 小亚基之间有明显的间隙 ( 图 2-1-9) 在蛋白质合成时,mRNA 分子从此间穿过, 可将多个核糖体串联起来形成多聚核糖体 每个核糖体就象一个合成蛋白质的装配车间 图 核糖体超微结构模式图 3. 内质网 (endoplasmic reticulum) 是分布在胞质中的膜管状结构 它由相互通连的扁平囊泡构成, 根据其表面有无核糖体的附着, 可分粗面和滑面两种 (1) 粗面内质网 (rough endoplasmic reticulum, RER): 由扁平囊泡和附在其表面的核糖体构成, 常在核周作层板状或同心圆状排列 ( 图 ) 粗面内质网参与蛋白质的合成和运输, 因此, 在合成外泌性蛋白质功能旺盛的细胞中, 如浆细胞 胰腺细胞等, 粗面内质网较丰富 图 内质网超微结构模式图

34 (2) 滑面内质网 (smooth endoplasmic reticnlum): 是一种分支管状或囊泡状的膜结构 ( 图 ), 膜的胞质面没有核糖体附着 一般细胞中滑面内质网较少, 而在肝细胞 分泌类固醇激素的细胞 汗腺细胞 小肠上皮细胞 胃腺壁细胞和肌细胞中, 滑面内质网较丰富 滑面内质网的功能较复杂, 不同细胞中的滑面内质网, 因其所含酶的种类不同, 其功能也不同 即使在同一个细胞中, 不同区域的滑面内质网也可有不同的功能 滑面内质网的功能大致有 :1 起着细胞内物质运输的管道作用 2 合成固醇类激素, 如肾上腺皮质细胞 3 参与脂类代谢, 如小肠上皮和肝细胞 4 参与糖代谢, 如肝细胞 5 贮存 释放 Ca 2+, 如肌细胞 6 参与生化转化和解毒, 如肝细胞 7 参与盐酸的合成, 如胃腺壁细胞 4. 高尔基复合体 (Golgi complex) 在光镜下呈网状分布于核周 主要参与细胞的分泌活动 在电镜下, 高尔基复合体包括有扁平囊泡群 大泡和小泡三个部分组成 作为主体的扁平囊泡由 3~10 层互相通连且平行排列的扁平膜囊组成 囊腔中央较宽, 连缘较窄, 排列成弓形 半球形或球形 切面上见膜囊堆向细胞核凸出的一面称为生成面, 面向细胞外方的凹入面为成熟面, 小泡又称运输小泡, 多分布于生成面 一般认为是由内质网形成并脱落下来的内含合成物的小泡 它与扁平囊泡融合后把合成物输入扁平囊泡, 经过加工, 浓缩, 由扁平囊泡周围的膨大部在成熟面脱落形成大泡 这些大泡有的是溶酶体, 分布于细胞质内, 有的是分泌颗粒, 逐渐移向细胞表面, 而后与细胞膜融合, 将内容以胞吐形式排出 ( 图 图 ) 图 高尔基复合体的超微结构模式图

35 图 细胞分泌 吞噬过程模式图 5. 溶酶体 (lysosome) 为直径 0.2~0.8µm 的圆形小体, 外有单位膜包裹, 其中充满着电子密度较高的物质 溶酶体内含有高浓度的酸性水解酶, 种类可达 60 余钟, 主要有蛋白酶 核酸酶 糖苷酸 脂酶 磷酸酶, 磷酸脂酶和硫酸脂酶等 这些酶在酸性环境中 ( 最适 ph 值为 5), 能对相应的底物进行消化 溶酶体具有多形性和异质性, 不同类型的溶酶体, 其大小 形态和所含的酶都有区别 溶酶体的酶在粗面内质网中合成后, 被输送到高尔基复合体中浓缩 加工 包装最终形成溶酶体 刚形成的溶酶体, 其中只含有酸性水解酶, 称为初级溶酶体 (primary lysosome) 当其与底物融合物后, 即称次级溶酶体 (secondary lysosome) 底物若来自细胞外, 如细胞 病毒 衰老的细胞 组织等, 称为异噬性溶酶体 ; 底物若来自细胞本身, 则称为自噬性溶酶体 在异噬性溶酶体中, 若底物为吞噬体 ( 固态 ), 又称为吞噬性溶酶体 ; 若底物为多个吞饮小泡 ( 液态 ), 则称为多泡体 溶酶体进行消化过程中形成的小分子物质, 可通过溶酶体的膜或膜载体蛋白的转运, 重新释入胞质中被利用 消化不了的残渣累积在溶酶体中形成残余小体 (residual body), 可通过胞吐作用排出, 或长期残留在细胞内 根据残余物的不同, 可形成脂褐素 含铁小体和髓样结构等 溶酶体是细胞内的 消化器, 起消化和营养作用 无论外源性物质和内源性物质均可被分解成小分子以供细胞利用, 后者更是细胞结构更新的一种手段 此外, 溶酶体膜破裂引起细胞的自溶和溶酶体酶的外释引起组织的溶解, 在胚胎发育和组织更新中起重

36 要作用 特殊的溶酶体 精子的顶体, 有序地释放多种水解酶, 是受精中不可缺少的步骤 此外, 溶酶体还参与机体的防御和免疫功能 激素的合成和分泌的过程等 6. 微体 (microbody) 又称过氧化物酶体 (peroxisome), 为圆形或卵圆形膜包的小囊泡, 比溶酶体稍大, 直径为 0.2~1.7µm 囊内为电子密度较高的微细颗粒 微体内含有过氧化酶和过氧化氢酶, 具有解毒功能 其中的过氧化酶能利用分子氧, 在氧化反应中去除特异底物 (R) 上的 H 原子, 生成过氧化氢 (H 2 O 2 ), 然后, 过氧化氢酶又利用 H 2 O 2 氧化其他各种底物 (R ), 把过氧化氢还原成水 RH 2 + O 2 R + H 2 O 2 H 2 O 2 + R H 2 R + H 2 O 7. 微丝 (microfilament) 为直径 5~7nm 长短不定的细丝, 由肌动蛋白 (actin) 组成, 广泛分布于各种细胞内 除在肌细胞形成细肌丝, 非肌细胞的某些特殊部位, 如吸收细胞微绒毛的轴心等处, 是一种稳定的结构外, 大多数情况下, 微丝是一种动态结构, 可随细胞功能状态变化而聚 散 微丝与细胞的运动 吞噬 分泌 神经递质等活性物质的释放等功能密切相关, 同时微丝还参与形成细胞骨架, 维持细胞的形态 8. 中间丝 (intemediate filament) 为直径约 10nm 的中空管状细丝, 常单根或成束地分布于细胞质中, 外与胞膜及细胞外基质相连, 内与细胞核的纤维层 微管 微丝和其他细胞器相连, 成为细胞骨架的主体 根据其组成成分不同, 可分为角蛋白纤维 波形蛋白纤维 结蛋白纤维 神经原纤维和神经胶质纤维 9. 微管 (microtubule) 为中空圆柱状结构的小管, 外径约 25nm, 内径约 15nm, 长度从数微米到几厘米不等 微管蛋白组成的 13 条原纤维呈螺旋状围列而成, 可呈单管 双联管和三联管 ( 图 ) 图 微管结构模式图 微管常散在分布于胞质中 有时可见微管壁上沿纵向的一定间距伸出臂状突起, 与相邻微管呈桥状连接, 并可延伸到相邻的质膜 ( 如核膜 内质网膜 胞膜和与之靠近的小泡质膜等 ) 除了在纤毛和鞭毛中的微管为稳定的结构外, 其余各处的微管也是一种能随细胞功能变化而聚 散的动态结构 细胞中的微管组织中心是形成微管的地方, 包括间期细胞的中心体 分裂期细胞的中心体和染色体的动粒和纤毛 鞭毛的基体 10. 中心体 (centrosome) 包括中心粒和中心球 电镜下的中心粒是一对互相垂直的

37 圆筒状小体, 直径 0.16~0.26µm, 长度变动于 0.16~5.6µm 之间 每个中心粒由 27 个微管组成 9 组三联管呈 30 度倾斜排列而成, 形似风车 ( 图 ) 在一对中心粒周围是一团电子密度高的中心粒周围物质 (pericentriolar material, PCM) 即中心球, 是细胞内微管组织中心, 能将微管蛋白组装成微管 中心体能复制, 参与细胞分裂活动 当细胞进入分裂期, 已复制的中心体彼此分开, 并借助纺锤丝与染色体相连, 使染色体随中心体向细胞两极移动 中心体能产生纤毛及鞭毛, 参与细胞的运动 图 中心体和中心粒的结构模式图 ( 三 ) 包含物 包含物 (inclusion) 为细胞内贮存物和代谢产物, 如脂滴 糖原和色素等 包含物的数量随细胞的生理状态不同而变化, 如进食后肝细胞的糖原增多, 肌饿时则减少 三 细胞核 除成熟的红细胞外, 人体内所有细胞都有细胞核 (nucleus) 细胞核的形态常与细胞的形态相关 细胞呈圆形 卵圆形 多边形或立方形, 其胞核常为圆形 ; 细胞为柱状, 其胞核常为椭圆形 ; 细胞为梭形, 其胞核常呈杆状 少数细胞的胞核呈不规则形, 如颗粒白细胞的核常分 2~5 叶 多数细胞只有一个胞核, 有些细胞可有双核, 如心肌 部分肝细胞等 大多数细胞其胞核与胞质比例较恒定 胞核约为胞质的 1/3~1/4, 一般幼稚的细胞核较大, 衰老的细胞核较小 细胞核是由核被膜 核基质 核仁和染色质组成 ( 一 ) 核被膜 光镜下可见核的表面有明显的界膜, 即核被膜 (nuclear envelope) 电镜下观察证明核膜为特殊的生物膜, 包括内 外二层厚约 6~8nm 的单位膜和两者之间的核周间隙 核膜上分布着许多由内外两层核膜融合形成的核孔 (nuclear pore), 它是细胞核与细胞质间物质

38 交换的一个通道 外核膜上的胞质面附有大量核糖体, 与粗面内质网的结构极为相似, 在某些部位还可见外核膜与粗面内质网相续 因此, 可以认为外核膜是内质网的特化区域, 核被膜是细胞膜系统的一个部分 内核膜的内面紧贴着一层网格状的纤维层称为核纤层 (nuclear lamina, fibrous lamina) 核周间隙一般宽约 20~40nm, 其中含有一些纤维状或晶体状的沉淀物 脂滴 各种电子密度的物质和酶等 核周间隙与内质网腔通连, 是细胞核与细胞质交流的重要通道 ( 图 ) 图 细胞超微结构模式图 ( 二 ) 核基质 核基质 (nuclear matrix) 的传统概念是指细胞核内除染色质和核仁以外的无定形液态部分 近年来采用新方法处理游离的细胞核, 发现其中存在着蛋白质纤维的网架结构体系, 并与核纤层共同构筑成核骨架, 使细胞核维持一定的形状, 同时为细胞核内的化学反应提供了空间支架 ( 三 ) 核仁 核仁 (nucleolus) 呈球形, 多为 1~2 个, 也有 3~5 个, 个别细胞无核仁 核仁的位置不定, 数量及大小常依细胞的类型和机能状态而改变, 一般是蛋白质合成快 生长旺盛的细胞核仁较大或多, 如神经细胞 原血细胞和胰腺分泌细胞等 ; 蛋白质合成不活跃的细胞核仁小而少甚至不见, 如精子细胞 G 0 期淋巴细胞和肌细胞等 细胞分裂前期核仁消失, 末期又重新出现 核仁的组成成分是 11% 的 RNA 和 80% 的蛋白质, 少量的 DNA

39 电镜下, 核仁由颗粒和纤维两部分组成, 外无被膜 核仁是形成核糖体的部位, 核蛋白体形成后通过核孔进入细胞质 ( 四 ) 染色质 染色质 (chromatin) 是指间期核内被碱性染料染成细丝状 细颗粒状和小块状的深色物质, 散布在核内, 核膜下常分布较多 染色质由 DNA 组蛋白和非组蛋白组成 其基本结构单位为 DNA 和组蛋白组成的核小体 (nucleosome), 染色质的一级结构为直径 10nm 的核小体链, 其再以螺旋和折叠的方式有序而非均一地集缩, 高度集缩的即成光镜下所见的异染色质 (heterochromatin), 低度集缩的只能在电镜下看到即常染色质 (euchromatin) 后者转录功能相对活跃 当细胞分裂时染色质高度地螺旋折叠形成染色体 ( 图 ) 图 染色质纤维螺旋折叠形成染色体示意图 ( 五 ) 染色体 染色体 (chromosome) 和染色质是同一物质的不同机能状态 细胞进入分裂期时, 每条染色丝均高度螺旋化, 变粗变短, 形成染色体 常规的核型分析, 都是以分裂中期的染色体为准 此时的染色体均由二条单体组成, 在着丝点 ( 原缢痕 ) 处相连 着丝点把染色单体分为长臂和短臂, 两臂的长度是鉴别染色体的重要标志 有的染色体臂上出现色浅的绞窄部, 称次缢痕 ; 有的染色体短臂上连有随体 (satellite) 根据着丝点的位置不同可将染

40 色体分成 : 中央着丝点染色体 亚中央着丝点染色体 近端着丝点染色体和顶端着丝点染色体 4 种 ( 图 ) 人有 46 条 (23 对 ) 染色体, 其中 1~22 对是男女均有的常染色体 (autosome), 第 23 对男女不同, 称性染色体 (sex chromosome), 男性为 XY, 女性为 XX 每对中二条染色体称为同源染色体, 其上有等位基因 按染色体的大小及着丝点的位置, 可将 23 对染色体分成 A B C D E F G 七组 ( 图 ) 图 染色体类型模式图 图 正常男性染色体及组型最后一对性染色体 XY

41 染色体是遗传物质的载体, 其功能单位为基因 (gene), 每个基因在染色体上都有其固定的位置称为基因位点 据估计人类基因组 ( 单倍体的全部基因 ) 内的蛋白质编码的结构基因为 5~10 万个 每个基因是一个 DNA 片段, 其携带的遗传信息决定一个遗传性状 一对同源染色体一条来自父方, 一条来自母方, 其形状相同, 他们在相同位置上所拥有决定一遗传性状的基因称为等位基因 第三节细胞分裂 细胞分裂 (cell division) 是细胞的增殖方式, 并以此繁衍后代 一个细胞分裂后形成两个子细胞 细胞的分裂是一个连续变化过程, 先是细胞核分裂, 继而出现细胞质分裂 细胞分裂有有丝分裂 (mitosis) 无丝分裂 (amitosis) 和成熟分裂 无丝分裂又称直接分裂, 在人体只偶见于肝细胞 肾小管上皮细胞和肾上腺皮质细胞有不完全的无丝分裂, 即细胞核拉长一分为二, 但胞质不分裂, 从而形成双核细胞 而成熟分裂只发生在生殖细胞的分裂, 又称减数分裂, 将在胚胎学和生殖系统讲述, 本章仅介绍有丝分裂 有丝分裂是最普通的细胞分裂方式 在早期的研究中, 光镜下观察到细胞分裂过程中出现细丝, 因而称为有丝分裂 细胞一分为二的过程是连续的, 为描述方便, 传统地把整个分裂过程人为地分为前期 中期 后期和末期 1. 前期 (prophase) 细胞从 G 2 期进入前期时细胞骨架微管解聚 细胞变圆, 胞质内形成微管蛋白库 细胞核内的染色质逐渐浓缩形成可分辨的细长条形染色体, 每条染色体由两条姊妹染色单体以着丝点相连形成 此时 rrna 不再形成, 核仁解聚消失, 核内骨架的非组蛋白部分参与染色体形成, 核被膜消失 间期复制的两个中心体开始分离向细胞两极移动, 并向周围发出辐射状细丝构成星体, 两星体的细丝相连形成纺锤体 这些细丝均为成束排列的微管组成 2. 中期 (metaphase) 染色体更致密而明显, 都集中排列在赤道平面上, 形成赤道板, 从两极向中间看, 染色体主要排列在赤道平面的周边部, 呈花环状, 从侧面看为 一 字形 两个中心体已分别移到细胞的两极, 纺锤体更明显, 纺锤丝与每条染色体的着丝点相连 3. 后期 (anaphase) 染色体在着丝点处已完全分离, 各自成为染色单体, 两组染色单体受纺锤丝的牵引, 逐渐向细胞两极移动, 分到两极的染色单体与原来的染色体数目相等 与此同时, 赤道部的细胞质缩窄拉长呈哑铃形 4. 末期 (telophase) 染色体已到达两极, 再度解螺旋成为染色质丝 核膜和核仁重新出现, 形成新的细胞核 细胞缩窄处继续变细, 最后分开, 形成两个子细胞 ( 图 )

42 图 细胞有丝分裂模式图 第四节细胞周期 细胞周期 (cell cycle) 又称细胞生活周期或细胞增殖周期 (cell generation cycle), 是指细胞从前一次分裂结束到下一次分裂结束为止所经历的整个过程 细胞增殖周期一般可分两个阶段, 间期 (interphase) 和分裂期 (mitotic phase, M) 间期又根据细胞中 DNA 合成的情况, 分为 DNA 合成前期 (first gap, G 1 ) DNA 合成期 (synthesis phase, S) 和 DNA 合成后期 (second gap, G 2 ) 分裂期又分为前期 中期 后期 末期 间期是周期中细胞生长 新陈代谢与物质合成最活跃的时期, 主要表现在 DNA 合成, 含量倍增, 以及 RNA 和蛋白质的持续合成 通过间期的物质合成, 细胞体积增长一倍 分裂期主要是通过细胞分裂的调控机制, 准确均等地将间期合成的遗传物质 DNA 和胞质成分分配到两个子细胞中去, 以维持生物遗传的稳定性 一 G 1 期 G 1 期是指细胞分裂结束到 DNA 合成期开始前, 是子细胞生长发育的时期 G 1 期主要进行 RNA 及蛋白质的大量持续合成 趋向分化的细胞在 G 1 期还合成与该细胞特殊形态及功能相关的蛋白质 对于增殖型的细胞,G 1 期则为细胞进入 S 期作各种准备, 例如 DNA 合成诱导物 DNA 复制所需的各种前体物质和酶等 目前一般认为 G 1 期存在着细胞增殖限制点 (restriction point, R) 根据是否通过 G 1 期的限止点, 可将 G 1 期细胞分成三种类型 1 不再增殖细胞 : 又

43 称不育细胞或终末分化细胞 该类细胞自分裂后, 停止在 G 1 期, 不再增殖, 进入分化阶段, 形成执行特定功能的细胞 如红细胞, 心肌细胞, 神经细胞等 2 继续增殖细胞 : 细胞不断进入周期分裂增殖 这类细胞一般分化程度较低 如骨髓造血干细胞 皮肤表皮基底层细胞 小肠腺细胞和精原细胞等 3 暂不增殖细胞 : 这类细胞已经分化, 但长期停留在 G 1 期, 处于静止状态, 因而又称 G 0 期细胞 ( 图 ) G 0 期细胞代谢水平低, 保持增殖能力, 在一定条件下可重新进入细胞周期分裂增殖 如肝 肾的实质细胞 淋巴细胞 成纤维细胞等 图 G 1 期细胞演化示意图 二 S 期 S 期是 DNA 合成期, 细胞中的 DNA 经过复制, 含量加倍 同时 S 期还转录 RNA, 合成 S 期需要的蛋白质 酶 其中组蛋白的合成是与 DNA 复制同时进行, 互为条件, 互相依赖 组蛋白在胞质合成后, 经核孔转移至核内与 DNA 共同组成染色质 S 期结束时, DNA 含量由 2N 增至 4N 正常情况下, 细胞一旦进入 S 期, 即可自动地持续下去直至完成分裂 S 期持续时间比较恒定 三 G 2 期 G 2 期是 DNA 合成后期, 其主要特征有 2 个 :1 合成细胞有丝分裂有关的蛋白质, 如有丝分裂促进因子, 微管蛋白等 2 染色体开始螺旋化, 产生凝集和浓缩 另外, 一些使核膜解体的可溶因子也出现在 G 2 期的晚期 G 2 期结束后 M 期开始, 细胞随即开始分裂 ( 王金茂 )

44 第二章细胞的基本功能 细胞是组成人体和其它生物体的基本结构和功能单位 体内所有的生理功能和生化反应都是在细胞及其产物的物质基础上进行的 可以认为, 离开了对细胞及构成细胞的各种细胞器的分子组成和功能的认识, 要阐明物种进化 生物遗传 个体的新陈代谢和各种生命活动等生物学现象, 要阐明整个人体和各系统 器官的功能活动的机制, 将是不可能的 因此, 要了解整个人体和各系统 器官生命活动的根本道理, 首先学习细胞的基本功能是很有必要的 第一节细胞膜的物质转运功能 细胞膜又称质膜 (plasma membrane), 是细胞和环境之间的屏障, 可使细胞内容物和细胞外界环境分隔开, 使细胞能独立存在于环境之中 细胞可通过细胞膜从外界环境中获得氧气和营养物质, 排出细胞的代谢产物, 以进行物质交换从而使细胞内各种物质和离子成分维持相对恒定 因此, 细胞膜必然是一个具有特殊结构和功能的半透膜, 它允许某些物质或离子有选择地通过 膜除了有物质转运功能外, 还有跨膜信息传递和能量转换功能, 这些功能的机制是由膜的分子组成和结构决定的 膜成分中的脂质分子层主要起了屏障作用, 而膜中的特殊蛋白质则与物质 能量和信息的跨膜转运和转换有关 根据液态镶嵌模型学说, 细胞膜主要由液态双分子层的脂质构成, 因此, 理论上只有脂溶性物质才能自由通过细胞膜 但事实上细胞在新陈代谢过程中, 不断有各种各样的物质 ( 其中多数为水溶性 ) 进出细胞, 说明细胞膜具有复杂的物质转运功能 目前的研究资料表明, 这些物质中除极少数能够直接通过脂质双分子层进出细胞外, 大多数物质进出细胞都与膜上特定的蛋白质有关 至于一些大分子或团块物质进出细胞, 则需要通过膜的变形 断裂和再融合等更为复杂的生物学形式才能进行 常见的细胞膜物质转运形式有单纯扩散 易化扩散 主动转运 出胞和入胞 一 单纯扩散 溶液中溶质或溶剂分子由高浓度区向低浓度区的净移动称扩散 (diffusion) 物质分子移动量的大小, 可用扩散通量 (flux) 来表示 扩散通量是指某种物质每秒钟通过每 cm 2 面积的克分子 ( 或毫克分子 ) 数, 一般情况下, 它与该溶质浓度差或浓度梯度 ( 指单位距离上的浓度差 ) 成正比, 如果是含有多种溶质的混合溶液, 那么, 每一种物质的扩散方向和扩散通量只取决于这种物质自身的浓度差, 而与其他物质的浓度和扩散量无关 在电解质溶液中, 离子的移动不仅决定于该离子的浓度差, 还决定于离子所受的电场力 ( 电位差 ) 物质的扩散通量不仅决定于膜两侧的浓度梯度, 还决定于膜对物质通过的难易程度, 即膜对这一物质的通透性 (permeability) 在生物体系中, 脂溶性物质顺浓度差的跨细胞膜的转运 ( 由膜的高浓度区一侧向膜的低浓度区一侧的净移动 ) 称单纯扩散 (simple diffusion)

45 单纯 一词的含义在于说明这是一种单纯的物理过程, 以区别于体内其他复杂的物质转运机制 由于膜基架是由脂质双分子层组成, 故只有脂溶性强的物质才能靠单纯扩散形式通过细胞膜 然而, 体内依靠单纯扩散方式通过细胞膜的物质较少, 比较肯定的有 O 2 CO 2 和 NO 等脂溶性气体分子, 可以靠其膜内外的浓度差 ( 分压差 ) 迅速通过脂质双分子层 其它大多数物质, 通过细胞膜均需依靠膜上某种蛋白质的帮助 二 易化扩散 在体内一些不溶于脂质或难溶于脂质的物质如葡萄糖 氨基酸和各种离子等, 本身很难通过细胞膜, 但在细胞膜上一些特殊蛋白质的帮助下, 能由细胞膜的高浓度一侧向低浓度一侧转运, 这种转运形式称易化扩散 (facilitated diffusion) 其扩散通量的大小也与被转运物质的浓度差和细胞膜对该物质的通透性有关 ; 在电解质溶液中还取决于被转运的带电荷物质所受的电场力的大小, 物质的净移动取决于这种物质自身的电位差与浓度差的代数和 ( 电 - 化学梯度 ) 与易化扩散有关的不少转运蛋白质已经提纯, 但关于其转运机制尚不清楚, 目前普遍被接受的是以载体 (carrier) 为中介的易化扩散和以通道 (channel) 为中介的易化扩散两种类型 ( 一 ) 以载体为中介的易化扩散 细胞膜上有许多专一的载体蛋白 每一种载体一般只能和一种物质结合, 从而帮助它们进出细胞膜 载体与酶不同, 它不起催化作用, 在转运过程中并不改变被转运物质的状态, 而载体本身的状态或构型却发生变化 载体转运的物质主要是一些小分子有机物如葡萄糖和氨基酸等 以载体为中介的易化扩散有以下一些特点 : l. 结构特异性膜的各种载体蛋白质与它所转运的物质之间有着高度的结构特异性, 即每一种载体蛋白质只能转运具有某种特定结构的物质 在相同的浓度梯度下, 右旋葡萄糖的跨膜转运量比左旋葡萄糖大得多 2. 饱和现象即膜一侧物质浓度增加超过某一限度时, 转运量就不再增加, 这是由于膜表面与某一转运物质有关的载体蛋白质有一定数目或每一载体上能与该物质结合的位点有一定数目, 这就使对该物质转运能力有一最大极限, 超过了这个极限, 再增加转运物质的浓度, 并不能使转运量增加 3. 竞争性抑制如果某一载体对 A 和 B 两种结构类似的物质都有转运能力, 那么在环境中加入 B 物质将会减弱它对 A 物质的转运, 这是因为有一定数量的结合位点竞争性地被 B 所占据的结果 ( 二 ) 以通道为中介的易化扩散 这种形式的转运是通过膜上特殊的通道蛋白质 ( 简称通道 ) 进行的, 转运的物质主要是一些离子, 如 K + Na + Ca 2+ 等正离子以及某些负离子 通道蛋白质也有特异性, 通常一种通道只允许一种离子通过, 因而有钾通道 钠通道和钙通道等之分 通道蛋白质转运离子的机制, 可能是由于细胞膜上的特殊蛋白质分子构成了具有高度选择性的亲水孔道, 容许适当大小和带有适当电荷的离子通过 细胞膜对某种离子的通透性的大小, 取决于开放的通道数目的多少, 开放通道数目愈多, 通透性愈大 一般离子通道大部分时间是关闭的, 在一定条件下开放的机率大大增加 这种通道的开放或关闭现象称为阀门 (gate) 控制或门控, 蛋白质分子构型改变是门控的物质基础 另外, 有部分离子通道是持续开

46 放的, 并无阀门控制, 称为非门控通道 传统上, 根据引起通道开放条件的不同, 门控通道大致可分为三类, 即电压门控通道 (voltage-gated channel) 配基门控通道 (ligand-gated channel) 和机械力敏感通道 (mechanosensitive channel)( 图 2-2-1) 电压门控通道对膜电位变化敏感, 通道的开放或关闭决定于通道蛋白质所在膜两侧的电位差 ; 配基门控通道的开闭决定于膜两侧是否存在特定的化学配基 ; 机械力敏感通道是当细胞受各种机械力刺激时开启的通道 图 电压门控通道 配基门控通道和机械力敏感通道开放和关闭的示意图 通道蛋白质对被转运物质有特异性, 但不如载体蛋白质那样严格 通道蛋白质功能状态的改变常常是突然的, 当膜两侧的电位差由于某种原因变化到某一临界值时或当膜表面受到某种化学信号作用时或膜受到牵张时, 通道蛋白质分子的构型突然改变 ( 阀门打开 ), 在其分子中出现适合该离子通过的水相孔道, 允许某一种或几种离子由膜的一侧转运到另一侧 通道的开放是有条件的 短暂的 通道的开放造成了带电离子的跨膜移动, 这固然是一种物质转运形式, 但从生理意义上看, 载体和通道活动的功能意义不尽相同 当通道的开放引起带电的离子跨膜移动时, 移动本身形成跨膜电流 ( 即离子电流 ); 而移位的带电离子会造成膜两侧电位差即跨膜电位, 而跨膜电位的改变以及进入膜内的离子 ( 特别是 Ca 2+ ), 将会引起该通道所在细胞一系列的功能改变 离子通道可被某种毒物或药物选择性地阻断, 这些物质被称为通道阻断剂, 如河豚毒 (tetrodotoxin) 可阻断钠通道, 四乙胺 (tetraethylammonium) 可阻断钾通道等 在单纯扩散和易化扩散中, 物质的分子或离子都是顺着浓度差或电位差移动的 这些物质移动时, 所消耗的能量均来自浓度差和电位差本身所包含的势能, 无需消耗细胞

47 代谢产生的能量, 因此, 单纯扩散和易化扩散都属于被动转运 (passive transport) 三 主动转运 主动转运 (active transport) 是指细胞通过本身的某种耗能过程, 在细胞膜上一些蛋白质的协助下, 将某些物质分子或离子经细胞膜逆浓度梯度或电位梯度转运的过程 按照热力学定律, 溶液中的分子由低浓度区域向高浓度区域移动, 必须由外部供给能量 在膜的主动转运中, 这能量只能由膜或膜所属的细胞来供给, 这就是主动的含义 细胞膜通过被称为 泵 的膜蛋白质的协助, 物质逆浓度梯度或电位梯度转运, 细胞需消耗能量 主动转运按其利用能量形式的不同, 又可分原发性主动转运 (primary active transport) ( 由 ATP 直接供能 ) 和继发性主动转运 (secondary active transport) ( 由 ATP 间接供能 ) ( 一 ) 原发性主动转运 原发性主动转运的能量直接来自 ATP 的分解, 其中以 Na + K + 的转运最重要, 研究也最充分 早已知道细胞膜内外各种离子的浓度差别很大, 以神经细胞和肌细胞为例, 正常时 K + 浓度在膜内比膜外高 30 倍, 而 Na + 浓度膜内比膜外低 12 倍 这种细胞膜内外 Na + K + 离子的不均匀分布, 是依靠细胞膜中的钠 - 钾泵 (sodium-potassium pump) 的活动来保持 ( 图 2-2-2) 钠 - 钾泵简称钠泵, 又称为 Na + -K + 依赖式 ATP 酶 (Na + -K + dependent ATPase), 它是一种糖蛋白, 其分子量约为 25 万, 钠泵蛋白质已用近代分子生物学方法克隆出来, 它们是由 α 和 β 亚单位组成的二聚体蛋白质, 肽链多次穿越脂质双分子层, 是一种整合蛋白质 α 亚单位有转运 Na + K + 和促使 ATP 分解的功能,β 亚单位作用还不很清楚 钠泵蛋白质的启动和活动强度与膜内出现较多的 Na + 和膜外出现较多的 K + 有关, 它的活性可因细胞膜内 Na + 的增加或细胞外 K + 的增加而激活, 也可因膜内缺 Na + 或膜外缺 K + 而减弱 钠泵活动时, 它泵出 Na + 和泵入 K + 这两个过程是同时进行或耦联在一起的 根据对红细胞等的研究发现, 在一般生理情况下, 钠泵每分解一个 ATP 分子可泵出 3 个 Na +, 同时泵入 2 个 K + 故可以认为, 在这种情况下钠泵是一种生电性泵 (electrogenic pump), 即它对 Na + K + 的主动转运可使细胞内正离子减少 但这种化学定比关系并不是一成不变的, 在不同的生理病理情况下是可变的 图 Na + -K + 泵作用机理模式图

48 钠泵广泛存在于身体的各种细胞的细胞膜上 据估计, 在机体的新陈代谢中利用能源物质所释放的能量, 约 20%~30% 用于钠泵的运转 钠泵活动具有重要的生理意义 :(1) 由钠泵形成的细胞内高 K +, 是许多代谢反应进行的必需条件 ;(2) 维持细胞正常的渗透压与形态 在细胞内具有不能通过细胞膜的带负电荷的大分子物质, 因而经常存在着细胞外小分子物质 ( 主要是 Na + ) 向胞内渗漏,Na + 进入就有可能把水带入细胞, 使细胞有发生肿胀解体的倾向 由于细胞膜存在着 Na + -K + 泵, 后者分解 ATP 提供能量, 不断驱出 Na +, 结果使细胞内的钾浓度较高和钠浓度较低, 细胞膜内外一定的 Na + 浓差是保持细胞的渗透压稳定和正常形态的主要因素 ;(3) 形成和保持细胞内外 Na + K + 不均匀分布及建立一种势能贮备 膜上的离子通道一旦开放,Na + K + 便可迅速地进行跨膜扩散, 这是神经和肌肉组织具有兴奋性的基础 ; 另外, 建立的 Na + 浓度势能贮备是一些营养物质 ( 如葡萄糖 氨基酸 ) 跨小肠和肾小管上皮细胞等继发性主动转运的能量来源 原发性主动转运是人体最重要的物质转运形式, 除上述的钠泵外, 目前了解较多的还有钙泵 ( 或称 Ca 2+ -Mg 2+ 依赖式 ATP 酶 ) H + 泵 ( 质子泵 ) 和碘泵等 这些泵蛋白都以直接分解 ATP 为能源, 对有关离子进行转运 钙泵分布在各种肌细胞 骨细胞及红细胞等膜结构上 钙泵的作用是主动转运 Ca 2+, 且只有 Ca 2+ 和 Mg 2+ 存在时, 才能维持其活性 肌质网钙泵活动时, 水解一个 ATP 分子可将肌细胞浆中两个 Ca 2+ 转运进入肌质网内, 使胞浆中 Ca 2+ 浓度下降, 而诱发肌肉的舒张 质子泵是一种推动质子 (H + ) 跨膜运动的酶蛋白, 存在于细胞膜 线粒体膜和囊泡状细胞器的包膜中 这些质子泵的主要化学成分和功能是极为相似的, 是一种能水解 ATP 产生能量 推动质子逆浓度梯度转运的酶 目前对细胞膜 ( 胃壁细胞膜 ) 和线粒体膜两种质子泵的研究较多 胃壁细胞膜上的质子泵, 目前所知是一种 K + -H + 交换的 ATP 酶, 能水解 ATP 释放能量, 使 H + 逆着浓度梯度由膜内向膜外转运, 同时将 K + 由膜外向膜内转运, 成电中性的跨膜离子交换转运, 使壁细胞分泌盐酸 线粒体膜的质子泵, 既能促进 ATP 分解, 又能促进 ATP 的合成, 与代谢能转化为 ATP 的高能磷酸键有关 此外, 在甲状腺细胞膜上有碘泵存在, 与甲状腺的聚碘作用有关 ( 二 ) 继发性主动转运 据观察, 小肠和肾小管上皮细胞等处葡萄糖和氨基酸转运过程的耗能, 并不直接伴随供能物质 ATP 的分解, 它们的跨膜转运决定于细胞外 Na + K + 的存在 现认为上皮管腔侧细胞膜上的转运葡萄糖载体蛋白质有两个结合位点, 分别与葡萄糖和 Na + 结合, 因此, 转运时两者一起进入细胞内, 同时细胞又不断地依靠基底侧膜上的钠泵分解 ATP 提供能量, 将 Na + 由细胞内泵出而形成 Na + 在细胞内浓度低 腔内浓度高的势能贮备, 势能贮备又被用来驱动葡萄糖逆浓度梯度进入细胞 这里葡萄糖所以能够主动转运, 所得能量并不直接来自 ATP 的分解, 而是来自细胞内外 Na + 的势能差, 但造成势能差的钠泵活动是需要分解 ATP 的, 因此, 葡萄糖的主动转运所需的能量还是间接来自 ATP, 为此人们把这种不直接利用分解 ATP 释放的能量, 而利用膜内外势能差进行的主动转运称继发性主动转运 因这种继发性主动转运葡萄糖的方向与提供势能差物质 Na + 的转运方向相同, 故又将这种继发性主动转运称为同向转运 (co-transport) 相反, 在几乎所有细胞的细胞膜上的 Na + -Ca 2+ 交换, 因继发性主动转运 Ca 2+ 的方向与提供势能差物质 Na + 的转运方向相反, 故将这种继发性主动转运称为逆向转运 (counter-transport) ( 图 2-2-3)

49 图 继发性主动转运示意图 四 入胞和出胞 大分子物质或物质团块不能通过上述的细胞膜蛋白质 ( 载体 离子泵等 ) 进行转运, 而是由细胞膜本身的运动来进行细胞内外的物质交换 根据被转运物质进出细胞的方向不同, 可分为入胞 (endocytosis) 和出胞 (exocytosis) 两种过程 ( 一 ) 入胞 入胞是指细胞外某些物质团块 ( 如蛋白质 脂肪颗粒 侵入体内的细菌或异物等 ) 进入细胞的过程 如果进入的是固体物质, 此过程称为吞噬 (phagocytosis); 如为液体则称为吞饮 (pinocytosis) 入胞过程首先是物质被细胞膜所识别, 接着与这些物质相接触的部分膜发生内陷, 并逐渐将其包绕, 然后细胞膜发生融合, 于是这些物质和包绕它的那部分膜进入胞浆内, 形成一个吞噬泡, 最后这些吞噬泡与溶酶体融合, 其内容被溶酶体内所含的各种酶消化 近年来发现, 细胞对吞噬物和吞饮物的辨认, 与细胞表面所存在的特殊受体有关 许多物质的入胞, 首先要和膜上的相应受体结合, 结合后的受体通过横向移动可向膜的一些被称为覆衣凹陷 (coated pits) 的特殊部位集中 在一个凹陷处, 一旦集中了一种受体结合物, 其他的结合物则不能再进入, 然后该处的膜向胞内进一步凹入并形成吞噬泡 附着在吞噬泡的外侧 一同进入胞浆的原细胞膜上的蛋白性结构, 则可能仍返回细胞膜再形成新的覆衣凹陷 失去膜蛋白结构的吞噬泡, 进而与胞浆中称为胞内体 (endosome) 的膜性结构相融合 此胞内体的特点是内部具有较低的 ph 值环境, 有助于受体同与它结合的物质分离 ; 以后的过程是这些物质 ( 如进入细胞的低密度脂蛋白颗粒和铁离子等 ) 再被转运到能利用它们的细胞器, 而保留在胞内体膜上的受体, 则与一部分膜结构形成较小的循环小泡, 移回到细胞膜并与之融合, 再成为细胞膜的组成部分, 使受体和膜结构可以重复使用 ( 图 2-2-4)

50 以上这一系列过程被称为受体介导式入胞 (receptor-mediated endocytosis) 目前认为这是一种最重要的入胞形式 通过这种方式入胞的物质已不下 50 余种, 包括血浆低密度脂蛋白颗粒 运铁蛋白 胰岛素等多肽类激素 抗体 某些细菌毒素和一些病毒等 图 受体介导式入胞过程示意图 ( 二 ) 出胞 出胞是指一些大分子物质或固态 液态的物质团块由细胞排出的过程, 主要见于腺细胞中分泌物的排出以及神经细胞中神经递质的释放 细胞的各种分泌物大都在内质网合成, 在由内质网到高尔基复合体的输送过程中被一层膜性结构包被形成分泌小泡 (vesicle), 贮存在细胞内 当细胞受到膜外某些特殊的化学信号或膜两侧电位改变的刺激时, 小泡逐渐向细胞膜移动, 小泡膜和细胞膜接触, 相互融合, 并在融合处出现裂口, 将小泡内容物一次全部排空, 泡膜就成为细胞膜的组成成分 入胞和出胞过程均要消耗能量, 主要来自细胞内线粒体氧化过程中形成的 ATP 如上所述, 一般大分子物质或物质团块依靠细胞膜的运动通过入胞或出胞作用进出细胞膜 ; 小分子物质或离子通过主动或被动转运进出细胞 ; 物质逆电位梯度和 / 或逆化学梯度的主动转运, 需 泵 蛋白质参与, 细胞消耗能量 ; 被动转运顺电位梯度和 / 或顺化学梯度转运, 转运消耗的能量来自浓度差和电位差所含的势能 ; 被动转运又分单纯扩散和易化扩散 : 细胞膜对脂溶性物质通透性大, 脂溶性物质以单纯扩散转运 ; 易化扩散转运不溶于脂质 ( 水溶性 ) 的物质, 需细胞膜上的 载体 和 通道 蛋白中介来提高膜对此类物质的通透性

51 第二节细胞的生物电现象及其原理 当环境发生变化时, 生物体内的代谢及其外表活动将发生相应的改变, 这种改变称为生物机体的反应 (response) 能引起生物机体发生反应的各种环境变化, 统称为刺激 (stimulus) 一切具有生命活动的细胞 组织或机体对刺激都具有发生反应的能力或特性, 称为兴奋性 (excitability) 一切活组织的细胞, 不论在安静状态还是在活动过程中均表现有电的变化, 这种电变化是伴随着细胞生命活动出现的, 所以称为生物电 (bioelectricity) 如神经 肌肉和腺体等组织受刺激后, 能迅速产生特殊的生物电现象 ( 如动作电位 ) 及其它反应 在传统的生理学中, 将神经 肌肉和腺体组织通称为可兴奋组织 (excitable tissue), 而且将这些可兴奋组织接受刺激后所产生的生物电反应过程及其表现, 称之为兴奋 (excitation) 但是, 应当指出, 经典概念的可兴奋组织中, 有少数平滑肌细胞可以在受刺激后不产生生物电改变而出现收缩 一 细胞生物电现象的观察和记录 可兴奋组织在受到有效刺激后, 一般先是产生某种特殊的生物电反应 ( 动作电位 ), 随后出现肌肉的收缩和腺体分泌等外部表现 动作电位是大多数可兴奋细胞受刺激而兴奋时共有的特征表现, 又是这些细胞实现其功能的前提或触发因素 神经纤维上的动作电位称为神经冲动 由于运动神经的神经冲动诱发肌肉的兴奋和收缩表现最为灵敏, 因此常利用神经或肌肉标本进行生物电现象的研究 观察和记录组织或细胞的生物电活动的实验方法大体有两种, 即细胞外记录和细胞内记录 ( 一 ) 细胞外记录 早在示波器问世之前, 人们就曾应用灵敏电位计简单测定出神经干的生物电变化 阴极射线示波器和放大器的出现, 则能更准确并定量地观察和记录微弱及变化迅速的生物电现象 图 示由细胞外记录的神经干受刺激前后的电变化过程 把与电位计或示波器相连的两个测量电极和神经干的两点相接触 在神经未受刺激时, 电位计的指针固定在零位不动, 说明安静的神经干表面没有电位差存在 如在神经干的左端给予一次有效刺激后, 电位计指针出现方向相反的两次摆动, 在示波器上则记录下一个双向的电位波动 ( 图 2-2-5A) 这说明, 刺激使神经干产生一个由左至右传播的负电位 当负电位位于测量电极 a 下方的神经段时,a 点电位较 b 点为低, 两电极间出现电位差而引起电位计指针向一侧摆动 ; 负电位区继续右移, 当同时位于 a b 两电极下神经段 ( 图 2-2-5A) 或 a b 两电极距离足够大而位于 a b 两电极之间的神经段 ( 图 2-2-5B) 时,a b 两电极间的电位差相等, 则电位计指针回到零 ; 当负电位区右移至 b 电极下方神经段时, 两电极间又出现电位差 (b 点较 a 点为低 ), 引起指针向方向相反的另一侧摆动 如把上述电位变化显示在示波器上, 则得到一双相曲线 ( 图 2-2-5A B 上方 ), 称为双相动作电位 (biphasic action potential) 如果在实验中, 预先用药物 ( 如普鲁卡因 ) 在 a b 两点之间阻断神经干, 使神经干受刺激后产生的电变化不能传到 b 点, 则 b 点电位始终不变, 只能引起电位计指针作一次摆动, 由示波器描出的曲线称单相动作电位 (monophasic action potential), 见图 2-2-5C

52 图 神经纤维的细胞外动作电位记录 图上方的曲线为示波器记录曲线 其中的数字表示当神经冲动出现于下方各图解过程中的不同部位时, 记录电极所测得的瞬时电位 该图解中的阴影区表示神经冲动所在位置 ; 斜线区表示药物阻断区域 电流的方向由电流计中指针的位置表示 ( 二 ) 细胞内记录 用以上所述的细胞外记录方法记录得到的生物电活动, 实际上是许多在结构和功能上相互独立的神经纤维电变化的复合 目前, 这种方法已常用于一些在体器官或组织的无创伤性检查中 ( 如心电 脑电 胃电 视网膜电图等以及神经纤维传导速度的测定 ) 但是, 生物电现象是以细胞为单位产生的 只有对单一神经或肌肉细胞进行生物电的记录和测量, 才能对其数值和产生机制作直接和深入的分析 由于高等哺乳动物的细胞一般较为细小, 常常应用细胞内微电极方法记录, 即用细玻璃管制成的内充导电液体 ( 如 KCl) 的微型测量电极 ( 尖端直径 lµm) 或用尖端裸露的微型金属电极, 插入细胞内以测定该细胞在不同功能状态时膜内电位与膜外参考电极之间的电位差 ( 图 2-2-6) 当微电极位于细胞外时, 其与位于细胞膜外的参考电极之间不存在电位差, 示波器上显示一条水平的基线 当微电极穿破细胞膜插入细胞内时, 示波器上出现一个突然的负电位跃变, 这表明安静细胞膜内外两侧存在着电位差, 膜内电位相对比膜外参考电位为负, 故呈负电位 当细胞受到一次有效刺激, 膜内电位则经历一次短暂而急剧的电位变化 ( 即动作电位 ), 见图

53 图 用细胞内微电极技术 (A) 测定单一神经纤维的跨膜电位 (B) 模式图 二 细胞生物电现象的物理化学基础 如果在一层对所有离子具有相等通透性的膜两边, 分置不同浓度的盐溶液, 那么盐溶液中的正 负离子都会透过此膜 从浓度高侧透向浓度低侧的离子数必然较多, 最后会使膜两边的离子浓度相等, 两边往返的离子数也就相等, 即达到平衡状态 在这种情况下, 膜的两边不会存在电位差 如果在膜只对某种离子有通透性的条件下, 则情况就不同了 图 表示在没有 K + Na + 主动转运情况下的神经细胞 在图 2-2-7A, 细胞内 K + 浓度大大高于细胞外 K + 浓度 假设细胞膜只对 K + 有通透性而对其它离子不通透,K + 由于浓度势能差产生的化学驱动力而扩散到膜外, 同时 K + 也携带正电荷到膜外 而膜内带负电荷的离子和蛋白质不能随 K + 透出细胞膜, 于是 K + 外移使膜内变负而膜外变正 这种细胞膜内外两侧存在的电位差形成的电场驱动力, 具有阻碍带正电荷的 K + 继续透出细胞膜和迫使其返回细胞内的作用 在几个毫秒内, 这种电场驱动力足以阻止 K + 向膜外的净扩散 此时,K + 的跨膜化学驱动力和电场驱动力大小相等而方向相反, 膜两侧的电位差稳定于某一数值, 即处于电 - 化平衡状态 此时的电位差称为 K + 的平衡电位 (K + equilibrium potentia1,e K ), 在哺乳动物神经纤维约 -88mV( 细胞内负 ) 假如细胞外 Na + 浓度高于细胞内 Na + 浓度, 而膜只对 Na + 通透而对其它离子不通透, 那么膜外 Na + 扩散进入细胞内, 产生膜外变负而膜内变正 同时, 在数毫秒内, 这一电位差形成的电场驱动力就足以阻止 Na + 因浓度势能差而引起的进一步扩散 Na + 处于电 - 化平衡状态时的膜两侧的电位差称为 Na + 的平衡电位 (E Na )( 图 2-2-7B) 在哺乳动物神经纤维, 该 E Na 约为 +68mV( 细胞内正 ) 由上可知, 在一定条件下, 可选择性通过细胞膜的离子, 其跨膜浓度差可导致膜电位的产生 下面是两个根据膜两侧离子浓度计算平衡电位的公式

54 图 不同状态下神经细胞模型的 K + Na + 平衡电位 A: 膜只对 K + 有通透性 ;(A) - 为带负电荷的离子或蛋白质 ;B: 膜只对 Na + 有通透性 其余见正文说明 ( 一 )Nernst 公式 因离子浓度差引起的平衡电位可用物理化学上的 Nernst 公式计算 即任何单价离子的平衡电位大小取决于膜两侧该离子浓度的比值, 比值越大, 从高浓度侧向低浓度侧扩散的趋势越大, 平衡电位越大, 但前提是膜只对该离子通透 在正常人体温度 37 条件下, 某种单价离子的平衡电位 (E): Co E = 61 log( )( mv ) (1) Ci 式 (1) 中 Co/Ci 表示某种离子膜外 / 膜内的浓度比 设定细胞膜外电位为零, 计算得到的平衡电位是细胞膜内电位 例如,K + o/k + i = 1:10, 则 E K 为膜内 -61mV 单价阴离子的 E 应该与计算所得的极性相反, 如 C1 - 顺浓度梯度内流, 将使膜两边的电位成为外正内负 ( 二 )Goldman-Hodgkin-Katz 公式 Cl - o/cl - i = 30:1, 则 E Cl 为 -90mV 假如细胞膜对几种不同离子具有通透性, 则其总平衡电位取决于以下 3 个因素 :1 每种离子的荷电极性 (+ 或 -);2 膜对每种离子的通透性 (P);3 每种离子在膜内 (i) 外 (o) 两侧的浓度 当细胞膜对 Na + K + Cl - 具有一定的通透性, 膜两侧的总平衡电位可根据 Goldman-Hodgkin-Katz 公式 ( 或称 Goldman 公式 ) 算出 : + Na o PNa + K opk + Cl i PCl E = 61 log( ( mv ) (2) Na PNa + K PK + Cl PCl i + 这一方程与 Nernst 公式 ( 式 1) 比较可以看出, 它是 Nernst 公式的扩展 如果膜仅对 K + 有通透性而对 Na + 和 Cl - 均无通透性时,P Na+ 和 P Cl- 均为 0, 此时式 (2) 等于式 (1) 所得平衡电位实际上就是 E K ; 如膜仅对 Na + 有较大通透性而对 K + 和 Cl - 均不通透, 则 P K+ 和 P Cl- 为 0, 此时所得的 E 则等于 E Na 三 细胞的生物电活动及其产生机制 如本章第一节所述, 细胞膜上存在着各种离子通道 细胞生物电活动的产生主要是与离子通道在不同条件下的状态密切相关的 + i + o

55 ( 一 ) 细胞生物电活动的离子通道基础 离子通道 (ion channel) 属于膜蛋白质部分, 存在于膜的脂质双分子层中, 贯穿整个膜层 通道具有水性小孔, 其中还存在选择性滤器 (selective filter) 以选择可以通过的离子, 即选择性通透, 如 Na + 通道 K + 通道 Ca 2+ 通道等 大多数通道受阀门的控制, 决定通道的开放和关闭 阀门是通道蛋白质的组成部分, 可受跨膜电位差或化学信号的影响而产生定向移位, 使通道开放或关闭 某种离子的通道开放, 允许该离子顺浓度梯度或电场梯度从膜的一侧向另一侧扩散, 也即细胞膜对该离子的通透性增大或膜电导增大 ( 电导为电阻的倒数 ) 根据通道阀门的活动, 离子通道可有下列状态, 即 : 静息 (resting) 激活(activation) 失活 (inactivation) 和恢复 (recovery, 或复活 reactivation) 离子通道的状态取决于跨膜电位差的数值 化学信号和时间过程 通道激活是指通道的开放, 允许某种离子选择性通透 ; 失活是指通道关闭, 不允许离子通过, 并且在此阶段不能再开放 ; 通道的恢复或复活则是指通道处于关闭状态, 但受到适当刺激可以再开放 ( 二 ) 静息电位 静息电位 (resting potential) 是指细胞未受刺激时存在于细胞膜内外两侧的电位差 测量方法见图 当微电极插入细胞膜内, 在示波器荧光屏上显示一个电位差, 膜内较膜外为负, 在哺乳动物神经和肌肉细胞为 -70mV~-90mV 由于这个电位差存在于细胞膜两侧, 故称跨膜静息电位 (transmembrane resting potential), 简称静息电位或静息膜电位 只要细胞未受到刺激, 静息电位一般总是稳定在某一水平, 这种膜内外两侧电位维持内负外正的稳定状态, 称为极化 (polarization) 如果在静息电位基础上膜内负电位减小 ( 绝对值减小 )( 如由 -70mV -50mV), 甚至由负转正 ( 如由 -70mV +30mV), 统称为去极化或除极化 (depolarization); 相反, 如果膜内负电位增大 ( 绝对值增大 )( 如由 -70mV -90mV), 则称为超极化 (hyperpolarization) 如果先发生去极化, 然后膜电位向正常安静时膜内所处的负值恢复, 则称为复极化 (repolarization) 静息电位是一切活细胞所共有的生物电现象, 但各种细胞静息电位的大小并不一致 例如, 枪乌贼巨轴突的静息电位为 -50~-70mV, 腺细胞为 -40~-70mV, 人红细胞约为 -10mV 等 1. 不同组织细胞内外液中各主要离子的浓度 平衡电位和静息电位见表 根据细胞内液和细胞外液中各种主要离子的浓度, 应用 Nernst 公式, 即可计算出每种离子的平衡电位, 但前提是细胞膜只对该种离子通透而对其它离子不通透 根据细胞膜对各种主要离子的不同通透情况, 应用 Goldman-Hodgkin-Katz 公式, 可计算出总平衡电位 如以 K + 的通透性作为 l, 则哺乳动物轴突膜对 Na + Cl - 的通透性分别约为 0.01 和 2, 枪乌贼大轴突膜对 Na + Cl - 的通透性分别约为 0.04 与 0.45, 则其总平衡电位分别为 -87 mv 和 -51mV, 接近静息电位 2. 静息电位的形成机制一般认为, 细胞静息电位的形成主要与以下 3 个方面的机制有关 (1) K + 平衡电位 (E K ): 如表 2-2-l 所示, 除人红细胞外, 在可兴奋细胞实际测得的静息电位数值与根据细胞内外 K + 浓度按 Nernst 公式计算出的 E K 理论值较为接近 人工改变细胞外液 K + 的浓度, 可使静息电位发生相应改变, 其改变值与用 Nernst 公式计算出的值

56 基本一致 说明细胞静息电位基本上相当于 K + 的平衡电位 也就是说, 安静情况下, 细胞内高 K + 和细胞外低 K + 以及细胞膜主要对 K + 具有通透性, 是大多数细胞产生和维持静息电位的主要原因 静息细胞膜对 K + 具有通透性的结构基础是细胞膜上存在着一种 K + -Na + 渗漏通道 (K + -Na + leak channel) 一般说来,K + Na + 均可通过此通道, 但其对 K + 的通透性比对 Na + 的大 100 倍左右 如表 2-2-l 所示, 实际测得的静息电位数值一般都比根据膜内外的 K + 浓度用 Nernst 公式计算出来的 E K 理论值偏低 这是由于安静细胞膜除了对 K + 有通透性外, 对 Na + 也有一定的通透性 ; 另外, 还与 Na + -K + 泵的参与有关 表 不同组织的细胞内外液中各主要离子的浓度 平衡电位和静息电位 细胞来源离子细胞内液 (mmol/l) 细胞外液 (mmol/l) 平衡电位 *(mv) 静息电位 (mv) 枪乌贼神经轴突 Na + K + Cl - 蛙缝匠肌 Na + K + Cl - 人红细胞 Na + 哺乳动物神经轴突 K + Cl - Na + K + Cl - 哺乳动物骨骼肌 Na + K + Cl * 恒温动物以室温 37 o C 计算, 变温动物以室温 18 o C 计算 (2) Na + 的扩散 : 在安静细胞, 由于 K + -Na + 渗漏通道的存在, 细胞膜对 Na + 也具有一定的通透性, 细胞外 Na + 顺电 - 化梯度扩散入细胞 但由于膜对 Na + 的通透性远较对 K + 的为小, 使静息电位稍小于由单独 K + 外移造成的 K + 平衡电位数值 (3) Na + -K + 泵 : 一般来说, 所有机体细胞膜上存在着 Na + -K + 泵, 这是一种生电性泵, 即把细胞内的 3 个 Na + 泵到细胞外, 同时把细胞外的 2 个 K + 泵入细胞内, 膜内净缺一个正电荷 这也是形成静息电位的原因之一 此外, 安静时膜对 C1 - 也有一定的通透性, 但通常由 K + 外移所形成的静息电位, 差不多正好抵消膜外高浓度 Cl - 的内移趋势, 故一般不出现 Cl - 的跨膜净移动 ( 三 ) 动作电位 动作电位 (action potentia1) 是指各种可兴奋细胞受到有效刺激时, 在细胞膜两侧所产生的快速 可逆 并有扩布性的电位变化 如图 所示, 当安静细胞受到一次有效刺激时, 静息电位的负值迅速减少并上升到正电位, 然后又回降到静息时的电位 这种电

57 位变化可沿着细胞膜向周围迅速扩布, 使整个细胞膜都经历一次同样的变化 1. 动作电位的几个阶段动作电位是一个连续的膜电位变化过程 以神经纤维为例, 其动作电位大致可分为以下 3 个阶段 (1) 静息相 : 即指动作电位发生前的膜电位静息阶段 此时的跨膜电位差为静息电位数值, 约 -70~-90mV (2) 去极相 : 当神经纤维受到一次短促的有效刺激时, 膜内原来存在的负电位迅速消失, 并进而变成正电位, 即膜内电位在极短暂时间内可由静息时的 -70~-90mV 上升到 +20~+40mV 水平, 由原来的内负外正变为内正外负 ( 称为反极化 ); 此时电位去极化的幅度约为 90~130mV, 构成动作电位的上升支, 亦称去极相 其中, 超过零电位至去极相顶端的电位数值约为 20~40mV( 图 中为 35mV), 称之为超射 (overshoot) 值 值得指出的是, 许多中枢神经元和细神经纤维以及其它一些可兴奋细胞, 在产生去极化时并不一定有超射 (3) 复极相 : 由刺激引起的这种膜内外电位的倒转 ( 倒极化 ) 是暂时的, 很快就出现膜内电位的下降并向静息水平恢复, 这构成了动作电位曲线的下降支, 亦称复极相 在动作电位的复极相中, 膜电位的下降往往不是立即下降到静息电位水平 有些可兴奋细胞的复极化曲线后段突然明显减慢, 这部分电位称为负后电位 (negative afterpotentia1) 或去极化后电位 (depolarizing afterpotentia1); 随后出现缓慢而持续时间较长的超极化电位, 称为正后电位 (positive afterpotentia1) 或超极化后电位 (hyperpolarizing afterpotential)( 图 2-2-6) 负后电位和正后电位这两个术语是沿用以前的命名, 因为在过去进行细胞外记录动作电位时的正负极性与现在细胞内记录时的极性相反 动作电位去极相和复极相的初期, 电位变化迅速, 电位曲线形如尖锋, 故称锋电位 (spike potential) 锋电位存在的时间极短, 约 0.3~0.5ms, 而后电位历时较长, 可达数十毫秒 因此, 动作电位的全过程包括锋电位和后电位两部分, 而锋电位是动作电位的主要部分, 所以锋电位也就成为动作电位的同义语 在不同的可兴奋细胞, 动作电位虽然在基本特点上类似, 但变化幅度和持续时间可以各有不同 如神经和骨骼肌细胞动作电位的主要部分的时间仅有 l ms 左右, 而心肌细胞可达数百毫秒 2. 动作电位的形成机制 Hodgkin 和 Huxley 在枪乌贼巨大神经轴突上研究了神经膜在去极化时的离子电流, 证实了动作电位是由于膜对 Na + K + 通透性的变化所形成的 当神经纤维受刺激时, 引起细胞膜去极化, 膜电位降低到一定程度 ( 约 -50~-70mV), 引起电压门控 Na + 通道 (voltage-gated sodium channel) 蛋白质分子构型发生改变, 激活门打开,Na + 通道开放 ( 激活 )( 图 2-2-8A), 细胞膜对 Na + 的通透性增大,Na + 顺电 - 化梯度内流 随着 Na + 的内流, 膜进一步去极化, 而去极化增大本身又促进更多的 Na + 通道开放, 膜对 Na + 通透性进一步增加 如此反复促进 Na + 内流, 称为 Na + 内流的再生性循环 (regenerative cycle) 这种正反馈作用使膜以极大的速率自动地去极化, 造成了锋电位陡峭的上升支 ( 去极相 ), 直至 Na + 内流造成的膜内正电位上升到接近 Na + 平衡电位水平

58 图 细胞膜上的 Na + 通道 (A) 和 K + 通道 (B) 活动状态模式图 细胞膜在去极相中, 由于 Na + 通道开放其对 Na + 的通透性可增加 500~5000 倍 但 Na + 通道开放的时间很短 ( 仅万分之几秒 ), 随后 Na + 通道失活门关闭而处于失活状态 ( 图 2-2-8A), 膜对 Na + 的通透性迅速下降 ; 这时, 膜上的电压门控 K + 通道已经开放 ( 激活 )( 图 2-2-8B), 膜对 K + 的通透性增大, 膜内 K + 顺着浓度梯度和 ( 或 ) 电场梯度向膜外扩散, 使膜内电位由正值向负值转变, 直至达到原来静息时接近 K + 平衡电位水平, 形成锋电位的下降相 此时,Na + 通道的失活状态解除 ( 复活 ),K + 的通透性也逐渐恢复到安静时水平, 使细胞膜能接受新的刺激 由此可见, 锋电位的上升相是膜对 Na + 通透性迅速增大造成 Na + 内流的结果 ; 而下降相则是膜对 Na + 的通透性减小,Na + 内流减少, 以及对 K + 的通透性增大造成 K + 外流所致 某些细胞的锋电位发生以后, 膜内电位产生微小而缓慢波动的后电位的原因, 一般认为是在复极时迅速外流的 K + 蓄积在膜外侧附近, 暂时阻碍了 K + 外流而导致负后电位的产生 ; 而正后电位的形成主要是由于 K + 通道仍然处于一定的开放状态 ( 持续数毫秒 ), 使较多的 K + 扩散到膜外, 引起膜内正离子的 额外 缺失而表现出超极化 另外, 由于细胞内 Na + 和细胞外 K + 浓度的调控,Na + -K + 泵活动加强引起膜的轻微超极化也可能是形成正后电位的机制之一 在动作电位过程中,Na + 的跨膜内流和 K + 的跨膜外流的动力来自于浓度梯度和 ( 或 ) 电场梯度提供的势能, 不需要所在细胞提供代谢能 而在一次动作电位结束后, 虽然膜电位已恢复到静息电位水平, 但 Na + K + 的跨膜浓度差有微小的改变 神经纤维每兴奋一次, 进入细胞内的 Na + 量可使膜内的 Na + 浓度增大约八万分之一, 复极时扩散至膜外的 K + 量也大致相当 正常细胞在经历多次动作电位后仍具有足够的 Na + K + 跨膜势能贮备,

59 用于静息电位的维持和动作电位的产生 已经进入细胞内的 Na + 能移回到膜外, 而已经外流的 K + 也可返回膜内, 这是由于这两种离子通过 Na + -K + 泵作用逆浓度梯度进行跨膜运动所致, 这种离子的主动转运必须由细胞提供能量 ( 四 ) 离子通道的研究方法简介 1. 电压箝 (voltage clamp) 技术电压箝技术 ( 又称电压固定技术 ) 是通过插入细胞内的一根微电极向胞内补充电流, 补充的电流量正好等于跨膜流出的反向离子流, 这样即使膜通透性发生改变时, 也能控制膜电位数值不变, 经过离子通道的离子流与经微电极施加的电流方向相反, 数量相等 因此可以定量测定细胞产生动作电位时的离子电流 Hodgkin 和 Huxley 在枪乌贼巨大神经轴突中应用电压箝技术进行了一系列实验, 并获得 1963 年 Nobel 医学和生理学奖 图 2-2-9A 示电压箝实验装置 图 电压箝实验 (A) 和膜片箝实验 (B) 工作原理示意图 2. 膜片箝 (patch clamp) 技术电压箝技术是控制跨膜电位以研究离子通道的理想技术, 但它并不能测定单一通道电流 70 年代以来, 由 Neher 和 Sakmann 首创的膜片箝技术 ( 又称小片膜箝制术 ) 得到了发展和完善 其基本原理是将加热抛光的微玻管电极与只含有 l~3 个离子通道 面积为几个 µm 2 的细胞膜通过负压吸引封接起来, 由于电极尖端与细胞膜的高阻抗封接, 在其尖端下的那片细胞膜与膜的其它部分从电学上隔离 因此, 此片膜内通道开放所产生的电流流进玻管, 用一极敏感的电流监视器 ( 膜片箝放大器 ) 测量此电流强度, 就代表单一离子通道电流 Neher 和 Sakmann 因此而获得 1991 年 Nobel 医学和生理学奖 图 2-2-9B 示膜片箝实验工作原理 膜片箝实验结果证明, 膜上电压依从性离子通道有两种状态, 即开放和关闭 因此, 某一部分膜在不同情况下表现的不同通透性, 是由这部分膜中处于开放状态的离子通道的数目决定的 电压门控 Na + 通道的膜片箝实验记录见图

60 图 电压门控 Na + 通道的膜片箝实验 A. 封接 ;B. 从维持电压改变到某一试验电压的刺激波形 ; C. 不同水平的试验电压下同一 Na + 通道的通道电流 ;D. 平均电流 ( 一 ) 刺激引起兴奋的条件 四 兴奋的引起和兴奋传导的机制 机体内外环境的变化, 只要其能引起组织或细胞的活动发生改变, 都称为刺激 对可兴奋组织而言, 只有刺激引起细胞产生动作电位, 才能说细胞产生了兴奋 任何刺激要引起组织兴奋 ( 即有效刺激 ), 必须在下列三个方面达到最低的有效值 : 即刺激的强度 刺激的持续时间以及强度 - 时间变化率 在保持强度 - 时间变化率恒定的条件下, 引起组织兴奋所需的最小刺激强度与最小刺激持续时间的关系呈反变关系 即在一定范围内, 刺激较强时, 其持续时间较短 ; 当刺激较弱时, 则需要较长的持续时间才能引起组织兴奋 这两者的关系如在坐标图上描出, 则可得到一条类似双曲线的曲线, 称为强度 - 时间曲线 (strength-duration curve)( 图 ) 这条曲线与正双曲线的不同点在于, 前者与两条坐标轴不是渐近线, 而是在接近某点时即变得与坐标轴平行 上面所说的反变关系只

61 存在于这两点之间的范围内 曲线右侧点 R 表明, 当刺激强度低于这一点所表示的强度时, 无论刺激时间怎样延长, 也不能引起组织兴奋, 这一刺激强度称为基强度 (rheobase); 曲线左侧点 T 表示. 当刺激持续时间短于这一点所表示的时间时, 即使大大增加刺激强度, 也同样不能引起组织兴奋 临床上所应用的超短波电热疗法, 尽管刺激的强度 ( 电压 ) 很大, 但由于刺激频率很高, 刺激持续时问很短, 并不引起肌肉的兴奋和收缩, 只能引起组织中分子的振荡而产生热效应 图 可兴奋组织的强度 - 时间曲线 ( 说明见正文 ) 图 上所示的时值 (chronaxie) 是指在保持强度 - 时间变化率不变的条件下, 两倍基强度的刺激引起组织兴奋的最短的刺激持续时间 时值和基强度可作为衡量组织兴奋性高低的指标 在电生理实验中, 人们常采用电刺激作为人工刺激 电刺激中最常使用的是矩形波脉冲, 其上升和下降速度 ( 强度 - 时间变化率 ) 极大而且固定, 其振幅 ( 刺激强度 ) 和波宽 ( 刺激持续时间 ) 均可任意调节, 且在一般刺激强度下, 既能引起组织兴奋, 又不致造成组织的过度损伤, 故矩形波是一种理想的电刺激 当固定波宽不变时, 刚能引起组织兴奋的最小刺激强度称为阈强度 (threshold intensity) 或阈值 (threshold), 这种刺激称为阈刺激 低于或高于阈强度的刺激分别称为阈下刺激或阈上刺激 阈值的大小也反映组织兴奋性的高低 ( 二 ) 外向电流和电紧张电位 在医学与神经科学的研究中, 膜电位往往受细胞外电流作用的影响而发生变化 当两个与直流电源相连的电极与神经相接触时, 电流可以从正极通过膜外的溶液流到负极 ; 另一方面, 电流也可以从正极处流入膜内, 在膜内通过胞浆流向负极处, 再从膜内流出膜外而到达负极 这与在金属导体上的情况不同 这些穿过膜的电流, 不仅在电极下的膜上流动, 而且还会扩散到电极附近的一定区域 在电极下的一点电流密度最大, 离电极越远, 电流密度越小 如图 所示, 在正极处存在着内向电流 (inward current), 在负极处则存在着外向电流 (outward current) 电流穿过膜的流动就会伴随着膜电位的变化, 内向电流在具有电阻和电容性质的细胞膜上造成的电压降与膜原有的极化状态 ( 内负外正 ) 是一致的, 结果使膜电位发生超极化 ; 外向电流则使膜两侧产生内正外负的电压降, 与

62 原有膜电位方向相反, 膜去极化 用微电极技术进行研究, 也可得到同样的结果 图 膜外电流引起的电紧张电位 A: 电流的流动方向 ;B: 相邻部位的膜电位变化 ( 向上为去极化, 向下为超极化 ) 由于外加电流的作用, 引起细胞膜电位发生变化, 这种电位变化称为电紧张电位 (electrotonic potential) 该电位可以是超极化电位, 也可以是去极化电位, 取决于外加电流的极性 必须指出, 电紧张电位只是指在外加电流较小 ( 阈下刺激 ) 而不足以引起细胞产生动作电位时的膜的被动反应, 也就是说, 它的强度还不足以改变膜对离子的通透性, 外加电流对细胞膜只是起着膜电容放电的作用 电紧张电位只局限于刺激局部, 随刺激强度的增大而增大, 并按一般的电学规律向周围扩布, 呈指数衰减 ( 即扩布距离按算术级数增加时, 电位幅度以几何级数减小 ) 由于电紧张电位的幅度小, 因此其扩布距离是十分有限的 这种扩布方式称为电紧张性扩布 (electrotonic propagation) ( 三 ) 局部反应 如上所述, 电流作用于可兴奋细胞, 将引起膜电位的变化 ( 电紧张电位 ); 电流越强, 膜电位变化亦越大 ; 负极处与正极处分别发生大小相等而方向相反的变化 但这种镜影式的变化, 只在刺激电流较弱的情况下才产生 当外加电流强度接近于阈强度时, 则在负极处发生的膜电位变化 ( 去极化 ) 比在正极处发生的变化 ( 超极化 ) 大 ( 图 ) 这表明, 除外加电流造成的电紧张电位外, 膜自身也发生了轻微的去极化反应 ( 少量 Na + 通道开放而导致少量 Na + 内流 ) 因此, 我们把阈下外向电流刺激时产生的电紧张电位和由少量 Na + 通道开放产生的特殊电变化叠加在一起的去极化电位称为局部反应 (1ocal response) 或局部电位 (local potentia1) 或局部兴奋 (1ocal excitation) 局部反应是可兴奋细胞的主动反应 局部反应有以下特点 : 1. 等级性和衰减性局部反应的去极化幅度随着阈下刺激强度的大小而增减, 呈等级性 局部反应局限于刺激部位, 不能传导 随着扩布距离的增加, 这种去极化电位迅速衰减和消失

63 2. 总和先后多个或细胞膜相邻多处的阈下刺激所引起的局部反应可以叠加总和, 分别称为时间总和 (temporal summation) 和空间总和 (spatial summation) 当局部反应大到一定程度时, 可以引起动作电位 图 电紧张电位 局部反应与动作电位的关系 ( 说明见正文 ) ( 四 ) 阈电位和兴奋的引起 刺激为何必须达到阈强度才能引起可兴奋细胞兴奋即产生动作电位呢? 这是由于位于细胞膜上的 Na + 通道属于电压门控通道, 这种通道只有当静息电位减小到某一临界数值时才能突然大量开放, 进而引起动作电位 这个能够导致膜对 Na + 通透性突然增大的临界膜电位数值, 称为阈电位 (threshold potential) 一般可兴奋细胞的阈电位, 大约比静息电位的绝对值小 10~20mV, 神经和骨骼肌的阈电位一般为 -50~-70mV 引起细胞兴奋或产生动作电位的关键在于能否使静息电位减小到阈电位水平, 而与导致这种膜电位减小的手段或刺激方式无关 阈电位对动作电位只起一种触发作用, 膜电位一旦达到阈电位水平, 此时的去极化就不再依赖于刺激强度, 膜电位变化成为一种 自动 过程, 直至动作电位结束 引起局部反应的阈下刺激与触发动作电位产生的阈刺激和阈上刺激, 其作用都是激活 Na + 通道, 并无质的区别 但前者引起的 Na + 通道开放数目有限, 只引起膜较小的去极化, 这种去极化很快由于 Na + 通道的失活和 K + 的外流而被抵消或消退 如果局部电位由于总和而达到阈电位水平, 则 Na + 通道的开放和 Na + 的内流不能被 K + 外流所抵消,Na + 内流产生再生性循环, 结果引起细胞产生以动作电位为标志的兴奋 可见阈电位是在一部分膜上能使 Na + 通道开放的数目足以引起 Na + 内流的再生性循环出现的膜去极化的膜电位临界水平 ( 五 ) 兴奋在同一细胞上的传导机制 所谓兴奋的传导, 实质上就是动作电位的扩布 当细胞膜某处受到刺激产生动作电位后, 动作电位可以迅速沿细胞膜向周围扩布, 使整个细胞膜都发生一次动作电位 动作电位在同一细胞上的传布过程称为传导 (conduction)

64 动作电位的传导实际上是细胞膜依次连续产生动作电位的过程 当一条无髓神经纤维的一端受到有效刺激而产生动作电位时, 该处的膜两侧出现了电位的暂时倒转, 即兴奋部位膜为外负内正, 而邻近未兴奋膜仍处于外正内负的极化状态 由于膜两侧的细胞外液和细胞内液都是导电的, 于是在神经纤维的兴奋段与未兴奋段之间出现了电位差而导致电荷的移动, 这称为局部电流 (1ocal current) 由于局部电流的作用, 使邻近未兴奋膜去极化而达到阈电位, 该处的 Na + 通道大量开放, 膜对 Na + 的通透性增加而产生动作电位 可见, 局部电流就相当于外加刺激电流, 导致未兴奋膜电位水平上移达阈电位, 也即由膜的已兴奋部位通过局部电流 刺激 了邻近的未兴奋膜, 使之产生动作电位, 这样的过程在膜表面连续进行下去, 就表现为兴奋在整个细胞的传导 ( 图 ) 由于动作电位产生期间电位变化幅度和速率相当大, 且细胞内 外液均具良好的导电性能, 因此在单一细胞上, 局部电流的强度超过了引起邻近膜兴奋所需阈强度数倍以上, 因而动作电位的传导过程是 安全可靠 的 图 无髓神经纤维兴奋传导示意图 膜内外的箭头表示局部电流的流动方向 A: 神经一端产生兴奋 ;B: 兴奋传导 下方的直箭头表示传导方向 上述以局部电流为基础的无髓神经纤维上的兴奋传导机制, 也基本适用于其它可兴奋细胞 ( 如骨骼肌细胞等 ) 但在有髓鞘神经纤维, 情况有所不同 由于髓鞘具有电绝缘性, 兴奋的传导只能在相邻的两个郎飞氏结之间形成局部电流, 而呈跳跃式传导 因此传导速度比在无髓神经纤维上快得多 从局部电流的形成原理可以看出, 如果在神经纤维的中段给予一个刺激并产生动作电位, 那么在兴奋部位与其两侧的未兴奋膜之间均可形成局部电流, 动作电位可同时向神经纤维的两端传导 ( 即双向传导 ) 在整体, 运动神经的兴奋从中枢发出, 感觉神经的兴奋由感受器传入中枢, 动作电位仅表现为单向传导 但在有分支的感觉神经, 也可以表现为双向传导 可兴奋细胞的动作电位及其传导过程表现出 全或无 的方式 动作电位的 全或无 现象 (all or none phenomenon) 具有两个方面的含义 :(1) 在单一可兴奋细胞, 阈下刺激不引起动作电位, 而动作电位一旦产生则其幅度即达最大值, 不因刺激强度的再增加而改变 换言之, 阈刺激和阈上刺激引起同一细胞的动作电位幅度相等 (2) 动作电位在同一细胞上传导时, 不因传导距离的增加而有所衰减, 即不衰减传导 上述特性是膜本身的生物物理性质和跨膜离子分布所决定的

65 ( 一 ) 兴奋性的定义及其评定指标 五 兴奋性及其影响因素 1. 兴奋性的定义在生理科学发展过程的早期, 兴奋性的概念是指活组织或细胞对外界刺激发生反应的能力或特性 如肌细胞受刺激表现为收缩反应, 腺细胞受到刺激引起分泌活动, 神经纤维受到电刺激产生神经冲动等 实际上, 几乎所有的活组织或细胞都具有某种程度的对外界刺激发生反应的能力, 只是反应的灵敏程度和表现方式有所不同 可兴奋细胞兴奋时, 虽然有不同的外部表现, 但它们都有一个共同的特征, 即受刺激后先产生动作电位, 以此为触发因素, 再使细胞表现其它功能 因此, 兴奋性可看作是细胞受到刺激后产生动作电位的能力 ; 兴奋可看作是动作电位及其产生过程 这两个概念显然只适用于可兴奋细胞 2. 评定兴奋性的指标强度 - 时间曲线无疑可以全面地反映组织的兴奋性 但是, 其测定过程较复杂费时, 特别是当兴奋性发生迅速改变时进行测定是相当困难的 因此, 通常选择曲线上的一点作为衡量兴奋性的指标 (1) 阈强度 : 测定阈强度的方法是, 固定一个适中的刺激持续时间和强度 - 时间变化率. 由低到高逐渐增加刺激强度, 测得刚能引起兴奋的最低强度 阈强度愈低, 表明组织的兴奋性愈高, 即兴奋性 l/ 阈强度 (2) 时值 : 测定方法是先用持续时间较长的刺激测得基强度, 然后以两倍基强度的刺激, 观察电刺激需要作用多久才能引起组织兴奋 这个刚能引起组织兴奋的最短时间即为时值 时值小表示兴奋性高, 时值大则表示兴奋性低 ( 二 ) 影响兴奋性的因素 兴奋是可兴奋细胞在刺激作用下, 细胞膜部分去极化达到阈电位而激活离子通道, 然后由离子活动所产生的全面去极化 ( 扩布性兴奋 ) 兴奋性的高低常常以产生部分去极化达到阈电位所需阈刺激的大小为指标 1. 静息电位水平静息电位绝对值增大, 则其与阈电位之间的距离增大, 引起兴奋所需的阈刺激增大, 兴奋性降低 反之, 静息电位绝对值减小, 则其与阈电位之间的距离缩小, 引起兴奋所需的阈刺激减小, 兴奋性增高 2. 阈电位水平阈电位上移 ( 负度减小 ), 则其与静息电位之间的距离增大, 引起兴奋所需的阈刺激增大, 兴奋性降低 反之, 阈电位下移 ( 负度增大 ), 则其与静息电位之间的距离减小, 兴奋性增高 3. 通道的性状如前所述, 由于通道阀门的活动, 离子通道具有不同的状态 以神经纤维的 Na + 通道为例, 当其处于失活状态时, 通道关闭且不能被再激活, 此时细胞的兴奋性下降至零 只有当 Na + 通道处于静息状态或激活后恢复到静息状态时, 细胞才具有正常的兴奋性 ( 三 ) 细胞在兴奋及其恢复过程中的兴奋性变化 可兴奋细胞在接受一次有效刺激出现兴奋的过程中以及随后的一段时间内, 其兴奋性将发生一系列有规律的变化, 然后才恢复正常 细胞的这一特性说明, 在接受连续刺激时, 有可能前一刺激引起了细胞对随后刺激反应能力的改变, 这对于细胞发挥正常功

66 能有重要意义 如果用阈强度作为衡量兴奋性的指标, 测定可兴奋细胞 ( 以神经细胞为例 ) 在受到一次刺激而发生兴奋时和兴奋后的兴奋性改变, 一般可依次分为几个时期 1. 绝对不应期神经细胞在接受一次阈刺激或阈上刺激后产生动作电位的很短时间内, 任何强大的刺激都不能使其再次兴奋, 这一段时间称为绝对不应期 (absolute refractory period), 表明其兴奋性降低到零 产生绝对不应期的原因是此时神经细胞膜上的 Na + 通道处于失活状态而不能再开放 2. 相对不应期绝对不应期后的一段时间内, 大于阈强度的刺激才能引起细胞产生动作电位, 这一时期称为相对不应期 (relative refractory period), 表明细胞的兴奋性低于正常 此期内,Na + 通道已开始逐渐复活, 但处于静息状态的 Na + 通道数目及其开放能力尚未恢复到正常水平, 故需要阈上刺激才能引起再次兴奋 3. 超常期在相对不应期之后的一段时间内, 小于阈强度的刺激 ( 阈下刺激 ) 就可引起细胞兴奋, 这一时期称为超常期 (supranormal period), 表明细胞的兴奋性比正常高 超常期内, 膜电位复极接近静息电位水平,Na + 通道也基本恢复到可被激活的静息状态 由于此时膜电位绝对值小于正常静息电位水平, 与阈电位的差距小, 故兴奋性高于正常 4. 低常期在超常期之后的较长时期内, 需用大于阈强度的刺激才能引起细胞产生动作电位, 这一时期称低常期 (subnormal period), 表明兴奋性低于正常 此时, 尽管 Na + 通道已完全恢复至正常状态, 由于膜电位大于静息电位绝对值 ( 超极化 ), 与阈电位之间的距离大, 兴奋性低于正常 如图 所示, 把神经纤维动作电位全过程中兴奋性的变化与膜电位变化相对照可见, 绝对不应期大致相当于锋电位持续时间, 相对不应期大致相当于负后电位早期, 超常期相当于负后电位后期, 低常期相当于正后电位的持续时间 可兴奋细胞受到有效刺激后出现兴奋性的周期性改变, 这一现象说明当组织兴奋后, 其兴奋性只有经过上述几个时期的一系列变化才能恢复到原来的状态 值得指出的是, 在不同细胞上述各期的持续时间可有很大的差异, 某些细胞可能缺少 某一期的兴奋性改变 绝对不应期的存在, 意味着组织不论受到频率多高的刺激, 它在单位时间内能 图 神经纤维动作电位及其兴奋性变化过程示意图 够产生动作电位的次数是有限的, 次数的多少取决于它在兴奋时绝对不应期的长短, 即其在单位时间内可能发生的最高兴奋次数要少于绝对不应期的倒数 例如, 哺乳动物神经纤维的绝对不应期约为 0.5ms, 所以在理论上它每秒最多只能产生或传导 2000 次神经冲动 实际上, 在体内神经纤维产生和传导的冲动频率远远低于这一理论值

67 第三节细胞的信号传递与转导功能 一 细胞间的信号传递 人体是由各种细胞 组织和器官组成 但大多数细胞是生活在直接浸浴它们的细胞外液中, 不与外界直接接触, 细胞之间必然需要有效的信息联络, 对细胞功能进行调控, 从而彼此协调, 相互配合, 适应各种生命活动和生长 繁殖的需求 细胞间信息的传递有神经和体液两条途径 然而, 不论神经调节还是体液调节, 都涉及到信息在细胞间的传递 (transmission) 问题 信息在细胞间的传递大体可分为两大类 : 一种是化学传递, 另一种是电传递 所谓化学传递是指神经元末梢释放化学递质 内分泌细胞分泌激素或机体细胞分泌细胞因子等化学信息物质作用于靶细胞, 调节其生理活动的过程 ; 所谓电传递是指细胞的兴奋, 不经过化学物质传递, 而直接通过缝隙连接的特殊结构, 以局部电流传递的方式直接诱发相邻细胞活动的过程 ( 一 ) 化学传递 1. 化学信号在细胞间的信息化学传递中, 主要的化学信号包括神经递质 激素和细胞因子等 (1) 神经递质 (neurotransmitter): 在神经元之间或神经元与效应器细胞之间, 必需由神经递质来传递信息 神经递质主要在神经元中合成并储存在突触前囊泡中, 神经兴奋时释放入突触间隙, 作用于突触后膜或效应器膜受体, 引起生理效应, 完成信息的跨细胞传递过程 已发现的神经递质超过 30 种, 以脑中最多 如乙酰胆碱 氨基酸类 ( 如甘氨酸 γ- 氨基丁酸 谷氨酸等 ) 胺类 ( 如肾上腺素 去甲肾上腺素 多巴胺等 ) 肽类 ( 如脑啡肽 阿片肽 生长抑素等 ) (2) 激素 (hormone): 激素是指由内分泌细胞分泌的具有高度生物活性的化学物质, 经由体液途径运送至特定的靶细胞, 发挥特定的生理作用 按激素的化学结构可分为含氮类激素和类固醇激素两大类 (3) 细胞因子 (cytokine): 细胞因子是由细胞分泌的一类信息物质, 作用于特定的靶细胞, 调节其生理功能 与激素相比, 分泌细胞因子的细胞大多是机体的一般细胞, 而不是分化的内分泌细胞 平滑肌细胞 心肌细胞 血小板 巨噬细胞 淋巴细胞等都能分泌细胞因子 如白细胞介素 生长因子等 除以上三类化学信号外, 在机体内还存在着一些气体性信使分子如一氧化氮和一氧化碳等, 可作为化学信号在细胞间传递信息 如一氧化氮 (nitric oxide, NO) 是广泛存在于神经系统和外周组织中, 与多种机体功能的调节有关 它不具有一般神经递质或激素的特点, 它一般是在受到某些化学或物理因素的作用时激活了一种细胞内广泛存在的 NO 合酶 (nitric oxide synthase,nos), 后者再作用于精氨酸而生成 NO 这种小分子物质可自由扩散出细胞膜并进入邻近的细胞中 NO 作用的靶分子通常是鸟苷酸环化酶, 再生成 cgmp( 环一磷酸鸟苷 ), 后者参与多种细胞内功能的调节 2. 受体细胞中能识别化学信号 ( 包括神经递质 激素 细胞因子等 ) 并与其特异结

68 合, 引起各种生物效应的分子, 均称为受体 (receptor) 受体的化学本质是蛋白质 按其分布的部位, 可分为细胞膜受体和细胞内受体 神经递质 激素和细胞因子等化学物质将信息从某一种细胞带到一些特定细胞并与细胞膜上的受体结合, 称为第一信使 第一信使与受体结合是信息传递至细胞的第一步, 随后由受体构象的变化引起一系列信息转导过程 ( 二 ) 缝隙连接处的电传递 高等动物细胞之间信息的传递, 除化学传递外, 还存在着以局部电流直接进行传递的电传递形式 电传递广泛存在于心肌 内脏平滑肌 ( 如肠和子宫的平滑肌 ) 和神经细胞间 形态学和生理学实践都证明, 细胞之间的缝隙连接 (gap junction) 处构成了细胞间低电阻通道 它可能是细胞间的直接电传递及胞浆间物质交换的结构基础 在缝隙连接处, 相邻的两细胞膜仅隔开 2nm, 而且每一侧膜上都整齐地排列着多个各由 6 个蛋白质亚单位组成的颗粒, 颗粒的中心是一个亲水性孔道, 颗粒所包含的蛋白质和孔道都贯穿膜的脂质双分子层, 在膜的外侧面同相邻细胞的相似结构相对接, 使两个细胞的胞浆可以通过其中的孔道相交通 ( 图 ), 这些通道是亲水性的, 可允许分子量低于 1000 或直径小于 1nm 的物质分子, 包括电解质离子 氨基酸 环核苷酸 ( 如 camp) 和实验中常用作标记物的荧光色素等通过 缝隙连接处的离子通透性好, 电阻低, 一侧膜的去极化可通过局部电流使另一侧膜也去极化, 而呈双向性传递 此种传递的潜伏期短, 在时间上, 几乎不存在延搁 细胞间电传递的意义是使一些功能相似的细胞能进行同步活动 图 缝隙连接处细胞间通道的模式图 A: 缝隙连接处的横切面图 ;B: 为 A 图的放大模式图 显示两个细胞外侧膜上细胞间通道的 6 个蛋白亚单位组成颗粒, 颗粒的中心是亲水性孔道, 与相邻细胞的相似结构相接 图中尚表示各种能够通过孔道的物质

69 二 细胞的跨膜信号转导 细胞外液中的各种化学信息物质, 大部分并不需要其自身进入它们的靶细胞后才起作用, 它们常常是选择性地同靶细胞膜上特异性的受体相结合, 再通过跨膜信号转导 (transmembrane signal transduction) 过程, 最后才间接地引起靶细胞膜的电变化或其他细胞内功能的改变 脂溶性的类固醇激素 甲状腺素等可穿过细胞膜进入细胞内, 与胞内受体结合, 不需膜受体的转导 跨膜信号转导途径从膜受体与化学信息物质结合开始, 多数途径通过 G 蛋白 催化生成第二信使 (second messenger) 的酶 第二信使 蛋白激酶, 最终引起功能蛋白质或调节蛋白质的磷酸化 这些蛋白质被磷酸化后活性出现改变 ( 激活或失活 ), 从而引起较快速的生物效应或迟发而持久的基因表达 跨膜信号转导经膜通道跨膜信号传递途径和酶耦联受体途径中不需 G 蛋白参与 真核细胞内主要的跨膜信息转导途径大致可归纳为膜通道跨膜信号传递途径 G 蛋白耦联受体跨膜信号传递途径和酶耦联受体跨膜信号传递途径 ( 一 ) 膜通道介导的跨膜信号转导途径 目前认为, 体内至少存在三种类型的膜通道样结构, 使不同细胞对外界相应的刺激起反应, 完成跨膜信号转导 : 即配基门控通道或化学门控通道 电压门控通道 机械力敏感 ( 门控 ) 通道 后两种通道属于细胞对物理信号的接受和转导, 有别于化学信息的跨膜信号转导途径 1. 配基门控通道介导的跨膜信号转导途径在突触传递和神经末梢与效应器细胞的化学传递中, 神经末梢所释放的递质与位于突触后膜或效应器细胞膜上某种离子通道上的特异受体相结合, 引起分子变构及离子通道开放, 出现某种离子的跨膜流动, 进而导致通道所在细胞膜电位改变, 完成信号的跨膜传递过程 ( 化学信号通过跨膜传递后转变为电信号 ) 运动神经纤维末梢引起它所支配的骨骼肌细胞兴奋的信息传递系统, 是目前研究得比较清楚的, 也是最早开始研究的 早已知道, 乙酰胆碱分子与 N- 型受体相结合, 引起终板膜产生电变化 目前已将这种可与乙酰胆碱结合的蛋白质提纯, 并基本搞清了它的分子结构及其在膜中的存在形式 这是一种分子量约为 290 kd 的蛋白质, 为一五聚体 ( 图 ), 由 α β γ 和 δ 四种亚单位按 α 2 βγδ 比例构成 每个亚单位都有 4 个跨过膜疏水区的 α 螺旋, 分别称为 M 1 M 2 M 3 和 M 4,5 个亚单位中的 M 2 共同构成通道的内壁 2 个 α 亚单位上存在着乙酰胆碱的结合位点, 以前称为乙酰胆碱受体 实际上, 这种蛋白质本身是一种离子通道, 其 α 单位具有与乙酰胆碱分子特异结合的能力, 应称为 N- 型乙酰胆碱门控通道 但为了说明化学门控通道也具有受体功能, 也可称它们为通道型受体 当 2 分子乙酰胆碱与 2 个 α 亚单位上的乙酰胆碱结合位点结合时, 导致蛋白质分子变构, 离子通道开放,Na + 内流而 K + 外流, 引起终板膜上的去极化, 即终板电位, 完成信号的跨膜转导 目前认为, 以这种膜通道跨膜信号传递方式的化学物质除乙酰胆碱外, 还有谷氨酸 门冬氨酸 γ- 氨基丁酸和甘氨酸等 2. 电压门控通道介导的跨膜信号转导途径电压门控通道具有同化学门控通道类似的分子结构, 但控制这类通道开放与关闭的因素, 是这些通道所在膜两侧的跨膜电位的

70 改变 ; 当细胞外电变化信息到达时, 可引起所在细胞的跨膜电位变化, 在细胞膜上这类通道的分子结构中, 存在一些对跨膜电位的改变敏感的结构域或亚单位, 由后者诱发整个通道分子功能状态的改变, 进而改变相应离子的易化扩散, 引起膜自身出现动作电位, 完成信号的跨膜转导 如 Na + K + 和 Ca 2+ 等电压门控通道 3. 机械力敏感 ( 门控 ) 通道介导的跨膜信号转导途径许多细胞的表面膜存在能感受机械性刺激并引起细胞功能改变的通道样结构 例如, 内耳毛细胞顶部的听毛在受到切向力的作用产生弯曲时, 毛细胞会出现短暂的感受器电位, 这也是一个跨膜信号转导, 即外来机械性信号通过膜结构内的某种过程, 引起细胞出现电变化 据精细观察, 从听毛受力而致听毛根部所在膜的变形, 到该处膜出现跨膜离子移动, 其间只有极短的潜伏期, 因而推测可能是膜的局部变形或牵引直接激活了附近膜中的机械门控通道 除毛细胞外, 心室肌细胞 血管平滑肌以及某些神经胶质细胞等处的细胞膜中, 也有特殊机械门控通道蛋白质的存在, 使这些细胞对机械刺激发生反应 图 N- 型乙酰胆碱门控通道的分子结构示意图 A:5 个亚单位在细胞膜中的存在形式 ;B:5 个亚单位聚合成一个通道分子, 构成一个水性通道 ;C: 各个亚单位所包含的 4 个 α 螺旋各有其特定的位置 ( 二 )G- 蛋白耦联受体介导的跨膜信号转导途径 对这种类型的跨膜信号传递的研究, 首先是从对激素的作用机制探讨开始的 二十世纪 60 年代在研究肾上腺素引起肝细胞中糖原分解为葡萄糖的作用原理时, 发现如果使肾上腺素单独同分离出的肝细胞膜碎片相互作用, 可以生成一种分子量小 能耐热的物质, 当把这种物质同肝细胞的胞浆单独作用时, 也能引起胞浆糖原的分解, 同肾上腺素作用于完整的肝细胞时有类似的效应 这个颇具说服力的实验提示, 在肾上腺素正常起作用时, 它只是作用于肝细胞的膜表面, 通过某种发生在膜结构中的过程, 先在膜内侧胞浆中生成上述小分子物质, 后者再实现肾上腺素分解糖原的作用 这种小分子物质后来被证明是一种环核苷酸, 称为环 - 磷酸腺苷 (cyclic AMP, camp) 以后又陆续发现, 很多其他激素类物质作用于相应的靶细胞时, 都是先同膜表面的特异性受体相结合, 再引起膜内侧胞浆中 camp 含量的改变, 实现激素对细胞内功能的调节 这样, 就把 camp 称作第二信使 (second messenger), 这是相对于把激素分子这类外来化学信号看作第一信

71 使而言的 导致 camp 产生的膜结构内部的过程颇为复杂, 它至少与膜中三类特殊的蛋白质有关 第一类是能与到达膜表面的外来化学信号作特异性结合的受体蛋白质, 其位于膜内的 C- 末端和三个连接跨膜螺旋段的肽链, 则与激活膜内侧另一种蛋白质即 G- 蛋白有关 第二类即 G- 蛋白, 是鸟苷酸结合蛋白 (guanine nucleotide-binding protein) 的简称, 可对膜结构中 ( 位置靠近膜的内侧面 ) 的第三类称为膜的效应器酶的蛋白质起作用, 后者的激活 ( 或被抑制 ) 可以引致胞浆中第二信使物质的生成增加 ( 或减少 ) 许多化学信息物质与细胞膜受体结合后, 有着类似的过程, 即受体变构, 激活 G- 蛋白, 后者再激活 G- 蛋白效应器酶, 第二信使的生成量改变, 进而使蛋白激酶活性改变, 调节细胞内的反应 在这一跨膜信号转导系统中, 作为信息传递者的化学物质, 除大部分是激素分子外, 神经递质类物质和一些细胞因子也可以引起细胞产生第二信使 这一系统中的受体属于同一蛋白质家族, 都由约 300~400 个氨基酸残基组成,N 端在膜外,C 端在膜内, 之间有 7 个跨过膜疏水区的 α 螺旋 受体蛋白质与膜上的 G- 蛋白有功能耦联关系, 因而这类受体称为 G- 蛋白耦联受体 (G-protein-coupled receptor) G- 蛋白是存在于细胞膜上的一类蛋白质家族 不同的受体可激活不同的 G- 蛋白, 不同的 G- 蛋白激活的效应器酶不同, 引起的生理学效应也不同 G- 蛋白是由 α β γ 三种亚单位构成的不均一三聚体 α 亚单位上的鸟苷酸结合位点可结合 GDP 或 GTP, 其具有 GTP 酶活性, 可将 GTP 水解成 GDP 及 Pi β γ 亚单位结合紧密, 起着调节 α 亚单位的作用 在 G- 蛋白未被激活时,α 亚单位结合 GDP, 并与 β γ 亚单位构成无活性的三聚体 当受体与激素等第一信使结合后, 激活的受体可与 G- 蛋白相互作用,α 亚单位释出 GDP 并立即结合 GTP, 此时 α 亚单位与 β γ 亚单位解离 游离的 α 亚单位对效应器酶蛋白有调节作用, 引起第二信使生成的量改变 ( 图 ) 值得指出的是, 被某种受体激活了的 G- 蛋白, 可不通过第二信使而直接作用于细胞膜上的离子通道使其对某种离子的通透性发生改变 图 G- 蛋白介导的跨膜信号转导途径模式图

72 大量的细胞外信号分子是通过 G- 蛋白耦联受体把信号转导至细胞内, 并引发生物效应 它们大致可归纳为以下几条途径 1.cAMP-PKA 途径激素等与细胞膜上的特异受体结合后, 通过一种兴奋性 G- 蛋白 (stimulatory G protein, Gs) 激活腺苷酸环化酶, 使胞浆中的第二信使 camp 生成量增加 camp 可激活依赖 camp 的蛋白激酶 A(protein kinase A,PKA), 引起多种细胞内蛋白质的磷酸化, 进而完成激素对细胞功能的调节 对一些关键酶的共价磷酸化是调节代谢途径的快速方式 ; 蛋白激酶 A 可磷酸化钙通道, 引起大量 Ca 2+ 内流 ; 磷酸化微管蛋白, 改变其构象, 引发细胞的分泌功能 进入核内的 PKA 可磷酸化转录因子相关蛋白, 调节基因转录 抑制性 G- 蛋白 (inhibitory G protein, Gi) 可抑制腺苷酸环化酶, 使胞浆中的 camp 量减少 2.IP 3 -Ca 2+ 途径当激素 神经递质等与相应受体结合后, 可通过 G- 蛋白介导激活一种位于细胞膜上的磷脂酶 C(phospholipase C,PLC), 后者可将磷脂酰肌醇二磷酸 (phosphatidyl inositol-4, 5-biphosphate, PIP 2 ) 水解成三磷酸肌醇 (1, 4, 5-inositol triphosphate, IP 3 ) 及甘油二酯 (diacylglycerin, DG), 这二者都是第二信使 在内质网 ( 或肌质网 ) 膜表面有 IP 3 受体, 其亚单位的羧基端部分构成钙通道 当 IP 3 与 IP 3 受体结合后, 受体变构, 钙通道开放, 贮存于内质网的 Ca 2+ 释入胞浆内, 使胞浆内 Ca 2+ 浓度升高 胞液 Ca 2+ 浓度升高, 可以激活 Ca 2+ / 钙调蛋白依赖性蛋白激酶, 在体内发挥生理性调节作用 如钙调蛋白激酶磷酸化平滑肌的肌球蛋白轻链后, 可引起平滑肌收缩或张力增加 3.DG-PKC 途径如前述, 当激素等与受体结合, 通过 G- 蛋白激活 PLC 后, 可将 PIP 2 水解成 IP 3 及 DG 近年来发现 DG 还可来自磷脂酰胆碱 ( 卵磷脂 ) 激素经受体 G 蛋白介导, 还可激活磷脂酶 D, 在 Ca 2+ 存在下, 可将磷脂酰胆碱水解为磷脂酸, 后者再被磷脂酸磷酸水解酶水解成 DG 这二种来源的 DG 都能活化蛋白激酶 C (protein kinase C, PKC), 激活的 PKC 可促进细胞膜 Na + /H + 交换蛋白磷酸化, 增加 H + 外流 ;PKC 激活也可通过磷酸化转录因子, 调节基因转录过程 4.G 蛋白 - 离子通道途径 G 蛋白通过两种机制调节离子通道 (1) 直接机制 : 少数 G 蛋白可以直接调节离子通道的活动, 不需第二信使的参与 直接受 G 蛋白调节的离子通道主要有 Ca 2+ K + 通道 (2) 间接机制 :G 蛋白间接调节离子通道的方式, 是通过第二信使和 / 或第二信使下游的蛋白激酶调节离子通道的活动, 实现信号转导 ( 图 ) ( 三 ) 酶耦联受体介导的跨膜信号转导途径 1. 酪氨酸激酶酪氨酸激酶耦联的受体可分为两类 : 一类受体分子具有酶的活性, 即受体与酶是同一蛋白分子, 称为具有酪氨酸激酶的受体 (tyrosine kinase receptor) 或受体酪氨酸激酶 (receptor tyrosine kinase,rtk); 另一类受体本身没有酶的活性, 但当它被配体激活时, 立即与酪氨酸激酶结合并使之激活, 称为结合酪氨酸激酶的受体 (receptor-associated tyrosine kinase) 酪氨酸激酶是一类能催化蛋白质酪氨酸残基磷酸化的蛋白激酶, 该酶可催化自身或底物的酪氨酸残基磷酸化 (1) 具有酪氨酸激酶的受体该类受体都是贯穿脂质双层的膜蛋白, 一般只有一个跨膜 α 螺旋, 它在膜外侧有与配体结合的受体位点, 而它伸入胞浆的一端具有酪氨酸激酶的结构域 当膜外的信号分子 ( 如生长因子等 ) 与它的受体位点结合时, 就引起胞浆侧的酪氨酸激酶结构域的激活, 导致受体自身及 / 或细胞内靶蛋白的磷酸化, 激活细胞内信号转导通路 ( 图 )

73 图 受体酪氨酸激酶介导的信号转导 生长因子与受体酪氨酸激酶 (RTK) 相结合, 首先导致相邻受体二聚化和受体胞浆侧分子自身磷酸化, 生长因子受体结合蛋白 2(growth-factor receptor binding protein 2, GRB2) 与二聚化受体结合并激活一个鸟苷酸释放因子 SOS,SOS 的激活使单体 G 蛋白 Ras 活化, 活化的 Ras 蛋白结合并激活蛋白激酶 Raf(MAPKKK), 后者又依次激活 MAPKK 和 MAPK, 由此激活细胞内信号转导通路 (2) 结合酪氨酸激酶的受体此类受体的分子结构中没有蛋白激酶的结构域, 但是一旦与细胞外的配体结合而被激活, 就可和细胞内的酪氨酸激酶形成复合物, 并通过对自身和底物蛋白的磷酸化作用把信号转入细胞内 这类受体包括生长素 白细胞介素 干扰素等受体 这些受体一旦与配体结合便可进一步结合并激活细胞内的酪氨酸激酶 ( 如 JAK), 与受体结合的酪氨酸激酶就会使不同的靶蛋白磷酸化, 导致细胞内效应 ( 图 )

74 图 经生长素受体的信号转导 生长素 (growth hormone, GH) 与其受体结合首先诱导受体分子二聚化, 二聚化的受体与酪氨酸激酶 JAK( 酪氨酸激酶 Janus 家族的一个成员 ) 结合并使之激活, 引起受体和 JAK 自身的磷酸化, 磷酸化的 JAK 与胞浆内另一种酪氨酸激酶 STAT( 转录信号转导与激活蛋白 ) 结合并使之磷酸化, 磷酸化的 STAT 与 JAK 分离并以二聚体的形式进入胞核, 激活基因转录 2. 鸟苷酸环化酶生物组织中存在着膜结合型与可溶性鸟苷酸环化酶 尿钠肽等可与膜结合型鸟苷酸环化酶专一性受体功能域结合, 可使环化酶活化 可溶性鸟苷酸环化酶可被气体性信使 NO 和 CO 激活 环化酶的活化可催化 GTP 转变为 cgmp, 促使细胞内 cgmp 水平升高 cgmp 可以调节 cgmp 门控通道 磷酸二酯酶和 cgmp 依赖性蛋白激酶的活性, 引发生理效应 ( 夏强 )

75 第四篇细胞适应 损伤与修复 第一章细胞信号转导及其异常 在多细胞生物体内, 细胞与细胞之间的相互信息交流除直接接触外, 更主要的是相隔一定距离的细胞通过内分泌 旁分泌和自分泌所产生的信息分子来进行协调 细胞通过位于胞膜或胞内的受体感受胞外信息分子的刺激, 经复杂的细胞内信号转导系统的转换而影响其生物学功能, 这一过程称为细胞信号转导 (cellular signal transduction), 这是细胞对外界刺激做出应答反应的基本生物学方式 其中, 水溶性信息分子如肽类激素 生长因子及某些脂溶性信息分子 ( 如前列腺素 ) 等, 不能穿过细胞膜, 需通过与膜表面的特殊受体相结合才能激活细胞内信息分子, 经信号转导的级联反应将细胞外信息传递至胞浆或核内, 调节靶细胞功能, 这一过程称为跨膜信号转导 (transmembrane signal transduction) 脂溶性信息分子如类固醇激素和甲状腺素等能穿过细胞膜, 与位于胞浆或核内的受体结合, 激活的受体作为转录因子, 改变靶基因的转录活性, 从而诱发细胞特定的应答反应 在病理状况下, 由于细胞信号转导途径中一个或多个环节异常, 可以导致细胞代谢及功能紊乱或生长发育异常 第一节细胞信号转导的主要途径 一 G 蛋白介导的细胞信号转导途径 G 蛋白是指可与鸟嘌呤核苷酸可逆性结合的蛋白质家族, 分为两类 :1 由 α β 和 γ 亚单位组成的异三聚体, 位于细胞膜内侧, 在膜受体与效应器之间的信号转导中起中介作用 ;2 小分子 G 蛋白, 为分子量 21000~28000 的小肽, 只具有 G 蛋白 α 亚基的功能, 在细胞内进行信号转导 目前发现的 G 蛋白偶联受体 (G protein coupling receptors, GPCRs) 已达 150 种以上, 它们在结构上的共同特征是由单一肽链 7 次穿越膜, 构成 7 次跨膜受体 当受体被配体激活后,G α 上的 GDP 为 GTP 所取代, 这是 G 蛋白激活的关键步骤 此时 G 蛋白解离成 GTP-G α 和 G βγ 两部分, 它们可分别与效应器作用, 直接改变其功能, 如离子通道的开闭 ; 或通过产生第二信使影响细胞反应 G α 上的 GTP 酶水解 GTP, 终止 G 蛋白介导的信号转导 此时,G α 与 G βγ 又结合成无活性的三聚体 ( 一 )Gs Gi 介导的腺苷酸环化酶途径 在腺苷酸环化酶 (adenylyl cyclase, AC) 信号转导途径中存在着两种作用相反的 G 蛋白,Gs 与 G i o 它们通过增加或抑制 AC 活性来调节细胞内 camp 浓度, 进而影响细胞的

76 功能 β 肾上腺素能受体 胰高血糖素受体等激活后经 Gs 增加 AC 活性, 促进 camp 生成 而 α 2 肾上腺素能受体 M 2 胆碱能受体等激活则与 G i 偶联, 经抑制 AC 活性减少 camp 的生成 camp 可激活蛋白激酶 A(protein kinase A, PKA), 引起多种靶蛋白磷酸化, 调节其功能 例如, 肾上腺素引起肝细胞内 camp 增加, 通过 PKA 促进磷酸化酶激酶活化, 增加糖原分解 心肌 β 受体兴奋引起的 camp 增加经 PKA 促进心肌钙转运, 提高心肌收缩力 进入核内的 PKA 可磷酸化转录因子 CRE 结合蛋白 (camp response element binding protein, CREB), 使其与 DAN 调控区的 camp 反应元件 (camp respones element, CRE) 相结合, 激活靶基因转录 ( 二 )G q 介导的 IP 3 Ca 2+ - 钙调蛋白激酶途径 α 1 肾上腺素能受体 内皮素受体 血管紧张素 II 受体等激活可与 G qα 结合, 激活细胞膜上的磷脂酶 C(phospholipase C, PLC) β 亚型, 催化质膜磷脂酰肌醇二磷酸 (phosphatidylinositol 4, 5-diphosphate, PIP 2 ) 水解, 生成三磷酸肌醇 (1, 4, 5-inositol triphosphate, IP 3 ) 和甘油二酯 (1, 2-diacylglycerol, DG) IP 3 促进肌浆网或内质网储存的 Ca 2+ 释放,Ca 2+ 亦可作为第二信使启动多种细胞反应 例如, 促进胰岛 β 细胞释放胰岛素 ; 与心肌和骨骼肌的肌钙蛋白结合, 触发肌肉收缩 Ca 2+ 与钙调蛋白结合, 激活 Ca 2+ / 钙调蛋白依赖性蛋白激酶活性, 经磷酸化多种靶蛋白产生生物学作用 ( 三 )G q 介导的 DG- 蛋白激酶 C 途径 DG 与 Ca 2+ 能协调促进蛋白激酶 C(protein kinase C, PKC) 活化 激活的 PKC 可促进细胞膜 Na + /H + 交换蛋白磷酸化, 增加 H + 外流 ;PKC 激活也可通过磷酸化转录因子 AP-1 NF- K B 等, 促进靶基因转录和细胞的增殖与肥大 ( 图 4-1-1) α 2 受体 α 1 受体 β 受体 M 受体 内皮素受体 G Sα G i G qα (+)( - ) α β γ (+)( + ) 腺苷酸环化酶 PLC β camp PIP 2 IP 3 PKA DAG Ca 2+ 释放 靶蛋白 靶基因 PKC 靶蛋白 磷酸化 转录 磷酸化 图 G 蛋白介导的细胞信号转导途径

77 二 酪氨酸蛋白激酶介导的信号转导途径 ( 一 ) 受体酪氨酸蛋白激酶途径 受体酪氨酸蛋白激酶 (tyrosine protein kinase, TPK) 是由 50 多种跨膜受体组成的超家族, 其共同特征是受体胞内区含有 TPK, 配体则以生长因子为代表 表皮生长因子 (epidermal growth factor, EGF) 血小板源生长因子 (platelet-derived growth factor, PDGF) 等与受体胞外区结合后, 受体发生二聚化并催化胞内区酪氨酸残基自身磷酸化, 进而活化 TPK 磷酸化的酪氨酸可被一类含有 SH2 区 (Src homology 2 domain) 的蛋白质识别, 通过级联反应向细胞内进行信号转导 由于大多数调节细胞增殖及分化的因子都通过这条途径发挥作用, 故它与细胞增殖肥大和肿瘤发生的关系十分密切 1. 经 Ras 蛋白激活丝裂原活化蛋白激酶丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase, MAPK) 家族是与细胞生长 分化 凋亡等密切相关的信号转导途径中的关键物质, 可由多种方式激活 EGF PDGF 等生长因子与其受体结合并引起 TPK 激活后, 细胞内含 SH2 区的生长因子受体连接蛋白 Grb2 与受体结合, 将胞浆中具有鸟苷酸交换因子活性的 Sos 吸引至细胞膜,Sos 促进无活性 Ras 所结合的 GDP 为 GTP 所置换, 导致 Ras 活化 激活的 Ras 活化 Raf ( 又称 MAPK kinase, MAPKKK), 进而激活 MEK( 又称 MAPK kinase, MAPKK), 最终导致细胞外信号调节激酶 (extracellular signal regulated kinase, ERK) 激活 ( 图 4-1-2) 激活的 ERK 可促进胞浆靶蛋白磷酸化或调节其他蛋白激酶的活性, 如激活磷脂酶 A 2 ; 激活调节蛋白质翻译的激酶等 更重要的是激活的 ERK 进入核内, 促进多种转录因子磷酸化, 如 ERK 促进血清反应因子 (serum response factor, SRF) 磷酸化, 使其与含有血清反应元件 (serum response element, SRE) 的靶基因启动子相结合, 增强转录活性 生长因子 受体 TPK PI3K Grb2 PLCγ 靶蛋白 Sos PIP 2 IP 3 磷酸化 Ras DAG Ca 2+ Raf PKC MEK 靶蛋白 ERK 转录因子 靶基因 磷酸化 磷酸化 转录 图 受体酪氨酸蛋白激酶介导的信号转导途径

78 ( 二 ) 非受体酪氨酸蛋白激酶信号转导途径 细胞因子如白介素 (IL) 干扰素 (INF) 及红细胞生成素等的膜受体本身并无蛋白激酶活性, 其信号转导是由非受体 TPK 介导的 非受体 TPK 的调节机制差异较大, 现以 INF-γ 为例, 说明其信号转导途径 INF-γ 与受体结合并使受体发生二聚化后, 受体的胞内近膜区可与胞浆内非受体 TPK JAK 激酶 (janus kinase) 结合并发生磷酸化, 进而与信号转导和转录激活因子 (signal transducers and activators of transcription, STAT) 相结合 在 JAK 催化下, STAT 中的酪氨酸磷酸化, 并结合成 STAT 二聚体转移入核, 与 DNA 启动子的活化序列结合, 诱导靶基因的表达, 促进多种蛋白质的合成, 进而增强细胞抵御病毒感染的能力 三 鸟苷酸环化酶信号转导途径 鸟苷酸环化酶 (guanylyl cyclase, GC) 信号转导途径存在于心血管系统和脑内, 一氧化氮 (nitric oxide,no) 激活胞浆可溶性 GC, 心钠素及脑钠素激活膜颗粒性 GC, 增加 cgmp 生成, 再经激活蛋白激酶 G(protein kinase G, PKG) 磷酸化靶蛋白发挥生物学作用 ( 图 4-1-3) 乙酰胆碱 Ca 2+ NO 合酶 GTP 受体 NO GC GC 受体 细胞因子精氨酸 NO cgmp PKG 血管舒张 血管内皮细胞 血管平滑肌细胞 图 血管鸟苷酸环化酶信号转导途径 四 核受体及其信号转导途径 细胞内受体分布于胞浆或核内, 本质上都是配体调控的转录因子, 均在核内启动信号转导并影响基因转录, 故统称为核受体 (nuclear receptor) 按核受体的结构与功能可将其分为 :1 类固醇激素受体家族包括糖皮质激素 盐皮质激素 性激素受体等 类固醇激素受体 ( 除雌激素受体位于核内 ) 位于胞浆, 未与配体结合前与热休克蛋白 (heat shock protein,hsp) 结合存在, 处于非活化状态 配体与受体的结合使 HSP 与受体解离, 暴露 DNA 结合区 激活的受体二聚化并转移入核, 与 DNA 上的激素反应元件 (hormone response element, HRE) 相结合或与其他转录因子相互作用, 增强或抑制靶基因转录 ( 图 4-1-4);2 甲状腺素受体家族包括甲状腺素 维生素 D 和维甲酸受体等 此类受体位于核内, 不与 HSP 结合, 多以同源或异源二聚体的形式与 DNA 或其他蛋白质结合, 配体入核与受体结合后, 激活受体并经 HRE 调节基因转录 近年来的研究表明, 不同信息分子 不同信号转导途径之间还存在交叉对话 (crosstalk) 即相互调节, 从而构成复杂的信号转导网络 例如,G iβγ 可通过激活 PLC β, 引起 AC 及

79 PLC 介导的信号转导途径之间的交互调节 ; 在众多的信号转导途径中, 无论任何环节出现异常, 都可使相应的信号转导过程受阻, 导致细胞的应答反应减弱 丧失或者反应过度, 这些均可导致疾病的发生 图 类固醇激素受体的信号转导途径 第二节信号转导异常 细胞信号转导的异常是指由于信号转导蛋白量或结构的改变, 导致信号转导的过强或过弱, 并由此引起细胞增殖 分化 凋亡或机能代谢的改变 具体地说 :1 信号转导通路中某一成分的减少 缺失或结构异常, 使与这种信号转导相关的细胞代谢和功能障碍, 导致特定信号 / 配体的抵抗征 迄今报道较多的是激素抵抗征, 如胰岛素抵抗性糖尿病 雄激素抵抗征 TXA 2 抵抗征等 ;2 疾病时某些信号转导蛋白的过度表达, 或基因突变使某一信号蛋白的固有活性限制解除, 成为异常的不受控制的激活状态 ; 或者激活的癌基因产物 自身抗体作为信号蛋白的类似物, 能模拟某种信号转导蛋白的作用, 从而参与了细胞内的信号转导过程, 也使细胞内的信号转导失控 这将造成信号积累, 导致细胞增殖 分化 凋亡或功能代谢异常 导致信号转导异常的原因为 : ( 一 ) 基因突变 一 信号转导异常的原因 可以是生殖细胞的突变如某些遗传性疾病, 或体细胞的突变如肿瘤 基因突变分为 :

80 1 失活性突变, 导致信号转导蛋白功能减弱或丧失 某些失活型突变体除本身无功能外, 还能通过竞争性抑制的方式阻断野生型信号转导蛋白的作用, 从而阻断该信号转导通路, 这种突变体被称为显性失活型突变体 (dominant negative mutant);2 激活性突变, 生成组成型激活突变体 (constitutively activate mutant), 这种突变的信号转导蛋白呈不受调节的持续性激活状态 ( 二 ) 自身免疫反应 多数信号分子或受体为蛋白质, 在一定内外因素作用下, 可作为抗原, 使机体产生相应的自身抗体 自身抗体可使信号分子或受体失活, 从而阻断特定的信号转导通路, 也可模拟信号分子的作用, 激活特定的信号转导通路, 最终导致特定的自身免疫性疾病 ( 三 ) 继发性异常 信号分子 ( 配体 ) 量的持续性变化 ( 增多或减少 ), 如体内某种激素长时间的分泌过多或减少, 或长时期使用某种激素的激动剂或拮抗剂, 使细胞特定受体的量或亲和力改变, 其中受体数量的增加或减少分别称为上调 (up regulation) 或下调 (down regulation), 或使受体后信号转导过程改变, 造成细胞对特定信号的反应性减弱或增强, 前者称为脱敏, 后者称为高敏 例如, 当各种原因引起心功能不全时, 交感神经活动的代偿性加强, 血浆去甲肾上腺素浓度增高, 可使心肌细胞上的 β 1 受体减少以及受体与 G 蛋白解偶联, 使细胞内 camp 生成减少, 导致去甲肾上腺素的正性肌力作用减弱, 从而可加快心衰的发展 此外, 严重感染时, 可导致细胞对胰岛素的抵抗, 这也属于受体和信号转导通路继发性的异常, 因为随着感染被控制, 这种抵抗的情况可被纠正 二 信号转导异常的发病机制 信号转导的有关的异常可发生在多个层次 : ( 一 ) 信号本身的异常 信号的异常是指信号的发放过多或过少, 体内某种信号的拮抗因素过多或产生了抗某种蛋白多肽类信号的自身抗体等 如胰岛素生成减少 体内产生抗胰岛素抗体以及应激反应时体内产生的大量应激激素, 如儿茶酚胺 胰高血糖素 糖皮质激素 生长激素等能拮抗胰岛素的作用, 这些均可导致血糖增高 ( 二 ) 受体异常 受体异常也称为受体病, 包括 :1 受体基因突变使受体数量改变或结构异常所造成的遗传性受体病 ;2 抗受体自身抗体生成导致自身免疫性受体病 抗受体抗体有两类 : 阻断型和刺激型 前者与受体结合后, 可干扰受体与配体的结合, 从而阻断受体的效应, 导致靶细胞功能低下 如体内的抗 N 型乙酰胆碱受体 (nachr) 的抗体通过阻断运动终板上的 nachr 与乙酰胆碱的结合, 导致重症肌无力 刺激型抗受体抗体与受体结合后, 可模拟配体的作用, 使靶细胞功能亢进, 其典型的例子是促甲状腺激素受体的抗体, 该抗体可促使甲状腺合成和分泌过多的甲状腺素从而引起甲亢 ;3 受体调节性的改变 受体受自身配体的向上和向下调节就是受体调节性改变的典型例子 受体数量和亲和力还受其他多种因素的影响, 如在炎症时, 血液中的内毒素 炎症介质或细胞因子可以上调白细胞和内皮细胞表面的某些粘附分子, 导致两种细胞的粘附增强, 利于白细胞穿过内皮

81 细胞向炎症部位游走 ( 三 ) 受体后信号转导通路异常 已报道受体后信号转导通路异常包括 G 蛋白 α 亚基 (G α ) 的异常 某些酪氨酸蛋白激酶如 JAK3 的异常以及细胞内离子信使 Ca 2+ 或气体信使 NO 等量的异常 如甲状旁腺素的作用是通过其受体 -G 蛋白 (Gs)- 腺苷酸环化酶 -camp 信号通路介导的,Gas 量的减少和或突变使 camp 生成减少, 使靶细胞对甲状旁腺激素不敏感, 结果导致 Ia 型假性甲状旁腺功能减退症 ; 钙离子是细胞内重要的信使分子, 细胞内 [Ca 2+ ] 的过度增高, 可导致细胞的损伤和死亡 从理论上说, 受体后信号通路的任何环节都可能发生异常, 但这些异常并非一定都和机能异常及疾病相关 因为细胞的信号系统是一个网络, 某种信号蛋白的功能丧失后, 如它的作用能由别的相关信号蛋白来取代, 或者功能相近的信号转导途径间发生了功能上的互补, 则不会影响细胞的机能代谢 已证明有些信号转导蛋白的基因剔除 (gene knockout) 并不引起小鼠表型的改变 基因剔除实验有助于确定某个信号转导蛋白对特定信号通路和生理功能是否是必需的和特异的以及体内有无替代成分 三 细胞信号转导异常的结果 根据信号转导系统控制的细胞功能, 细胞信号转导异常可导致以下结果 : 1. 控制细胞代谢的信号通路异常如胰岛素的信号转导通路异常可致糖尿病 ; 甲状腺激素的信号转导过程异常与甲亢的发生有关 2. 与细胞功能有关的信号转导异常如神经细胞释放的神经递质通过细胞的信号转导系统使肌肉收缩或舒张, 重症肌无力是体内出现了抗乙酰胆碱受体的抗体干扰了乙酰胆碱的信号转导所致 3. 细胞增殖信号转导异常生长因子 细胞因子以及多种激素能通过它们的受体激活酪氨酸蛋白激酶, 通过蛋白质的磷酸化反应, 启动 Ras-Raf-MAPK 通路 JAK-STATs 通路 PLC-PKC 通路等导致细胞的增殖 细胞增殖信号的产生和转导具有严格的时相型, 已知物理 化学 炎症和损伤等多种刺激可使细胞释放上述促增殖的信号, 启动细胞内的信号通路 导致细胞增殖 产生组织肥厚, 如高血压心肌肥厚, 甚至出现良性肿瘤 如果促增殖信号不在适当的时间和部位增强, 且其发生和转导不受控制, 如由于基因突变, 使编码生长因子或细胞因子 受体以及受体后的信号转导通路的成分组成型激活, 可产生肿瘤 4. 细胞凋亡异常细胞死亡一般分为坏死和程序性死亡两类 近年来的研究证明, 在多种病理生理过程中, 如缺血及炎症反应时不仅有细胞的坏死, 也有细胞的凋亡 细胞凋亡在诸如肿瘤的发生, 细胞的损伤反应 神经细胞的退行性改变以及自身免疫性疾病等的发病中具有重要作用 ( 郭峻 )

82 第二章细胞凋亡 第一节概述 由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡 (apoptosis), 又称程序性细胞死亡 (programmed cell death, PCD), 但有学者认为凋亡与 PCD 是两个不同的概念, 前者是形态学概念 ( 如染色质着边及 DNA 梯状条带等 ), 后者是功能性概念 ( 不一定存在上述形态学变化 ) 凋亡一词源于希腊文, 其意义为 花瓣或树叶的枯落 这是病理学家 Kerr 等人在 1972 年提出的一个不同于坏死的细胞死亡新概念 坏死通常由严重损伤因素 ( 如毒物中毒 严重缺血 缺氧 强酸 强碱 强大电流等 ) 所致, 其过程是 : 首先是细胞膜通透性增高, 大量 H 2 O 进入细胞, 细胞因肿胀而破裂, 细胞内容物 ( 包括溶酶 ) 释放而诱发进一步的细胞损伤和炎症反应, 但细胞核不破坏 正常组织细胞不发生细胞坏死 细胞凋亡作为一种生理性 主动的细胞死亡的方式, 在许多方面与坏死有显著的差别 ( 表 4-2-1) 1. 性质 2. 诱导因素 3. 生化特点 4. 形态变化 5.DNA 电泳 6. 炎症反应 7. 凋亡小体 8. 基因调控 坏死 表 细胞凋亡与坏死的比较 病理性, 非特异性强烈刺激, 随机发生被动过程, 无新蛋白合成, 不耗能细胞结构全面溶解 破坏 细胞肿胀弥散性降解, 电泳呈均一 DNA 片状溶酶体破裂, 局部炎症反应无无 凋亡 生理性或病理性, 特异性较弱刺激, 非随机发生主动过程, 有新蛋白合成, 耗能细胞及细胞器相对完整, 细胞皱缩, 核固缩 DNA 片段化 ( bp), 电泳呈 梯 状条带溶酶体相对完整, 局部无炎症反应有有 细胞凋亡有重要的生理和病理意义, 凋亡作为生理过程, 它具有以下三项作用 :1 确保正常发育 生长 机体的发育 生长过程并不仅仅与细胞的增殖与分化有关, 凋亡在器官组织的形成 成熟过程中也发挥了重要作用 它可以清除多余的 失去功能价值的细胞 例如 : 人胚胎肢芽发育过程中指 ( 趾 ) 间组织, 通过细胞凋亡机制而被逐渐消除, 形成指 ( 趾 ) 间隙 ;2 维持内环境稳定 受损 突变或衰老的细胞如果存在留体内就可能干扰机体功能, 甚至演变为多种疾病 ( 如肿瘤 ) 为了维持内环境的稳定, 机体必须及时将这些细胞清除, 清除这些细胞的主要方式就是凋亡 例如 : 机体通过细胞凋亡机制清除了针对自身抗原的 T 淋巴细胞, 维持了免疫系统功能的稳定 为了维持良好的功能状态, 皮肤 粘膜上皮需要不断更新, 这个过程不仅仅是新生细胞的增殖, 也包含了衰老细胞的凋亡 子宫内膜在周期性的增生之后由于激素撤退而发生凋亡 脱落 ; 受损不能修复的细胞或发生癌前病变的细胞通过凋亡而被清除 通过细胞凋亡被机体清除的细胞

83 数量是相当可观的, 每秒钟可达数百万个 3 发挥积极的防御功能 细胞凋亡参与了机体的防御反应, 例如当机体受到病毒感染时, 受感染的细胞发生凋亡, 使 DNA 发生降解, 整合于其中的病毒 DNA 也随之被破坏, 因而阻止了病毒的复制 细胞凋亡概念也使人们对疾病的发生 发展的认识增多了一个视角, 即从细胞凋亡角度来看, 细胞凋亡不足 该 死 的细胞 ( 如肿瘤细胞 自身反应性免疫细胞 ) 未死, 是造成肿瘤 自身免疫性疾病的主要发病机制之一 细胞凋亡过度, 不该 死 的细胞 ( 如神经元 心肌细胞 ) 死了, 这与老年性痴呆 心肌缺血 / 再灌注损伤等发病有关 细胞凋亡不足与过度并存, 这与动脉粥样硬化发病有关 凋亡失调是当今威胁人类健康的许多重大疾病的发病机制之一, 因此, 调控凋亡过程是人类防治这些疾病的新途径 第二节细胞凋亡过程与调控 一 细胞凋亡的过程 凋亡是基因调控的主动性有序死亡, 大致可分成以下四个阶段 : 1. 凋亡信号转导细胞内外的调亡诱导因素通过各种受体作用于细胞后, 细胞产生一系列复杂的生化反应, 形成与细胞凋亡有关的第二信使物质如 :Ca 2+,cAMP, 神经酰胺等, 然后通过胞内的信号转导途径激活后续凋亡程序 2. 凋亡基因激活调控凋亡的基因接收由信号转导途径传来的死亡信号后按预定程序启动, 并合成为执行凋亡所需的各种酶类及相关物质 3. 细胞凋亡的执行已决定死亡的细胞迅即进入死亡执行 (execution of death) 阶段, 凋亡主要的执行者是核酸内切酶 (endogenous nuclease, Dnase) 和 Caspases, 前者彻底破坏细胞生命活动所必须的全部指令, 而后者导致细胞结构的全面解体 4. 凋亡细胞的清除已经凋亡的细胞可被邻近的吞噬细胞或其他细胞所吞噬, 分解 上述全过程需时约数分钟至数小时不等 从凋亡信号转导到凋亡执行的各个阶段都有负调控因子存在, 以形成完整的反馈环路, 使凋亡过程受到精确 严密的调控 ( 图 4-2-1) 凋亡 死 凋亡 诱 camp 亡 相关 DNase 激活 巨噬细胞 导 + 受体 Ca 2+ 信 基因 Caspases 激活 吞噬分解 因 神经酰胺 号 激活 凋亡细胞 素 图 细胞凋亡过程 二 凋亡时细胞的主要变化 ( 一 ) 细胞凋亡的形态学改变 发生凋亡的细胞, 其表面的微绒毛消失, 并逐步脱离与周围细胞的接触 胞浆脱水

84 浓缩, 胞膜迅速发生空泡化 (blebbing), 细胞体积逐渐缩小, 出现固缩 (condensation) 内 质网不断扩张并与胞膜融合, 形成膜表面的芽状突起, 称为出芽 (buding) 晚期核质高度 浓缩融合成团, 染色质集中分布在核膜的边缘, 呈新月形或马蹄形分布, 称为染色质边 集 (margination) 线粒体和溶酶体的形态结构变化不大 胞膜皱缩内陷, 分割包裹胞浆, 形成泡状小体称为凋亡小体 (apoptosis body), 这是凋亡细胞特征性的形态学改变 在电镜 下典型的凋亡小体由透亮空泡和不透光的浓密的核碎片两部分组成, 二者形成强烈的反 差 体积较大的凋亡小体用普通高倍光镜也可观察到 小体内的成份主要是胞浆碎裂的 核物质和亚微结构 有些凋亡小体完全由固缩核染色质组成, 也有的仅含胞浆成分 凋 亡小体形成后迅即被邻近细胞吞噬 消化 整个凋亡过程没有细胞内容物的外漏, 因而 不伴有局部的炎症反应 重要 ( 二 ) 细胞凋亡的生化改变 细胞凋亡过程中可出现各种生化改变, 其中 DNA 的片段化断裂及蛋白质的降解尤为 1.DNA 的片段化典型的细胞凋亡以细胞核固缩 染色质 DNA 的特征片段化为主 要特征 细胞凋亡发生时 DNA 双链的断裂发生在核小体连接部, 是内源性核酸内切酶被 激活所致 组成染色质的基本结构单位是核小体, 核小体之间的连接区易受内切酶的攻击而发 生断裂 DNA 链上每隔 200 个核苷酸就有 1 个核小体, 当内切酶在核小体连接区切开 DNA 时, 即可形成 bp 或其整倍数的片段 这些片段在琼脂糖凝胶电泳中可呈特 征性的 梯 状 (ladder pattern) 条带, 这是判断凋亡发生的客观指标之一 因此,DNA 片 段化断裂是细胞凋亡的关键性结局 2. 内源性核酸内切酶激活及其作用在细胞凋亡过程中执行染色质 DNA 切割任务 的是内源性核酸内切酶 正常情况下, 该酶可能以无活性的形式存在于细胞核内, Ca 2+ /Mg 2+ 可增强它的活性, 而 Zn 2+ 能抑制其活性 此外, 在某些细胞也存在着非依赖二 价金属离子的核酸内切酶, 这些酶的活性不依赖 Ca 2+ /Mg 2+, Zn 2+ 也不能抑制其活性 尽 管已有多种核酸内切酶存在于细胞核内, 但细胞内外的凋亡诱导因素并不能直接激活该 酶, 它需要经过一系列胞内信号转导环节方能被激活 3. 凋亡蛋白酶 (caspases) 的激活及其作用凋亡蛋白酶是一组对底物天冬氨酸部位有 特异水解作用, 其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶 (caspase 是 cysteine-containing aspartate-specific protease 的缩写 ) 目前已发现该蛋白酶家族至少有 13 个成员 (caspase l-13),caspase 在凋亡中所起的主要作用是 : 灭活细胞凋亡的抑制物 ( 如 Bcl-2); 水解细胞 的蛋白质结构, 导致细胞解体, 形成凋亡小体 ; 在凋亡级联反应 (cascade) 中水解相关活性 蛋白, 从而使该蛋白获得或丧失某种生物学功能如 :caspase-9 可使 caspase-3 酶原水解形 成具有分解蛋白质活性的 caspase-3 ( 一 ) 细胞凋亡相关因素 三 细胞凋亡的调控

85 细胞凋亡相关因素分诱导性因素和抑制性因素两大类 : 1. 诱导性因素细胞凋亡是一个程序化的过程, 这个程序虽已预设于活细胞之中, 正常情况下它并不 随意 启动, 只有当细胞受到来自细胞内外的凋亡诱导因素作用的时候, 它才会启动, 使细胞一步步走向死亡, 因此凋亡诱导因素是凋亡程序的启动者 在少数情况下细胞凋亡可自发产生, 但多数是在诱导因素的作用下发生, 常见诱导因素有 : (1) 激素和生长因子失衡 : 生理水平的激素和生长因子是细胞正常生长不可缺的因素, 一旦缺乏, 细胞会发生凋亡 ; 相反, 某些激素或生长因子过多也可导致细胞凋亡 例如 : 强烈应激引起的淋巴细胞数量减少, 主要由于大量糖皮质激素分泌, 诱导淋巴细胞凋亡所致 (2) 理化因素 : 射线 高温 强酸 强碱 乙醇 抗癌药物等, 均可导致细胞凋亡 例如 : 电离辐射可产生大量氧自由基, 使细胞处于氧化应激状态,DNA 受损, 引起细胞凋亡 (3) 免疫性因素 : 免疫细胞在生长 分化及执行防御 自稳 监视功能中其免疫分子参与了免疫细胞或靶细胞的凋亡过程, 例如 : 细胞毒 T 淋巴细胞 (CTL) 可分泌粒酶 (granzyme), 能特异性裂解天冬氨酸残基, 引起靶细胞发生凋亡 (4) 微生物学因素 : 细菌 病毒等致病微生物及其毒素可诱导细胞凋亡 例如 HIV 感染时, 可致大量 CD + 4 淋巴细胞凋亡, 这时 AIDS 病人相关免疫功能低下, 因此是肿瘤及机会性感染增加的主要原因 2. 抑制性因素一些细胞因子 (IL-2, 神经生长因子等 ) 具有抑制凋亡的作用, 当其从细胞培养基中去除后, 依赖它们的细胞会发生凋亡 ; 反之, 在培养体系中加入所需要的细胞因子后, 由于促进了细胞内存活基因的表达, 细胞凋亡受到抑制 某些激素 (ACTH 睾丸酮 雌激素等) 对于防止靶细胞凋亡, 维持其正常存活是必需的 例如 : 当腺垂体被摘除或功能低下时, 肾上腺皮质细胞失去 ACTH 刺激, 可发生细胞凋亡, 引起肾上腺皮质萎缩 此时, 只要给予生理维持量的 ACTH 即可抑制肾上腺皮质细胞的凋亡, 防止肾上腺皮质的萎缩 睾丸酮对前列腺细胞, 雌激素对子宫平滑肌细胞都有类似的作用 此外, 某些二价金属阳离子如 :Zn 2+, 药物如 : 苯巴比妥 半胱氨酸蛋白酶抑制剂, 病毒如 :EB 病毒, 牛痘病毒 CrmA 等及中性氨基酸也具有抑制细胞凋亡的作用 ( 二 ) 细胞凋亡信号的转导大多数情况下来自于细胞外的细胞凋亡诱导因素作用于细胞后可转化为细胞凋亡信号, 并通过胞内不同的信号转导 (transduction) 途径, 最终激活细胞死亡程序, 导致细胞凋亡 因此, 凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核 DNA 片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节 这个系统的特点是 :1 多样性 : 即不同种类的细胞有不同的信号转导系统 2 偶联性 : 即死亡信号的转导系统与细胞增殖 分化过程中的信号转导系统在某些环节上有交叉 偶联 ; 因此同一个信号, 在不同条件下既可引起凋亡, 也可刺激增殖 3 同一性 : 即不同的凋亡诱导因素可以通过同一信号转导系统触发细胞凋亡 例如 : TNF-α 电离辐射及 Fas 抗原等多种凋亡诱导因素均可通过神经酰胺信号途径触发细胞凋

86 亡 这就意味着切断某一信号转导系统, 就有可能影响多种凋亡诱导因素引起的细胞凋亡 4 多途性 : 即同一凋亡诱导因素可经过多条信号转导途径触发凋亡 例如 : 糖皮质激素引起淋巴细胞凋亡可通过神经酰胺系统 胞内 Ca 2+ 信号系统及 camp/ 蛋白激酶 A(PKA) 信号系统转导凋亡信号 这就意味着要完全阻抑某一凋亡诱导因素的作用, 就必须同时切断多条相关的信号转导途径 ( 三 ) 凋亡相关基因细胞的生存和死亡是对立统一的两个方面 在进化过程中控制细胞生死的程序已经以基因的形式存储于细胞中, 当细胞受到凋亡诱导因素的作用后, 经有关信号转导系统的传递而激活凋亡基因, 细胞即按死亡程序一步步自动走向死亡 在细胞中同样也存在着抑制凋亡的基因, 对促进凋亡的基因起对抗作用 正常情况下这两类基因处于协调的对立统一状态, 以确保细胞生存有序 目前, 细胞凋亡相关基因多达数十种, 根据功能的不同可将其分为三类 : 抑制凋亡基因, 例如 :EIB IAP Bcl-2 的研究最为详细而系统 促进凋亡基因, 例如 :Fas Bax ICE P53 等 双向调控基因, 例如 c-myc Bclx 1.Bcl-2 Bcl-2 是 B 细胞淋巴瘤 / 白血病 -2(B cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2) 基因的缩写形式, 它是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因 人的 Bcl-2 蛋白由 229 个氨基酸组成, 小鼠为 236 应用单克隆抗体定位研究证实,Bcl-2 蛋白主要分布在线粒体内膜 细胞内表面 内质网 核膜等处 广泛存在于造血细胞 上皮细胞 淋巴细胞 神经细胞及多种瘤细胞 Bcl-2 的高表达能阻抑多种凋亡诱导因素 ( 如 : 射线 化学药物等 ) 所引发的细胞凋亡 例如 : 依赖神经生长因子的神经细胞, 当撤除神经生长因子后, 细胞会迅速发生凋亡 如果将表达 Bcl-2 的基因质粒显微注入细胞中, 则可防止神经细胞凋亡 临床研究发现, 当淋巴细胞性白血病病人外周淋巴细胞有 20% 以上呈 Bcl-2 阳性时, 其预后不佳, 因为 Bcl-2 的过高表达, 可导致肿瘤细胞对射线 抗癌药物的耐受性增强, 不容易发生凋亡 目前认为 :Bcl-2 抗凋亡的主要机制是 :1 直接的抗氧化 ;2 抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质, 如 : 细胞色素 C, 凋亡诱导因子 (AIF);3 抑制促凋亡调节蛋白 Bax Bak 的细胞毒作用 ;4 抑制凋亡蛋白酶 (caspases) 的激活 ;5 维持细胞钙稳态 2.Fas Fas 蛋白是一种细胞表面受体, 是一种跨膜蛋白, 它伸向胞浆的部分有一段与 TNFα 受体相似, 与 FNFα 受体和 NGF( 神经生长因子 ) 受体高度同源, 在多种组织细胞中存在 目前的研究表明, 天然表达或转染表达的 Fas 基因对细胞凋亡有促进作用,Fas 抗体能诱导细胞发生凋亡是因为 Fas 抗原作为细胞表面受体, 其天然配基可能就是某种信号, 通过信号转导, 最终诱发凋亡, 而 Fas 抗体正是模拟了配基的这种作用, 另外 Fas 抗原也许是某种生长因子受体, 而 Fas 抗体与之结合能阻断生长因子的作用, 因而发生凋亡 3.p53 野生型 P53 基因是一种抗癌基因, 具有诱导细胞凋亡的功能, 当该基因发生突变后反而可抑制细胞凋亡 野生型 p53 基因编码的 p53 蛋白是一种 DNA 结合蛋白, 该蛋白在细胞周期的 G 1 期发挥检查点 (checkpoint) 的功能, 负责检查染色体 DNA 是否有损伤, 一旦发现有缺陷的 DNA, 它就刺激 CIP(CDK-interacting protein-1, CDK 是 cyclin dependent kinase 的缩写 ) 的表达, 阻止细胞进入细胞周期, 并启动 DNA 修复机制 ; 如果

87 修复失败,p53 则启动细胞凋亡机制 那些遗传信息出错, 有可能演变为恶性肿瘤的细胞, 常常通过这种机制被消灭在萌芽之中 因此,p53 有 分子警察 (molecular policeman) 的美誉 4.c-myc, Bcl-x c-myc 是一种癌基因, 它能诱导细胞增殖, 也能诱导细胞凋亡, 具有双向调节作用 c-myc 蛋白作为重要的转录调节因子, 既可激活介导细胞增殖的基因, 也可激活介导细胞凋亡的基因, 在此情况下细胞何去何从, 取决于细胞接受何种信号以及细胞所处的生长环境 例如 : 在 c-myc 基因表达后, 如果没有足够的生长因子持续作用细胞就发生凋亡 ; 反之, 细胞就处于增殖状态 Bclx 基因通过 mrna 不同的剪切可翻译出两种蛋白 Bcl-XL 和 Bcl-Xs, 前者抑制细胞凋亡, 后者促进细胞凋亡 Bcl-X 激活后是否产生细胞凋亡则与这两种蛋白合成以谁为主有关 第三节细胞凋亡的发生机制 细胞凋亡发生机制尚未充分阐明, 有以下可能 : ( 一 ) 氧化损伤在细胞凋亡中的作用 氧自由基化学性质活泼, 破坏机体正常的氧化 / 还原的动态平衡, 造成生物大分子 ( 核酸 蛋白质 脂质 ) 的氧化损伤, 干扰正常的生命活动, 形成严重的氧化应激 (oxidative stress) 状态, 机体氧化损伤的后果之一就是诱导细胞凋亡 例如 : 各种氧化剂 ( 如 : 过氧化氢 ) 可直接诱导细胞凋亡, 抑制超氧化物岐化酶 (SOD) 的活性也可诱导细胞凋亡, 而使用抗氧化剂 ( 如 :VitE 胡萝卜素等 ) 可以阻断具备氧化应激背景的各种凋亡诱导因素如肿瘤坏死因子 (TNFα) 电离辐射等所引起的细胞凋亡 氧化应激引起细胞凋亡的可能机制是 : (1) 氧自由基引起的 DNA 损伤可激活 p53 基因引起细胞凋亡 (2) 氧自由基引起的 DNA 损伤可活化聚 ADP 核糖转移酶, 引起 NAD 快速耗竭,ATP 大量消耗, 引发细胞凋亡 (3) 氧自由基攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸, 引起脂质过氧化直接造成细胞膜的损伤可诱导细胞凋亡 ; 此外细胞膜上不饱和脂肪酸 ( 如 : 花生四烯酸 ) 的氧化产物过氧羟基 24 碳四烯酸有很强的诱发细胞凋亡的作用 (4) 氧化应激可激活 Ca 2+ /Mg 2+ 依赖的核酸内切酶, 也可产生膜的发泡现象 (5) 氧化应激引起细胞膜结构的破坏, 可改变细胞膜的通透性使 Ca 2+ 内流增加, 诱导细胞凋亡 自由基对线粒体膜的损害导致其通透性和膜电位的变化也可诱导细胞凋亡 (6) 氧化应激可活化核转录因子 NF-κB 和 AP-1, 可加速细胞凋亡相关的一些基因的表达, 诱发细胞凋亡 但目前也有实验证明, 在活性氧显著减少的低氧环境下某些类型的细胞凋亡仍可发生, 这表明氧化应激不是细胞凋亡的唯一机制 ( 二 ) 钙稳态失衡在细胞凋亡中的作用 细胞钙稳态失衡 (calcium dyshomeostasis) 也是细胞凋亡的重要机制之一 例如 : 各种凋

88 亡刺激, 如 TNF-α, 抗 CD 3 抗体,TCDD(2, 3, 7, 8-tetrachlorodi-benzo-p-dioxin) 等所引起细胞凋亡是钙依赖过程 凋亡发生时胞浆 Ca 2+ 浓度显著上升, 并在随后发生的一系列凋亡改变中起关键性作用 诸多的凋亡变化如 :Ca 2+ /Mg 2+ 依赖的核酸内切酶的激活 需钙蛋白酶 (calpain) 磷脂酶 (phospholipases) 谷氨酰氨转移酶等的激活, 凋亡细胞膜的空泡化等均与钙稳态失衡有关 钙稳态失衡参与了多种凋亡相关疾病的发病, 如神经退行性疾病 钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制 : (1) 激活 Ca 2+ /Mg 2+ 依赖的核酸内切酶, 降解 DNA 链 ; (2) 激活谷氨酰胺转移酶, 催化细胞内肽链间的酰基转移, 在肽链间形成共价键, 使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联, 有利于凋亡小体形成 ; (3) 激活核转录因子, 加速细胞凋亡相关基因的转录 ; (4) Ca 2+ 在 ATP 的配合下使 DNA 链舒展, 暴露出核小体之间的连接区内的酶切位点, 有利 DNA 内切酶切割 DNA ( 三 ) 线粒体损伤在细胞凋亡中的作用 在细胞凋亡期间尽管线粒体仍能维持其超微结构的基本正常, 但事实上其功能已发生显著改变, 如 : 线粒体内膜通透性增大, 线粒体内膜的跨膜电位 ( ψm) 下降, 能量合成水平显著降低等, 目前证据显示 : 线粒体功能改变在细胞凋亡的发生中起关键性作用, 其证据是 : 抑制线粒体的三羧酸循环或呼吸链功能即可引起细胞凋亡 ; 在细胞核出现凋亡性改变之前, 常常先有线粒体跨膜电位的降低 体内 外实验证明, 阻止线粒体的通透性改变 (permeability transition, PT) 可以防止细胞凋亡, 例如 : 用 Bcl-2 可以阻止细胞凋亡, 在于它能升高线粒体的跨膜电位和阻止线粒体通透性改变 目前认为, 线粒体膜功能和结构上的完整性破坏引起细胞凋亡的可能机制是 : 线粒体内 外膜之间有通透性转换孔 (permeability transition pore, PTP, 其本质是一种蛋白复合物 ) 具有调节线粒体膜通透性的作用 正常情况下, 绝大多数 PTP 处于关闭状态 当线粒体跨膜电位在各种凋亡诱导因素作用下降低时 PTP 开放, 导致线粒体膜通透性增大, 使细胞凋亡启动因子如 : 细胞色素 C 凋亡蛋白酶激活因子 (Apaf) 和凋亡诱导因子 (AIF) 等从线粒体内释放出来 细胞色素 C 与 Apaf 相互作用可激活 caspase-9, 而 AIF 是一种核基因组编码的一种分子量为 的膜间蛋白, 可快速激活核酸内切酶, 并增强 caspase-3 的水解活性 研究证实阻止线粒体膜通透性的改变可防止细胞凋亡 Bcl-2 具有恢复 ψm 和调制 PTP 功能的作用, 因而可阻止上述凋亡启动因子从线粒体向外释放, 切断了细胞凋亡级联式反应中的关键性环节, 所以具有很强的抗细胞凋亡的作用 ( 图 4-2-2) 氧化损伤 钙稳态失衡 线粒体损伤三者在细胞凋亡的发生上既可单独启动, 又可联合作用, 是许多凋亡诱导因素的共同通路, 事实上这三种机制常常是互相联系, 互为因果, 故近来有学者把它们合而为一, 提出了细胞凋亡的恶性网络假说 (deleterious network hypothesis), 以求更全面的解释细胞凋亡发生的机制

89 Bcl-2 NO (-) (-) (-) 缺血 Apaf+Cyt.C 缺氧 线粒体 PTP 开放 (+) 活性氧 ψm 下降 Caspase-9 酶原 Caspase-9 (+) Caspase-3 酶原 Caspase-3 (+) Caspase 抑制剂 AIF 蛋白质水解 Ca 2+ 细胞凋亡 无活性核 (+) 核酸内 酸内切酶 切酶激活 DNA 断裂 图 线粒体 ψm 下降与细胞凋亡 Cyt.C: 细胞色素 C ( 郭峻 )

90 第三章细胞 组织对损伤的反应 在生命过程中, 细胞和由其构成的组织 器官不断对变化着的体内 外环境作出及时的 适当的调整和反应, 形成了细胞与内 外环境之间的动态平衡, 从而细胞的生命活动得以维持 在长期进化过程中, 人体细胞已获得了对体内 外环境复杂变化作出调整和反应的多种能力 当环境改变 细胞或组织损伤以及功能发生变化时, 细胞和组织往往通过改变自身的代谢 功能和结构加以协调, 这个过程称为适应 (adaptation) 适应在形态上表现为萎缩 肥大 增生和化生 在大多数情况下, 细胞 组织及器官能通过自身代谢 功能和结构的调整以替代 补偿被损伤的细胞 组织和器官的功能, 使各器官之间重新协调, 建立新的动态平衡, 这个过程称为代偿 (compensation) 细胞和组织遭受不能耐受的有害因子刺激时, 则可能引起损伤 (injury) 较轻的细胞损伤是可逆的, 即消除刺激因子后, 受损伤细胞可恢复常态, 通常称之为变性 (degeneration); 而细胞的严重损伤是不可逆的, 最终引起细胞死亡 损伤造成机体部分细胞和组织丧失后, 机体对所形成缺损进行修补恢复的过程, 称为修复 (repair), 修复后可完全或部分恢复原组织的结构和功能 修复过程起始于损伤, 损伤处坏死的细胞 组织碎片被清除后, 由其周围健康细胞分裂增生来完成修复过程 修复过程可概括为两种不同的形式 : 一种称为再生 (regeneration), 由损伤周围的同种细胞来修复, 另一种称为纤维性修复, 由纤维结缔组织来修复, 以后形成瘢痕, 故也称瘢痕修复 在多数情况下, 上述两种修复过程常同时存在 第一节细胞损伤的原因 引发细胞损伤的原因很多, 可以归纳为 : 缺氧 化学物质和药物 物理因素 ( 机械性 高低温 高低气压 电流 射线等 ) 生物因子 ( 细菌 病毒 真菌 寄生虫等 ) 营养失衡 ( 过剩或缺乏 ) 内分泌因素 免疫反应 遗传变异 衰老 社会, 心理 精神因素和医源性因素等若干大类 ( 一 ) 缺氧 缺氧 (hypoxia) 是导致细胞和组织损伤最常见和最重要的原因之一, 也是许多致病因素引起细胞损伤的一个非常重要的基本环节 缺氧引起细胞损伤主要是因为它导致细胞内氧化磷酸化过程障碍, 继而引起代谢 功能和结构的变化 缺氧大致有三方面的原因, 一是缺血, 血管性疾病或血栓导致动脉血流和静脉引流障碍, 使血供减少或丧失 ; 其次是心肺功能衰竭导致血的氧合不足 ; 再者, 血液携带氧的能力降低或丧失, 如贫血 CO

91 中毒等 ( 二 ) 理化因素 实际上所有的化学品和药物都可以引起细胞的适应 损伤和死亡 化学物质浓度过高可破坏细胞的渗透环境而引起细胞损伤或死亡, 如葡萄糖 体内的某些代谢产物, 如尿素及自由基等, 亦可成为内源性化学性致病因素 机械性因素 高低温 气压改变 电离辐射 激光 超声波 : 微波 噪声等都可引起范围广泛的细胞和组织损伤 ( 三 ) 生物因素 生物因素也是导致细胞和组织损伤常见和重要的原因 它主要包括病毒 立克次体 细菌 霉菌和寄生虫等, 其引起细胞 组织损伤的机理不同 多数细菌通过其内 外毒素或分泌的酶造成细胞损伤 病毒通过整合入宿主 DNA 扰乱细胞功能 通过复制繁殖破坏细胞或通过免疫反应对细胞造成损伤 寄生虫除了其分泌物及代谢产物的毒性作用和免疫反应外, 还可因虫体的运动造成机械性损伤 ( 四 ) 免疫反应 不恰当的免疫反应可造成细胞损伤 如变态反应和自身免疫性疾病 先天性或后天性免疫缺陷不直接造成组织和细胞的损伤, 但由于机体的免疫功能下降, 很易遭受外来抗原的侵袭而导致疾病的发生 ( 五 ) 遗传缺陷 染色体畸变和基因突变可引起细胞代谢 功能和结构的改变 ; 也导致对某些疾病的遗传易感性 (genetic predisposition) 增强 可表现为先天性畸形, 也可表现为蛋白结构和功能的改变, 包括受体数目或功能 酶活性的改变等 ( 六 ) 年龄 营养因素 老年人体的细胞处于生理性自然退化状态, 对于长期积累下来的或是即时接受的各种致病因素的损伤作用会更为敏感, 从而导致衰老 (aging) 或老化 (senility) 食物中缺乏某些必需的物质, 如蛋白质 维生素 微量元素等可引起相应的病变 相反, 营养过剩也可引起疾病, 例如过多地摄入维生素 D 可致肾 心 主动脉等器官出现钙质沉积 食物中动物脂肪过多可致肥胖症和动脉粥样硬化, 并且增加对许多疾病如糖尿病的易感性 ( 七 ) 心身因素 不良的社会 心理 精神刺激是现代社会中日益受到重视的致病因素, 由这种思想 情感障碍引发细胞损伤所形成的器质性疾病称为心身疾病 (psychommatic disease) 例如心理 精神障碍是原发性高血压 消化性溃疡 冠心病和植物神经功能紊乱等的一个重要发病因素, 甚至也可成为潜在恶性肿瘤临床发作的重要因素 其他, 在对患者原有疾病进行诊断 治疗时, 由于诊治过程本身继发的伤害属于医源性疾病 (iatrogenicdisease) 医生在临床工作中要注意防范

92 第二节细胞损伤的机理 细胞损伤的发生机理是很复杂的 由多种因素引发的细胞损伤, 细胞膜的破坏 活性氧类物质 ( 氧自由基等 ) 增多 胞浆内高游离钙 缺氧 化学毒作用和遗传物质变异等, 对于细胞损伤的发生具有重要意义 这几方面的机制常是相互结合或是互为因果地导致细胞的损伤 ( 一 ) 缺血 缺氧的损伤作用 缺氧 (hypoxia) 是指细胞不能获得足够氧或是氧利用障碍 缺氧是一个很常见的重要病理过程 缺氧的原因很多, 常见的有四种类型 : 1. 单纯性缺氧指空气中氧分压低或气道 ( 外呼吸 ) 障碍 2. 血液性缺氧血红蛋白的质 量异常 3. 循环性缺氧局部性缺血或心 肺功能衰竭 4. 中毒性缺氧直接中毒所致线粒体内呼吸 ( 生物氧化, 主要是氧化磷酸化 ) 障碍 其实, 上述原因引发的缺氧最终都导致线粒体氧化磷酸化受抑制, 使 ATP 生成减少, 造成细胞膜钠 钾泵 钙泵功能低下和胞浆内蛋白质合成 脂肪代谢 ( 脂肪运出胞浆 ) 障碍等, 造成无氧糖酵解过程的活化 酵解会使细胞酸中毒 溶酶体膜破裂, 并损伤核染色质 (DNA 链 ) 缺氧可以破坏细胞膜的结构和功能 细胞膜与外界互通信息 交换物质, 在免疫应答 细胞分裂和分化等方面具有重要作用, 细胞膜的破坏进一步引发细胞损伤 缺氧也会导致细胞浆内高游离钙状态 细胞浆内的磷脂酶和内切核酸酶等能降解磷脂 蛋白质 ATP 和 DNA, 这两种酶的作用需要游离钙活化 胞浆内游离钙与 ATP 依赖性钙转运蛋白结合, 成为蛋白结合钙并贮存于线粒体 内质网等钙库内 正常时, 胞浆因此处于低游离钙状态, 使上述酶类活性稳定, 细胞的结构和功能得以保持 细胞膜内依赖于 ATP 的钙泵和钙离子通道也参与胞浆内游离钙浓度的调节, 使胞浆内游离钙减少 缺氧 中毒等致使 ATP 减少时, 细胞的胞浆内会因此继发游离钙增多, 上述的酶类因而活化, 使细胞损伤 胞浆内高游离钙所引发的酶活化是多种致病因素导致细胞损伤发生机制的终末环节 缺氧还可使氧自由基等活性氧类物质增多, 膜磷脂丢失, 脂质崩解, 细胞骨架破坏等 ( 见后述 ) 轻度 较短时间缺氧所致的细胞损伤通常是可逆的 ( 神经细胞除外 ), 一般引发细胞的水肿 脂肪变 ; 严重缺氧或 / 和较长时间的轻度缺氧所致的细胞损伤是不可逆的, 引发细胞坏死 图 以局部缺血为例, 说明缺氧所致细胞损伤的发生机制 ( 二 ) 活性氧类物质的损伤作用 活性氧类物质 (activated oxygen species,aos) 或称反应性氧类物质 (reactive oxygen species,ros), 包括处于自由基状态的氧和不属于自由基的过氧化氢 (H 2 O 2 ), 前者包括超氧自由基 (Q) 和羟自由基 ( OH) 自由基 (free radicals) 是原子最外层偶数电子失去一个电子后形成的具有强氧化活性的基团 AOS 以其对于脂质 蛋白质和 DNA 的氧化作用损

93 伤细胞 细胞内同时存在生成 AOS 体系和拮抗其生成的抗氧化剂体系 因此, 正常时少量生成的 AOS 会及时被抗氧化剂 ( 例如超氧歧化酶 ) 清除 细胞在多种致病因素作用下, AOS 生成增多, 导致细胞损伤 AOS 的强氧化作用, 是细胞损伤发生机制的基本环节 图 缺血损伤机理 ( 三 ) 化学性损伤 化学性损伤 (chemical injury) 包括化学物质和药物的毒性作用, 日益成为致细胞损伤的重要因素 作为医治疾病的药物具有可能引发细胞损伤的副作用, 是最常见的医源性致病因子 化学性损伤可表现为 :1 全身性 : 例如氰化物中毒 ;2 局部性 : 例如吞食强酸 强碱所致口腔 食管和胃粘膜的腐蚀 ;3 器官特异性 : 例如有机磷 四氯化碳引发的肝损伤 化学物质和药物对细胞的损伤程度与剂量, 吸收 蓄积 代谢或排出的部位以及代谢速度的个体差异有关 化学性物质和药物损伤细胞有多种途径, 如直接的细胞毒性作用 : 例如氰化物因迅速封闭线粒体的细胞色素氧化酶系统而致猝死 ; 再有, 化学物质和药物代谢产物对于靶细胞的细胞毒性作用 : 肝细胞是许多化学物质和药物, 特别是有机磷农药或杀虫剂 酒精 抗肿瘤药等的代谢部位, 尤易遭受毒性代谢产物的损伤, 通常表现为中毒性或药物诱发性肝炎 ; 其他途径还有, 诱发免疫性损伤和诱发 DNA 损伤 ( 见下文 遗传变异 ), 前者如青霉素可经由 Ⅰ 型变态反应引发过敏反应, 氯霉素可经由 Ⅱ 型变态反应引发粒细胞减少症 再生障碍性贫血等 ( 四 ) 遗传变异 化学物质和药物 病毒 射线等可损伤细胞核内的 DNA, 诱发基因突变和染色体畸变, 使细胞发生遗传变异 (genetic variation), 可由此直接导致细胞的结构功能改变而产生疾病, 也可由此增加细胞基因组不稳定性, 使细胞对环境中的各类损伤因素易感性增高

94 第三节适应 一 萎缩 萎缩 (atrophy) 是指已发育正常的实质细胞 组织或器官的体积缩小, 可以伴发细胞数量的减少 组织 器官的实质细胞萎缩时, 常继发其间质 ( 主要是脂肪组织 ) 增生, 有时使组织 器官的体积甚至比正常还大, 称为假性肥大 ( 见于萎缩的胸腺 肌肉等 ) 器官先天地部分性和完全性末发育所致的体积小, 分别称为发育不全 (hypoplasia) 和不发育 (agenesis), 并非萎缩 萎缩细胞的蛋白质合成减少而分解增多, 以适应其营养水平低下的生存环境 萎缩分为生理性和病理性两类 人体的许多组织 器官, 例如胸腺 生殖系统等, 随年龄增长自然地发生生理性萎缩 萎缩的脏器镜下特点为, 萎缩细胞胞浆内的细胞器大量退化 自噬小体增多, 因而可有大量未能被溶酶体酶降解 富含磷脂的残体积聚, 即脂褐素 (lipofuscin), 常见于心肌 肝细胞和神经节细胞 眼观, 萎缩的器官均匀性缩小, 重量减轻, 功能低下 萎缩的心脏因心肌胞浆中脂褐素沉着而呈褐色 ( 褐色萎缩 ) 大脑萎缩时, 脑回变窄, 脑沟变深, 皮质变薄, 体积缩小, 重量变轻 ( 图 4-3-2) 轻度病理性萎缩时, 去除原因后, 萎缩的细胞有可能恢复常态 ; 持续性萎缩的细胞终于死亡 病理性萎缩按其发生原因可分为 : 1. 营养不良性萎缩由营养不良引起的萎缩可波及全身或只发生于局部 此类萎缩可见于蛋白质等营物质摄入不足 如饥饿和 / 或消耗过度如恶性肿瘤的恶病质, 慢性结核病和糖尿病等, 是局部动脉血供不足如脑动脉硬化时血图 脑萎缩供不足而引起的脑萎缩 2. 压迫性萎缩器官或组织长期受压亦可发生萎缩 引起萎缩的压力并不需要过大, 关键在于一定的压力持续存在 例如尿路梗阻时, 因肾盂积水引起的肾萎缩 ( 图 4-3-3) 又例如动脉瘤压迫脊椎引起脊椎萎缩 脑膜瘤引起局部颅骨的萎缩 脑室积水时周围脑组织的萎缩 肝转移性癌结节周围肝细胞的萎缩等 3. 废用性萎缩因长期工作负荷减少所致的萎缩, 例如久卧不动时的肌肉萎缩 骨质疏松 4. 神经性萎缩一方面因神经 脑或脊髓损伤所致的肌肉萎缩, 另一方面神经对血管运动的调节丧失而致局部组织器官的营养不良 ; 常见于麻风病 脊髓灰质炎 麻风患者的周围神经受到侵犯时, 可导致肢体, 尤其是肢体末端 ( 包括肌肉 骨路及皮肤 ) 的明显萎缩 图 肾压迫性萎缩

95 5. 内分泌性萎缩例如因腺垂体肿瘤或缺血性坏死等引发的肾上腺萎缩, 严重者还可致甲状腺 性腺和全身性萎缩 (Simmonds 综合征 ) 心肌 脑等的老年性萎缩兼有生理性和病理性萎缩 二 肥大 细胞 组织和器官体积的增大, 称为肥大 (hypertrophy) 肥大分为生理性肥大 (physiologic hypertrophy) 和病理性肥大 (pathologic hypertrophy) 细胞肥大通常具有功能代偿意义, 多属于代偿性肥大 (compensatory hypertrophy) 由激素引发的肥大称为内分泌性肥大 (endocrine hypertrophy) 肥大的组织 器官常伴发细胞数量的增多 ( 增生 ), 即肥大常与增生并存 骨骼肌和心肌是不具分裂能力的永久性细胞, 只能以代偿性肥大适应其工作负荷的增加, 例如运动员有关肌肉的生理性肥大, 高血压时左心室排血阻力增加所致的左心室肌壁病理性肥大 ( 图 4-3-4) 妊娠期子宫和哺乳期乳腺发生生理性肥大常兼有增生, 属于内分泌性 ( 激素性 ) 肥大 图 左室肥大 细胞的肥大导致由其组成的组织和器官体积增大 重量增加和功能增强 因代偿而肥大的器官超过其代偿限度时便会失代偿 (decompensation), 例如肥大心肌的失代偿引发心力衰竭 三 增生 实质细胞的增多称为增生 (hyperplasia), 增生可导致组织 器官的增大 细胞增生常与激素和生长因子的作用有关 受机体调控的细胞增生, 随其有关引发因素的去除而停止 这不同于肿瘤细胞的失控性增生 但是, 过度增生的细胞有可能演变为肿瘤性增生 增生也可分为生理和病理性两类 例如女性青春期乳腺和妊娠期的子宫均属生理性增生 ; 雌激素水平升高所致的子宫内膜和乳腺增生则属病理性增生 功能代偿也可引发增生, 例如低钙血症引发的甲状旁腺代偿性增生 细胞增生通常为弥漫性, 以致增生的组织 器官弥漫 均匀地增大 在有关激素的过度作用下, 前列腺 甲状腺 肾上腺和乳腺等常呈结节性增生 这可能是由于这类器

96 官中有的靶细胞对于激素的作用更为敏感, 因而在正常或大致正常的组织中形成单个或多发性结节 四 化生 一种分化成熟的细胞因受刺激因素的作用转化为另一种分化成熟细胞的过程称为化生 (metaplasia) 发生机理可能与干细胞 ( 如上皮组织的贮备细胞, 间叶组织的原始间叶细胞 ) 调控分化的基因重新编程 (reprogramming) 有关 这种分化上的转向通常只发生于同源性细胞之间, 即上皮细胞之间和间叶细胞之间 图 鳞化 图 肠化 化生有多种类型, 主要发生于上皮细胞, 也见于间叶细胞 最常为柱状上皮 ( 例如子宫颈管和支气管粘膜的腺上皮 ) 移行上皮等化生为鳞状上皮, 称为鳞状上皮化生 ( 简称鳞化 )( 图 4-3-5) 萎缩性胃炎时胃粘膜腺上皮的肠上皮化生 ( 简称肠化 )( 图 4-3-6) 在间叶组织中, 纤维组织可化生为软骨组织或骨组织 ( 例如骨化性肌炎时的骨组织形成 ) 化生的生物学意义利害兼有, 以呼吸道粘膜纤毛柱状上皮的鳞化为例, 化生的鳞状上皮一定程度地强化了局部抗御环境因子刺激的能力, 因此属于适应性变化, 但是, 却减弱了粘膜的自净机制 化生的上皮可以恶变, 如由被覆腺上皮的粘膜 ( 例如肺内的支气管粘膜 ) 可发生鳞状细胞癌, 胃粘膜可发生肠型腺癌

97 第四节细胞 组织损伤常见形态学 细胞损伤过程是复杂的, 因而细胞遭受损伤后可有不同的表现 一般来讲, 当损伤轻微而长期慢性持续作用, 可先表现为某些适应性的改变 ( 如前所述 ); 当损伤程度不足以引起细胞或组织死亡时, 也可先表现为代谢性变化, 经过一段不等的时间 ( 如损伤后数分钟至数小时 ), 受损伤细胞呈现组织化学和超微结构的变化, 然后 ( 如损伤后数小时至数日 ), 才呈现光镜下和用肉眼可见的形态学变化, 即病理变化或病变 (lesions) 这种损伤性病变, 在去除病因后有可能恢复常态的可逆性病变, 称亚致死性细胞损伤或变性 当损伤严重导致细胞不可逆性病变, 即细胞死亡 一 变性 细胞或细胞间质受损伤后因代谢发生障碍所致的某些可逆性形态学变化, 常表现为细胞浆内或细胞间质内有各种异常物质或是异常增多的正常物质的蓄积, 这一类形态学 改变统称为变性 (degeneration), 变性伴有细胞功能下降 1. 细胞水肿 (cellular swelling) 或称为水样变性 (hydropic degeneration) 是细胞轻度损伤后常发生的早期病变, 好发于肝 心 肾等实质细胞的胞浆 细胞水肿的主要原因是缺氧 感染和中毒 其发生机制是 : 缺氧时线粒体受损伤, 使 ATP 生成减少, 细胞膜 Na + -K + 泵功能因而发生障碍, 导致胞浆内 Na + 水增多 病理变化 : 电镜下, 胞核正常, 胞浆内的线粒体 内质网等肿胀呈囊泡状 ( 图 4-3-7) 光镜下, 弥漫性细胞胀大, 胞浆淡染 清亮, 核可稍大, 重度水肿的细胞称为气球样变 ( 见于病毒性肝炎 )( 图 4-3-8) 肉眼观, 发生了细胞水肿的肝 肾等体积增大 颜色变淡 去除病因后, 水肿的细胞可恢复正常 图 细胞水肿 ( 电镜观 ) 图 气球样变

98 2. 脂肪变细胞浆内中性脂肪 ( 甘油三酯 ) 的蓄积称为脂肪变 (fatty change) 或脂肪变性 (fatty degeneration) 起因于营养障碍 感染 中毒和缺氧等 多发生于肝细胞 心肌纤维和肾小管上皮 病理变化 : 电镜下, 细胞胞浆内的脂肪表现为脂肪小体, 进而融合成脂滴 光镜下, 于 HE 染片中, 脂滴表现为大小不等的近圆形空泡 ( 因脂肪被制片时的有机溶剂溶解之故 )( 图 4-3-9); 于冷冻切片中, 蓄积于胞浆内的脂肪可用脂溶性的苏丹 Ⅲ 染料染成红色 去除病因后, 蓄积于胞浆内的脂肪可消失 肝细胞是脂代谢的部位, 最常发生脂肪变 显著弥漫性肝脂肪变称为脂肪肝 肉眼观 : 肝增大 边缘钝 色淡黄 较软, 切面油腻感 重度脂肪变的肝细胞, 其胞核被胞浆内蓄积的脂肪压向一侧, 形似脂肪细胞, 并可彼此融合成大小不等的脂囊 ( 图 ) 肝细胞脂肪变通常不引起肝功能障碍 重度脂肪变的肝细胞可坏死, 并可继发肝硬化 图 细胞内脂肪变 图 肝细胞内脂肪空泡 心肌脂肪变常累及左心室的内膜下和乳头肌, 分为灶性和弥漫性两种 : 灶性心肌脂肪变可见于长期中等程度的缺氧 弥漫性心肌脂肪变常侵犯两侧心室, 心肌呈弥漫性淡黄色 弥漫性心肌脂肪变常侵犯两侧心室, 心肌呈弥漫性淡黄色 白喉型心肌炎属弥漫型脂肪变的典型改变 有时严重缺氧时 ( 如严重贫血 ) 肉眼上表现为大致横行的黄色条纹, 与未脂肪变的暗红色心肌相间, 形似虎皮斑纹, 称为虎斑心 这种分布可能与乳头肌内的血管分布有关 黄色条纹相当于血管末梢分布区, 因缺血缺氧程度重, 病变明显 而近血管供应区则缺氧程度轻, 病变轻或无病变 心外膜处显著增多的脂肪组织, 可沿心肌层的间质向着心腔方向伸人, 心肌因受伸入脂肪组织的挤压而萎缩并显薄弱, 称为心肌脂肪浸润 (fatty infiltration), 病变常以右心室, 特别是心尖区为严重 脂肪心多见于高度肥胖者或饮啤酒过度者 平时大多无明显症状 重度心肌脂肪浸润时, 浸润于心肌内的脂肪组织可接近 ( 甚至达于 ) 心内膜下方, 可导致心肌破裂 出血, 引发猝死, 成为急死的原因 细胞脂肪变的机制肝细胞脂肪变为例, 当血液中的脂肪酸进入肝细胞胞浆后, 经由下列过程进行代谢 :1 被氧化为酮体和 CO 2 ;2 参与磷脂和胆固醇的合成 ;3 在 α- 磷酸甘油的参与下合成甘油三酯 ( 中性脂肪 ), 甘油三酯经与载脂蛋白结合以脂蛋白的形式进入血流 肝细胞脂肪酸代谢过程的某个或多个环节, 由于下列因素的作用而异常时, 便可引发脂肪变 :1 肝细胞胞浆内脂肪酸增多 : 高脂饮食或身体皮下 大网膜等处脂肪组织大量分解 ( 例如营养不良时 ) 可致血液脂肪酸增多 ; 机体缺氧所致肝细胞糖酵解过程生成

99 的乳酸可转化为多量脂肪酸 ; 肝细胞内脂肪酸也可因其氧化过程低下而相对增多 2 饮酒 : 可致 α- 磷酸甘油增多而促进甘油三酯合成 3 缺氧 营养不良 ( 蛋白质缺乏 饥饿 糖尿病等 ) 和肝毒物质 (CCl 4 等 ) 使载脂蛋白减少, 进而脂蛋白减少, 甘油三酯蓄积于肝细胞胞浆内 3. 玻璃样变玻璃样变 (hyaline change) 又称玻璃样变性或透明变性 (hyaline degeneration), 泛指细胞内 纤维结缔组织间质或细动脉壁等, 在 HE 染片中呈现均质 粉染至红染 毛玻璃样半透明的蛋白质蓄积 其发生机制各异 (1) 细胞内玻璃样变 : 蓄积于细胞内的异常蛋白质形成均质 红染的近圆形小体, 通常位于细胞浆内 例如, 肾小管上皮细胞的玻璃样小滴变性 ( 蛋白尿时由原尿中重吸收的蛋白质 )( 图 ) 浆细胞胞浆中的 Russell 小体 ( 蓄积的免疫球蛋白 ) 和酒精性肝病时肝细胞胞浆中的 Mallory 小体 ( 图 ) 等 图 肾小管内玻变 图 示 Mallory 小体 图 纤维结缔组织玻变 (2) 纤维结缔组织玻璃样变 : 是胶原纤维老化的表现, 见于纤维结缔组织的生理性增生, 例如发生于萎缩的子宫 乳腺 睾丸等和病理性增生, 例如瘢痕 动脉粥样硬化斑块 肾小球纤维化 硅肺 心瓣膜病 浆膜粘连 血栓或坏死组织的机化等 镜下 : 增生的胶原纤维变粗 融合, 形成均质 粉色或淡红染的索 片状结构, 其中很少纤维细胞和血管 ( 图 ) 肉眼观 : 大范围透明变性的纤维结缔组织 ( 例如大块瘢痕 ) 呈灰白色 均质半透明, 较硬韧 胶原纤维透明变性可能是由于胶原蛋白交联增多, 使胶原纤维大量融合 多量糖蛋白蓄积其间 ; 也可能是胶原蛋白变性 融合的结果 (3) 细动脉壁玻璃样变 : 又称细动脉硬化 (artiolosclerosis), 常见于缓进性高血压和糖尿病患者, 弥漫地累及肾 脑 脾和视网膜等处的细小动脉壁 玻璃样变的细小动脉壁因有蛋白质蓄积而显

100 增厚 均质性红染, 管腔狭窄, 可导致血管变硬, 血液循环外周阻力增加和局部缺血 ; 管壁弹性减弱 脆性增加, 因而继发扩张, 导致破裂出血 ( 图 ) 4. 淀粉样变淀粉样变 (amyloidosis) 是在细胞外的间质内, 特别是小血管基底膜处, 有蛋白质 - 粘多糖复合物蓄积, 并显示淀粉样呈色反应, 即遇碘液后呈棕褐色, 再遇稀硫酸时由棕褐色变为深蓝色 这种淀粉样物质 (amyloid) 在 HE 染片中呈均质性粉红色至淡红色, 类似玻璃样变 ( 图 ), 但被刚果红染成红色 甲基紫染成紫红色 电镜下, 淀粉样物质呈细丝状 ( 宽约 0.75~10nm) 局部性淀粉样变发生于皮肤 眼结膜 舌 喉 气管和肺 膀胱 胰岛 ( 糖尿病时 ) 等处, 也可蓄积于恶性淋巴瘤和神经内分泌肿瘤 ( 例如甲状腺髓样癌 ) 的间质内 全身性淀粉样变分为原发性和继发性 继发性者的淀粉样物质来源未明, 常继发于严重的慢性炎症, 例如慢性空洞性肺结核病, 慢性化脓性骨髓炎等和某些恶性肿瘤 ; 原发性者的淀粉样物质来源于免疫球蛋白的轻链 全身性淀粉样变时可累及许多部位, 引发相关的临床表现 肝 脾 肾 心常受累及, 体积增大, 色泽较淡, 质地较脆, 可因其实质细胞被压萎缩而发生功能障碍 图 喉粘膜淀粉样变 5. 粘液样变性粘液样变性 (mucoid degeneration) 是指间质内有粘多糖 ( 透明质酸等 ) 和蛋白质的蓄积 常见于间叶组织肿瘤 风湿病 动脉粥样硬化和营养不良时的骨髓和脂肪组织等 镜下 : 间质疏松, 有多突起的星芒状纤维细胞散在于灰蓝色粘液样基质中 甲状腺功能低下时, 可能是由于甲状腺素减少所致的透明质酸酶活性减弱, 使含有透明质酸的粘液样物质以及水分蓄积于皮肤及皮下的间质中, 形成粘液性水肿 (myxedema) 6. 纤维蛋白样变 (fibrinoid change) 又称纤维蛋白样坏死 (fibrinoid necrosis) 是纤维结缔组织的一种变性坏死 病变局部结构消失, 形成边界不清的小条或小块状染色深红的无结构物质 由于其染色性质与纤维蛋白相似, 故而得名 纤维蛋白样坏死常见于变态反应性疾病, 如急性风湿病 结节性动脉周围炎 新月性肾小球肾炎等 也见于非变态反应性疾病, 如恶性高血压的小动脉和胃溃疡底部的动脉壁 不同疾病时纤维蛋白样坏死所形成的机理可能不同 7. 病理性色素沉着有色物质 ( 色素 ) 在细胞内 外的异常蓄积称为病理性色素沉着 (pathologic pigmentation) 沉着的色素主要是由体内生成的( 内源性色素 ), 包括含铁血黄素 脂褐素 胆红素 黑色素等 随空气吸入肺内的炭尘和纹身时注入皮内的着色物质等属于外源性色素沉着 (1) 含铁血黄素 (hemosiderin): 组织内出血时, 从血管中逸出的红细胞被巨噬细胞摄人并由其溶酶体降解 使来自红细胞血红蛋白的 Fe 3+ 与蛋白质结合成电镜下可见的铁蛋白微粒, 若干铁蛋白微粒聚集成为光镜下可见的棕黄色 较粗大的折光颗粒, 称为含铁血黄素 巨噬细胞破裂后, 此色素也可见于细胞外 含铁血黄素因含 Fe 3+ 被普鲁氏蓝染

101 成蓝色 生理情况下, 红细胞在肝 脾内破坏, 可有少量含铁血黄素形成 含铁血黄素的病理性沉着多为局部性, 提示陈旧性出血 当溶血性贫血时, 有大量红细胞被破坏, 可出现全身性含铁血黄素沉积, 主要见于肝 脾 淋巴结和骨髓等器官 (2) 脂褐素 (1ipofuscin): 是蓄积于胞浆内的黄褐色微细颗粒, 电镜下显示为自噬溶酶体内未被消化的细胞器碎片残体, 其中 50% 为脂质 附睾管上皮细胞 睾丸间质细胞和神经节细胞的胞浆内正常时便含有脂褐素 老年人及一些慢性消耗性疾病患者的心肌细胞 肝细胞 肾上腺皮质网状带细胞等萎缩时, 其胞浆内有多量脂褐素沉着 故此色素又有消耗性色素之称 (3) 黑色素 (melanin): 是由黑色素细胞生成的黑褐色微细颗粒 在腺垂体分泌的 ACTH 和 MSH( 黑色素细胞刺激激素 ) 促进下, 黑色素细胞胞浆中的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下, 氧化成多巴 (dihydroxyphenylalanine, Dopa), 并进一步生成黑色素 局部性黑色素增多见于色素痣 恶性黑色素瘤等 肾上腺皮质功能低下的 Addison 病患者可呈现全身性皮肤 粘膜的黑色素沉着 这是因为肾上腺皮质激素分泌减少, 对垂体的反馈抑制减弱, 致使 ACTH 和 MSH 分泌增多之故 7. 病理性钙化在骨和牙齿外的软组织内有固体性钙盐 ( 主要是磷酸钙和碳酸钙 ) 的沉积称为病理性钙化 (pathologic calcification) 在 HE 染色时, 钙盐呈蓝色颗粒状或团块状 继发于局部变性 坏死组织或其他异物 ( 例如血栓 死亡的寄生虫卵 ) 内的钙化, 称为营养不良性钙化 (dystrophic calcification)( 图 ) 营养不良性钙化时, 体内钙磷代谢正常 由于钙磷代谢障碍 ( 高血钙 ) 所致正常肾小管 肺泡壁 胃粘膜等处的多发性钙化, 称为转移性钙化 (metastatic calcification), 可影响细胞 ; 组织的功能 甲状旁腺功能亢进 骨肿瘤破坏骨组织 维生素 D 过多摄人等可引发高血钙, 导致转移性钙 图 寄生虫卵钙化 二 细胞死亡 细胞因受严重损伤而累及胞核时, 呈现代谢停止 结构破坏和功能丧失等不可逆性变化, 此即细胞死亡 (cell death) 细胞死亡包括坏死和凋亡两大类型 1. 坏死坏死 (necrosis) 是活体内范围不等的局部细胞死亡, 死亡细胞的质膜 ( 细胞膜 细胞器膜等 ) 崩解 结构自溶 ( 坏死细胞被自身的溶酶体酶消化 ) 并引发急性炎症反应 炎症时渗出的嗜中性粒细胞释放溶酶体酶, 可促进坏死的发生和溶解 坏死可迅即发生, 也可由可逆性损伤 ( 变性 ) 发展而来 坏死基本病变 : 细胞死亡几小时 ( 例如心肌梗死后 4~12 小时 ) 后, 光镜下才可见坏死

102 细胞开始呈现自溶性变化 胞核一般依序呈现 1 核固缩 (pyknosis): 表现为核缩小 凝聚, 呈深蓝染, 提示 DNA 停止转录 ;2 核碎裂 (karyorrhexis): 表现为染色质崩解成致密蓝染的碎屑, 散在于胞浆中, 核膜溶解 ;3 核溶解 (karyolysis): 染色质中的 DNA 和核蛋白被 DNA 酶和蛋白酶分解, 核淡染, 只见 甚至不见核的轮廓 ( 图 ) 胞浆红染, 胞膜破裂, 坏死细胞进而解体 消失 ; 间质内胶原纤维肿胀 崩解 液化, 基质解聚 最后坏死的细胞和崩解的间质融合成一片模糊的无结构的颗粒状红染物质 ( 图 ) 坏死时细胞也呈现超微结构变化 电镜下, 坏死细胞胞核的染色质最初高度致密并聚集于胞膜附近 ( 边集 ), 细胞器退变, 线粒体肿大 破裂和钙盐沉积, 溶酶体也肿大 破裂, 致使坏死细胞自溶 图 细胞坏死模式图 A. 正常细胞 B. 核固缩 C. 核碎裂 D. 核溶解 ( 参照 Stevens 和 Lows,1995) 图 肝细胞坏死 A: 坏死区模糊的无结构颗粒状红染物质 ( 示坏死细胞 ) P: 未坏死区 坏死的眼观典型的坏死的形态学改变的出现需要一定时间, 因此早期组织坏死眼

103 观常不易辨认 临床上一般将失去生活能力的组织称为失活组织, 在治疗中必须将其清除 一般讲, 失活组织颜色苍白 混浊, 失去原有弹性 ; 切割无血液流出 ; 正常的感觉和运动 ( 如肠蠕动 ) 功能消失 ; 无血管搏动等 发生坏死后还常伴有细胞的生物化学改变 坏死初发时, 首先呈现琥珀酸脱氢酶 乳酸脱氢酶等的活性降低, 由于坏死细胞膜通透性增加, 胞浆中的一些酶可释放至血液中, 临床上可借以作为诊断某些部位细胞坏死性疾病的参考指标, 例如心肌梗死时的血液肌酸激酶 乳酸脱氢酶 谷草转氨酶升高 ; 肝细胞坏死时的血液谷草转氨酶 谷丙转氨酶升高 ; 胰腺坏死时的血液淀粉酶升高等 (1) 类型 : 坏死分为凝固性坏死 液化性坏死和纤维素样坏死三个基本类型, 前两种坏死又有一些特殊类型 1) 凝固性坏死 (coagulative necrosis): 坏死细胞的蛋白质凝固, 还常保持其轮廓残影 ( 图 ) 这可能是由于坏死局部的酸中毒使坏死细胞的结构蛋白和酶蛋白变性, 封闭了蛋白质的溶解过程 凝固性坏死好发于心肌 肝 脾 肾等 图 肾脏坏死 ( 光镜 ) 干酪样坏死 (caseous necrosis) 是彻底的凝固性坏死, 是结核病的特征性病变 镜下 : 不见坏死部位原有组织结构的残影, 甚至不见核碎屑 ( 图 ); 肉眼观 : 坏死呈白色或微黄, 细腻, 形似奶酪 ( 图 ), 因而得名 图 干酪样坏死图 干酪样坏死 ( 肉眼观 ) 2) 坏疽 (gangrene) 是凝固性坏死的一种特殊类型 身体内直接或间接地与外界大气相

104 通部位的较大范围坏死, 并因有腐败菌生长而继发腐败 坏疽分为干性 湿性和气性三种 干性和湿性坏疽多继发于动脉阻塞引起的缺血性坏死 ( 梗死 ) 肉眼观呈黑色, 其与坏死局部来自红细胞血红蛋白的 Fe 2+ 与腐败组织分解出的 H 2 S 形成硫化铁有关 干性坏疽 (dry gangrene) 常继发于肢体, 水分容易蒸发的体表组织坏死, 由于坏死组织干燥, 腐败菌感染一般较轻边界清楚 ( 图 ) 湿性坏疽 (moist gangrene) 常继发于肠管 胆囊 子宫 肺等与外界沟通, 而水分不易蒸发的脏器坏死, 也可继发于动脉受阻同时有静脉淤血的体表组织坏死, 由于坏死组织含水分较多, 边界欠清, 腐败菌感染严重 图 干性坏疽气性坏疽 (gas gangrene) 常继发于深在的开放性创伤, 特别是战伤, 合并厌氧的产气荚膜杆菌等感染时, 细菌分解坏死组织产生大量气体, 使坏死组织内含气泡呈蜂窝状 湿性坏疽, 尤其是气性坏疽可伴发全身性中毒 3) 液化性坏死 (liquefactive necrosis): 是坏死组织因酶性分解而变为液态 最常发生于含可凝固的蛋白少和脂质多的脑和脊髓, 又称为软化 (malacia)( 图 ) 化脓 脂肪坏死和由细胞水肿发展而来的溶解性坏死 (lytic necrosis) 都属于液化性坏死 脂肪坏死 (fat necrosis) 包括创伤性和酶解性两大类 创伤性者好发于皮下脂肪组织 ( 尤其是女性乳房 ), 致脂肪细胞破裂, 脂肪外溢, 引起巨噬细胞和异物巨细胞吞噬脂质反应, 局部形成肿块 ; 酶解性者见于急性胰腺炎, 与胰脂酶外溢消化胰周脂肪组织有关 镜下, 坏死脂肪细胞仅留下模糊混浊的轮廓 ( 图 ) 脂肪坏死时因有大量脂肪酸形成常继发营养不良性钙化 ( 钙皂形成 ) 肉眼见为白色的斑点或斑块 图 脑软化灶 图 脂肪坏死 L: 示脂肪坏死区

105 4) 纤维素样坏死 (fibrinoid necrosis): 曾称为纤维素样变性, 发生于结缔组织和血管壁, 是变态反应性结缔组织病 ( 风湿病 类风湿性关节炎 系统性红斑狼疮 结节性多动脉炎等 ) 和急进性高血压的特征性病变 镜下, 坏死组织呈细丝 颗粒状的红染的纤维素 ( 纤维蛋白 ) 样, 聚集成片块 ( 图 ) 纤维素样坏死物质可能是肿胀 崩解的胶原纤维 ( 由抗原 - 抗体复合物引发 ), 或是沉积于结缔组织中的免疫球蛋白, 也可能是由血液中渗出的纤维蛋白原转变成的纤维素 可能由于疾病的不同, 纤维素样物质的成分也有异 (2) 坏死的结局 1) 细胞坏死后发生自溶, 并在坏死局部引发急性炎症反应 2) 坏死组织溶解, 组织坏死后, 由于坏死组织本身及坏死灶周围中性粒细胞所释放的各种水解酶的作用, 使坏死组织溶解液化, 然后由淋巴管或血管吸收 不能吸收的碎片, 则由吞噬细胞吞噬 消除 小的坏死灶溶解吸收后, 常通过组织修复使功能和形态恢复 3) 坏死组织分离 排出 : 根据坏死的大小 及是图 纤维素样坏死否位于体表或自然管道腔面, 可有不同的结局 皮肤 粘膜处的浅表性坏死性缺损称为糜烂 (erosion), 较深的坏死性缺损称为溃疡 (ulcer), 坏死形成的开口于表面的深在性盲管称为窦道 (sinus), 两端开口的通道样坏死性缺损称为瘘管 (fistula) 在有天然管道与外界相通器官( 例如肺 肾等 ) 内, 较大块坏死组织经溶解后由管道 ( 支气管 口腔 输尿管 尿道 ) 排出后残留的空腔, 称为空洞 (cavity) 4) 机化 (organization): 坏死物不能完全溶解吸收或分离排出, 则由新生的肉芽组织长入坏死区, 吸收 取代坏死物的过程称为机化 最终形成瘢痕组织 5) 包裹 (encapisulation): 坏死灶如较大, 或坏死物质难于溶解吸收, 或不完全机化, 最初则由肉芽组织包裹, 以后则为增生的纤维组织包裹 6) 坏死组织可继发营养不良性钙化 : 机体内的异物如血栓, 如不能发生溶解吸收, 也可发生机化和钙化 (3) 坏死对机体的影响 : 与下列因素有关 :1 坏死细胞的生理重要性, 例如心肌 脑组织的坏死后果严重 ;2 坏死细胞的数量, 例如肝细胞的广泛性坏死后果严重 ;3 坏死细胞所在器官的再生能力, 例如肝细胞易于再生, 坏死后容易恢复 ;4 发生坏死器官的贮备代偿能力, 例如肾 肺为成对的器官, 贮备代偿能力强, 即便有较大的坏死也不会明显的影响功能 2. 凋亡与坏死组织自溶过程不同, 凋亡 (apoptosis) 的发生是一个基因调控 耗能的主动过程, 也称之为程序性细胞死亡 (programmed cell death, PCD) 凋亡是单个细胞或数个细胞的死亡, 死亡细胞的质膜 ( 细胞膜和细胞器膜 ) 不破裂, 不引发死亡细胞的自溶, 也不引起急性炎症反应 凋亡不仅与胚胎发生 发展 个体形成 器官的细胞平衡稳定等有密切的关系, 并在人类肿瘤 自身免疫性疾病 病毒性疾病等的发生上具有重要意义 凋亡的形态学特点电镜下, 凋亡的细胞皱缩, 质膜完整, 胞浆致密, 细胞器密集

106 不同程度退变 ; 核染色质致密, 形成形状不一 大小不等的团块边集于核膜处, 进而胞核裂解 胞浆多发性芽突 ; 胞浆芽突迅速脱落, 形成许多凋亡小体 (apoptotic bodies) 凋亡小体外被以胞膜, 其胞浆中含有细胞器, 核碎片可有可无 ( 图 图 ) 凋亡小体迅即在局部被巨噬细胞和相邻的其他细胞 ( 例如上皮细胞 ) 吞噬 降解 光镜下, 凋亡小体多呈圆形或卵圆形, 大小不等, 胞浆浓缩, 强嗜酸性, 可有可无固缩深染的核碎片, 故有称之为嗜酸性小体 (councilman bodies) 病毒性肝炎中所见的嗜酸性小体实为肝细胞的凋亡 图 凋亡和凋亡小体

107 图 凋亡小体 ( 电镜 ) 凋亡的生物化学特点最具特征的改变是基因组 DNA 在内源性核酸内切酶的作用下, 降解为一系列规则的寡核苷酸片段, 在电泳分离时, 呈现特征性的阶梯状 DNA 条带图谱 这种电泳中的特征性阶梯状, 系 DNA 链在核小体单位 (nucleosomal units) 之间连接区被活化了的核酸内切酶随机分解所致 酶切割后产生了以单个核小体的长度为 180~ 200bp 为单位的 DNA 片段, 电泳时产生的特征性阶梯状条带均为单核小体的不同倍数, 又称寡聚体 第五节细胞 组织对损伤的修复 损伤造成机体部分细胞和组织丧失后, 机体对所形成缺损进行修补恢复的过程, 称为修复 (repair), 修复后可完全或部分恢复原组织的结构和功能 修复过程起始于损伤, 损伤处坏死的细胞 组织碎片被清除后, 由其周围健康细胞分裂增生来完成修复过程 修复过程可概括为两种不同的形式 :1 组织缺损后, 邻近健康细胞分裂增生以取代死亡细胞的过程, 称为再生 (regeneration), 如果完全恢复了原组织自身结构及功能, 则称为完全再生 ;2 由纤维结缔组织来修复, 称为纤维性修复, 以后形成瘢痕, 故也称瘢痕修复 疤痕修复后的组织在结构与功能上与原有的组织不完全相同, 也称为不完全性再生 在多数情况下, 由于有多种组织发生损伤, 故上述两种修复过程常同时存在 一 再生 再生分为生理性再生及病理性再生 在生命活动过程中经常有些细胞和组织不断地衰老 死亡, 又被同类细胞不断地进行分裂增生而补充, 这种经常更新组织的再生称为生理性再生 在病理情况下细胞或组织受损, 坏死后由再生的细胞和组织取代的过程, 称为病理性再生 前者如皮肤角化细胞不断脱落, 基底层细胞不断增生分化予以补充 ; 血细胞衰老后从血液中消失, 造血器官不断产生新的血细胞进行补充, 以维持血液中血细胞数量的平衡 ; 消化道粘膜上皮细胞每 l~2 天更新一次等 生理性再生均为完全性再生 本章主要讨论病理状态下细胞 组织缺损后发生的再生, 即病理性再生 ( 一 ) 细胞周期和不同类型细胞的再生潜能 细胞增殖周期由 G l 期 (DNA 合成前期 ) S 期 (DNA 合成期 ) G 2 期 ( 分裂前期 ) 和 M 期 ( 分裂期 ) 构成 在生理状态下, 静止细胞处于 G 0 期 不同种类的细胞, 其细胞周期的时程长短不同, 在单位时间里可进入细胞周期进行增殖的细胞数也不相同, 因此具有不同的再生能力 一般而言, 低等动物比高等动物的细胞或组织再生能力强 就个体而言, 幼稚组织比高分化组织再生能力强 ; 平时易受损伤的组织及生理状态下经常更新的组织有较强的再生能力 ; 除了主要由非分裂的持久细胞构成的组织外, 多数成熟的组织都含有保持分裂能力的静止细胞, 当其受到刺激时, 可重新进入细胞周期 ( 图 ) 按再生能能力的强弱, 可将人体细胞分为三类 1. 不稳定细胞 (labile cells) 是指再生能力很强的细胞 在生理情况下, 这类细胞就不断地分裂增生更替衰老死亡的细胞 属于这类细胞的有口腔 胃肠道 呼吸道 泌尿

108 道粘膜被覆细胞 男性及女性生殖器官管腔的被覆细胞 淋巴及造血细胞 间皮细胞等 这些细胞的再生能力相当强 图 细胞周期 2. 稳定细胞 (stable cell) 是指当机体发育成熟后处于稳定状态的细胞, 在生理情况下不繁殖, 处于静止期 (G 0 期 ), 但仍保持强大潜在的再生能力, 一旦遭受损伤而死亡后或在某种刺激的情况下, 即可进入 DNA 合成前期 (G 1 ), 再生进行修复 属于此类细胞的有肝 胰 涎腺 内分泌腺 肾小管等上皮细胞 间叶细胞及其衍生细胞, 如成纤维细胞 内皮细胞 平滑肌细胞 成骨细胞 成软骨细胞等 3. 永久性细胞 (permanent cells) 属于这类细胞的有神经细胞 骨骼肌细胞及心肌细胞 不论中枢神经细胞及周围神经的神经节细胞, 在出生后都不能分裂增生, 一旦遭受破坏则成为永久性缺失 但这不包括神经纤维, 在神经细胞存活的前提下, 受损的神经纤维有着活跃的再生能力 当组织受到损伤时, 稳定性细胞和不稳定性细胞迅速增生, 但其修复之完好程度, 依赖于受损组织的间质或组织支架的完好程度 因实质细胞增生, 需在原有支架上进行, 方可恢复正常结构 如肾小管上皮细胞坏死, 倘若基底膜或上皮下的网状纤维间质未被破坏, 则再生的上皮细胞可沿间质排列, 恢复正常结构及功能, 如肾小管的网状纤维间质也被破坏消失, 则不能恢复原有结构, 而形成疤痕 ( 二 ) 各种组织的再生过程

109 1. 上皮组织的再生 (1) 被覆上皮再生皮肤与粘膜的被覆上皮最容易受损, 但它们的再生能力强, 也最容易修复 鳞状上皮缺损后数小时之内即开始增生, 由创缘或底部的基底层细胞分裂增生, 向缺损中心迁移, 先形成单层上皮, 以后增生分化为形成复层扁平的鳞状上皮 粘膜如胃肠粘膜的上皮缺损后, 同样也由邻近的基底部细胞分裂增生来修补 新生的上皮细胞起初为立方形, 以后增高变为柱状细胞 (2) 腺上皮再生腺上皮细胞再生能力一般较被覆上皮为弱, 但仍有较强的再生能力, 若基底膜未被破坏, 残存的上皮细胞分裂补充, 可完全再生修复 但再生的情况依损伤的状态而异 : 如果有腺上皮的缺损而腺体的基底膜未被破坏, 可由残存细胞分裂补充, 可完全恢复原来腺体结构 ; 皮肤附属器如汗腺完全破坏后不能再生, 修复时仅能由结缔组织代替 ; 再如, 肝细胞有活跃的再生能力, 肝再生情况比较复杂 : 肝细胞损伤时, 不论范围大小, 只要肝小叶网状支架完整, 从肝小叶周边区再生的肝细胞可沿支架延伸, 恢复正常结构 ; 但若肝细胞坏死较广泛, 肝小叶网状支架塌陷, 网状纤维转化为胶原纤维, 或者由于肝细胞反复坏死及炎症刺激, 纤维组织大量增生, 形成肝小叶内间隔, 此时再生肝细胞难以恢复原来小叶结构, 成为结构紊乱的肝细胞团, 例如肝硬化时的再生结节 2. 纤维组织的再生纤维组织的再生能力很强, 是病理性再生最常见的组织修复 在损伤的刺激下局部的静止纤维细胞或未分化的间叶细胞, 开始分裂增生形成成纤维细胞 成纤维细胞最初呈小圆形, 继而胞体膨大呈圆形 椭圆形甚至星芒状, 两端常有突起 镜检见胞质丰富而微带嗜碱性, 胞核大而淡染, 呈椭圆形或梭状, 可见 1~2 个核仁 电镜下, 胞浆内有丰富的粗面内质网及核蛋白体, 说明其合成蛋白的功能很活跃 胞核体积大, 染色淡, 有 1~2 个核仁 较大的成纤维细胞具有平滑肌细胞的超微结构和生物化学特性, 有肌动凝蛋白, 有人称此成纤维细胞为肌成纤维细胞 (myofibroblast) 当成纤维细胞停止分裂后, 便合成和分泌原胶原蛋白, 并在细胞周围形成胶原纤维, 成纤维细胞逐渐成熟, 胞质变少, 核变小染色深, 变为长梭形的纤维细胞 成纤维细胞除合成胶原外, 亦参与基质形成 基质内含有粘多糖, 如硫酸软骨素 透明质酸等 3. 软骨组织和骨组织的再生软骨再生起始于软骨膜的增生, 这些增生的幼稚细胞形似成纤维细胞, 以后逐渐变为软骨母细胞, 并形成软骨基质, 细胞被埋在软骨陷窝内而变为静止的软骨细胞 软骨再生力弱, 软骨组织缺损较大时由纤维组织参与修补 骨组织再生力强, 骨折后可完全修复 4. 血管的再生 (1) 毛细血管的再生 : 在组织修复过程中, 血管的再生非常重要 毛细血管的再生过程又称为血管形成 (angiogenesis), 是以生芽 (budding) 方式来完成的 首先在蛋白分解酶作用下基底膜分解, 该处内皮细胞分裂增生形成突起的幼芽, 随着内皮细胞向前移动及后续细胞的增生而形成一条细胞索, 数小时后便可出现管腔, 形成新生的毛细血管, 进而彼此吻合构成毛细血管网 ( 图 ) 根据功能需要一部分关闭消失, 一部分毛细血管壁由周围间叶细胞分化为平滑肌细胞 胶原纤维 弹力纤维及血管外皮细胞, 使管壁增厚, 改建为小动脉和小静脉 增生的内皮细胞分化成熟时还分泌 Ⅳ 型胶原 层粘连蛋白和纤维连接蛋白, 形成基底膜的基板 周边的成纤维细胞分泌 Ⅲ 型胶原及基质, 组成基底膜的网板, 本身则成为血管外膜细胞, 至此毛细血管的构筑遂告完成 新生的毛细血管基

110 底膜不完整, 内皮细胞间空隙较大, 故通透性较高 为适应功能的需要, 这些毛细血管还会不断改建, 有的管壁增厚发展为小动脉 小静脉, 其平滑肌等成分可能由血管外未分化间叶细胞分化而来 图 毛细血管的再生 (2) 大血管的修复 : 大血管离断后需手术吻合, 吻合处两侧内皮细胞分裂增生, 互相连接, 恢复原来内膜结构 但离断的肌层不易完全再生, 而由结缔组织增生连接, 形成瘢痕修复 5. 肌组织的再生肌组织的再生能力很弱 不同的肌组织再生能力也不一样 横纹肌受损后能否完全再生, 取决于肌膜是否存在及肌纤维是否完全断裂 当损伤较轻, 肌膜存在, 仅部分肌纤维坏死时, 残存的肌细胞分裂增生, 产生肌浆, 融合成带状, 先出现纵纹, 继而出现横纹, 最后恢复正常结构 损伤不太重而肌膜未被破坏时, 肌原纤维仅部分发生坏死, 此时嗜中性粒细胞及巨噬细胞进入该部吞噬清除坏死物质, 残存部分肌细胞分裂, 产生肌浆, 分化出肌原纤维, 从而恢复正常横纹肌的结构 ; 如果肌纤维完全断开, 断端肌浆增多, 也可有肌原纤维的新生, 使断端膨大如花蕾样 但这时肌纤维断端不能直接连接, 而靠纤维瘢痕愈合 愈合后的肌纤维仍可以收缩, 加强锻炼后可以恢复功能 ; 如果整个肌纤维 ( 包括肌膜 ) 均被破坏, 则难以再生, 需由结缔组织增生连接, 形成瘢痕修复 平滑肌有一定的再生能力, 如动脉粥样硬化时的平滑肌细胞再生和妊娠早期子宫增大时见到的子宫平滑肌细胞核分裂, 但多数情况下平滑肌细胞再生能力非常差, 损伤后多由疤痕组织修复 心肌几乎没有再生能力, 受损后只能由疤痕组织代替 心肌再生能力极弱, 破坏后一般都是瘢痕修复 6. 神经组织的再生神经组织是分化最高的组织, 再生能力最低 脑及脊髓内的神经细胞破坏后不能再生, 由神经胶质细胞及其纤维修补, 形成胶质瘢痕 外周神经受损时, 如果与其相连的神经细胞仍然存活, 则可完全再生 首先, 断处远侧段的神经纤维髓鞘及轴突崩解, 并被吸收 ; 近侧段的数个 Ranvier 节神经纤维也发生同样变化 然后由两端的神经鞘细胞增生形成带状的合体细胞, 将断端连结 近端轴突以每天约 lmm 的速度逐渐向远端生长, 穿过神经鞘细胞带, 最后达到末梢鞘细胞, 鞘细胞产生髓磷脂将轴

111 索包绕形成髓鞘 此再生过程常需数月以上才能完成 神经纤维离断的两断端距离太远, 不能对接, 新生的轴索不长入神经膜细胞构成的管道内, 和所属的神经鞘及周围增生的纤维组织互相混杂, 卷曲纠缠成团块状, 形成肿瘤样结节, 此即所谓创伤性神经瘤 (traumatic neuroma) 由于常发生在截肢处的肢体残端, 故又称为截肢性神经瘤 (stump neuroma) 这是非肿瘤性病变, 常引起持续性疼痛 ( 三 ) 损伤处细胞再生与分化的分子机制 就单个细胞而言, 细胞增殖是受基因控制的, 细胞周期出现的一系列变化是基因活化与表达的结果, 已知的有关基因控制细胞生长的包括原癌基因 (proto-oncogene) 及细胞分裂周期基因 (cell division cycle gene) 等 然而机体是由多细胞组成的极其复杂的统一体, 部分细胞 组织丧失引起细胞再生予以修复, 修复完成后再生便停止 受损组织修复的完好程度不仅取决于受损组织 细胞的再生能力, 同时也受许多细胞因子及其他因素的调控 目前已知影响损伤处细胞再生与分化的分子机制可概括为以下三个方面 1. 与再生有关的几种生长因子当细胞受到损伤因素的刺激后, 释放 些生长因子 (growth factors), 刺激同类细胞或同一胚层发育来的细胞增生, 促进修复过程 尽管有许多化学介质都可影响细胞的再生与分化, 但以多肽类生长因子最为关键 它们除刺激细胞的增殖外, 还参与了损伤组织的重建 以下介绍几种已被公认并能被分离 纯化的重要生长因子 (1) 血小板源性生长因子 (platelet derived growth factor, PDGF): 来源于血小板的 颗粒, 能引起成纤维细胞 平滑肌细胞和单核细胞的增生和游走, 并能促进胶质细胞增生 (2) 成纤维细胞生长因子 (fibroblast growth factor, FGF): 生物活性十分广泛, 几乎可刺激所有间叶细胞, 但主要作用于内皮细胞, 特别在毛细血管的新生过程中, 能使内皮细胞分裂并诱导其产生蛋白溶解酶, 后者溶解基膜, 便于内皮细胞穿越生芽 (3) 表皮生长因子 (epidermal growth factor, EGF): 是从颌下腺分离出的一种 6kDa 多肽 对上皮细胞 成纤维细胞 胶质细胞及平滑肌细胞都有促进增殖的作用 (4) 转化生长因子 (transforming growth factor, TGF): 许多细胞都分泌 TGF TGF-α 的氨基酸序列有 33%~44% 与 EGF 同源, 可与 EGF 受体结合, 故与 EGF 有相同作用 TGF-β 由血小板 巨噬细胞 内皮细胞等产生, 它对成纤维细胞和平滑肌细胞增生的作用依其浓度而异 : 低浓度诱导 PDGF 合成 分泌, 为间接分裂原 ; 高浓度抑制 PDGF 受体表达, 生长受抑制 此外 TGF-β 还促进成纤维细胞趋化, 产生胶原和纤维连接蛋白, 抑制胶原降解, 促进纤维化发生 (5) 血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF): 最初从肿瘤组织中分离提纯, 对肿瘤血管的形成有促进作用 也可促进正常胚胎的发育 创伤愈合及慢性炎症时的血管增生 VEGF 还可明显增加血管的通透性, 进而促进血浆蛋白在细胞基质中沉积, 为成纤维细胞和血管内皮细胞长入提供临时基质 由于仅内皮细胞存在 VEGF 受体, 故其对其他细胞增生的促进作用都是间接的 (6) 细胞因子 (cytokines): 细胞因子也是生长因子, 例如白介素 1(IL-1) 和肿瘤坏死因子 (TNF) 能刺激纤维母细胞的增殖及胶原合成,TNF 还能刺激血管再生 此外还有许多细胞因子和生长因子, 如造血细胞集落刺激因子 神经生长因子 IL-2(T 细胞生长因子 ) 等, 对相应细胞的再生都有促进作用, 在此不再赘述

112 在损伤部位, 多肽生长因子与细胞膜上相应受体结合, 并激活该受体使其具有内源性激酶活性 后者使大量底物发生磷酸化, 当然这些底物是参与信号转录和第二信使生成的 通过激酶的扩大效应激活核转录因子, 启动 DNA 合成, 最终引起细胞分裂 在体内, 细胞的增殖又受周期素 (cyclins) 蛋白家族凋控, 当周期素与周期素依赖性激酶 (cyclin-dependent kinase, CDK) 形成复合体时, 涉及细胞分裂的有关蛋白质的磷酸化将受到抑制, 进而控制了细胞的分裂 可见机体存在着刺激增生与抑制增生两种机制, 两者处于动态平衡, 如刺激增生机制增强或抑制增生机制减弱, 则促进增生, 反之增生受到抑制 2. 抑素与接触抑制与生长因子相比, 对抑素 (chalon) 的了解甚少 抑素具有组织特异性, 似乎任何组织都可以产生一种抑素抑制本身的增殖 例如已分化的表皮细胞能分泌表皮抑素, 抑制基底细胞增殖 当皮肤受损使已分化的表皮细胞丧失时, 抑素分泌终止, 基底细胞分裂增生, 直到增生分化的细胞达到足够数量和抑素达到足够浓度为止 前面提到的 TGF-β 虽然对某些间叶细胞增殖起促进作用, 但对上皮细胞则是一种抑素 此外干扰素 -α, 前列腺素 E 2 和肝素在组织培养中对成纤维细胞及平滑肌细胞的增生都有抑素样作用 皮肤创伤, 缺损部周围上皮细胞分裂增生迁移, 将创面覆盖而相互接触时, 或部分切除后的肝脏, 当肝细胞增生达到原有大小时, 细胞停止生长, 不至堆积起来 这种现象称为接触抑制 (contact inhibition) 细胞缝隙连接 ( 可能还有桥粒 ) 也许参与接触抑制的调控 3. 细胞外基质在细胞再生过程中的作用细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 在任何组织都占有相当比例, 它的主要作用是把细胞连接在一起, 借以支撑和维持组织的生理结构和功能 近年来的研究证明, 尽管不稳定细胞和稳定细胞都具有完全的再生能力, 但能否重新构建为正常结构尚依赖 ECM, 因为后者在调节细胞的生物学行为方面发挥更为主动和复杂的作用 它可影响细胞的形态 分化 迁移 增殖和生物学功能 由其提供的信息可以调控胚胎发育 组织重建与修复 创伤愈合 纤维化及肿瘤的侵袭等 组成 ECM 的主要成分有 : (1) 胶原蛋白 (collagen): 目前已知胶原蛋白有 10 余种, 它们分别存在于不同组织的细胞外基质中, 除作为组织和器官的主要支架外, 对细胞的生长 分化 细胞粘附及迁移都有明显的影响 此外, 它还能启动外凝系统, 参与凝血过程 (2) 蛋白多糖 (proteoglycans): 蛋白多糖是构成 ECM 的主要成分, 它能把多种细胞粘合在一起形成组织或器官 它参与体内的凝胶和溶胶体系, 对物质交换 渗透压平衡有作用 (3) 粘连糖蛋白 (adhesive glycoproteins): 包括纤维连接蛋白 (fibronectin, FN) 层粘连蛋白 (1aminin, LN) 等 FN 可与 ECM 中各类成分结合及介导细胞间粘附, 还可促进细胞铺展, 而细胞铺展是细胞增殖的条件,FN 浓度越高细胞增殖越快 LN 主要存在于基底膜的透明层, 对细胞的粘附 移行和增殖均有影响 损伤修复过程中,ECM 经代谢调整, 其成分也会有所改变, 如 Ⅲ 型胶原减少而 Ⅰ 型胶原增多, 使修复组织能力增强 然而实质脏器慢性炎症时, 该脏器的某些间叶来源细胞 ( 如肝脏的贮脂细胞, 肺泡隔间叶细胞 ) 可增生 激活 转化为成纤维细胞, 最终引起 ECM 过度增多和沉积, 器官发生纤维化 硬化

113 二 纤维性修复 纤维性修复首先通过肉芽组织增生, 溶解 吸收损伤局部的坏死组织及其它异物, 并填补组织缺损, 以后肉芽组织转化成以胶原纤维为主的瘢痕组织, 修复便告完成 ( 一 ) 肉芽组织 肉芽组织 (granulation tissue) 由新生薄壁的毛细血管以及增生的成纤维细胞构成, 并伴有炎性细胞浸润, 肉眼表现为鲜红色, 颗粒状, 柔软湿润, 形似鲜嫩的肉芽故而得名 1. 肉芽组织的成分及形态镜下可见大量由内皮细胞增生形成的实性细胞索及扩张的毛细血管, 向创面垂直生长, 并以小动脉为轴心, 在周围形成拌状弯曲的毛细血管网 在毛细血管周围有许多新生的纤维母细胞, 此外常有大量渗出液及炎性细胞 ( 图 ) 炎性细胞中常以巨噬细胞为主, 也有多少不等的中性粒细胞及淋巴细胞 巨噬细胞能分泌 PDGF FGF TGF-β IL-l 及 TNF, 加上创面凝血时血小板释放的 PDGF, 进一步刺激纤维母细胞及毛细血管增生 巨噬细胞及中性粒细胞能吞噬细菌及组织碎片, 这些细胞破坏后释放出各种蛋白水解酶, 能分解坏死组织及纤维蛋白, 肉芽组织中毛细血管内皮细胞亦有吞噬能力, 并有强的纤维蛋白溶解作用 图 肉芽组织 右下插图示新生毛细血管 2. 肉芽组织的作用及结局肉芽组织在组织损伤修复过程中有以下重要作用 :1 抗感染保护创面 ;2 填补创口及其他组织缺损 ;3 机化或包裹坏死 血栓 炎性渗出物及其他异物 肉芽组织在组织损伤后 2~3 天内即可出现, 自下向上 ( 如体表创口 ) 或从周围向中心 ( 如组织内坏死 ) 生长推进填补创口或机化异物 随着时间的推移 ( 如 1~2 周 ), 肉芽组织按其生长的先后顺序, 逐渐成熟 其主要形态标志为 : 间质的水分逐渐吸收减少 ; 炎性细胞减少并逐渐消失 ; 部分毛细血管管腔闭塞 数目减少, 按正常功能的需要少数毛细血

114 管管壁增厚, 改建为小动脉和小静脉 ; 成纤维细胞产生越来越多的胶原纤维, 最后变为纤维细胞 至此, 肉芽组织成熟为纤维结缔组织, 并且逐渐转化为老化阶段芽组织疤痕组织 ( 二 ) 瘢痕组织 瘢痕组织 (scar tissue) 的形成是肉芽组织逐渐纤维化的过程 此时网状纤维及胶原纤维越来越多, 网状纤维胶原化, 胶原纤维变粗, 与此同时纤维母细胞越来越少, 少量剩下者转变为纤维细胞 ; 间质中液体逐渐被吸收, 中性粒细胞 巨噬细胞 淋巴细胞和浆细胞先后消失 ; 毛细血管闭合 退化 消失, 留下很少的小动脉及小静脉 这样, 肉芽组织乃转变成主要由胶原纤维组成的血管稀少的瘢痕组织, 肉眼呈白色, 质地坚韧 瘢痕形成宣告修复完成, 然而瘢痕本身仍在缓慢变化 : 如常发生玻璃样变, 有的瘢痕则发生瘢痕收缩, 这种现象不同于创口的早期收缩, 而是瘢痕在后期由于水分的显著减少所引起的体积变小, 有人认为也与肌纤维母细胞持续增生以至瘢痕中有过多的肌纤维母细胞有关 瘢痕组织的作用及对机体的影响可概况为两个方面 1. 瘢痕组织的形成对机体有利的一面 1 它能把损伤的创口或其他缺损长期地填补并连接起来, 可使组织器官保持完整性 ;2 由于瘢痕组织含大量胶原纤维, 虽然没有正常皮肤的抗拉力强, 但比肉芽组织的抗拉力要强得多, 因而这种填补及连接也是相当牢固的, 可使组织器官保持其坚固性 如果胶原形成不足或承受力大而持久, 加之瘢痕缺乏弹性, 可造成瘢痕膨出, 在腹壁可形成疝, 在心壁可形成室壁瘤 2. 瘢痕组织的形成对机体不利的一面 1 瘢痕收缩 由于瘢痕坚韧又缺乏弹性, 加上瘢痕收缩可引起器官变形及功能障碍, 如在消化道 泌尿道等腔室器官则引起管腔狭窄, 在关节附近则引起运动障碍 关于瘢痕收缩的机制可能是由于其中的水分丧失或含有大量肌成纤维母细胞所致 ;2 瘢痕性粘连 特别是在各器官之间或器官与体腔壁之间发生的纤维性粘连, 常常不同程度地影响其功能 ;3 器官内广泛损伤导致广泛纤维化玻璃样变, 可发生器官硬化 ;4 瘢痕组织增生过度, 又称肥大性瘢痕 如果这种肥大性瘢痕突出于皮肤表面并向周围不规则地扩延, 称为瘢痕疙瘩 (keloid)( 临床上又常称为 蟹足肿 ), 易见于烧伤或反复受异物等刺激的伤口 其发生机制不清, 般认为与体质有关 瘢痕组织内的胶原纤维在胶原酶的作用下, 可以逐渐地分解 吸收, 从而使瘢痕缩小 软化 胶原酶主要来自成纤维细胞 嗜中性粒细胞和巨噬细胞等 因此, 要解决瘢痕收缩和器官硬化等的关键是在细胞生长调控和细胞外基质等分子病理水平上, 阐明如何调控肉芽组织中胶原的合成和分泌, 以及如何加速瘢痕中胶原的分解与吸收 三 创伤愈合 创伤愈合 (wound healing) 是指机体遭受外力作用, 皮肤等组织出现离断或缺损后的愈合过程, 为包括各种组织的再生和肉芽组织增生 瘢痕形成的复杂组合, 表现出各种过程的协同作用 ( 一 ) 皮肤创伤愈合 1. 创伤愈合的基本过程不同程度的创伤其愈合过程不一样 轻者仅限于皮肤表皮层, 可通过上皮再生愈合 重者可有肌肉 肌腱 神经的断裂及骨折, 愈合过程就比较复杂 以皮肤手术切口为例叙述创伤愈合的基本过程

115 (1) 伤口的早期变化 : 伤口局部有不同程度的组织坏死和血管断裂出血, 数小时内便出现炎症反应 早期白细胞浸润以嗜中性粒细胞为主,3 天后则以巨噬细胞为主 伤口中的血液和渗出液中的纤维蛋白原很快凝固形成纤维素凝块, 有的凝块表面干燥形成痂皮, 凝块及痂皮起着保护伤口的作用 (2) 伤口收缩 :2~3 日后边缘的整层皮肤及皮下组织向中心移动, 于是伤口迅速缩小, 直到 2 周左右停止 伤口收缩的意义在于缩小创面 不过在各种具体情况下伤口缩小的程度因伤口部位 伤口大小及形状而不同 伤口收缩是由伤口边缘新生的肌纤维母细胞的牵拉作用引起的 (3) 肉芽组织增生和瘢痕形成 : 大约从第 3 天开始从伤口底部及边缘长出肉芽组织填平伤口 毛细血管迅速增长 其方向大都垂直于创面, 并呈袢状弯曲 肉芽组织中没有神经, 故无感觉 第 5~6 天起成纤维细胞产生胶原纤维, 其后一周胶原纤维形成甚为活跃, 以后逐渐缓慢下来 随着胶原纤维越来越多, 出现瘢痕形成过程, 大约在伤后一个月瘢痕完全形成 瘢痕中的胶原纤维最终与皮肤表面平行 (4) 表皮及其它组织再生 : 创伤发生 24 小时内, 伤口边缘的基底细胞即开始增生, 并在血凝块下面向伤口中心迁移, 形成单层上皮, 覆盖于肉芽组织的表面 当这些细胞彼此相遇时, 则停止迁移, 并增生 分化成为鳞状上皮 健康的肉芽组织对表皮再生十分重要, 因为它可提供上皮再生所需的营养及生长因子 有时, 由于异物及感染等刺激而过度生长的肉芽组织 (exuberant granulation), 高出于皮肤表面, 也会阻止表皮再生, 因此临床上常需将其切除 若伤口过大 ( 一般认为直径超过 20 cm 时 ), 则再生表皮很难将伤口完全覆盖, 往往需要植皮 皮肤附属器 ( 毛囊 汗腺及皮脂腺 ) 如遭完全破坏, 则不能完全再生, 而出现瘢痕修复 肌腱断裂后, 初期也是瘢痕修复, 但随着功能锻炼而不断改建 胶原纤维可按原来肌腱纤维的方向排列, 达到完全再生 2. 创伤愈合的类型根据损伤程度及有无感染, 创伤愈合可分为以下两种类型 (1) 一期愈合 (healing by first intention): 见于组织缺损少 创缘整齐 无感染 经粘合或缝合后创面对合严密的伤口, 例如手术切口 ; 这种伤口中只有少量血凝块, 炎症反应轻微, 表皮再生在 24~48 小时内便可将伤口覆盖 肉芽组织在第三天就可从伤口边缘长出并很快将伤口填满,5~6 天胶原纤维形成 ( 此时可以拆线 ), 约 2~3 周完全愈合, 留下一条线状瘢痕 一期愈合的时间短, 形成瘢痕少 ( 图 ) (2) 二期愈合 (healing by second intention): 见于组织缺损较大 创缘不整 哆开 无法整齐对合, 或伴有感染的伤口 这种伤口的愈合与一期愈合有以下不同 :1 由于坏死组织多, 或由于感染, 继续引起局部组织变性 坏死, 炎症反应明显 只有等到感染被控制, 坏死组织被清除以后, 再生才能开始 2 伤口大, 伤口收缩明显, 从伤口底部及边缘长出多量的肉芽组织将伤口填平 3 愈合的时间较长, 形成的瘢痕较大 ( 图 ) (3) 痂下愈合 (healing under scar): 是指伤口表面的血液 渗出液及坏死物质干燥后形成黑褐色硬痂, 在痂下进行上述愈合过程 待上皮再生完成后, 痂皮即脱落 痂下愈合所需时间通常较无痂者长, 因此时的表皮再生必须首先将痂皮溶解, 然后才能向前生长 痂皮由于干燥不利于细菌生长, 故对伤口有一定的保护作用 但如果痂下渗出物较多, 尤其是已有细菌感染时 ; 痂皮反而成了渗出物引流排出的障碍, 使感染加重, 不利于愈合

116 3. 影响创伤愈合的因素损伤的程度 组织的再生能力 伤口有无坏死组织和异物以及有无感染等因素决定修复的方式 愈合的时间及瘢痕的大小 因此, 治疗原则应是缩小创面 ( 如对合伤口 ) 防止再损伤和感染以及促进组织再生 影响创伤愈合的因素包括全身和局部两个方面 图 创伤愈合 : 一期愈合 (1) 全身因素 1 年龄 : 青少年的组织再生能力强 愈合快 老年人则相反, 组织再生力差, 愈合慢, 此与老年人血管硬化, 血液供应减少有很大关系 2 营养 : 严重的蛋白质缺乏, 尤其是含硫氨基酸 ( 如甲硫氨酸 胱氨酸 ) 缺乏时, 肉

117 芽组织及胶原形成不良, 伤口愈合延缓 维生素中以维生素 C 对愈合最重要 这是由于 α- 多肽链中的两个主要氨基酸 脯氨酸及赖氨酸, 必须经羟化酶羟化, 才能形成前胶原分子, 而维生素 C 具有催化羟化酶的作用, 因此维生素 C 缺乏时前胶原分子难以形成, 从而影响了胶原纤维的形成 在微量元素中锌对创伤愈合有重要作用, 手术后伤口愈合迟缓的病人, 皮肤中锌的含量大多比愈合良好的病人低 此外已证明, 手术刺激 外伤及烧伤患者尿中锌的排出量增加, 补给锌能促进愈合 锌的作用机制不很清楚 图 创伤愈合 : 二期愈合 (2) 局部因素 1 感染与异物感染对再生修复的妨碍甚大 许多化脓菌产生 些毒素和酶, 能引

118 起组织坏死, 溶解基质或胶原纤维, 加重局部组织损伤, 妨碍创伤愈合 ; 伤口感染时, 渗出物很多, 可增加局部伤口的张力, 常使正在愈合的伤口或已缝合的伤口裂开, 或者导致感染扩散加重损伤 ; 坏死组织及其它异物, 也妨碍愈合并有利于感染 因此, 伤口如有感染, 或有较多的坏死组织及异物, 必然是二期愈合 临床上对于创面较大, 已被细菌污染但尚未发生明显感染的伤口, 施行清创术以清除坏死组织 异物和细菌, 并可在确保没有严重感染的情况下, 缝合创口 这样有可能使本来是二期愈合的伤口, 达到一期愈合 2 局部血液循环局部血液循环一方面保证组织再生所需的氧和营养, 另一方面对坏死物质的吸收及控制局部感染也起重要作用 因此, 局部血液供应良好时, 则再生修复较为理想 相反, 如下肢有动脉粥样硬化或静脉曲张等病变, 局部血液循环不良时, 则该处伤口愈合迟缓 3 神经支配正常的神经支配对组织再生有一定的作用 例如麻风引起的溃疡不易愈合, 是因为神经受累致使局部神经性营养不良的缘故 植物神经的损伤, 使局部血液供应发生变化, 对再生的影响更为明显 4 电离辐射能破坏细胞 损伤小血管 抑制组织再生 因此影响创伤的愈合 ( 二 ) 骨折愈合 1. 骨折愈合的基本过程骨折 (bone fracture) 通常可分为外伤性骨折和病理性骨折两大类 骨折发生后, 两断端骨组织的再生能力很强, 且同样经肉芽组织增生而愈合 只要经过良好的复位及固定, 骨膜细胞的再生, 可以完全恢复正常的结构和功能 骨折愈合 (fracture healing) 过程, 可分为以下四个阶段 ( 图 ) 图 骨折愈合 (1) 血肿形成 : 骨折时由于骨组织及周围组织受到损伤, 局部血管破裂出血, 在骨折的两断端及周围组织间形成血肿, 数小时内发生血液凝固, 两断端连接起来, 继而局部出现炎症反应 渗出的白细胞清除坏死组织, 有利于肉芽组织长入和机化 同时由于在骨折处供应骨髓 骨皮质及骨膜的血管发生断裂, 使局部缺血, 骨皮质可发生缺血性坏死, 坏死的骨组织可被破骨细胞吸收, 有时也可脱落, 游离而成死骨片

119 (2) 纤维性骨痂形成 : 骨折后的 2~3 天, 血肿开始由肉芽组织取代而机化, 继而发生纤维化形成纤维性骨痂, 或称暂时性骨痂 肉眼及 X 线检查见骨折局部呈梭形肿胀 约 1 周左右, 上述增生的肉芽组织及纤维组织可进一步分化, 形成透明软骨 透明软骨的形成一般多见于骨外膜的骨痂区, 骨髓内骨痂区则少见 (3) 骨性骨痂形成 : 在纤维性骨痂的基础上, 分化出骨母细胞, 并形成类骨组织, 以后钙盐沉着, 类骨组织转变为编织骨 (woven bone) 纤维性骨痂中的软骨组织, 也经钙盐沉着演变为骨组织, 至此形成骨性骨痂 此时, 骨折的两瑞牢固地结合在一起, 但骨小梁排列紊乱, 结构较疏松, 比正常骨脆弱, 故仍达不到正常骨负重功能 此过程约 4~8 周 (4) 骨痂改建或重塑 : 编织骨由于结构不够致密, 骨小梁排列紊乱, 故仍达不到正常功能需要 为了适应骨活动时所受应力, 编织骨经过进一步改建成为成熟的板层骨, 皮质骨和髓腔的正常关系以及骨小梁正常的排列结构也重新恢复 改建是在破骨细胞的骨质吸收及骨母细胞新骨质形成的协调作用下完成的 2. 影响骨折愈合的因素凡影响创伤愈合的全身及局部因素对骨折愈合都起作用 此外, 尚需强调以下三点 : (1) 骨折断端的及时 正确的复位 : 完全性骨折由于肌肉的收缩, 两断端常常发生错位或有其他组织 异物的嵌塞, 可使愈合延迟或不能愈合 因此及时 正确的复位是骨折完全愈合的必要条件 (2) 骨折断端及时 牢靠的固定 : 骨折断端即便已经复位, 由于肌肉活动仍可错位, 因而复位后的及时 牢靠的固定 ( 如打石膏 小夹板或髓腔钢针固定 ) 更显重要, 一般要固定到骨性骨痂形成以后 (3) 早日进行全身和局部功能锻炼, 保持局部良好的血液供应 : 由于骨折后常需复位 固定及卧床, 虽然有利于局部愈合, 但长期卧床, 血运不良, 又会延迟愈合 局部长期固定不动也会引起骨及肌肉的废用性萎缩, 关节强直等不利后果 为此, 在不影响局部固定情况下, 应尽早离床活动 骨折愈合障碍者, 有时新骨形成过多, 形成赘生骨痂, 愈合后有明显的骨变形, 影响功能的恢复 有时纤维性骨痂不能变成骨性骨痂并出现裂隙, 骨折两端仍能活动, 形成假关节 ( 周韧 )

120 第四章自由基与组织损伤 自由基 (free radical) 指含有未配对电子的原子 原子团或分子 生命过程中的许多化学反应都有自由基的参与, 如氧化还原反应 光合作用等, 它在机体的生命活动中扮演着重要的角色 但同时, 自由基损伤又是组织损伤的重要分子机制之一, 由于自由基的高度化学活泼性, 它极易与相邻的物质发生电子的得 失交换, 一旦自由基生成的数量或时空定位出现异常, 超出了机体的调控 保护能力, 自由基必将造成组织的损伤, 包括核酸 蛋白质 脂质和各种生物大分子都是极易受自由基攻击的目标 目前发现, 许多疾病的损伤机制中都有自由基的参与 第一节生物体中的主要自由基及其生理学意义 ( 一 ) 氧中心自由基 一 生物体中的主要自由基 生物体中生成最多, 与机体的生理 病理生理过程关系最密切的自由基是以氧为中心的氧自由基 地球上的绝大多数生物都是需氧生物, 利用氧化反应获取能量 氧是这种生物代谢反应中的终末电子接受体, 一分子氧最多可接受四个电子而被还原为水, O 2 +4e+4H + 2H 2 O 但在生命化学中, 氧分子的还原并不总是一步到位的, 常常会出现 单电子或双电子还原, 从而生成超氧阴离子 O & ( 单电子还原 ), 过氧化氢 H 2 O 2 ( 双电子 还原 ), 以及羟自由基 OH ( 三电子还原 ) 等等, 这些氧源性活性基团通过自由基链反应又生成其它自由基 1. 超氧阴离子 (superoxide radical) 体内 O & 的主要生成途径如下 : (1) 细胞色素 P 450 (Cyt P 450 ):Cyt P 450 是一种加单氧酶, 附着于细胞的各种膜相结构上 ( 如内质网 ), 对营养物 药物 毒物的代谢起重要作用 其催化的反应是将一个氧原子插入 C-H 中, 形成 C-OH 键 ( 加单氧 ), 使底物氧化 羟化 另一个氧原子由还原为 H 2 O, 此过程需要有氧的活化, 生成活性氧分子 ( O & 和 H 2 O 2 ) 这是机体产生 O & 的重要途径 - 2 (2) 线粒体 : 通常线粒体的电子传递链通过细胞色素 C 氧化酶连续从还原型细胞色素 C 供给 4 个电子用以还原 1 分子氧,4CytC 2+ +4H + +O 2 4CytC 3+ +2H 2 O 但辅酶 Q( 泛醌 ) 和细胞色素在传递电子时, 可出现 电子漏, 生成包括 O & 在内的各种活性氧 ;FADH 在向 NAD + 递氢的过程中也可将电子传递给分子氧, 生成 O & 据测算, 即使在生理状态 下也大约有 2% 的氧量生成活性氧 线粒体遭受损伤时, 如细胞色素 C 氧化酶活性下降时 电子漏增大, O - 2 & 生成增多

121 (3) 吞噬细胞的呼吸爆发 : 吞噬细胞被激活时耗氧量明显增加, 被称为呼吸爆发, 又 称氧爆发 (oxidative burst), 其增加的耗氧量基本上都用于生成 O & 呼吸爆发中催化 O & 生 成的酶主要是 NADPH 氧化酶 DADH 氧化酶和髓过氧化物酶 (4) 黄嘌呤氧化酶 (xanthine oxidase): 黄嘌呤氧化酶是嘌呤核苷酸的分解代谢酶, 催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤, 再氧化为尿酸, 而以分子氧为电子受体 根据反应条件的不 同 ( 如 ph 值 氧分压 黄嘌呤的浓度 ), 分子氧可被单电子还原生成 O &, 或双电子还原 生成 H 2 O 2, 体内嘌呤核苷酸的分解代谢主要在肝脏 小肠及肾脏中进行, 黄嘌呤氧化酶在这些脏器中活性较高 血管内皮细胞含黄嘌呤脱氢酶 (xanthine dehydrogenase), 亦可催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤, 再氧化为尿酸, 但以 NAD + 和 NAPD + 为电子受体, 生成 NADH - 2 和 NADPH, 而不生成 O & 和 H 2 O 2 但当黄嘌呤脱氢酶受到一定程度的降解或分子内的某 些 -SH 基被氧化后 ( 如在缺血 - 再灌注损伤时 ), 则转化出黄嘌呤氧化酶的活性, 亦可生 - 2 成 O & 或 H 2 O 2 2. 过氧化氢 (hydrogen peroxide,h 2 O 2 ) H 2 O 2 不是自由基, 其分子结构中无未配对电子, 但由于基 O-O 键较弱, 且很易通过 Fenton 反应生成生物体内化学性质最活泼的羟自由基 OH, 因此也是一个较强的氧化剂, 被称为活性氧 (reactive oxygen) 在本章的后续讨论中, 氧自由基和活性氧将同等看待 生物体内的 H 2 O 2 主要来源于以下几条途径 : (1) - O 2 & 的歧化反应 : O - 2 & +2H + H 2 O 2 +O 2 真核细胞的胞浆和线粒体中都含有超氧化 物歧化酶, 催化上述反应大大加速, 所以凡是生成 O & 的地方都可以通过歧化反应生成 H 2 O 2, 这是机体生成 H 2 O 2 的主要方式 (2) 酶促反应 : 催化 O 2 双电子还原生成 H 2 O 2 的酶有黄嘌呤氧化酶 单胺氧化酶 尿酸氧化酶等等 其中的单胺氧化酶具有较重要的生理和病理生理意义, 它主要催化机体的芳香胺氧化脱氨, 如肾上腺素 多巴胺等儿茶酚胺类神经递质以及酪胺 苯乙胺等的分解代谢 该酶定位于线粒体的外膜, 由其所催化生成的 H 2 O 2 可造成线粒体的损伤, 并可能与神经系统的某些退行性疾病有关 3. 羟自由基 (hydroxyl radical,oh ) 细胞代谢本身并不直接生成 OH, 机体内的 - 2 OH 基本上都是由 O & 和 H 2 O 2 经 Haber-Weiss 反应生成的 : O - 2 & +H 2 O 2 O 2 +OH +OH - 此反应的速度很慢, 速率常数仅为 0.13 mol L -1 s -1 但当有 Fe 2+ 或 Cu 2+ 存在时, 反应速度将极大的加快,O 2 +H 2 O Fe 2+ 2 O 2 +OH +OH -, 被称为 Fenton 型 Haber-Weiss 反应 OH 是体内最具损伤性的自由基, O - 2 & 和 H 2 O 2 对活组织的损伤基本上都是由于经 Fenton 反应生成 OH 后造成的, 若无 Fe 2+ 或 Cu 2+ 存在, O - 2 & 和 H 2 O 2 对活组织的直接损伤是非常有限的 4. 单线态氧 1 O 2 (singlet oxygen) 普通 ( 基态 ) 氧分子 O 2 的外层 π 键轨道上,2 个电子分别占据两个电子轨道, 并保持自旋平行, 因此其自旋多重度为 [ 自旋多重度 = 2 乘以各电子自旋量子数代数和加 1, 即 2 (1/2+1/2)+1 = 3], 被称为三重态氧 按照自由基的概念, 普通氧分子是一个双自由基, 但 2 个未成对电子相距很近, 使 O O 键长较短, 而键能较低, 因此是一个稳定的自由基 当普通 ( 基态 ) 氧分子 O 2 吸收一定能量后,

122 2 个未成对电子受激发从自旋平行转变为自旋反平行, 占据同一个轨道或仍然各占一个轨道, 由于自旋相反, 其自旋多重度为 1[2 (-1/2+1/2)+1 = 1], 故称为单线态氧 ( 或单态氧 ) 单线态氧是基态氧分子的激发态, 其化学反应活性明显升高, 因此也是一种活性氧分子 单线态氧在体内可有如下几条生成途径 :1 自由基反应, 如 O & +OH 1 O 2 +OH - 2 髓过氧化物酶, 白细胞呼吸爆发时经髓过氧化物酶可生成次氯酸 OCl - 和 H 2 O 2, 后两者反应生成 1 O 2 :OCl - +H 2 O 2 1 O 2 +Cl - +H 2 O 3 光敏反应, 光敏化合物可吸收一定波长的光子后变为激发态, 该激发能可传递给氧分子生成 1 O 2, 而光敏分子返回基态 生物体内常见的光敏化合物包括 : 核黄素及黄素蛋白 FMN FAD 胆红素, 视黄醛以及叶绿素和卟淋类化合物 ( 二 ) 氮中心自由基 1. 一氧化氮 (nitric oxide,no) NO 是体内的一种信号分子, 具有广泛的生理功能, 但同时也是一个自由基, 生成过量时也会造成组织的损害 通常在书写一氧化氮时, 人们常常省略 而写成 NO NO 在体内由一氧化氮合酶 (NOS) 催化生成, 底物为 L- 精氨酸和 O 2,NADPH 供电子, 总反应式如下 : - 2 O 2 NOS L- 精氨酸 L- 胍氨酸 +NO NADPH NADP + 不同组织可表达不同的 NOS, 目前已证实有三种不同类型的 NOS, 分别为 cnos inos enos,nos 不同, 其催化生成的 NO 量 诱导因子 辅因子等等皆有不同, 其所生成的 NO 也常常发挥不同的生理功能 2. 过氧亚硝基阴离子 (peroxynitrite,onoo - ) 过氧亚硝基阴离子是 NO 的衍生物, - 2 由 NO 与 O & 反应生成,NO+ O - 2 & ONOO - ONOO - 不是自由基, 但却具有很强的氧化能 力, 因其在偏酸条件下极易自发分解 ONOO - NO 2 +OH +H + H 2 O 该反应不需 Fe 2+ 参与即能迅速进行, 生成的 NO 2 和 OH 都是极活泼的自由基, 主要产生损伤效应, 目前尚未发现 ONOO - 具杀菌 杀肿瘤外的其它生理功能 ( 三 ) 半醌类自由基 生物体内的半醌自由基 (semiquinone radical) 通常指黄素类蛋白 (FAD FMN) 和辅酶

123 Q( 泛醌 ) 的单电子还原 ( 或氧化 ) 型式 该两类化合物在电子传递链中起着特殊的作用, 因供氢体 ( 如 NADH) 每次供 2 个电子, 而细胞色素每次只传递 1 个电子, 两者之间须由黄素类蛋白 (FAD FMN) 和辅酶 Q 相关联, 因为它们既可以半醌自由基的形式传递单电子, 又可以氢醌型 ( 或醌型 ) 传递 2 个电子, 从而在供氢体和细胞色素之间形成了有效的桥连 半醌类自由基是线粒体中执行重要生理功能的一类自由基 二 自由基的生理学意义 生命过程中的许多化学反应都有自由基的参与, 如线粒体中半醌类自由基的电子传递, 氨基酸的氧化脱氨, 胶原蛋白合成过程中脯氨酸和赖氨酸的羟化, 花生四烯酸经环氧合酶催化生成前列腺素的过程, 等等, 都有自由基反应, 但自由基通常只是这些反应的中间产物 而自由基作为一种独立的 分子 行使生理功能的主要见于以下几方面 1. 蛋白质活性的调控巯基 (-SH,cysteinyl residues) 在蛋白质的活性中心常常是一个重要的功能基团, 其氧化 ( 形成二硫键,disulfide) 或还原对蛋白质的构象和活性是一种重要的调控方式, 两者的平衡受细胞内氧化 - 还原态 (redox statue) 的调控, 细胞内含有丰富的氧化 - 还原态调控物质以维持巯基的正常状态, 其中还原 / 氧化型谷胱甘肽 (GSH/GSSG) 起着关键的作用 GSSG 增加时, 巯基趋向于形成二硫键, 从而引起蛋白质构象和活性的改变 正常时, 人红细胞内 GSH/GSSG 比值约为 400~600/1 当 H 2 O 2 增加时, 谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione peroxidase) 催化如下反应 :2GSH+H 2 O 2 GSSG+2H 2 O, 使 GSSG 增多, 从而使许多蛋白质活性中心的巯基状态改变, 蛋白质构象改变, 活性亦改变 通过此种或与此类似 ( 如 NAD + + NADP/NADH + + NADPH 比值的改变 ) 的方式, 活性氧可调节许多生物大分子的活性, 如转录因子 NF-κB, 激活物蛋白 (activator protein, AP-1 AP-2), 蛋白激酶 C(protein kinase C, PKC),Ca 2+ -ATP 酶, 胶原酶 (collagenase), 酪氨酸激酶 (tyrosine kinases) 等等, 从而参与对生物大分子的活性 信号转导 基因转录等许多生命过程的调控 (1) 氧张力感受 : 主动脉 颈动脉体都有 PO 2 感受器, 氧张力降低时发放神经冲动 目前认为这与低氧引起的外向钾电流减小有关,PO 2 的降低很可能通过 NAD(P)H 氧化酶 - 2 产生活性氧 O & 和 H 2 O 2, 引起钾通道的修饰, 使外向钾电流减小, 而 Na + 和 Ca 2+ 的内向 电流不受 PO 2 降低的影响, 从而引起细胞去极化, 产生兴奋 ;Ca 2+ 内流还引起内质网的储存 Ca 2+ 释放, 进而促进神经递质的释放 (2) 黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶的转化 : 血管内皮细胞主要含黄嘌呤脱氢酶, 此点与肝 肾 小肠等不同, 后者主要含黄嘌呤氧化酶 但当黄嘌呤脱氢酶中的某些 SH 被氧化后则转化成黄嘌呤氧化酶, 显示出活性氧对酶活性的调控作用 黄嘌呤氧化酶生成 - 2 的 O & 据认为可参与对 NO 介导的血管松驰效应的反馈调控, 但更多的证据显示, 该酶特 性的此种转化常常发生在缺血 - 再灌注损伤, 并参与该损伤的发生 受氧化 - 还原态调控的生理 生化过程还有许多, 如前列腺素的合成 可溶性鸟苷酸环化酶 (sgc) 的活性 钾通道等等 2. 自由基作为信号分子对基因转录的调控 (1) 转录因子 AP-1 的激活 :AP-1 是具有亮氨酸拉链和碱性结构域 (leucine zipper/basic

124 domain) 的转录因子家族的总称, 是即早反应基因家族 (immediate-early response gene families)fos 和 jun 的蛋白产物 AP-1 控制着许多基因的表达, 包括编码细胞周期素 D(cyclin D) 转化生长因子 -1β (transforming growth factor-1β, TGF-1β) 胶原酶 和许多细胞因子的基因 AP-1 的活性依赖于以下 4 种与活性氧相关的机制 1) FOS/JUN 蛋白可逆氧化 - 还原态的转化调控 AP-1 的活性 :AP-1 蛋白中某些关键部位半胱氨酸残基保持还原态 (-SH) 为其与 DNA 结合所必需, 若被氧化则失去与 DNA 的结合能力 活性氧是这些半胱氨酸残基氧化 - 还原态的重要调控因子 2) Ca 2+ 依赖的 AP-1 蛋白的转录诱导 :Ca 2+ 是诱导 AP-1 蛋白转录表达的重要第二信使, 活性氧通过多种机制升高胞浆的 Ca 2+ 浓度, 促进 AP-1 的表达 3) 通过花生四烯酸代谢介导的 AP-1 的表达 : 花生四烯酸及其衍生物 HETE (hydroperocyeicosatetraenoic acid, 氢过氧化廿碳四烯酸, 白三烯的前体 ) 可诱导 FOS 和 JUN 的表达, 而细胞受活性氧攻击后可在数秒钟内激活磷脂酶 A 2, 使膜磷脂的水解和花生四烯酸的释放, 并进而促进 AP-1 的表达 4) 经丝裂原激活的蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase, MAPK) 介导的 AP-1 的激活和 FOS/JUN 基因的表达 :AP-1 蛋白中 JUN 亚基的激活需要 JUN 激酶 (JNKs, 属 MAPK 家族 ) 对其某些部位的磷酸化, 从而使其 DNA 结合域暴露出来, 显现其转录因子的活性, 而 JNKs 受活性氧的激活 ; 另一方面,fos 和 jun 基因启动子的一段序列 ( 血清反应元件,serum response element,sre) 可受氧化剂 短波紫外线以及细胞因子的激活, 从而诱导 fos 和 jun 基因的转录 (2) 对核转录因子 Kappa B(NF-κB) 的调控 : 在机体的防御 免疫 炎症反应中,NF-κB 是一个关键的转录因子, 各种细胞因子 ( 如 TNF ILs 各种生长因子 IFN 等 ) 粘附分子基因的启动子中都有 NF-κB 结合位点 甚至某些逆转录病毒, 如 HIV-1, 其基因启动子内亦有 NF-κB 结合位点, 利用宿主的 NF-κB 启动病毒的复制 未激活前,NF-κB 在胞浆中与 κb 抑制因子 (IκB) 形成复合体 (NF-κB/IκB), 无活性 许多病原性 炎症性刺激都可激活 NF-κB 细菌 病毒感染 脂多糖 短波紫外线 电离辐射 IL-1 TNF 等等 对 NF-κB 的激活依赖 IκB 激酶 (IκB kinase), 该酶使 IκB 序列中 32 和 36 位的丝氨酸残基磷酸化, 并与 NF-κB 解聚,NF-κB 迅即向核内移位, 并与基因启动子中的相应位点结合, 激活基因转录 活性氧可以激活 IκB 激酶, 从而激活 NF-κB; 而且几乎所有激活 NF-κB 的刺激都可被某种抗氧化剂所抑制, 如 L- 半胱氨酸 Vit E 及其衍生物等等, 这进一步表明活性氧在 NF-κB 激活中的重要作用 但活性氧对 NF-κB 的作用并不仅仅表现为激活, 已有证据显示 :NF-κB 的 p50 亚基的 Cys-62(62 位的半胱氨酸残基 ) 的 SH 被氧化可抑制 NF-κB 与 DNA 的结合, 从而抑制 NF-κB 的活性 因此, 活性氧对 NF-κB 的作用并不仅仅是激活, 许多细节尚有待更深入细致的探索 活性氧在信号转导 基因调控方面还有许许多多的例子, 对上面两种转录因子的调控仅是一个范例, 限于篇幅, 不再一一枚举 3. 氮自由基 NO 的生理功能 NO 激活鸟苷酸环化酶 GC, 产生第二信使 cgmp, 进而产生广泛的生理效应 且 NO 为一小分子气体分子, 极易扩散通过生物膜, 其生物半衰期 3~5 秒, 这足以使它在细胞间传递广泛的信息 (1) 内皮依赖的血管松驰因子 : 许多血管扩张剂的扩血管效应都依赖于血管内皮细胞

125 的 NO 合成, 如乙酰胆碱 Ach ATP 缓激肽等, 它们通过 Ca 2+ 依赖的机制激活血管内皮细胞的 enos, 生成的 NO 扩散到血管平滑肌和血小板, 激活 GC, 经 cgmp 门控通道和 cgmp 依赖的蛋白激酶通路降低细胞内 Ca 2+ 浓度, 松驰血管平滑肌, 降低血压, 并抑制血小板的活性 通过此种方式, 血液内的信号被传递参与血压和血流的调控, 成为机体调控血压 血流的一种重要方式 临床上常用的硝酸酯类扩血管药的作用机制即主要在于其能在体内释出 NO (2) 神经信使分子 :1 非肾上腺能 非胆碱能 (NANC) 神经递质在支配胃肠道 盆腔内脏 气管 心血管平滑肌的自主神经系统中, 其内在神经丛的神经元多数为 NANC 神经元,NO 是这些神经元的主要递质, 参与肠蠕动 阴茎勃起 排尿节制等等许多植物性生理功能的调节 2 学习和记忆的信使分子在学习和记忆的诸多神经机制中, 海马的长时程 ( 突触效应 ) 增强机制 (long-term potentiation, LTP) 可能是其中最重要的一种, 它可以使某个刺激的突触效应持续数小时 数天甚至数周,NO 是该过程的重要信使分子之一 产生 LTP 的传入神经末梢释放谷氨酸, 经 NMDA(N-methyl-D-aspartate, N- 甲基 -D- 门冬氨酸 ) 受体通道使 Ca 2+ 内流, 产生一系列 Ca 2+ 依赖的神经生化过程 同时, 又使 Ca 2+ 钙调蛋白依赖的 enos 激活, 释放 NO,NO 扩散返回到传入神经末梢, 激活 GC, 经 cgmp 通路促进谷氨酸的进一步释放, 不断反复, 从而产生突触效应的长时程增强 (3) 免疫效应分子 : 单核吞噬细胞 白细胞等非特异免疫效应细胞中的 NOS 为诱导型 NO 合酶 (inducible NOS, inos), 可受病原菌 内毒素 TNF IL-1 等多种细胞因子的诱导, 产生大量的 inos, 其生成的 NO 在 nmol NO/min mgpr 水平 (enos cnos 产生的 NO 在 pmol 水平 ), 大量生成的 NO 此时主要显示其自由基的杀伤效应, 杀菌 杀肿瘤细胞, 成为一种重要的免疫效应分子 NO 的杀伤机制可能有二, 其一是 NO 对金属离子 特别 Fe 2+ 有非常强的配位结合能力, 而体内不少酶都是金属蛋白,NO 可使其失活 其二是生成过氧亚硝基阴离子, 吞噬细胞呼吸爆发时, 常同时释放 O & 和 NO, 两者虽然 都是自由基, 但氧化毒性都不很强, 但两者却易于发生如下反应 : - 2 NO+ O - 2 & ONOO NO 2 +OH H + H 2 O 生成的 NO 2 OH 则都具有极强的氧化杀伤能力 4. 免疫保护效应中的自由基机制多形核白细胞 单核吞噬细胞 淋巴细胞激活后的呼吸爆发可产生活性氧, 活性氧和卤系强氧化物, 这些强氧化剂是上述细胞杀灭病原微生物的主要手段之一 催化这些反应的酶主要是 NADPH 氧化酶和髓过氧化物酶 (myeloperoxidase, MPO) 其主要反应如下 : H 2 O 2 Cl MPO HOCl

126 2 生成的 O 再经歧化 Fenton 等反应生成 H 2 O 2 OH 等其它活性氧, 而次氯酸 HOCl 本身则是一个强氧化剂, 活性氮由 inos 催化生成 上述强氧化剂即可杀灭病原微生物, 但也可造成组织损伤 第二节自由基损伤 氧自由基的生成通常是在机体的严格调控之下, 需氧生物都有一整套完善的自由基防御清除系统, 厌氧生物在有氧环境中不能生存, 就是因为它们缺乏一套活性氧清除系统 当活性氧的生成超出了生理范围和机体的抗氧化防卫能力时, 则会造成细胞的损伤, 这种情况被称为氧化应激 (oxidative stress) 自由基损伤被认为是组织损伤的主要分子机制之一 一 自由基对核酸的损伤 造成 DNA 损伤的主要自由基是 OH, 它对碱基 脱氧核糖 磷酸二酯键骨架都能造成损伤, 依据损伤程度的不同, 可引起突变 凋亡或坏死等 据有关专家估计,DNA 的氧化损伤频率可达 :10000 次 / 每个基因组 每个细胞 每天 1.DNA 骨架损伤 OH 通常攻击脱氧核糖的 C4 位, 造成相邻的磷酸二酯键骨架断裂, 链断裂被认为是 DNA 氧化损伤的标志之一, 其在基因突变 原癌基因的活化中可能有重要意义 因为修复 DNA 断裂的酶也会受自由基攻击而降低保真度, 造成 DNA 修复时碱基的错配或丢失, 引起突变 而某些原癌基因的活化则需要 N- 末端的丢失,OH 引起的链断裂则正可引起其 N- 末端的缺失, 如原癌基因 C-Raf-1 的活化即需 N- 末端的缺失, 将其置于 OH 生成系统中, 即可观察到原癌基因 C-Raf-1 向癌基因的转化 ; 此外, 抑癌基因 p53 受 OH 攻击失活, 也促进肿瘤的发生 2. 碱基修饰 OH 对碱基的修饰最容易发生在嘌呤的 C8 位, 形成 8- 羟基鸟嘌呤或 8- 羟基腺嘌呤, 其中以 8- 羟基鸟嘌呤最常见, 其与脱氧核糖构成的 8- 羟基鸟嘌呤脱氧核苷 (8-OhdG) 可作为 DNA 氧化损伤的重要检测指标 ; 嘧啶碱基的氧化损害常发生在 C5 C6 位, 形成相应位置的羟基嘧啶 ( 或二羟基嘧啶 ) 修饰碱基引起 DNA 复制时的碱基错配, 如胸腺嘧啶二醇常导致 T C 的转换,8- 羟基嘌呤则主要诱导 G T 转换, 碱基的错配导致突变 诱发癌变等等 3.DNA-DNA DNA- 蛋白交联 (cross-links) 自由基对 DNA 的化学修饰也可在 DNA 与 DNA 之间,DNA 与蛋白之间形成共价结合, 引起交联, 染色体破坏, 导致细胞的损伤, 甚至死亡 二 自由基对蛋白的损伤 蛋白质是自由基攻击的主要目标, 特别是肽链中的蛋氨酸 酪氨酸 色氨酸 脯氨酸 半胱氨酸 苯丙氨酸等残基, 更易受到攻击, 引起氨基酸残基的修饰 交联 肽链断裂 蛋白质变性等等 1. 蛋白质活性部位的修饰最易被氧化修饰的是巯基, 已如前述, 因此细胞内含有

127 丰富的还原型谷胱甘肽 GSH 以修复被氧化的巯基 色氨酸氧化常发生 C5 位, 生成 5- 羟色氨酸, 然后进一步氧化成犬尿氨酸 蛋氨酸的氧化则主要在 - 硫甲基位, 生成甲硫氨酸亚砜 ; 等等 各种氨基酸残基的修饰不但破坏蛋白质的活性中心, 且可引起肽链的交联 甚至断裂 2. 蛋白质分子的聚合 断裂 OH 攻击蛋白质分子常常是夺电子反应 ( 氢抽提 ), 受攻击后的蛋白质分子则在分子内部或分子间发生电子转移 ( 氢传递 ), 最后常在肽链的 α 碳原子位形成酰氨基 如酪氨酸受 OH 攻击后形成酪氨酰基, 两个酪氨酰基交联可发生在分子内, 也可发生在分子间, 形成稳定的二酚化合物 蛋白质一级结构的修饰 交联进一步引起二级 三级结构的破坏, 疏水结构暴露, 分子发生非共价聚合 蛋白质变性 α 碳原子的氢抽提也可产生肽链的断裂 ; 二级 三级结构的改变使原来被屏蔽的肽键暴露, 从而易遭受蛋白水解酶的降解, 进一步引起蛋白质分子的破坏 三 自由基对脂质的损伤 油脂久存以后会酸败, 其本质即是脂质的过氧化 生物体内含有大量的脂质, 特别是各种膜相结构含有丰富的不饱和脂肪酸, 更易遭受自由基攻击, 引起体内的脂质过氧化, 从而造成一系列的生理 生化过程的紊乱 脂质过氧化过程常是一个自由基链式反应, 生成一系列脂自由基 在多不饱和脂肪酸 (LH) 中, 与双键相连的碳原子的 C H 键较弱, 此位置易发生 OH 的夺氢氧化反应, OH 被还原成 H 2 O,LH 则成为脂自由基 L (lipid free radical), 作为自由基,L 很易与 O 2 反应生成脂过氧自由基 LOO (lipid peroxide radical) 脂过氧自由基又可与其它脂质分子 LH 形成新的脂自由基 L 和脂氢过氧化物 LOOH, LOOH 有类似于 H 2 O 2 的 Fenton 反应 : LOOH + Fe 2+ LO +OH + Fe 2+, 此反应的速度比 H 2 O 2 的 Fenton 反应速度还快几个数量级, 被称为类 Fenton 反应 上述的链式反应可引起自由基损伤的不断扩大, 但同时机体内也有不断的自由基清除反应, 以及上述各种脂质自由基的降解和终止反应, 生成各种小分子的醛 酮 羧酸等产物 丙二醛 (malondialdehyde,mda) 即是过氧化脂

128 质的一种重要分解产物, 常被用以作为脂质过氧化程度的检测指标 膜脂质的过氧化可引起细胞的多种损伤, 如 : 1. 膜结构的破坏不饱和脂肪酸的过氧化使膜的流动性降低, 破坏了膜的流动镶嵌结构, 导致膜受体 膜的离子通道 膜通透性等的功能障碍 2. 脂自由基对蛋白质分子的进攻脂自由基 L LO LOO 亦易对蛋白质分子发生夺氢氧化反应, 生成蛋白质自由基, 最终导致蛋白质分子的聚合 变性 Pr Pr L LO LOO LH LOH LOOH 3. 过氧化脂质羰基产物对蛋白质分子的交联作用过氧化脂质的降解常形成一些醛类化合物, 如丙二醛, 其两个羰基很易与蛋白质分子的氨基发生加成反应, 导致蛋白质的分子内或分子间的交联, 蛋白质凝聚 蛋白质分子中的巯基也是此类醛类化合物容易进攻的目标 此外, 脂质的过氧化还可引起脂质信号分子的生成异常 ( 如 PGs IP 3 DG) 细胞外基质中的大分子交联等等 ( 郭峻 )

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130 2

131 目录 第一章绪论 (1) 第一节生理学的定义和研究水平 (1) 一 生理学的定义 (1) 二 生理学的主要研究方法和水平 (2) 第二节机体的内环境及其稳态 (2) 第三节生理学与临床医学的关系 (3) 第四节生理功能的调节 (3) 一 神经调节 (3) 二 体液调节 (4) 三 自身调节 (4) 第五节生理功能的调节控制原理 (4) 一 非自动控制系统 (4) 二 反馈控制系统 (5) 三 前馈控制系统 (5) 第二章细胞的基本功能 (7) 第一节细胞膜的基本结构和物质转运功能 (8) 一 细胞膜的结构概述 (9) 二 物质的跨膜转运 (10) 第二节细胞的跨膜信号转导 (14) 一 G 蛋白耦联受体介导的信号转导 (15) 二 离子通道受体介导的信号转导 (16) 三 酶耦联受体介导的信号转导 (17) 第三节细胞的生物电现象 (18) 一 细胞的静息电位及其产生机制 (18) 二 动作电位及其产生机制 (20) 第四节肌细胞的收缩 (22) 一 骨骼肌 (23) 二 平滑肌 (32) 第三章血液 (35) 第一节概述 (36) 3

132 一 血液的组成和功能 (36) 二 血量与血细胞比容 (37) 三 血液的理化特性 (37) 第二节血浆 (39) 一 血浆与内环境 (39) 二 血浆的成分 (39) 第三节血细胞生理 (40) 一 红细胞 (40) 二 白细胞 (43) 三 血小板 (45) 第四节血液凝固和纤维蛋白溶解 (47) 一 血液凝固 (47) 二 纤维蛋白的溶解 (51) 第五节血型和输血 (52) 一 血型 (52) 二 输血 (54) 第四章血液循环 (56) 第一节心脏的生物电活动 (58) 一 心肌细胞的跨膜电位及其形成机制 (58) 二 心肌电生理特性 (61) 三 体表心电图 (65) 第二节心脏的泵血功能 (67) 一 心肌收缩的特点 (67) 二 心脏的泵血过程和机制 (68) 三 心脏泵血功能的评定 (71) 四 心脏泵血功能的贮备 (72) 五 影响心输出量的因素 (72) 第三节血管生理 (75) 一 各类血管的结构和功能特点 (75) 二 血流量 血流阻力和血压 (76) 三 动脉血压和动脉脉搏 (78) 四 静脉血压和静脉回心血量 (81) 五 微循环 (84) 4

133 六 组织液 (86) 七 淋巴液的生成和回流 (88) 第四节心血管活动的调节 (88) 一 神经调节 (89) 二 体液调节 (94) 三 局部血流调节 (98) 第五节器官循环 (98) 一 冠脉循环 (99) 二 肺循环 (100) 三 脑循环 (102) 第五章呼吸 (104) 第一节肺通气 (105) 一 肺通气的原理 (106) 二 肺通气功能的指标 (112) 第二节肺换气和组织换气 (115) 一 气体交换的原理 (115) 二 肺换气 (116) 三 组织换气 (117) 第三节气体在血液中的运输 (117) 一 氧的运输 (118) 二 二氧化碳的运输 (121) 第四节呼吸运动的调节 (122) 一 呼吸中枢与呼吸节律的形成 (122) 二 呼吸的反射性调节 (124) 第六章消化和吸收 (129) 第一节概述 (130) 一 消化的方式 (130) 二 消化腺的分泌和消化液的功能 (130) 三 消化管平滑肌的特性 (131) 四 消化管的神经支配及其作用 (132) 五 胃肠激素 (133) 第二节口腔内消化 (134) 5

134 一 唾液 (134) 二 咀嚼和吞咽 (135) 第三节胃内消化 (136) 一 胃液的性质 成分和作用 (136) 二 胃的运动 (138) 三 胃内消化的调节 (139) 第四节小肠内消化 (142) 一 胰液 (142) 二 胆汁 (143) 三 小肠液 (144) 四 小肠的运动 (145) 五 小肠内消化的调节 (145) 第五节大肠的功能 (147) 一 大肠液 (148) 二 大肠内细菌的活动 (148) 三 大肠的运动 (148) 四 大肠活动的调节 (148) 五 排便反射 (149) 第六节吸收 (149) 一 概述 (149) 二 主要营养物质的吸收 (150) 第七章能量代谢和体温 (154) 第一节能量代谢 (154) 一 能量的来源和去路 (154) 二 能量代谢的测定 (155) 三 影响能量代谢的因素 (156) 四 基础代谢 (160) 第二节体温及其调节 (162) 一 人的正常体温及其生理变动 (162) 二 人体的产热与散热 (163) 三 体温调节 (166) 第八章尿的生成与排出 (168) 6

135 第一节肾的功能解剖和肾血流特点 (169) 一 肾的功能解剖 (169) 二 肾血液循环的特点 (171) 第二节肾小球的滤过作用 (172) 一 滤过膜及其通透性 (173) 二 有效滤过压 (174) 三 影响肾小球滤过的因素 (175) 第三节肾小管和集合管的物质转运功能 (176) 一 肾小管和集合管的转运方式 (176) 二 肾小管和集合管的重吸收功能 (177) 三 肾小管和集合管的分泌及排泄功能 (180) 第四节尿液的浓缩和稀释 (181) 一 尿浓缩和稀释的基本过程 (182) 二 肾髓质渗透压梯度的形成和保持 (182) 第五节尿生成的调节 (185) 一 肾内调节 (185) 二 神经和体液调节 (186) 第六节血浆清除率 (188) 一 血浆清除率测定方法 (188) 二 测定血浆清除率的意义 (189) 第七节尿液排放 (190) 一 膀胱和尿道的神经支配 (190) 二 排尿反射 (191) 第九章感觉器官 (192) 第一节 概述 (193) 一 感受器与感觉器官 (193) 二 感受器的一般生理特性 (193) 第二节 视觉器官 (195) 一 眼的折光系统及其调节 (196) 二 眼的感光换能功能 (199) 三 与视觉有关的几种生理现象 (202) 第三节听觉器官 (204) 一 外耳和中耳的功能 (204) 7

136 二 内耳耳蜗的功能 (206) 三 人耳的听阈和听域 (208) 第四节前庭器官 (209) 一 椭圆囊和球囊的功能 (209) 二 半规管的功能 (210) 三 前庭反应 (211) 第五节嗅觉和味觉 (212) 一 嗅觉 (212) 二 味觉 (212) 第十章神经系统 (214) 第一节神经元活动的一般规律 (215) 一 神经元和神经纤维 (215) 二 神经元间信息传递的方式 (217) 三 神经递质和受体 (219) 四 神经的营养性作用 (223) 第二节神经胶质细胞 (224) 第三节反射活动的一般规律 (225) 一 反射与反射弧 (225) 二 中枢神经元的联系方式 (225) 三 反射弧中枢部分兴奋的传递特征 (226) 四 中枢抑制 (227) 第四节神经系统的感觉分析功能 (228) 一. 脊髓与脑干的感觉传导功能 (229) 二 丘脑及其感觉投射系统 (230) 三 大脑皮层的感觉代表区 (232) 四 痛觉 (234) 第五节神经系统对躯体运动的调节 (236) 一 脊髓对躯体运动的调节 (236) 二 脑干对躯体运动的调节 (240) 三 小脑对躯体运动的调节 (242) 四 基底神经节对躯体运动的调节 (245) 五 大脑皮层对躯体运动的调节 (246) 8

137 第六节神经系统对内脏活动的调节 (248) 一 自主神经系统的结构和功能特征 (249) 二 各级中枢对内脏活动的调节 (250) 第七节脑的高级功能 (252) 一 学习与记忆 (252) 二 大脑皮层的语言功能和一侧优势 (254) 第八节脑的电活动与觉醒睡眠 (255) 一 脑电图和皮层诱发电位 (255) 二 觉醒与睡眠 (257) 第十一章 内分泌 (260) 第一节概述 (261) 一 激素的分类 (261) 二 激素作用的一般特性 (263) 三 激素作用的机制 (264) 四 激素的分泌调节 (266) 第二节下丘脑与垂体 (267) 一 下丘脑 - 神经垂体系统 (268) 二 下丘脑 - 腺垂体系统 (268) 第三节甲状腺 (271) 一 甲状腺激素的合成与运输 (271) 二 甲状腺激素的生物学作用 (273) 三 甲状腺激素分泌的调节 (274) 第四节肾上腺 (276) 一 肾上腺皮质 (276) 二 肾上腺髓质 (278) 第五节调节钙 磷代谢的激素 (279) 一 甲状旁腺激素 (279) 二 降钙素 (280) 三 维生素 D3 (281) 第六节胰岛 (281) 一 胰岛素 (281) 二 胰高血糖素 (283) 第七节其他激素 (283) 9

138 一 松果体激素 (283) 二 前列腺素 (284) 三 瘦素 (284) 第十二章生殖与性生理 (286) 第一节男性生殖 (286) 一 睾丸的生精功能 (287) 二 睾丸的内分泌功能 (287) 三 睾丸功能的调节 (288) 第二节女性生殖 (290) 一 卵巢的生卵功能 (290) 二 卵巢的内分泌功能 (290) 三 卵巢功能的调节 (292) 第三节妊娠与分娩 (294) 第四节性生理 (297) 一 性刺激 (297) 二 性反应 (299) 三 性功能的调控 (301) 10

139 第二章细胞的基本功能 教学目的和要求 : 掌握物质通过细胞膜的基本原理 掌握细胞跨膜信号转导的途径 掌握细胞生物电活动产生和兴奋传导的原理 掌握肌肉收缩的原理以及收缩的外部表现和力学分析 内容提要 : 1. 各种物质的跨膜转运的主要方式包括 : 单纯扩散 易化扩散 主动转运 出胞与入胞 单纯扩散是指脂溶性物质通过细胞膜由高浓度侧向低浓度侧扩散的过程 水溶性小分子或离子在特殊膜蛋白的帮助下, 由细胞膜的高浓度一侧向低浓度一侧扩散的过程, 称为易化扩散, 易化扩散分两种 : 经载体易化扩散和经通道易化扩散 主动转运指细胞通过本身的耗能过程, 将物质分子或离子由膜的低浓度一侧移向高浓度一侧的过程, 主动转运分两种 : 原发性主动转运和继发性主动转运 出胞是指细胞内大分子物质以分泌囊泡的形式排出细胞的过程, 入胞是指细胞外大分子物质或物质团块借助于与细胞膜形成吞噬泡或吞饮泡的方式进入细胞的过程 2. 跨膜信号转导的路径可分为三类 :G 蛋白耦联受体介导的信号转导 离子通道受体介导的信号转导和酶耦联受体介导的信号转导 G 蛋白耦联受体介导的信号转导是通过膜受体 -G 蛋白 - 效应器 - 第二信使的活动实现的 离子通道受体介导的信号转导是通过通道的开放或关闭引起离子的跨膜转运, 改变膜电位或细胞内化学活动的改变而实现的 酶耦联受体介导的信号转导是通过改变酶耦联受体分子胞浆一侧自身酶的活性或直接影响胞浆中的酶活性而实现的 3. 静息电位是指细胞未受刺激时存在于细胞膜内外两侧的电位差, 其形成机制包括 :1K + 平衡电位 (Ek);2 膜对 K + 的通透性 ;3 钠 - 钾泵活动水平 在静息电位的基础上, 细胞受到一个适当的刺激, 膜电位会发生迅速的一过性的波动, 这种波动称为动作电位 当静息电位减小到某一临界值时, 引起细胞膜上大量钠通道开放, 触发动作电位的产生, 这种能触发动作电位的临界膜电位数值称为阈电位 动作电位的去极相主要是由于 Na + 大量 快速内流所引起, 动作电位的复极相主要是由于 K + 外流形成 4. 阈刺激或阈上刺激可引起可兴奋细胞发生动作电位, 阈下刺激虽不能触发动作电位, 但可引起局部反应, 局部反应的特点 :1 电紧张性扩布 ;2 分级性 ;3 总和效应 5. 动作电位在细胞膜的某一点产生后, 会迅速沿着细胞膜向周围传播, 这种在同一细胞上动作电位的传播称为传导 有髓神经纤维的传导呈跳跃式 6. 神经 - 肌接头处的兴奋传递过程 : 当动作电位到达神经末梢, 引起乙酰胆碱递质的释放, 乙酰胆碱通过接头间隙与终板膜上的 N2 乙酰胆碱门控通道受体结合并引起通道开放, 导致终板膜对 Na + K + 的通透性增加 ( 主要是 Na + ), 引起终板膜的去极化产生终板电位, 使邻近肌细胞膜爆发动作电位 神经 - 肌接头的传递特点 :1 单向传递 ;2 时间延搁 ; 3 易受药物和其他环境因素的影响 7. 以肌膜的电变化为特征的兴奋过程和以肌丝滑行为基础的收缩过程之间的中介过程称为兴奋 - 收缩耦联, 其基本过程包括 :1 肌膜上的动作电位沿 T 管扩布至三联管, 激活 T 管膜和肌膜上的 L 型 Ca 2+ 通道 ;2 L 型 Ca 2+ 通道的激活导致三联管膜上的 ryanodine 受体通道开放, 终池中 Ca 2+ 释放入胞浆 ;3 胞浆内 Ca 2+ 浓度的升高促使 TnC 与 Ca 2+ 结合并引发肌肉收缩 ;4 胞浆内 Ca 2+ 浓度升高同时激活肌浆网膜上的钙泵, 钙泵将胞浆中的 Ca 2+ 回收至肌浆网, 胞浆 Ca 2+ 浓度降低, 肌肉舒张 8. 影响骨骼肌收缩的因素包括 : 前负荷 后负荷和肌肉收缩能力 前负荷决定了肌肉的初长度, 在一定范围内, 肌肉收缩力量与其初长度成正变关系 后负荷是肌肉开始收缩时才遇到的阻力, 后负荷增加, 收缩张力增加而肌肉缩短速度减小 肌肉收缩能力是指与负荷无关的 决定肌肉收缩效能的内在特性, 主要取决于胞浆内 Ca 2+ 水平和肌球蛋白 ATP 酶活性 9. 收缩时肌肉长度保持不变而只有张力的增加, 这种收缩形式称为等长收缩 ; 收缩时只发生肌肉的缩短而张力保持不变, 称为等张收缩 当骨骼肌受到一次短促刺激, 出现一次 11

140 收缩和舒张, 称为单收缩 ; 当骨骼肌受到频率较高的连续刺激时, 可发生收缩的总和, 包括不完全强直收缩和完全强直收缩 细胞是人体的基本结构单位和功能单位 体内所有的生理功能和生化反应都是以细胞为基础进行的 因此, 对细胞结构和功能的研究, 能够揭示出众多的生命现象, 并对人体和组成人体各部分的功能及其发生机制有更深入的理解和认识 本章主要介绍各种细胞共有的基本功能, 包括细胞膜的物质转运功能 细胞的信号转导功能 细胞膜的生物电现象和肌细胞的收缩功能 第一节细胞膜的基本结构和物质转运功能细胞膜是包绕细胞内液的特殊的半透性膜, 是细胞的屏障, 也是细胞接受外界影响的门户 环境中的多种物理 化学成分的变化, 体内产生的激素 递质等化学性刺激物, 以及进入体内的异物 药物, 要发挥其作用, 首先要作用于细胞膜或通过细胞膜进入细胞内, 然后再影响细胞的活动 一 细胞膜的结构概述关于细胞膜的结构和组成, 目前公认的是液态镶嵌模型, 它的基本内容是 : 细胞膜以液态的脂质双分子层为基架, 在脂质双分子层中及其表面镶嵌着许多具有不同结构和功能的蛋白质 ; 有些脂质分子和膜蛋白结合着具有不同功能的糖链 ( 图 2-1) 图 2-1 细胞膜的液态镶嵌模型 ( 一 ) 脂质双分子层 12

141 膜的脂质主要由磷脂 糖脂和胆固醇组成, 其中磷脂约占总量的 50%, 糖脂约占 5%, 胆固醇不超过 30%, 此外还有少量的鞘脂, 它们以脂质双层的形式存在于细胞膜 磷脂中含量最多的是磷脂酰胆碱, 其次是磷脂酰丝氨酸 磷脂酰乙醇胺, 含量最少的是磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇 磷脂酰肌醇的含量虽少, 但在信号转导中有着重要作用 磷脂和胆固醇都是双嗜性分子, 磷脂分子中磷酸和碱基以及胆固醇分子中的羟基形成亲水性基团朝向两侧 ( 细胞外液和胞质 ), 而脂肪酸烃链形成的疏水性基团两两相对, 构成膜内部的疏水区 ( 二 ) 细胞膜蛋白细胞膜的主要功能都是通过膜蛋白来实现的 根据膜蛋白的功能, 可分为酶蛋白 转运蛋白和受体蛋白等 根据它们在膜上的存在形式, 又可分为表面蛋白 (peripheral protein) 和整合蛋白 (integral protein) 表面蛋白通过肽链中的带电氨基酸与脂质的极性基团以静电引力相结合, 或以离子链与膜中的整合蛋白相结合, 附着于膜的内表面或外表面 ( 主要是在内表面 ) 如红细胞膜内表面的骨架蛋白就是一种表面蛋白 整合蛋白是以其肽链一次或反复多次穿越脂质双层为特征的 与物质跨膜转运功能有关的功能蛋白, 如载体 (carrier) 通道(channel) 离子泵(ion pump) 和转运体 (transporter) 等, 都属于整合蛋白 ( 三 ) 细胞膜的糖类质膜中的糖类主要是一些寡糖和多糖链, 它们以共价链的形式与膜蛋白或膜脂质结合形成糖蛋白 (glycoprotein) 或糖脂 (glycolipid) 这些糖链仅存在于细胞膜的外侧 二 物质的跨膜转运各种物质进出细胞必须经过细胞膜 由于细胞膜的基架是脂质双分子层, 脂溶性的物质可以通过细胞膜, 而水溶性物质则不能直接通过细胞膜, 它们必须借助细胞膜上某些物质的帮助才能通过, 其中细胞膜结构中具有特殊功能的蛋白质起着关键性的作用 现将几种常见的跨膜物质转运形式分述如下 ( 一 ) 单纯扩散单纯扩散 (simple diffusion) 是指脂溶性物质通过细胞膜由高浓度侧向低浓度侧扩散的过程 细胞膜起到分割细胞内液和外液的屏障作用, 人体体液中的脂溶性物质 ( 如氧气 二氧化碳 一氧化氮和甾体类激素等 ) 可以单纯依靠浓度差进行跨细胞膜转运 跨膜转运物质的多少以通量表示, 其大小取决于两方面的因素 :1 细胞膜两侧该物质的浓度差, 这是物质扩散的动力, 浓度差愈大, 扩散通量也愈大 ;2 该物质通过细胞膜的难易程度, 即通透性 (permeability) 的大小, 细胞膜对该物质的通透性减小时, 扩散通量也减小 水分子虽然是极性分子, 但它的分子极小, 又不带电荷, 故膜对它是高度通透的 另外, 水分子还可通过水通道跨膜转运 ( 见下文 ) 13

142 ( 二 ) 膜蛋白介导的跨膜转运带电离子和分子量稍大的水溶性分子, 其跨膜转运需要由膜蛋白的介导才能完成 根据转运方式不同, 介导物质转运的膜蛋白可分为载体 通道 离子泵和转运体等 由它们介导的跨膜转运根据是否消耗能量又可分为被动转运 (passive transport) 和主动转运 (active transport) 两大类 1. 易化扩散水溶性小分子或离子 (Na + K + Ca 2+ 等 ) 在特殊膜蛋白的帮助下, 由细胞膜的高浓度一侧向低浓度一侧扩散的过程, 称为易化扩散 (facilitated diffusion) (1) 经载体易化扩散载体是一些贯穿脂质双层的整合蛋白, 它与溶质的结合位点随构象的改变而交替暴露于膜的两侧 当它在溶质浓度高的一侧与溶质结合后, 即引起膜蛋白质的构象变化, 把物质转运到浓度低的另一侧, 然后与物质分离 在转运中载体蛋白质并不消耗, 可以反复使用 ( 图 2-2) 经载体易化扩散具有以下特性:1 结构特异性 即某种载体只选择性地与某种物质分子作特异性结合 以葡萄糖为例, 右旋葡萄糖的跨膜通量超过左旋葡萄糖, 木糖不能被运载 2 饱和现象 即被转运物质在细胞膜两侧的浓度差超过一定限度时, 扩散通量保持恒定 其原因是由于载体蛋白质分子的数目和 / 或与物质结合的位点的数目固定, 出现饱和 3 竞争性抑制 如果一个载体可以同时运载 A 和 B 两种物质, 而且物质通过细胞膜的总量又是一定的, 那么当 A 物质扩散量增多时,B 物质的扩散量必然会减少, 这是因为量多的 A 物质占据了更多的载体的缘故 图 2-2 经载体易化扩散示意图 A: 载体蛋白质在膜的一侧与被转运物氨基酸结合 B: 载体蛋白质在膜的另一侧与氨基酸分离 的 许多重要的营养物质如葡萄糖 氨基酸 核苷酸等都是以经载体易化扩散方式进行转运 14

143 (2) 经通道易化扩散溶液中的 Na + K + Ca 2+ Cl - 等带电离子, 借助于镶嵌于膜上 的通道蛋白质的介导, 顺浓度梯度或电位梯度的跨膜扩散, 称为经通道易化扩散 中介这一 过程的膜蛋白称为离子通道 (ion channel) 离子通道是一类贯穿脂质双分子层的, 中央带 有亲水性孔道的膜蛋白 当通道开放时, 离子可经通道跨膜流动而无需与脂质双分子层相接 触, 从而使通透性很低的带电离子以极快的速度跨越质膜 离子通道的特征主要是 :1 离子选择性 即离子通道的活动表现出明显的对离子的选择 性, 每一种离子通道都对一种或几种离子有较大的通透性, 而其它离子则不易或不能通过 例如, 钾通道对 K + 和 Na + 的通透性之比约为 100:1, 乙酰胆碱受体阳离子通道对小的阳离 子如 Na + K + 都高度通透, 但不能透过 Cl - 2 门控特性 通道内具有 闸门 (gate) 样的 结构控制离子通道的开放 ( 激活 ) 或关闭 ( 失活 ), 这一过程称为门控 (gating) 根据通道 的门控机制, 离子通道又可分为电压门控通道 (voltage-gated ion channel) 化学门控通 道 (chemically-gated ion channel) 和机械门控通道 (mechanically-gated ion channel) ( 图 2-3) 动 水分子除了以单纯扩散的方式通过细胞膜以外, 也可经水通道 (water channel) 跨膜流 15

144 图 2-3 经通道易化扩散模式图 需要指出的是, 以单纯扩散和易化扩散的方式转运物质时, 物质分子移动的动力是膜两侧存在的浓度差 ( 或电位差 ) 所含的势能, 它不需要细胞另外提供能量, 因而这两类转运又称为被动转运 (passive transport) 2. 主动转运主动转运 (active transport) 指细胞通过本身的耗能过程, 将物质分子或离子由膜的低浓度一侧移向高浓度一侧的过程 主动转运按其利用能量形式的不同, 可分原发性主动转运 ( 由 ATP 直接供能 ) 和继发性主动转运 ( 由 ATP 间接供能 ) (1) 原发性主动转运原发性主动转运 (primary active transport) 是指细胞直接利用代谢产生的能量, 将物质分子或离子逆浓度梯度或电位梯度跨膜转运的过程 介导这一过程的膜蛋白称为离子泵 (ion pump) 离子泵可将细胞内的 ATP 水解为 ADP, 并利用高能磷酸 16

145 键贮存的能量完成离子的跨膜转运 由于离子泵具有水解 ATP 的能力, 所以也把它称作 ATP 酶 (ATPase) 在哺乳动物的细胞膜上普遍存在的离子泵就是钠 - 钾泵 (sodium-potassium pump), 简称钠泵 (sodium pump), 也称 Na + -K + -ATP 酶 (Na + -K + -ATPase) 钠泵蛋白质是由 α 和 β 两种亚单位组成 α- 亚单位有转运 Na + K + 和促使 ATP 分解的功能,β- 亚单位为保持酶活性所必需 ( 图 2-4) 图 2-4 钠泵主动转运示意图 细胞内 [Na + ] 升高或细胞外 [K + ] 升高时都可激活钠泵 钠泵每分解 1 分子 ATP, 可将 3 个 Na + 移出胞外, 同时将 2 个 K + 移入胞内 由于钠泵的活动, 使细胞内 K + 浓度为细胞外液 中的 30 倍, 而细胞外 Na + 的浓度为细胞内液中的 12 倍 细胞能量代谢产生的 ATP, 有 1/3 以上用于维持钠泵的活动, 因此钠泵的活动具有重要的生理意义 :1 钠泵活动造成的细胞内 高 K +, 是胞浆内许多代谢反应所必需的 2 钠泵活动能维持胞浆渗透压 细胞容积和 ph 等的相对稳定 3 钠泵活动造成的膜内外 Na + 和 K + 的浓度差, 是细胞生物电活动的前提条件 ( 见本章第三节 ) 4Na + 在膜内外的浓度差也是继发性主动转运的动力 ( 见下文 ) 另一种广泛分布的离子泵是钙泵 (calcium pump), 也称 Ca 2+ -ATP 酶 (Ca 2+ -ATPase), 它位于细胞膜 肌质网或内质网膜 细胞膜钙泵每分解 1 分子 ATP 可将 1 个 Ca 2+ 由胞质转 运至胞外, 而肌质网或内质网膜钙泵每分解 1 分子 ATP 可将 2 个 Ca 2+ 从胞质转运至肌质网 或内质网内 生物体内除钠泵和钙泵外, 还有许多其它的生物泵, 常以被它转运的物质命名 例如转 运 I - 的碘泵 转运 H + 的质子泵等 这些生物泵活动时, 细胞要为生物泵的运转提供能量, 17

146 而能量来源于细胞的代谢过程, 所以它与细胞的代谢紧密相关 如果细胞代谢障碍, 生物泵 的功能就会受到影响 (2) 继发性主动转运许多物质在进行逆浓度梯度或电位梯度的跨膜转运时, 所需的 能量并不直接伴随供能物质 ATP 的分解, 而是来自 Na + 在膜两侧的浓度势能差, 后者是钠泵 利用分解 ATP 释放能量建立的, 这种间接利用 ATP 能量的主动转运过程称为继发性主动转运 (secondary active transport) 葡萄糖和氨基酸在小肠粘膜上皮处的吸收以及它们在肾小 管上皮处的重吸收, 甲状腺上皮细胞的聚碘,Na + / Ca 2+ 交换,Na + K + Cl - 同向转运等生理 过程, 均属于继发性主动转运 ( 图 2-5) 如果被转运的离子或分子都向同一方向运动, 称 为同向转运 (symport), 相应的转运体也称为同向转运体 (symporter); 如果被转运的离子或 分子彼此向相反方向运动, 称为反向转运 (antiport) 或交换 (exchange), 相应的转运体也称 为反向转运体 (antiporter) 或交换体 (exchanger) 图 2-5 两种继发性主动转运模式同向转运 : 被转运物质的方向与提供势能差物质 Na + 的转运方向相同逆向转运 : 被转运物质的方向与提供势能差物质 Na + 的转运方向相反 葡萄糖同向转运体位于肠粘膜上皮细胞面向肠腔的顶膜, 是一个由 664 个氨基酸组成 的 具有 12 个跨膜片段的糖蛋白, 在上皮细胞面向组织液的基侧膜, 有钠泵和葡萄糖载体 Na + / 葡萄糖同向转运体在葡萄糖继发性主动转运过程中具有重要作用 由于钠泵的活动, 造 成细胞内低 Na +, 并在顶膜区的膜内外形成 Na + 的浓度差 膜上的同向转运体则利用 Na + 的 浓度势能, 将肠腔中的与葡萄糖一起转运至上皮细胞内 这一过程中的转运是顺浓度梯度, 18

147 是转运过程的驱动力, 而葡萄糖分子的逆浓度梯度转运是间接利用钠泵分解 ATP 释放的能量 完成的 如果利用药物抑制钠泵的活动后, 葡萄糖的主动转运也就减弱甚至消失了 进入上 皮细胞的葡萄糖分子可经基侧膜上的葡萄糖载体扩散至组织液, 完成葡萄糖在肠腔中的吸收 过程 氨基酸在小肠也是以同样模式被吸收的 Na + / Ca 2+ 交换 (Na + / Ca 2+ exchange) 也是细胞膜上普遍存在的一个反向转运过程, 它是 通过称为 Na + / Ca 2+ 交换体的膜蛋白完成转运的 在大多数细胞, 交换是以 3 个 Na + 进入胞 内和 1 个 Ca 2+ 排出胞外的化学计量进行活动的 因此, 它的主要功能是利用钠泵活动造成的 膜两侧的浓度势能, 将细胞内的 Ca 2+ 排出细胞, 以维持细胞质内较低 Ca 2+ 的游离 Ca 2+ 浓度 ( 三 ) 出胞与入胞 膜蛋白可以介导水溶性小分子通过细胞膜, 但它却不能转运大分子, 如蛋白质 多聚核 苷酸等 这些大分子物质乃至物质团块需要借助于细胞膜的 运动, 以出胞 (exocytosis) 或入胞 (endocytosis) 的方式完成跨膜转运 这些过程需要细胞提供能量 出胞是指细胞内大分子物质以分泌囊泡的形式排出细胞的过程 出胞主要见于细胞的分 泌活动, 如内分泌细胞分泌激素 外分泌腺分泌酶原颗粒和粘液以及轴突末梢释放神经递质 等 各种蛋白性分泌物先在粗面内质网生物合成, 在由内质网到高尔基复合体的输送过程中, 逐渐被一层膜性结构包被, 形成分泌囊泡 当分泌活动开始时, 囊泡逐渐向质膜内侧移动, 最后囊泡膜和质膜相互接触和融合, 进而融合处破裂, 将囊泡内容物一次性排放 ( 图 2-6) 出胞过程由膜外的特殊化学信号或膜两侧电位改变引起, 使局部膜 Ca 2+ 通道开放,Ca 2+ 内流 触发囊泡的移动 融合和排放 图 2-6 大分子物质跨膜转运示意图 入胞是指细胞外大分子物质或物质团块 ( 如细菌 病毒 异物 大分子营养物质等 ) 借 助于与细胞膜形成吞噬泡或吞饮泡的方式进入细胞的过程, 并分别称为吞噬 (phagocytosis) 和吞饮 (pinocytosis) 吞噬是指物质颗粒或团块进入细胞的过程, 形成的吞噬泡直径较大 19

148 (1~2µm), 吞噬只发生在一些特殊的细胞, 如巨噬细胞 中性粒细胞等 ; 吞饮过程出现于几乎所有的细胞, 形成的的吞饮泡较小 (0.1~0.2µm) 吞饮又可分为液相入胞(fluid-phase endocytosis) 和受体介导入胞 (receptor-mediated endocytosis) 两种 液相入胞是指细胞外液及其所含的溶质连续不断地进入胞内, 是细胞本身固有的活动, 进入细胞的溶质与溶质的浓度成正比 一些特殊物质进入细胞, 是通过被转运物质与膜表面的特殊受体蛋白质相互作用而引起的, 称为受体介导入胞 被转运物质首先与膜上的受体相结合, 结合部位的膜内陷 离断, 在胞质内形成吞饮泡 在细胞内, 受体与其结合的被转运物分离, 只含有受体的小泡再与细胞膜的内侧接触 融合, 成为膜的组分, 因此, 膜受体可反复利用, 而膜的表面积也能保持相对恒定 受体介导入胞是一种非常有效的转运方式, 溶质选择性地进入细胞时, 并不同时进入较多的细胞外液, 而且溶质的浓度即使低, 也不影响有效的入胞过程 许多大分子物质都是以这种方式进入细胞的, 如结合了 Fe 2+ 的运铁蛋白 低密度脂蛋白等 第二节细胞的跨膜信号转导调节机体内各种细胞在时间和空间上有序的增殖 分化, 协调它们的代谢 功能和行为, 主要是通过细胞间数百种信号物质实现的 这些信号物质包括激素 神经递质和细胞因子等 概括它们作用方式的不同, 大体可分为两类 : 一类是疏水性的类固醇激素 维生素 D 和甲状腺激素, 它们可弥散透过细胞膜, 与胞内受体结合而发挥作用 ( 见第十一章 ); 另一类是为数更多的信号物质, 在化学上属于亲水性分子, 只能作用于细胞膜表面的受体或起受体样作用的蛋白质, 再通过细胞内一系列以蛋白质构象和功能变化为基础的级联反应来产生生物学效应 这一信号转导过程还具有信号放大功能, 使少量的细胞信号分子得以引发靶细胞显著的反应 根据细胞膜上感受信号物质的蛋白质分子的结构和功能的不同, 跨膜信号转导 (transmembrane signal transduction) 的路径大致可分为 G 蛋白耦联受体介导的信号转导 离子通道受体介导的信号转导和酶耦联受体介导的信号转导三类 一 G 蛋白耦联受体介导的信号转导 G 蛋白耦联受体介导的信号转导是通过膜受体 G 蛋白 G 蛋白效应器和第二信使等一系列存在于细胞膜和胞质中的信号分子的活动实现的 ( 一 ) 参与 G 蛋白耦联受体介导的信号转导的信号分子 1.G 蛋白耦联受体 G 蛋白耦联受体 (G protein-linked receptor) 种类繁多, 它们在分子结构上属于同一超家族, 每种受体都是由一条 7 次穿膜的肽链构成, 因而也称为 7 次跨膜受体 这类受体分子的胞外侧和跨膜螺旋内部有配体的结合部位, 并在其胞内侧有结合 G 蛋白的部位, 当受体与配体结合后, 通过构象变化结合并激活 G 蛋白 20

149 2.G 蛋白鸟苷酸结合蛋白 (guanine nucleotide-binding protein) 简称 G 蛋白 (G protein), G 蛋白的种类很多, 依 α 亚单位的不同可将其分为 4 类, 即 G s G i G q 和 G 12, 每一类又分为若干亚型 G 蛋白通常由 α β γ 三个亚单位组成, 其中 α 亚单位起催化作用 当 G 蛋白未被激活时, 它结合一分子的二磷酸鸟苷 (GDP), 同时与 β γ 亚单位结合 当 G 蛋白与激活了的受体相遇时,α 亚单位与 GDP 分离, 并与三磷酸鸟苷 (GTP) 结合, 同时 α 亚单位与 β γ 亚单位分离, 此时 G 蛋白处于激活状态 α 亚单位 -GTP 和 β-γ 亚单位均可进一步激活膜的效应器蛋白, 把信号向细胞内转导 由于 α 亚单位同时具有 GTP 酶活性, 可将与它结合的 GTP 水解生成 GDP, 并与 GDP 和 β-γ 亚单位相继结合, 形成失活型的 G 蛋白, 从而终止信号转导 3.G 蛋白效应器 G 蛋白效应器 (G protein effector) 主要指催化生成或分解第二信使的酶 G 调控的效应器酶主要有腺苷酸环化酶 (adenylyl cyclase, AC), 磷脂酶 C(phospholipase C,PLC), 磷脂酶 A 2 (phospholipase A 2,PLA 2 ), 鸟苷酸环化酶 (guanylyl cyclase,gc) 和 cgmp 磷酸二脂酶 (phosphodiesterase,pde) 这些效应器酶都是通过生成( 或分解 ) 第二信使完成细胞外信号向细胞内转导的 除此之外, 某些离子通道也可接受 G 蛋白的直接或间接 ( 通过第二信使 ) 调控 4. 第二信使第二信使 (second messenger) 是指激素 递质和细胞因子等信号分子即第一信使作用于细胞膜后产生的细胞内信号分子, 它们可把细胞外信号分子所携带的信息转入细胞内 重要的第二信使有环 - 磷酸腺苷 (cyclic adenosine monophosphate,camp), 三磷酸肌醇 (inositol triphosphate,ip 3 ), 二酰甘油 (diacylglycerol,dg) 环- 磷酸鸟苷 (cyclic guanosine monophosphate,cgmp) 和钙离子等 第二信使调节的靶蛋白主要是各种蛋白激酶和离子通道, 产生以靶蛋白构象改变为基础的级联反应和细胞功能的改变 ( 二 )G 蛋白耦联受体介导的信号转导的主要途径 G 蛋白耦联受体目前已发现 1000 多种, 而能与之发生特异性结合的配体也已发现 100 多种, 但是众多的配体与受体结合后, 仅通过为数不多的几条信号转导途径把信息转导至胞内, 并引发生物效应 ( 图 2-7) 现仅举两例加以说明: 1. 受体 -G 蛋白 -AC 途径这一途径参与调节 AC 活性的 G 蛋白有兴奋性 G 蛋白 (G s ) 和抑制性 G 蛋白 (G i ) 如果配体受体复合物与 G s 结合可激活 AC, 在 Mg 2+ 存在的条件下, 活化的 AC 使 ATP 水解产生第二信使 camp 与此相反, 如果配体受体复合物与 G i 结合可抑制 AC 的活性, 从而降低细胞内的 camp 水平 细胞的一个配体受体复合物可激活多达 100 个 G s 蛋白分子, 一个激活型的 G s 蛋白可激活一个 AC 分子, 而后者又可催化生成许多 camp, 因此细胞外的一个信号分子可经此途径诱导细胞内产生至少几百个分子 camp, 从而产生放大效应 2. 受体 -G 蛋白 -PLC 途径这一途径参与调节 PLC 活性的 G 蛋白是 G q 和 G i 许多配体与结合后, 可经 G q 和 G i 家族的某些亚型激活 PLC, 后者可将膜脂质中含量甚少的二磷酸脂酰肌醇 21

150 (phosphatidylinositol bisphosphate,pip 2 ) 迅速水解为两种第二信使第二信使 IP 3 和 DG IP 3 和 DG 分别调节胞质中的 Ca 2+ 浓度和蛋白激酶 C(protein Kinase C,PKC) 来始动细胞的功能 图 2-7 受体 -G 蛋白 - 效应器酶组成的跨膜信号转导系统示意图 二 离子通道受体介导的信号转导 离子通道受体又称促离子型受体 (ionotropic receptor), 受体蛋白本身就是离子通道 例如 N 2 型 ACh 受体 A 型 γ- 氨基丁酸受体和甘氨酸受体都是细胞膜上的化学门控通道 通 道的开放 ( 或关闭 ) 不仅涉及离子本身的跨膜转运, 而且可实现化学信号的跨膜转导, 因而 这一信号转导途径称为离子通道受体介导的信号转导 例如, 骨骼肌终板膜上 N 2 型 ACh 受 体是由 4 种亚基组成的 α α β γ δ 五聚体 ( 图 2-8), 当 N 2 型 ACh 受体的 α- 亚基与 Ach 结合后, 构象发生变化导致通道的开放, 引起 Na + 和 K + 经通道跨膜流动, 造成膜的去极化, 并以终板电位的形式将信号传给周围肌膜, 引发肌膜的兴奋和肌细胞的收缩, 从而实现 ACh 的信号跨膜转导 又如神经元细胞膜上 A 型 γ- 氨基丁酸受体与配体结合后, 导致氯通道开放, Cl - 的跨膜流动使膜超极化, 进而引起突触后神经元的抑制 电压门控通道和机械门控通道通常不称为受体, 但是事实上它们是接受电信号和机械信 号的 受体, 并通过通道的开放 关闭和离子跨膜流动的信号传递到胞内 例如, 肌细胞 T 管膜上的 L 型钙通道就是一种电压门控通道, 动作电位产生时,T 管膜的去极化可激活这 22

151 种钙通道, 它的开放不仅引起本身的 Ca 2+ 内流, 而且 Ca 2+ 内流的又作为第二信使, 进一步 激活肌质网上的钙释放通道, 引起胞质浓度的 Ca 2+ 升高和肌细胞的收缩, 从而实现电信号 ( 动作电位 ) 的跨膜转导 ; 大鼠主动脉内皮细胞受到血流切应力的刺激时, 可激活两种机械 门控通道, 即非选择性阳离子通道和 K + 选择性通道, 这两种通道的开放都有助于 Ca 2+ 进入 内皮细胞, 胞内增多 Ca 2 + 的作为第二信使可进一步激活一氧化氮合酶 (nitric oxide synthase,no), 并引发血管舒张, 从而实现机械信号 ( 血流切应力的刺激 ) 的跨膜转导 可见, 电压门控通道和机械门控通道不仅是物质 ( 离子 ) 的跨膜转运通路, 更重要的是它们 在实现体内各种电信号和机械信号的跨膜转导中起着关键的作用, 图 2-8 N- 型 ACh 门控通道的分子结构示意图 A: N- 型 ACh 门控通道的 5 个亚单位相互吸引, 包绕成一个梅花状的通道样结构 B 和 C: 在跨膜通道结构中, 各个亚单位所包含的 4 个 α- 螺旋在通道结构中的位置 23

152 三 酶耦联受体介导的信号转导酶耦联受体具有与 G 蛋白耦联受体完全不同的分子结构和特性, 这一跨膜信号转导过程不需要 G 蛋白的参与, 也没有第二信使的产生 酶耦联受体分子的胞质一侧自身具有酶的活性, 或者可直接结合并激活胞质中的酶, 并由此实现细胞外信号对细胞功能的调节 其中较重要的有以下两类受体 ( 一 ) 酪氨酸激酶受体酪氨酸激酶受体 (tyrosine kinase receptor,tkr) 的分子都是贯穿脂质双层的整合蛋白, 一般只有一个跨膜 α 螺旋, 它在膜外侧有配体的结合位点, 而伸入胞质的一端具有酪氨酸激酶的结构域, 也就是说受体与酶是同一个分子 但也有一些受体本身并不具有酶活性部位, 但可直接与胞质中的酪氨酸激酶结合 酪氨酸激酶受体一旦被激活, 由于分子构象发生改变, 可引起胞质侧酶活性部位的活化, 或导致对胞质酪氨酸激酶的结合和激活 大部分生长因子 胰岛素和一部分肽类激素都是通过酪氨酸激酶受体将信号转导至细胞内, 从而实现细胞外信号对细胞功能的调节 ( 二 ) 鸟苷酸环化酶受体鸟苷酸环化酶受体 (guanylyl cyclase receptor) 的分子只有一个跨膜 α 螺旋, 分子的 N 端位于膜外侧, 具有配体的结合位点,C 端位于膜内侧, 有鸟苷酸环化酶 (GC) 结构域 一旦配体与受体结合将激活 GC 与 AC 激活一同的是此过程不需要 G 蛋白参与 GC 使胞质内的 GTP 环化, 生成 cgmp, 后者可结合并激活依赖 cgmp 的蛋白激酶 G(proteinkinase G,PKG) PKG 与 PKA PKC 一样, 也是丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶, 通过对底物蛋白的磷酸化实现信号转导 例如心房钠尿肽就是鸟苷酸环化酶的一个重要配体, 是由心房肌合成并释放的一类多肽, 可刺激肾脏排钠利尿, 并使血管平滑肌松弛 一氧化氮 (nitric oxide,no) 也可激活鸟苷酸环化酶, 但这种鸟苷酸环化酶存在于胞质, 称为可溶性鸟苷酸环化酶 (soluble guanylyl cyclase,sgc) NO 作用于 sgc, 使胞质内 cgmp 的浓度和 PKG 活性升高, 从而引起血管平滑肌舒张等反应 ( 图 2-9) 24

153 图 2-9 血管鸟苷酸环化酶信号转导途径 第三节细胞的生物电现象当环境发生变化时, 生物体内的代谢及其外表活动将发生相应的改变, 这种改变称为生物机体的反应 (response) 能引起生物机体发生反应的各种环境变化, 统称为刺激 (stimulus) 一切具有生命活动的细胞 组织或机体对刺激都具有发生反应的能力或特性, 称为兴奋性 (excitability) 一切活组织的细胞, 不论在安静状态还是在活动过程中均表现有电的变化, 这种电变化是伴随着细胞生命活动出现的, 所以称为生物电 如神经 肌肉和腺体等组织受刺激后, 能迅速产生特殊的生物电现象 ( 如动作电位 ) 及其它反应 在传统的生理学中, 将神经 肌肉和腺体组织通称为可兴奋组织 (excitable tissue), 而且将这些可兴奋组织接受刺激后所产生的生物电反应过程及其表现, 称之为兴奋 (excitation) 生物电是一切活细胞都具有的基本生命现象 生物电已被广泛应用于医学的实验研究和临床 例如, 临床上常用的心电图 肌电图 脑电图就是用特殊仪器将心肌细胞 骨骼肌细胞 大脑神经细胞产生的电位变化, 进行检测和处理后记录的图形, 它们对相关疾病的诊断有重要的参考价值 就目前所知, 人体和各器官所表现的电现象, 是以细胞水平的生物电活动为基础 细胞水平的生物电现象主要有两种表现, 即在安静时具有的静息电位和受刺激后产生的动作电位 25

154 一 细胞的静息电位及其产生机制 ( 一 ) 细胞的静息电位静息电位 (resting potential,rp) 是指细胞未受刺激时存在于细胞膜内外两侧的电位差 ( 图 2-10) 静息电位表现为膜内电位较膜外为负, 如果规定膜外电位为 0mV, 则膜内电位都在 -10~-100mV 之间 例如, 高等哺乳动物的神经和骨骼肌细胞为 -70~-90mV, 平滑肌为 -50~-60mV, 红细胞为 -10mV 只要细胞未受到外来刺激而且保持着正常的新陈代谢, 静息电位就稳定在某一相对恒定的水平 静息电位的大小通常以负值的大小来判断, 负值越大表示膜两侧的电位差越大 例如, 从 -90mV 变化到 -70mV, 称为静息电位减小, 反之则称为静息电位增大 人们通常把静息电位存在时细胞膜内外两侧所保持的外正内负状态, 称为膜的极化 (polarization) 静息电位的增大称为超极化(hyperpolarization); 静息电位的减小称为去极化 (depolarization); 细胞膜去极化后再向静息电位方向的恢复, 称为复极化 (repolarization) 静息电位与极化是一个现象的两种表达方式, 它们都是细胞处于静息状态的标志 图 2-10 单一神经纤维静息电位和动作电位模式图 ( 二 ) 静息电位产生的机制 静息电位的产生与细胞膜内外离子的不均衡分布和细胞膜对各种离子选择性通透有关 正常时细胞内 K + 浓度高于细胞外, 细胞外 Na + 浓度高于细胞内 如果细胞膜在安静时只对 26

155 K + 有通透性, 当 K + 外流时, 膜内带负电荷的蛋白质 (A - ) 因为不能通过细胞膜而留在细胞 内, 流出膜外的 K + 所产生的外正内负的电场力, 将阻碍 K + 的继续外流, 随着 K + 外流的增加, 这种阻止 K + 外流的力量 ( 膜两侧的电位差 ) 也不断加大 当促使 K + 外流的浓度差与阻止 K + 外移的电位差的两种力量达到平衡时, 膜内外不再有 K + 的净移动, 此时膜的电位差称为 K + 的平衡电位 (K + equilibrium potential,e k ) K + 的平衡电位的数值决定于膜两侧初始存在的 K + 浓度差的大小, 它的精确数值可根据 Nernst 公式算出 (37 条件下 ): E k K K [ ] o = 60 log ( mv ) + [ ] 式中 E k 表示 K + 的平衡电位,[K + ] o 和 [K + ] i 分别表示 K + 膜外和膜内的浓度 计算的 K + 平衡电位数值与实际测得的静息电位数值非常接近, 这提示静息电位主要是 K + 由膜内向膜外扩散所造成的 为了证明此点, 在实验中人工地改变细胞外液中 K + 的浓度, 也就改变了 [K + ] O /[K + ] i 的值, 结果发现, 细胞静息电位的值也随着 K + 的改变而改变, 而且改 变的情况基本上与根据 Nernst 公式计算所得的预期值相一致 但是实测的静息电位值比理 论计算值略小, 这是因为细胞膜除了对 K + 通透性较大外, 对其他离子如 Na + 也有一定的通 透性 此外, 细胞膜钠 - 钾泵的活动也会影响静息电位 钠 - 钾泵每分解 1 分子 ATP, 可将 3 个 Na + 移出胞外, 同时将 2 个 K + 移入胞内, 结果使膜外净增加了一个正电荷, 造成膜的超 极化 总结以上静息电位的形成机制, 不难看出, 影响静息电位水平的因素主要有三个 :1 膜 外 K + 浓度, 它与膜内 K + 的浓度差决定 E k, 因而 [K + ] O 的改变会显著影响静息电位 ;2 膜对 K + 和 Na + 的相对通透性, 如对 K + 通透性增大, 静息电位也增大, 反之, 如对 Na + 的通透性增 大, 静息电位将减小 ;3 钠 - 钾泵活动的水平 + i 二 动作电位及其产生机制 ( 一 ) 细胞的动作电位在静息电位的基础上, 如果细胞受到一个适当的刺激, 膜电位会发生迅速的一过性的波动, 这种波动称为动作电位 (action potential) 不同细胞受到刺激后产生的动作电位具有不同的形态 例如, 枪乌贼大神经轴突动作电位时程仅 1ms, 而心室肌细胞动作电位时程可达几百 ms ( 图 2-10) 是细胞内电极记录的神经纤维动作电位 神经纤维在安静情况下受到一次足够强度的刺激时, 膜内的负电位迅速减小, 原有的极化状态去除 ( 即去极化 depolarization), 并变成正电位, 即膜内电位在短时间内可由原来的 -70~-90mV 变为 +50mV, 原来的内负外正变为内正外负 这样整个膜内电位变化的幅度约为 90~130mV 动作电位变化曲线的上升支, 称为去极相 动作电位上升支中零电位以上的部分, 称为超射值 但是, 由刺激所引起的这种膜内电位的倒转只是暂时的, 很快就出现膜内电位下降并恢复到刺激前原有的负电位或极化状态 ( 即复极化 repolarization), 构成了动作电位的下降支, 称为复极 27

156 相 由此可见, 动作电位是细胞膜受到刺激后在原有的静息电位基础上发生的一次膜两侧的 快速而可逆的倒转和复原 在神经纤维, 它一般在 0.5~2.0ms 间完成, 因此动作电位的曲 线呈尖锋状, 故称为锋电位 动作电位的特点 :1 全或无 (all-or-none) 现象 动作电位的产生需要一定的刺激强 度, 刺激达不到阈值, 动作电位不出现, 达到阈值后, 动作电位的幅度就达到最大值, 而继 续增大刺激强度, 动作电位的幅度不再因刺激强度的增大而继续增大 这一特征称为动作电 位的 全或无 现象 2 不衰减性传导 动作电位一旦在细胞膜的某一部位产生, 它就会立 即向整个细胞膜传布, 而且它的幅度不会因为传布距离的增加而衰减 ( 二 ) 动作电位的离子机制 在细胞静息时, 细胞膜外 Na + 浓度大于膜内,Na + 有向膜内扩散的趋势, 而且静息时膜 内外的电场力也吸引 Na + 向膜内移动 ; 但是, 由于静息时膜上的 Na + 通道多数处于关闭状态, 膜对 Na + 相对不通透, 因此 Na + 不可能大量内流 当细胞受到一个阈刺激 ( 或阈上刺激 ) 时, 膜上的钠通道被激活, 有少量的 Na + 内流, 引起细胞膜轻度去极化 当膜电位去极化至某一 临界电位时, 电压门控式 Na + 通道开放, 此时膜对 Na + 的通透性突然增大, 并且超过了膜对 K + 的通透性,Na + 迅速大量内流, 使膜发生更强的去极化 较强的去极化又会使更多的钠通 道开放和形成更强的 Na + 内流, 如此便形成钠通道激活对膜去极化的正反馈 ( 又称 Na + 的再 生性循环 ), 使膜迅速去极化, 直到膜内正电位增大到足以阻止由浓度差所引起的 Na + 内流 时, 膜对 Na + 的净移动为零, 从而形成了动作电位的上升支, 此时膜两侧的电位差称为 Na + 的平衡电位 根据 Nernst 公式计算出 Na + 平衡电位的数值 (+50~+70mV), 与实际测得的动作 电位的超射值 (+40~+50mV) 非常接近 然而, 膜内电位并不停留在正电位状态, 而是很快出现动作电位的复极相, 这是因为 Na + 通道开放的时间很短, 它很快就进入失活状态, 从而使膜对 Na + 通透性变小 与此同时, 电压门控式 K + 通道开放, 膜内 K + 在浓度差和电位差的推动下又向膜外扩散, 膜内电位由正 值向负值发展, 直至恢复到静息电位水平 要复极期末, 膜电位的数值虽然已经恢复到静息电位水平, 但细胞内外离子的浓度差已 发生变化 细胞每兴奋一次或每产生一次动作电位, 细胞内 Na + 浓度的增加及细胞外 K + 浓 度的增加都是十分微小的变化, 但是足以激活细胞膜上的钠泵, 使钠泵加速运转, 逆着浓度 差将细胞内多余的 Na + 主动转运至细胞外, 将细胞外多余的 K + 主动转运入细胞内, 从而使 细胞内外的 Na + K + 离子分布恢复到原先的静息水平 ( 三 ) 动作电位的产生与阈电位 当静息电位减小到某一临界值时, 引起细胞膜上大量钠通道的开放, 触发动作电位的产 生 这种能触发动作电位的临界膜电位的数值称为阈电位 (threshold potential) 从静息电位 去极化达到阈电位是产生动作电位的必要条件 阈电位的数值约比静息电位的绝对值小 10~20mV 28

157 至此, 兴奋性的概念可表述为细胞产生动作电位的能力 一般说来, 细胞兴奋性的高低与细胞的静息电位和阈电位的差值呈反变关系, 即差值愈大, 细胞愈不容易产生动作电位, 兴奋性愈低 ; 差值愈小, 细胞愈容易产生动作电位, 兴奋性愈高 例如, 超极化时静息电位增大, 使它与阈电位之间的差值扩大 ( 图 2-11a), 受刺激时静息电位去极化较不容易达到阈电位, 所以超极化使细胞的兴奋性降低 可见, 所谓阈强度, 是作用于细胞使膜的静息电位去极化到阈电位的刺激强度 刺激引起膜去极化, 只是使膜电位从静息电位达到阈电位水平, 而动作电位的爆发则是膜电位达到阈电位后其本身进一步去极化的结果, 与施加给细胞刺激的强度没有关系 刺激强度低于阈强度的阈下刺激虽不能触发动作电位, 但它也会引起少量的 Na + 内流, 从而产生较小的去极化, 只不过这种去极化的幅度不足以使膜电位达到阈电位的水平, 而且只限受刺激的局部 这种产生于膜的局部 低于阈电位值的去极化反应称为局部反应 (local response)( 图 2-11b) 局部反应的特点是:1 电位幅度小且呈电紧张性扩布 局部反应向周围扩布时, 只能使临近膜的静息电位稍有下降, 且这种电位变化将随着扩布距离的增加而迅速减少以至消失, 这种扩布称为电紧张性扩布 (electrotonic propagation) 2 非 全或无 式 局部反应可随阈下刺激强度的增强而增大 3 总和效应 一次阈下刺激引起的一个局部反应固然不能引发动作电位, 但局部反应没有不应期, 如果多个阈下刺激引起的多个局部反应在时间上 ( 多个刺激在同一部位连续给予 ) 或空间上 ( 多个刺激同时在相邻的部位给予 ) 叠加起来, 就可能使膜的去极化达到阈电位, 从而引发动作电位 ( 图 2-11c 和 d) 因此, 动作电位可以由一次阈刺激或阈上刺激引起, 也可以由多个阈下刺激的总和引发 图 2-11 刺激引起膜超极化 局部反应及其在时间上的总和效应 a: 刺激引起膜超极化, 与阈电位的距离加大 b: 阈下刺激引起的局部反应, 达不到阈电位, 不产生动作电位 c d: 均为阈下刺激, 但 d 在 c 引起的局部反应的基础上给予, 产生总和效应, 引发动作电位 29

158 ( 四 ) 动作电位的传导动作电位一旦在细胞膜的某一点产生, 就会迅速沿着细胞膜向周围传播, 一直到整个细胞膜都产生动作电位 这种在同一细胞上动作电位的传播称为传导 (conduction) 如果发生在神经纤维上, 传导的动作电位又称为神经冲动 无髓神经纤维 ( 图 2-12A) 在膜的 a 点产生动作电位, 细胞膜出现外负内正的反极化状态 这时兴奋的 a 点膜外侧为负, 它相邻部位没有兴奋仍然为正 ; 而膜内侧则相反, 兴奋的 a 点为正, 它的相邻部位为负 这样必然会产生由正到负的电流流动 其流动的方向是, 在膜外侧, 电流由未兴奋点流向兴奋点 a; 在膜内侧, 电流则由兴奋点 a 流向未兴奋点, 这种在兴奋区域周围局部流动的电流称为局部电流 (local current) 局部电流流动的结果, 造成与 a 点相邻的未兴奋点膜内侧电位上升, 膜外侧电位下降, 即产生去极化, 这种去极化如达到阈电位水平, 即触发相邻未兴奋点爆发动作电位, 使它转变为新的兴奋点 就这样兴奋膜与相邻未兴奋膜之间产生的局部电流不断地向前移动 ( 图 2-12B), 就会使产生在 a 点的动作电位迅速地传播开去, 一直到整个细胞膜都发生动作电位为止 可见, 动作电位的传导是局部电流作用的结果 由于动作电位的传导其实是沿着细胞膜不断产生新的动作电位, 因而它的幅度和形状在长距离传导过程中保持不变 30

159 图 2-12 动作电位在神经纤维上的传导 A B: 动作电位在无髓神经纤维上依次传导 C: 动作电位在有髓神经纤维上跳跃式传导 有髓神经纤维外面包裹着一层既不导电又不允许离子通过的髓鞘 因此动作电位只能在没有髓鞘的郎飞结处进行传导 传导时, 出现在某一郎飞结的动作电位与它相邻的郎飞结之间产生局部电流, 使相邻的郎飞结兴奋, 表现为跨越一段有髓鞘的神经纤维而呈跳跃式传导 ( 图 2-12C) 加上有髓神经纤维较粗, 电阻较小, 所以它的动作电位传导速度要比无髓神经纤维快得多 例如, 人的粗大有髓神经纤维的传导速度超过 100m/s, 而一些纤细的无髓神经纤维传导速度还不到 1m/s 第四节肌细胞的收缩人体各种形式的运动, 主要是靠肌细胞的收缩活动来完成的 根据形态学特点, 可将肌肉分为横纹肌和平滑肌 ; 根据肌肉的功能特性又可将肌肉分为骨骼肌细胞 平滑肌细胞和心肌细胞三种 不同肌细胞在结构和功能上各有特点, 但从分子水平来看, 各种收缩活动都与 31

160 细胞内所含的收缩蛋白, 主要是肌球蛋白和肌动蛋白等的相互作用有关 肌细胞共同的基本 功能是收缩 骨骼肌是体内最多的组织, 约占体重的 40% 本节将对骨骼肌细胞的收缩功能 作较详细的阐述 一 骨骼肌 ( 一 ) 神经 - 肌接头处的兴奋传递如图 2-13 所示, 神经 - 肌接头 (neuromuscular junction) 是由运动神经末梢和与它接触的骨骼肌细胞膜形成的 神经 - 肌接头处是由接头前膜 (prejunctional membrane) 接头后膜 (postjunctional membrane) 和它们之间的接头间隙 (junctional cleft) 三部分组成 运动神经纤维到达骨骼肌细胞时, 其末梢失去髓鞘, 嵌入肌细胞膜, 因此, 接头前膜就是神经轴突的细胞膜 在轴突末梢的轴浆内含有很多囊泡, 囊泡的直径约为 50nm, 内含乙酰胆碱 接头后膜又称为终板膜 (endplate membrane) 是与接头前膜相对应的肌细胞膜 ( 肌膜 ), 它有规则地向细胞内陷入, 形成许多皱褶 接头前膜与接头后膜并不接触, 它们之间形成一个充满细胞外液的间隙, 即接头间隙 图 2-13 神经 - 肌接头的结构和化学传递过程示意图 1AP 到达神经轴突末梢 ;2 细胞外 Ca 2+ 进入轴突末梢 ;3 囊泡向接头前膜方向移动 ;4 囊泡与接头前膜融合并破裂, 释放乙酰胆碱 (Ach);5Ach 进入接头间隙与接头后膜上的 Ach 受体通道结合 当动作电位到达神经末梢时, 突触前膜的电压门控 Ca 2+ 通道开放, 可引起大量 Ca 2+ 由 胞外进入 一次动作电位引起的 Ca 2+ 内流, 可导致 200~300 个囊泡几乎同步地在突触前膜 以胞吐形式将其中的乙酰胆碱分子释放到突触间隙 每一个乙酰胆碱囊泡中的乙酰胆碱分子 32

161 数约为 5000~10000 个 这种以囊泡为单位的 倾囊 释放被称为量子释放 乙酰胆碱通过接头间隙到达接头后膜 ( 终板膜 ) 时, 立即与接头后膜上 N2 乙酰胆碱门 控通道受体的 2 个 α- 亚单位结合, 由此引起蛋白质内部构象发生变化, 导致通道开放, 结 果引起终板膜对 Na + K + 的通透性增加, 但 Na + 的内流远大于 K + 的外流, 因而引起终板膜 的去极化, 这一电位变化称为终板电位 (endplate potential) 终板电位以电紧张的形式 扩布, 由于一次终板电位一般都大于相邻肌膜阈电位的 3~4 倍, 所以它很容易引起邻近肌细 胞膜爆发动作电位, 也就是引起骨骼肌细胞的兴奋 终板电位不是动作电位, 属于局部反应, 不表现 全或无, 没有不应期, 具有总和效 应 它的大小与接头前膜释放的乙酰胆碱的多少呈正变关系 接头前膜释放到接头间隙中的 乙酰胆碱很快被存在于接头间隙中和接头后膜上的胆碱酯酶分解而失效, 这样就保证了一次 神经冲动仅引起一次肌细胞兴奋, 表现为一对一的关系 否则, 释放的乙酰胆碱在接头间隙 中积聚起来, 将使骨骼肌细胞持续地兴奋和收缩而发生痉挛 神经 - 肌接头的传递有以下特点 :1 单向传递 在神经 - 肌接头处兴奋的传递是单向的, 兴奋只能由运动神经末梢传向肌细胞, 这是由神经 - 肌接头的结构所决定的 ;2 时间延搁 在神经 - 肌接头处, 由于递质的释放 扩散及其与受体结合而发挥作用, 均需要时间, 兴奋 通过一个神经 - 肌接头头至少需要 0.5~1.0ms;3 易受药物和其他环境因素的影响 细胞外液 的酸碱度 温度的改变和药物或其他体液性物技的作用都可以影响神经 - 肌接头处的兴奋传 递 例如, 当细胞外液中 Ca 2+ 浓度降低或 Mg 2+ 的浓度增高时, 可减少 Ach 的释放量, 从而 影响神经 - 肌接头处兴奋的传递 ; 美洲箭毒和 α- 银环蛇毒可以与 Ach 竞争终板膜上的 N 2 - 型 Ach 受体 α- 亚单位, 从而阻断神经 - 肌接头处 Ach 的信号传递而使肌肉失去收缩能力, 具有 类似作用的药物称为肌肉松弛剂, 如三碘季胺酚 ; 重症肌无力病人的发病是由于自身免疫性 抗体破坏了终板膜上的 Ach 受体通道而引起的 ; 有机磷农药和新斯的明等胆碱脂酶抑制剂 能灭活胆碱脂酶的活性, 造成 ACh 在接头处和其他部位的大量积聚, 而使肌细胞处于持续兴 奋状态, 出现肌肉痉挛等一系列中毒症状 ( 二 ) 骨骼肌细胞的微细结构 骨骼肌细胞中含有大量的肌原纤维和高度发达的肌管系统, 它们有规律地排列, 这是骨 骼肌进行机械活动 耗能作功的基础 1. 肌原纤维和肌节如图 2-14 所示, 每个肌细胞或肌纤维都包含大量直径为 1~2μm 的纤维状结构, 称为肌原纤维 它们平行排列, 纵贯肌细胞全长 在显微镜下观察, 肌原纤 维呈明暗相间的节段, 分别称为明带和暗带 明带中央有一条与肌原纤维垂直的横线称为 Z 线 暗带中央也有一条横线称为 M 线 M 线两侧有相对透明的 H 区 两条相邻 Z 线间的节段 就是一个肌节 (sarcomere), 它是肌细胞收缩的基本功能单位 一个肌节包括一个位于中间 部位的暗带和其两侧各 1/2 的明带 肌细胞的收缩或舒张, 实际上就是肌节的缩短或延长 肌节的明带和暗带是由不同的肌丝成分组成 暗带的长度固定, 组成暗带的肌丝主要是粗肌 33

162 丝, 其中 H 区只有粗肌丝, 在 H 区的两侧各有一个粗 细肌丝重叠区 而明带的长度是可变的, 它只由细肌丝组成 由于明带的长度可变, 肌节的长度在不同情况下可变动于 1.5~3.5μm 之间, 通常在体骨骼肌安静时肌节的长度约为 2.0~2.2μm M 线是把许多粗肌丝联结在一起的结构,Z 线是联结许多细肌丝的结构 由于细肌丝的一部分伸入到相邻的粗肌丝之间, 所以粗 细肌丝有一部分重叠 图 2-14 肌原纤维结构模式图 2. 肌管系统肌原纤维间有两种不同的肌管系统, 即横管和纵管 这些肌管系统是骨 骼肌兴奋引起收缩耦联过程的形态学基础 ( 图 2-15) 横管或称 T 管 (T tubule) 位于明带 与暗带的交界处或 Z 线处, 形成包绕肌原纤维的垂直管道系统 它是由肌膜向细胞内凹陷形 成的, 所以横管实质上是肌膜的延续, 管中的液体就是细胞外液 当动作电位在肌膜产生并 传导时, 能沿横管向肌细胞内部传播 纵管又名肌浆网 (sarcoplasmic reticulum, SR), 分布在肌节的中间部位, 与肌原纤维平行排列, 它们互相连通形成网状包绕肌原纤维, 但不 与细胞外液或胞浆沟通, 只是在接近肌节两端的横管时管腔出现膨大, 称为终池 终池内 Ca 2+ 的浓度比肌浆高 1000 倍以上, 膜上有 Ca 2+ 释放通道 (Ca 2+ release channel) 或称 ryanodine 受体 (ryanodine receptor, RYR), 与其对置的 T 管膜或肌膜上有 L 型 Ca 2+ 通道 每一横管和来自两侧肌节的纵管终池, 构成所谓三联管 (triad) 结构 横管和纵管的膜在 三联管结构处并不接触, 中间被约 l2nm 的胞浆隔开 三联管的作用是把从横管传来的电信 息和终池的 Ca 2+ 释放联接起来, 完成横管向肌质网的信息传递, 它在兴奋 - 收缩耦联过程中起 34

163 重要作用 ( 见下文 ) ( 三 ) 骨骼肌收缩的分子机制骨骼肌细胞是如何收缩的? 目前用肌节中粗 细肌丝的相对滑行来说明肌肉收缩的机制 这一被称为滑行学说 (sliding theory) 的主要内容是 : 肌肉的缩短是由于肌节中细肌丝在粗肌丝之间的滑行, 而肌肉的长度和结构不变, 即当肌肉收缩时, 由 Z 线发出的细肌丝在某种力量的作用下主动向暗带中央滑动, 结果相邻的各 Z 线互相靠近, 肌节的长度变短, 从而导致肌原纤维以至整条肌纤维和整块肌肉的缩短 这一理论最直接的证据是, 肌肉收缩时暗带长度不变, 只有明带缩短, 同时可见 H 带相应变窄 图 2-15 肌管系统结构模式图 1. 肌丝的分子组成粗肌丝 (thick filament) 主要由肌球蛋白 (myosin) 所组成, 一个肌球蛋白分子包括头部和杆部两部分 在粗肌丝内肌球蛋白分子的杆部朝向 M 线, 呈束状排列, 而它的头部则规律地分布在粗肌丝表面, 形成横桥 ( 图 2-16A) 横桥的主要特性有二: 一是横桥在一定条件下可以和细肌丝上的肌动蛋白分子呈可逆性的结合, 同时出现横桥向 M 线方向的扭动 ; 二是横桥具有 ATP 酶的作用, 可以分解 ATP 而获得能量, 作为横桥扭动和作功的能量来源 所以横桥在细肌丝滑行过程中有重要作用, 是拉动细肌丝滑行的直接发动者 35

164 图 2-16 肌丝分子结构示意图 A: 肌球蛋白 B: 粗肌丝 ( 肌球蛋白在其中的排列 ) C: 细肌丝及其组成的蛋白质分子 细肌丝由三种蛋白质分子组成, 即肌动蛋白 (actin) 原肌球蛋白 (tropomyosin) 和 肌钙蛋白 (troponin)( 图 2-16C), 它们在细肌丝中的比例为 7:1:1 肌动蛋白是球形分 子, 它在细肌丝中聚合成两条链并相互缠绕形成螺旋, 构成细肌丝的主干 原肌球蛋白是长 杆状分子, 也由两条肽链形成的双螺旋分子, 其长度约相当于 7 个肌动蛋白单体, 在细肌丝 中, 原肌球蛋白分子首尾相连, 走行于肌动蛋白双螺旋的浅沟附近, 阻止了肌动蛋白分子与 横桥头部的结合, 在肌肉收缩中起调节作用 每个原肌球蛋白分子上还结合有另一个蛋白, 即肌钙蛋白, 它是由 3 个亚单位组成的球形分子 三个亚单位分别是肌钙蛋白 T(troponin T, TnT) 肌钙蛋白 I(troponin I, TnI) 和肌钙蛋白 C(troponin C, TnC) 其中 TnT 是与原肌球蛋白结合的亚单位,TnI 是与肌动蛋白结合的亚单位,TnC 是结合 Ca 2+ 的亚单位, 每个 TnC 可结合 4 个 Ca 2+, 并在结合 Ca 2+ 后启动收缩过程 肌动蛋白和肌球蛋白与肌丝滑 行有直接的关系, 故被称为收缩蛋白质 而原肌球蛋白和肌钙蛋白虽然不直接参加肌细胞收 缩, 但是它们对收缩过程起着重要的调控作用, 故合称调节蛋白 36

165 图 2-17 横桥周期 A: 肌动蛋白 ; M: 肌球蛋白 ; Pi: 磷酸 2. 收缩过程肌肉收缩的基本过程是在肌动蛋白与肌球蛋白的相互作用下, 将分解 ATP 所释放的化学能转变成机械能的过程, 能量转换发生在肌球蛋白头部与肌动蛋白之间 其主 要过程包括以下几个步骤 ( 图 2-17):1 横桥头部具有 ATP 酶活性, 在舒张状态时, 横桥结 合的 ATP 被分解, 分解产物 ADP 和无机磷酸仍留在头部, 此时的横桥处于高热能状态, 其方 位与细肌丝成 90, 并对细肌丝上的肌动蛋白具有高度亲和力, 但并不能与肌动蛋白结合, 因为肌钙蛋白与原肌球蛋白的复合物覆盖了肌动蛋白的活化位点 2 当胞浆内 Ca 2+ 浓度升高 时, 肌钙蛋白与 Ca 2+ 结合并发生变构, 导致 TnI 与肌动蛋白的结合减弱, 使原肌球蛋白向肌 动蛋白双螺旋沟槽的深部移动, 从而暴露出肌动蛋白的活化位点, 使肌球蛋白头部与肌动蛋 白结合 3 肌动蛋白与横桥头部的结合造成横桥头部构象发生改变, 使头部向 M 线方向摆动 45, 并拖动细肌丝向 M 线方向滑动, 从而将横桥头部贮存的能量 ( 来自 ATP 的分解 ) 转变 为克服负荷的张力和肌节的缩短 在横桥头部发生变构和摆动的同时, 它结合 ADP 和无机磷 酸便与之分离 4 在 ADP 解离的位点, 横桥头部马上又结合一个 ATP 分子, 结合后, 横桥头 部对肌动蛋白的亲和力明显下降, 遂使它与肌动蛋白解离 横桥头部与肌动蛋白解离后, 马上又将与它结合的 ATP 分解为 ADP 和无机磷酸, 并恢复 垂直于细肌丝的高势能状态和对肌动蛋白的高亲和力 此时, 如果胞浆内的 Ca 2+ 浓度较高, 37

166 便又可与下一个新的肌动蛋白活化位点结合, 重复上述收缩过程 如果如果胞浆内的 Ca 2+ 浓度降低到静息水平, 则 TnC 与 Ca 2+ 解离, 肌钙蛋白与原肌球蛋白复合物恢复原来的构象, 竖起的横桥头部便不能与肌动蛋白上新的位点结合, 肌肉进入舒张状态 上述横桥与肌动蛋 白结合 摆动 复位 再结合的过程, 称为横桥周期 (cross-bridge cycling) ( 四 ) 骨骼肌细胞的兴奋 - 收缩耦联 肌纤维的收缩总是在动作电位发生后数毫秒才开始出现 肌膜上的动作电位即兴奋过程 通过某种中介环节引起以肌丝滑行为基础的肌肉收缩 以肌膜的电变化为特征的兴奋过程和 以肌丝滑行为基础的收缩过程之间的中介过程称为兴奋 - 收缩耦联 (excitation-contraction coupling) Ca 2+ 在耦联过程中起了关键性作用 一般认为, 兴奋 - 收缩耦联的基本过程包括 : 1 肌膜上的动作电位沿 T 管膜扩布至三联管, 同时激活 T 管膜和肌膜上的 L 型 Ca 2+ 通道 ;2 L 型 Ca 2+ 通道的激活通过变构作用激活与之对置的三联管膜上的 RYR,RYR 是一种 Ca 2+ 释放 通道, 它的激活使终池中的 Ca 2+ 释放入胞浆, 使胞浆内的 Ca 2+ 浓度由静息时的 0.1µM 升高 至 1~10µM;3 胞浆内 Ca 2+ 浓度的升高促使 TnC 与 Ca 2+ 结合并引发肌肉收缩 ;4 胞浆内 Ca 2+ 浓度升高同时激活肌浆网膜上的钙泵, 钙泵将胞浆中的 Ca 2+ 回收至肌浆网, 遂使胞浆 Ca 2+ 浓度降低, 肌肉舒张 上述过程中, 肌细胞胞浆内增加的 Ca 2+ 绝大部分来自肌浆网内的 Ca 2+ 释放 在心肌, 由肌浆网释放的 Ca 2+ 占 80%~90%, 经 L 型钙通道内流的 Ca 2+ 占 10%~20%; 在骨骼肌的一 次单收缩中胞浆内增加的 Ca 2+ 几乎 100% 来自肌浆网 Ca 2+ 的释放 骨骼肌和心肌肌浆网释放 Ca 2+ 的机制也是不同的 在无 Ca 2+ 溶液中, 动作电位不能引起心肌肌浆网释放 Ca 2+ 和肌肉收 缩, 而骨骼肌则不受影响 这是因为心肌细胞的兴奋 - 收缩耦联过程高度依赖于细胞外的 Ca 2+ 当去极化使 L 型钙通道激活时, 经通道内流的 Ca 2+ 激活纵行肌浆网内 Ca 2+ 的释放 经 L 型钙通道内流的 Ca 2+ 触发肌浆网释放 Ca 2+ 的这一过程称为钙触发钙释放 (calcium-induced Ca 2+ release,cicr) 骨骼肌则与此不同, 它在肌膜和横管膜去极化时, 膜上的 L 型钙通道 被激活但不开放 ( 该通道完全开放需要几百 ms, 以至在动作电位持续的几百 ms 期间几乎没 有 Ca 2+ 流入 ) L 型钙通道激活时的构象变化直接作用于肌浆网膜的 RYR, 引发 RYR 释放 Ca 2+ L 型钙通道是作为一个电压敏感的信号转导分子, 而不是作为离子通道来发挥作用的 ( 图 2-18) 38

167 图 2-18 横纹肌肌浆网 Ca 2+ 释放机制 A. 钙触发钙释放机制示意图 肌膜去极化激活 L 型钙通道和内流, 后者结合于肌浆网结合位点引起钙释放通道开放 B. 电 - 机械耦联机制示意图 肌膜去极化引起 L 型钙通道电压敏感肽段的位移, 导致 拔塞 样作用的构象改变, 使肌浆网钙释放通道开放 胞浆内 Ca 2+ 浓度的下降主要依赖于肌浆网膜上的钙泵, 它每分解 1 分子 ATP 可将 2 个 Ca 2+ 由胞浆转运至肌浆网, 使胞浆 Ca 2+ 浓度下降和肌肉舒张 因此, 肌肉舒张过程也是一个 主动过程, 需要耗能 在骨骼肌舒张过程中, 胞浆中升高的几乎全部被肌浆网上的钙泵回收 ; 而在心肌, 大部分被纵行肌浆网上的钙泵回收, 另有 10%~20% 的 Ca 2+ 是经肌膜上的 Na + / Ca 2+ 交换体和钙泵排出胞外的 ( 五 ) 影响骨骼肌收缩效能的因素肌肉收缩效能 (performance of contraction) 表现为收缩时产生的张力 (force) 和 ( 或 ) 缩短程度 (shortening), 以及产生张力或缩短的速度 (velocity) 如果收缩时肌肉长度保持不变而只有张力的增加, 则这种收缩形式称为等长收缩 (isometric contraction); 收缩时只发生肌肉的缩短而张力保持不变, 称为等张收缩 (isotonic contraction) 骨骼肌的收缩效能是由收缩时承受的负荷 自身的收缩能力和总和效应等因素决定的 对骨骼肌而言, 收缩的总和是调节其收缩效能最主要的因素 1. 前负荷前负荷 (preload) 是指肌肉收缩前所承受的负荷 前负荷决定了肌肉在收缩前的长度, 亦即肌肉的初长度 (initial length), 因而初长度可以作为前负荷的观测指 39

168 标 图 2-19 肌肉等长收缩时的关系 A. 实验布置 ;B. 肌肉的长度 - 张力关系曲线, 主动张力是由总张 力和被动张力之差得到的 ;C. 肌节的长度 - 张力关系曲线 利用图 2-19A 装置在等长收缩的条件下, 可以测定在不同的肌肉长度对收缩张力的影响 当指肌肉伸展到一定长度时, 由于肌肉中结缔组织的回弹, 会产生一定的被动张力, 施加刺激后, 又可记录到一个收缩后的张力, 此张力为被动张力与肌肉主动收缩产生的张力之和, 即总张力 将肌肉固定于不同的初长度进行测量, 可得到被动张力和总张力与肌肉长度的关系曲线, 两条曲线相减, 即为主动张力与肌肉长度的关系曲线 ( 图 2-19B) 该关系曲线表明, 当前负荷逐渐增大时, 它每次收缩产生的主动张力也相应地增大, 但在超过某一限 40

169 度后, 再增加前负荷反而使主动张力起来越小, 以致最后下降至零 这种肌肉收缩时产生最大张力的前负荷或初长度, 称为最适前负荷或最适初长度 (optimal initial length) 图 2-19C 是肌节长度与主动张力关系曲线 在曲线的 d 点肌节的初长度最大, 粗 细肌丝完全不重叠, 肌肉收缩时产生的主动张力为零 ; 在曲线 c 点和 b 点, 肌节的初长度分别为 2.2µm 和 2.0µm, 粗 细肌丝处于最适重叠状态, 即所有的横桥都处于能与细肌丝重叠而有可能相互作用的位置 (M 线两侧各 0.1µm 范围内无横桥 ), 肌肉等长收缩时产生的主动张力可达最大值 ; 在曲线的 a 点, 肌节长度为 1.6µm, 细肌丝穿过 M 线, 造成两侧细肌丝相互重叠而发生卷曲, 影响了部分横桥与细肌丝的接触, 收缩张力相应减少 以上结果表明, 肌肉收缩产生的张力是与能和细肌丝接触的横桥数目成比例的, 因此, 最适肌节长度应是 2.0µm~ 2.2µm 由于整个肌肉的初长度决定了收缩前肌肉中每个肌节的长度和肌丝间的相互关系, 因此能维持最适肌节长度的肌肉初长度, 就是肌肉的最适初长度, 也即最适前负荷 处于最适初长度时, 肌肉收缩可以产生最大的主动张力 骨骼肌在体内的自然长度大致相当于它们的最适初长度 2. 后负荷后负荷 (afterload) 是指肌肉开始收缩时才遇到的负荷或阻力 在等张收缩的条件下, 测定在不同后负荷情况下肌肉收缩产生的张力和缩短速度, 可得到图 2-20A 所示的张力 - 速度曲线 该曲线表明, 随着后负荷的增加, 收缩张力增加而肌肉缩短速度减小 当后负荷增加到使肌肉不能缩短时, 肌肉可产生最大等长收缩张力 (P 0 ); 当后负荷为零时, 肌肉缩短可达最大缩短速度 (V max ) 肌肉的缩短速度取决于横桥周期的长短, 而收缩张力则取决于每瞬间与肌动蛋白结合的横桥数目 肌肉收缩的张力 - 速度关系可通过负荷对横桥周期的影响予以说明 ( 图 2-20B) 图 2-20 肌肉收缩时的张力 - 速度关系和负荷对横桥周期速率的影响 A: 张力 - 速度关系曲线 Vmax: 负荷为零时肌肉缩短的最大速度 ;P 0: 肌肉收缩的最大张力 B: 负荷对横桥周期速率的影响, 图中黑色的横桥代表与肌动蛋白结合后产生并承受张力的横 桥 较轻负荷时 ( 上图 ), 横桥头部由 90 向 45 摆动并与肌动蛋白解离的速度很快, 每瞬间处 41

170 于产生张力状态的横桥较少 ( 收缩速度较快 ); 较重负荷时 ( 下图 ), 横桥头部由 90 向 45 摆动 的速度变慢, 以至横桥周期的速率减慢, 因而每瞬间有较多数量的横桥处于产生和维持张力的 状态 ( 收缩张力较大 ) 3. 肌肉的收缩能力肌肉收缩能力 (contractility) 是指与负荷无关的 决定肌肉收缩 效能的内在特性 很显然, 肌肉收缩能力提高后, 收缩时产生的张力和 ( 或 ) 缩短, 以及产 生张力和缩短的速度都会提高, 表现为长度 - 张力曲线上移和张力 - 速度曲线右上移 肌肉收 缩能力降低会有相反的表现 肌肉这种内在的收缩特性主要取决于兴奋 - 收缩耦联期间胞浆 内 Ca 2+ 的水平和肌球蛋白 ATP 酶的活性 例如, 缺氧 酸中毒 肌肉中能源物质的缺乏, 以 及其他原因引起的兴奋 - 收缩耦联 肌肉蛋白质或横桥功能特性的改变, 都可能降低肌肉收 缩的效能 ; 而咖啡因 肾上腺素等体液因素则可能通过影响肌肉的收缩机制而提高肌肉的收 缩效能 4. 收缩的总和骨骼肌通过收缩的总和 (summation) 可以快速调节收缩的强度 总和的 发生是在神经系统的调节下完成的, 它有两种形式 : 运动单位数量的总和以及频率效应的总 和 一个脊髓前角运动神经元及其轴突分支所支配的全部肌纤维, 总称为一个运动单位 (motorunit) 运动单位的大小差别很大, 不同运动单位所包含的肌纤维数可以从几根至上 千根, 而收缩时产生的张力相差可达 50 倍 弱收缩时, 总是那些较小的运动神经元所支配 的小运动单位发生收缩 ; 随着收缩的加强, 就会有越来越多和越来越大的运动单位参加收缩, 产生的张力也随之增加 ; 舒张时, 停止放电和收缩的首先是最大的运动单位, 最后才是最小 的运动单位 骨骼肌的这种调节收缩强度的方式称为大小原则 (size principle) 显然, 弱 收缩时, 通过调节参与收缩的小运动单位的数量来改变收缩强度, 会使调节更为精细 运动神经元发放的冲动频率同样会影响骨骼肌的收缩形式和收缩强度 当骨骼肌受到一 次短促的刺激时, 可发生一次动作电位, 随后出现一次收缩和舒张, 这种形式的收缩称为单 收缩 (twitch)( 图 2-21A) 在一次单收缩中, 动作电位时程 ( 相当于绝对不应期 ) 仅 1~2ms, 而收缩过程可达几十甚至几百 ms, 因而有可能在机械收缩过程中接受新的刺激并发生兴奋 和收缩, 于是新的收缩便与上次尚未结束的收缩发生总和 当骨骼肌受到频率较高的连续刺 激时, 可出现以这种总和过程为基础的强直收缩 (tetanus)( 图 2-21B) 如果刺激频率相对 较低, 总和过程发生于舒张期, 就会出现不完全强直收缩 (incomplete tetanus); 提高刺激 频率, 使总和过程发生于收缩期, 就出现完全强直收缩 (completetetanus) 通常所说的强 直收缩是指完全强直收缩 在等长收缩条件下, 强直收缩产生的张力可达单收缩的 3~4 倍 这是由于单收缩时肌浆内 Ca 2+ 浓度升高的持续时间太短, 以致被活化的收缩蛋白尚未产生最 大张力时, 肌浆 Ca 2+ 浓度就开始下降 强直收缩时, 肌细胞连续兴奋, 使肌浆 Ca 2+ 浓度持 续升高, 收缩力达到一个稳定的最大值 在生理条件下, 支配骨骼肌的传出神经总是发生连续的冲动, 所以骨骼肌的收缩都是强 42

171 直收缩 图 2-21 刺激频率对骨骼肌收缩的影响 A. 单收缩 B. 强直收缩 二 平滑肌平滑肌 (smooth muscle) 广泛分布于人体的消化 呼吸 血管 泌尿和生殖等系统 与横纹肌不同, 平滑肌是一组异质性结构, 它们不论在形态学排列和生理学特性等方面, 都表现出明显的不一致 如在胃肠道 血管 子宫 输精管等处, 平滑肌排列成层, 而在脾和某些腺体等处则以独立成分存在 有些器官的平滑肌 ( 如胃肠道 ) 具有自发产生兴奋的特性, 而有些平滑肌则不产生自发兴奋 同一种体液因素对不同部位的平滑肌可能具有不同的作用 因此, 很难对平滑肌的基本特性作出概括, 但其在结构和生理特性方面具有某些基本的共同点 ( 一 ) 平滑肌的微细结构平滑肌细胞一般呈梭形, 直径约 2~5µm, 长度 20~500µm, 均远较骨骼肌细胞小 平滑肌细胞膜不内凹形成横小管, 但可形成烧瓶状凹陷 ; 肌质网极不发达, 其膜上钙泵的 ATP 酶活性低下, 无三联管结构 平滑肌细胞内存在着粗 细肌丝, 但排列不整齐, 因此不表现显微镜下的横纹, 也无肌节结构 粗肌丝主要由肌球蛋白组成, 粗细不均, 横桥头部的 ATP 酶活性低 细肌丝含有肌动蛋白和原肌球蛋白, 无肌钙蛋白, 但平滑肌细胞内存在着钙调蛋白, 在功能上类似于肌钙蛋白 平滑肌中细肌丝与粗肌丝之比 (12~18:1) 大大超过骨骼肌和心肌 (2:1) 在平滑肌细胞内有许多致密体, 为梭形结构, 细肌丝排列成束插入致密体, 位于两个相邻致密体之间的细肌丝中有粗肌丝重叠 据认为, 这种收缩单位类似于骨骼肌, 致密体可能起着骨骼肌中 Z 线的作用 ( 二 ) 平滑肌的分类尽管各种器官 组织的不同类型的平滑肌的特性很不相同, 但一般可根据它们的形态与 43

172 功能特性分为单单元平滑肌 (single-unit smooth muscle) 和多单元平滑肌 (multi-unit smooth muscle) 两类 但这种分类方法并不绝对, 有些平滑肌兼有这两方面的特点而难于归入某一类 单单元平滑肌或内脏平滑肌如胃肠道 子宫 输尿管等的平滑肌 这类平滑肌能自动产生节律性兴奋, 由于细胞间存在着许多缝隙连接, 兴奋可迅速传播到周围细胞, 使许多平滑肌细胞象一个单元一样进行整体性收缩, 机能上为一合体细胞 只有少量细胞受植物性神 经支配, 能对牵拉起反应而产生主动张力 多单元平滑肌 如竖毛肌 虹膜肌 睫状肌 大 气管和大血管等的平滑肌 这类平滑肌常离散分布, 一般细胞之间无直接联系, 各细胞在活 动时各自独立, 并受自主性神经纤维末梢的支配或体液因素的影响 无论哪种类型的平滑肌, 都可产生两种形式的收缩 : 时相性收缩 (phasic contraction) 和紧张性收缩 (tonic contraction) 时相性收缩是一种间断的或节律性的收缩, 如胃肠道的 蠕动就是管壁环行平滑肌的时相性收缩引起的 紧张性收缩是一种持续性的收缩活动, 如血 管张力就是血管壁平滑肌的紧张性收缩引起的 因此根据平滑肌的主要收缩形式, 又可将平 滑肌分为时相性平滑肌 (phasic smooth muscle) 和紧张性平滑肌 (tonic smooth muscle) 两 大类 ( 三 ) 平滑肌的收缩机制 实验证明, 平滑肌与横纹肌具有形状相似的长度 - 张力关系, 因而推测平滑肌内的粗 细肌丝也构成类似横纹肌肌节的结构, 并通过相互滑动来实现肌肉收缩 但是在平滑肌, 引 起兴奋 - 收缩耦联的机制和肌丝滑动的机制与横纹肌有很大的不同 平滑肌收缩时细胞内的 肌丝同样是由于肌浆内 Ca 2+ 浓度升高引起的, 但 Ca 2+ 的来源与骨骼肌不同 骨骼肌的收缩 几乎不受细胞外 Ca 2+ 浓度的影响, 肌浆内 Ca 2+ 增加的几乎全部是从肌浆网释放的 而在平 滑肌, 当细胞外 Ca 2+ 浓度降低到一定水平时, 其收缩几乎完全停止 这说明平滑肌收缩对细 胞外 Ca 2+ 的浓度依赖性很大 这是由于平滑肌 SR 不发达, 兴奋 - 收缩耦联期间增加的 Ca 2+ 有相当多的部分是经肌膜流入的, 它与由 SR 释放入肌浆的 Ca 2+ 构成平滑肌兴奋 - 收缩耦联 期间肌浆内 Ca 2+ 浓度升高的两个主要途径 平滑肌的肌丝滑行机制也不同于骨骼肌 平滑肌 的细肌丝没有肌钙蛋白, 而主要由肌动蛋白和原肌球蛋白构成 ; 粗肌丝同肌球蛋白构成, 肌 球蛋白分子与横纹肌相似, 也是由一对重链和两对轻链构成 目前比较一致的看法是, 平滑 肌收缩时, 横桥与细肌丝中肌动蛋白的结合是由肌浆中的肌球蛋白轻链激酶 (myosin light chain kinase,mlck) 使横桥头部的一对重链磷酸化引起的, 其主要过程包括 :1 肌浆内 Ca 2+ 浓度升高时,Ca 2+ 与钙调蛋白 (calmodulin,cam) 结合, 生成钙与钙调蛋白的复合物 (4 Ca 2+ CaM) 24 Ca 2+ CaM 与 MLCK 结合, 并使之激活 3 活化的 MLCK 使肌球蛋白 轻链 (myosin light chain,mlc) 磷酸化 4MLC 磷酸化引起肌球蛋白头部的构象改变, 从 而导致横桥与细肌丝肌动蛋白的结合 5 进入与横纹肌相似的横桥周期并产生张力和缩短 6 肌浆内 Ca 2+ 浓度下降时,MLCK 失活,MLC 在磷酸酶作用下脱磷酸, 横桥便与细肌丝的 44

173 肌动蛋白解离, 肌肉舒张 尽管平滑肌的收缩过程也包括类似骨骼肌的横桥周期, 但它的横桥摆动速度只有骨骼肌的 1/10~1/300, 因而收缩过程缓慢 ; 由于横桥周期较长, 横桥现肌动蛋白作用的时间也较长, 每瞬间处于结合状态的横桥数目增加, 因而能维持较高的张力 另一方面, 平滑肌收缩时能量消耗也很少 据测定, 在产生同等张力的情况下, 平滑肌收缩所需的能量只有骨骼肌的 1/10~1/300 这是因为一个横桥周期只消耗一分子 ATP, 而与周期长短无关 ( 汝海龙单绮娴 ) 复习思考题 : 1. 名词解释 : 易化扩散, 主动转运, 钠 - 钾泵, 刺激, 兴奋, 兴奋性, 静息电位, 动作电位, 阈电位, 终板电位, 兴奋 - 收缩耦联, 等长收缩, 等张收缩 2. 试比较单纯扩散与易化扩散的区别 3. 何谓钠泵? 其运转机制以及生理意义是什么? 4. 试述主要的信号跨膜转导路径, 并简述 G 蛋白耦联受体介导的信号转导过程 5. 何谓静息电位 动作电位? 其形成原理是什么? 6. 试比较局部电位与动作电位的区别 7. 试述神经 - 肌接头处的兴奋传递过程 45

174 第四章 血液循环 教学目的和要求 : 掌握心肌生物电活动及其形成原理, 掌握心肌生理特性 掌握心脏泵血的过程及原理, 心输出量及其影响因素 了解各类血管功能特点与血流动力学基本概念 掌握动脉压形成原理及影响因素 掌握静脉血流 微循环 组织液及淋巴生成和心血管活动的调节 了解器官循环 内容提要 : 1. 心室肌细胞的静息电位数值是 K + 平衡电位 少量 Na + 内流及生电性 Na + -K + 泵活动的综合反映 心室肌细胞的动作电位可分为 共五个时期 0 期形成机制 :Na + 通道开放和 Na + 内流 ;1 期机制 :Na + 通道失活, 一过性 K + 外流 ;2 期机制 : 电压门控 L 型钙通道激活引起 Ca 2+ 缓慢持久内流, 同时 K + 外流 ;3 期机制 : 钙通道失活关闭, K + 迅速外流 4 期机制 :Na + -K + 泵 Na + -Ca 2+ 交换和 Ca 2+ 泵, 恢复细胞内外离子的正常浓度梯度 2. 浦肯野细胞的动作电位 期的离子机制与心室肌细胞相似, 但在 4 期, 表现为自动去极化, 主要是由随时间而逐渐增强的内向电流 (If) 所引起 窦房结细胞的动作电位分为 共三个时期, 无明显的 1 期和 2 期,4 期自动去极化速度快于浦肯野细胞 ; 窦房结细胞的 0 期去极化是 L 型 Ca 2+ 通道激活 Ca 2+ 内流引起的 ; 随后钾通道开放 K + 外流引起 3 期 ;4 期自动去极化的机制主要是 K + 外流的进行性衰减 3. 心肌的电生理特性包括 : 兴奋性 自律性和传导性 影响兴奋性的因素有 : 静息电位或最大复极电位与阈电位之间的差距, 引起 0 期去极化的离子通道性状 心肌细胞一次兴奋过程中兴奋性的周期性变化依次为 : 有效不应期 相对不应期和超常期, 主要取决于膜离子通道的状态, 心肌细胞的有效不应期特别长 组织 细胞能够在没有外来刺激的条件下, 自动地发生节律性兴奋的特性, 称为自律性, 心脏内特殊传导组织的大多数细胞具有自律性, 其中窦房结细胞的自律性最高, 为心脏的正常起搏点 影响自律性的因素有 : 最大复极电位与阈电位之间的差距,4 期自动去极化速度 正常情况下窦房结发出的兴奋传到心房 房室交界区 房室束和左 右束支 浦肯野纤维网, 引起心室肌兴奋和收缩 其中房室交界是兴奋由心房进入心室的唯一通道, 其兴奋传导最慢, 形成房 - 室延搁, 保证房室交替兴奋和收缩 影响传导性的主要因素是动作电位 0 期去极化的速度和幅度以及邻近未兴奋膜的兴奋性 4. 心脏一次收缩和舒张, 构成一个机械活动周期, 称为心动周期 在心脏的泵血活动中, 心室起主要作用 评价心脏泵血功能的最基本指标是心输出量, 等于搏出量与心率的乘积 心输出量随机体代谢需要而增长的能力称为心力贮备 机体通过对搏出量和心率这两方面的调节来改变心输出量 影响每搏输出量的因素包括前负荷 心肌收缩能力和后负荷 5. 形成动脉血压的三个基本因素包括 : 循环系统内足够的血液充盈, 心脏射血, 外周阻力 影响动脉血压的因素 : 每搏输出量, 心率, 外周阻力, 主动脉和大动脉的弹性贮器作用, 循环血量和血管系统容积的比例 6. 右心房和胸腔内大静脉的血压称为中心静脉压, 其高低取决于心脏射血能力和静脉回心血量之间的相互关系 影响静脉回心血量的因素包括 : 循环系统平均充盈压, 心脏收缩力量, 体位改变, 骨骼肌的挤压作用, 呼吸运动 7. 微循环是指微动脉和微静脉之间的血液循环, 其最主要的功能是进行物质交换 微循环的血流通路主要有 : 迂回通路, 直捷通路, 动 - 静脉短路 微循环主要受局部代谢产物 ( 如乳酸 CO2 腺苷) 的调节 毛细血管内外的物质交换的主要方式 : 扩散, 滤过和重吸收, 吞饮 8. 决定组织液生成的有效滤过压 =( 毛细血管血压 + 组织液胶体渗透压 )-( 血浆胶体渗透压 + 组织液静水压 ) 影响组织液生成的主要因素有: 毛细血管壁的通透性, 毛细血管血压, 血浆胶体渗透压, 淋巴回流 9. 组织液进入淋巴管, 即成为淋巴液 淋巴液生成和回流的主要生理功能 : 调节血浆与组织液间的体液平衡, 回收组织液中的蛋白质, 将小肠绒毛吸收的脂肪运输入血液, 以及 46

175 清除组织中的红细胞 细菌和其他异物 10. 交感与副交感神经系统兴奋对心脏的效应相反, 分别表现为正性或负性的变时 变力和变传导作用 心血管活动最重要的反射性调节是颈动脉窦和主动脉弓压力感受性反射, 这种负反馈调节的生理意义主要是维持动脉血压的相对稳定 11. 调节心血管活动的主要体液因素有血管紧张素 II 肾上腺素 去甲肾上腺素 血管升压素和血管内皮生成的血管活性物质 ( 如前列环素 一氧化氮等舒血管物质和内皮素等缩血管物质 ) 12. 除了神经和体液调节外, 局部组织的血流量调节还存在自身调节机制, 主要通过局部代谢产物 ( 如 CO2 H + 腺苷 K + ) 调控局部微动脉和毛细血管前括约肌的活动 13. 冠脉血流量明显受心肌节律性收缩的影响, 影响冠脉血流量的重要因素是动脉舒张压的高低和心舒期的长短 心肌代谢水平是调节冠脉血流量的最重要因素 心脏和血管组成机体的循环系统, 血液在其中按一定方向周而复始地流动, 称为血液循环 (blood circulation) 血液循环的主要功能是完成体内的物质运输 运输代谢原料和代谢产物, 使机体新陈代谢不断进行 ; 体内各内分泌腺分泌的激素, 或其他体液因素, 通过血液的运输, 作用于相应的靶细胞, 实现机体的体液调节 ; 机体内环境理化特性相对稳定的维持和血液防卫功能的实现, 也都有赖于血液的不断循环流动 第一节心脏的生物电活动心脏是推动血液流动的动力器官 心房和心室不停地进行有顺序的 协调的收缩和舒张交替的活动, 是心脏实现泵血功能 推动血液循环的必要条件, 而心肌细胞的动作电位则是触发心肌收缩和泵血的动因 因此掌握心脏的生物电活动的规律, 对于理解心肌的生理特性 ( 包括电生理特性和机械特性 ) 有着重要的意义 根据组织学特点 电生理特性以及功能上的区别, 心肌细胞可分为两大类, 一类是普通的心肌细胞, 包括心房肌和心室肌, 含丰富的肌原纤维, 具有兴奋性 传导性和收缩性, 但不具有自动产生节律性兴奋的能力 ; 主要执行收缩功能, 故又称为工作细胞 另一类是一些特殊分化了的心肌细胞, 组成心脏的特殊传导系统, 其中主要包括 P 细胞和浦肯野细胞, 具有兴奋性和传导性之外, 还具有自动产生节律性兴奋的能力, 故称为自律细胞, 但它们含肌原纤维甚少 ( 或完全缺乏 ), 基本无收缩能力 ; 主要功能是产生和传播兴奋, 控制心脏的节律性活动 一 心肌细胞的跨膜电位及其形成机制心肌细胞跨膜电位的形状及其形成机制比骨骼肌和神经细胞都要复杂, 而且不同类型心肌细胞的跨膜电位不仅在幅度和持续时间上各不相同 ( 图 4-1), 形成的离子基础也有一定的差别, 这是不同类别心肌细胞在心脏整体活动过程中起着不同作用的基本原因 ( 一 ) 工作细胞的跨膜电位及其形成机制 1. 静息电位人心室肌细胞的静息电位约 -90mv 其形成机制与神经细胞 骨骼肌细 47

176 胞基本相同,K + 外流所达到的 K + 平衡电位是构成静息电位的主要成分, 另外, 少量 Na + 内 流及膜上生电性 Na + -K + 泵的活动也可影响静息电位的数值, 因此, 在心室肌细胞上实际测 得的静息电位数值是 K + 平衡电位 少量 Na + 内流及生电性 Na + -K + 泵活动的综合反映 图 4-1 不同类型心肌细胞的动作电位 图 4-2 心室肌细胞的动作电位和主要离子流 48

177 2. 动作电位心室肌细胞的动作电位复极化过程比较复杂, 持续时间较长, 整个过程 可分为 共五个时期 ( 图 4-2) (1) 去极化过程 (0 期 ) 心肌细胞在适宜的外来刺激作用下而兴奋时, 膜内电位由 静息状态下的 -90mV 迅速上升到 +30mV 左右, 即膜两侧原有的极化状态被消除并呈极化倒 转, 构成动作电位的上升支 人和哺乳动物心室肌动作电位的 0 期很短, 仅 1~2ms, 去极幅 度很大可达 120mV, 去极化的速度快, 最大速率可达 200~400V/s 0 期形成机制 : 在外来刺激作用下, 首先引起部分电压门控式 Na + 通道开放和少量 Na + 内流, 造成肌膜部分去极化, 膜电位绝对值下降 当去极化达到阈电位水平 (-70mV) 时, 膜上 Na + 通道开放概率和开放数量明显增加, 出现再生性 Na + 内流, 使膜内电位向正电性转 化, 导致细胞 0 期去极化 决定 0 期去极化的 Na + 通道是一种快通道, 它不仅激活时开放速 度快, 而且激活后很快失活, 当膜去极化达 0mV 左右时,Na + 通道就开始失活而关闭 从电 生理特性上, 尤其根据 0 期去极化的速率, 将心室肌细胞 ( 以及具有同样特征的心肌细胞 ) 称为快反应细胞, 其动作电位称为快反应电位, 以区别于以后将要介绍的慢反应细胞和慢反 应电位 (2) 复极化过程心室肌去极化达峰值后立即开始复极, 整个过程缓慢, 可分为以下 几个阶段 : 1 期 ( 快速复极初期 ): 在复极初期膜内电位由 +30mV 迅速下降到 0mV 左右, 占时约 10ms, 与 0 期构成锋电位 此期快 Na + 通道已经失活, 一种以 K + 为主要离子成分的一过性 外向电流 (I to ) 被激活, 即 K + 由细胞内流到膜外, 从而使膜迅速复极到平台期电位水平 2 期 ( 平台期 ): 此期复极过程非常缓慢, 膜内电位停滞于 0mV 左右, 记录的曲线比较 平坦, 故称为平台期, 持续约 100~150ms, 是整个动作电位持续时间长的主要原因, 也是心 肌细胞动作电位区别于神经和骨骼肌细胞动作电位的主要特征 平台期的形成是由于该期外向电流 (K + 外流 ) 和内向电流 ( 主要是 Ca 2+ 内流, 还有少 量的 Na + 内流 ) 同时存在 在平台期的早期, 外向电流和内向电流两者处于平衡状态,Ca 2+ 的内流和 K + 的外流所负载的跨膜正电荷量相当, 使膜电位稳定于 0mV 左右 ; 随后, 外向电 流逐渐增强, 内向电流逐渐减弱, 导致膜电位的缓慢复极化, 形成平台期的晚期 平台期的外向离子流是由 K + 携带的 心肌细胞膜上的 K + 通道有 I k1 I k 等多种 在静 息状态下心室肌细胞膜上 I k1 的通透性很高, 而在 0 期去极化时 I k1 的通透性显著下降,0 期 结束时,I k1 开始缓慢地和部分地恢复, 另外, 膜的去极化使 I k 激活开放,K + 外流缓慢地增 加, 细胞膜逐渐复极化 平台期的内向离子流是由 Ca 2+ 和少量的 Na + 负载的 心室肌细胞膜上存在一种电压门控 通道, 即 L(long-lasting) 型钙通道, 主要对 Ca 2+ 通透, 但也允许少量 Na + 通过 当膜去极 化达 -40mV 时被激活, 其激活 失活以及再复活所需的时间均比 Na + 通道要长, 故又称为慢 49

178 通道 该通道可被 Mn 2+ 和多种 Ca 2+ 阻断剂 ( 如维拉帕米等 ) 所阻断 3 期 ( 快速复极末期 ): 此期的细胞膜复极速度加快, 膜电位从 0mV 左右较快地下降到 -90mV, 完成复极化过程, 故又称快速复极末期, 占时约 100~150ms 3 期复极是由于 L 型 Ca 2+ 通道失活关闭, 内向离子流终止, 而外向 K + 流 (I k ) 进一步增 加, 并以再生性方式加速 3 期复极 3 期末,I k1 也参与, 导致膜电位快速复极化 4 期 ( 静息期 ): 此期心室肌细胞复极完毕, 膜电位恢复并稳定在 -90mV, 故又称静息期, 但实际上膜内外的离子分布尚未恢复, 必须把细胞内多余的 Na + 和 Ca 2+ 排出, 并摄回细胞外 的 K +, 恢复细胞内外离子的正常浓度梯度才能保持心脏正常的兴奋性 Na + 和 K + 浓度的恢 复依赖 Na + -K + 泵的作用 ; 细胞内 Ca 2+ 逆浓度梯度外运主要是通过细胞膜上的 Na + -Ca 2+ 交 换体 (Na + -Ca 2+ exchanger) 和 Ca 2+ 泵 (calcium pump) 进行的 ( 二 ) 自律细胞的跨膜电位及形成机制 自律细胞动作电位的特点是 3 期复极末膜内电位达最低水平 ( 即最大复极电位 ) 后, 进 入 4 期, 立即开始自动去极, 当去极达阈电位后引起动作电位, 这种 4 期自动去极化是产生 自动节律性兴奋的基础, 不同类型的自律细胞其跨膜电位形成机制不同 (1) 浦肯野细胞浦肯野细胞是一种快反应自律细胞, 其动作电位形状与心室肌细胞 相似, 产生的离子基础也基本相同, 但 4 期完全不同 在浦肯野细胞 4 期, 表现为自动去极 化, 主要是由随时间而逐渐增强的内向电流 (I f ) 所引起 I f 通道主要允许 Na + 通过 ( 也有少 量 K + 通过 ) 但不同于快 Na + 通道, 可被 Cs 2+ 选择性阻断, 且在动作电位 3 期复极化至 -60mV 左右时开始被激活开放, 至 -100mV 时完全激活开放 当 4 期自动去极化达到阈电位水平时, 便产生一次新的动作电位 I f 通道在膜的去极化水平达 -50mV 左右时关闭 浦肯野细胞的 4 期自动去极化速度远较窦房结为慢, 因此其自律性较窦房结为低 (2) 窦房结细胞窦房结细胞是一种慢反应自律细胞, 其跨膜电位具有许多不同于浦 肯野细胞的特征 ( 图 4-3):1 窦房结细胞的最大复极电位 (-70mV) 和阈电位 (-40mV) 均高于浦肯野细胞 ;20 期去极结束时膜内电位为 0mV 左右, 不出现明显的极化倒转 ;3 其去极化幅度小 (70mV), 时程长 (7ms 左右 ), 去极化的速率较慢 ( 约 10 V/s );4 没有 明显的复极 1 期和平台期 ;54 期自动去极速度 ( 约 0.1V/s) 快于浦肯野细胞 ( 约 0.02V/s) 去极化过程 : 窦房结细胞去极化过程为动作电位的 0 期 当膜电位由最大复极电位 (-70mV) 自动去极化达到阈电位水平 (-40mV) 时, 激活膜上的 L 型 Ca 2+ 通道, 引起 Ca 2+ 内流 (I Ca-L ), 导致 0 期去极化 由于 L 型 Ca 2+ 通道的激活和失活都较缓慢, 故窦房结细胞 的 0 期去极化过程比较缓慢, 持续时间较长 由慢 Ca 2+ 通道开放引起缓慢去极化的心肌细胞, 如窦房结细胞和房室交界区细胞, 称为慢反应细胞 (slow response cell) 它们的动作电位称 为慢反应动作电位 复极化过程 : 窦房结细胞复极化过程是动作电位的 3 期 0 期去极化达到 0mV 左右时, L 型 Ca 2+ 通道逐渐失活关闭,Ca 2+ 内流 (I Ca-L ) 减少 ; 另一方面, 在复极化的初期,I k 通道 50

179 被激活开放,K + 外流 (I k ) 逐渐增加 I Ca-L 减少和 I k 增加, 使细胞膜逐渐复极化并达到最大 复极电位 4 期自动去极化 : 机理复杂, 目前已知有以下几种跨膜离子流参与 ( 图 4-4): 1I k :K + 外流 (I k ) 进行性衰减, 这是导致窦房结细胞 4 期自动去极化的最重要的离子 基础 ;2I f : 进行性增强的内向电流 (I f );3I Ca-T : 除 L 型 Ca 2+ 通道外, 窦房结细胞还存在 T (transient) 型 Ca 2+ 通道, 其阈电位在 -50mV, 成为 4 期自动去极化后期的一个组成成分 T 型 Ca 2+ 通道可被 Ni 2+ 阻断 一般的 Ca 2+ 通道阻断剂对 I Ca-T 无阻断作用 图 4-3 心室肌 (A) 与窦房结 (B) 细胞跨膜电位的比较 图 4-4 窦房结细胞的动作电位和离子电流 51

180 二 心肌电生理特性 心肌细胞具有兴奋性 自律性 传导性和收缩性四种生理特性 其中, 收缩性是心肌以 肌丝滑行为基础的机械特性, 而兴奋性 自律性和传导性是心肌以生物电活动为基础的电生 理特性 ( 一 ) 兴奋性 心肌细胞同其它可兴奋细胞一样, 具有在刺激作用下产生动作电位能力, 即兴奋性 心 肌兴奋性的高低可用阈值作为衡量指标 阈值大则表示兴奋性低, 阈值小则兴奋性高 1. 影响兴奋性的因素 1 静息电位或最大复极电位的水平 : 静息电位或最大复极电位绝对值增大时, 距离阈电 位的差距加大, 引起兴奋所需的阈值也增大, 兴奋性降低 ; 反之, 则兴奋性增高 2 阈电位水平 : 阈电位水平上移, 与静息电位之间的差距加大, 引起兴奋所需的阈值增 大, 兴奋性降低 ; 反之, 则兴奋性增高 3Na + 通道的性状 :Na + 通道可表现为激活 失活和备用三种状态, 快反应细胞兴奋的产 生都是以 Na + 通道被激活作为前提的 Na + 通道所处的状态取决于当时的膜电位以及有关的 时间进程 当膜电位处于正常静息电位水平 -90mV 时,Na + 通道处于备用状态 此时,Na + 通道有双重特性, 一方面, 它是关闭的 ; 另一方面, 当膜电位从静息水平去极化到阈电位水 平时 (-70mV) 可被激活 开放, 导致 Na + 快速跨膜内流 Na + 通道激活后便迅速失活,Na + 通道关闭, 使 Na + 内流终止 处于失活状态的 Na + 通道不能被再次激活, 只有当膜电位恢复 到静息电位水平时,Na + 通道才重新恢复到备用状态, 此过程称为复活 Na + 通道是否处于备 用状态是心肌能否接受剌激产生动作电位的先决条件, 而正常静息电位又是决定 Na + 通道能 否处于或复活到备用状态的关键 Na + 通道在不同状态下对刺激的反应不同, 即膜的兴奋性 不同 值得指出的是, 快反应细胞产生动作电位 0 期去极化的相关离子通道是 Na + 通道, 后者 的性状可影响细胞的兴奋性 但是, 在慢反应细胞, 产生动作电位 0 期去极化的相关离子通 道是 L 型 Ca 2+ 通道, 此时,L 型 Ca 2+ 通道的性状是影响慢反应细胞兴奋性的一个因素, 而 不是 Na + 通道 2. 一次兴奋过程中兴奋性的周期性变化 : 心肌细胞每兴奋一次, 膜通道由备用状态经 历激活 失活和复活等过程, 细胞的兴奋性也发生相应的周期性改变, 其兴奋性的变化可分 为以下几个时期 ( 图 4-5) 52

181 图 4-5 心室肌动作电位期间兴奋性的变化及其与机械收缩的关系 A: 动作电位 ;B: 机械收缩 ; ERP: 有效不应期 ;RRP: 相对不应期 ;SNP: 超常期 1 有效不应期 : 心肌细胞发生一次兴奋后的短时间内, 任何强大的刺激都不能使其产生 反应, 兴奋性等于零, 这段时间称为绝对不应期 以心室肌细胞为例, 相当于去极化开始到 复极化 3 期膜电位到达 -55mV 从复极 -55mV 到复极至 -60mV 这段时间内, 足够强度的剌激 可以引起部分去极化 ( 即局部反应 ), 但不能引起可传播的动作电位, 因而实际上也不能引 起心脏兴奋和收缩 所以, 从去极化开始到复极化到 -60mV 这段时间 ( 约 200~300ms), 称 为有效不应期 (effective refractory period) 有效不应期的产生是因为 Na + 通道完全失活 ( 绝 对不应期 ) 或刚开始复活 ( 局部反应期 ), 但还远没有恢复到可以被再激活的备用状态 2 相对不应期 : 在有效不应期后, 膜电位从 -60mV 恢复到 -80mV 这段时间内, 给予阈 刺激, 心肌仍不能产生动作电位, 但用阈上刺激时, 则可产生一次新的可扩布性兴奋, 这段 时间称为相对不应期 (relative refractory period) 这一时期内,Na + 通道已逐渐复活, 但其开 放能力尚未恢复到正常水平, 此时,Na + 内流所引起的去极化速度和幅度均小于正常, 兴奋 的传导也比较慢 3 超常期 : 膜电位由 -80mV 恢复到 -90mV 这段时间,Na + 通道基本恢复至备用状态, 而 此时膜电位距阈电位的差距较小, 故兴奋性高于正常, 称为超常期 (supranormal period) 在此期内给予阈下刺激, 也可以引起可扩布的动作电位, 但其 0 期去极化的速度和幅度以及 兴奋传导的速度仍低于正常 经历了超常期后, 膜电位就恢复到静息电位水平, 兴奋性也恢复至正常 3. 兴奋性的周期性变化与收缩活动的关系 : 细胞在兴奋过程中, 兴奋性发生周期性变化, 这是可兴奋组织的共同特性 但心肌细胞的有效不应期特别长, 一直延续到机械反应的舒张 期开始之后 ( 图 4-5) 因此, 心肌在收缩期和舒张早期以前不可能再接受刺激产生第二次 53

182 兴奋和收缩 这个特点使得心肌不会产生完全强直收缩而始终作收缩和舒张相交替的活动, 保证了泵血功能的完成 正常情况下, 整个心脏是按窦房结发出的兴奋节律进行活动的 但在某些情况下, 如果心室有效不应期之后受到人工或窦房结以外的病理性异常刺激, 则可在下一个心动周期的窦房结节律性兴奋传来之前提前发生一次兴奋和收缩, 称为期前兴奋和期前收缩, 亦称早搏 期前兴奋也有它自己的有效不应期, 这样, 当紧接在期前兴奋之后的一次窦房结兴奋传到心室肌时, 常常落在期前兴奋的有效不应期内, 因而不能引起心室兴奋和收缩, 形成一次 脱失, 必须等到下一次窦房结的兴奋传到心室时才能引起心室收缩 这样, 在一次期前收缩之后往往出现一段较长的心室舒张期, 称为代偿间歇 ( 图 4-6) 图 4-6 期前收缩和代偿间歇 ( 二 ) 自动节律性组织 细胞能够在没有外来刺激的条件下, 自动地发生节律性兴奋的特性, 称为自动节律性 (autorhythmicity), 简称自律性 具有自动节律性的组织或细胞称自律组织或自律细胞 组织 细胞在每分钟内能够自动产生兴奋的次数, 即自动兴奋的频率, 是衡量自律性高低的指标 1. 自律细胞与心脏自律性的关系细胞内微电极技术证明, 心脏内特殊传导组织的大多数细胞具有自律性 而且各种自律细胞的自律性存在差别, 其中窦房结细胞自律性最高 (100 次 / 分 ), 末梢浦肯野纤维网自律性最低 (25 次 / 分 ), 而房室交界 ( 约 50 次 / 分 ) 的自律性介于两者之间 在正常情况下, 由于窦房结的自律性最高, 成为控制心脏活动的正常起搏点 (pacemaker), 窦房结引起的正常心跳节律称为窦性心律, 其他部位的自律组织虽有起搏能力, 但由于自律性低, 通常受控于窦房结的节律之下, 只起传导作用而不表现出本身的自律性, 故称为潜在起搏点 只有在某些异常情况下, 如窦房结的兴奋因传导阻滞而不能下传, 或潜在起搏点的自律性异常升高时, 潜在起搏点可以取代窦房结成为异位起搏点, 控制一部分或整个心脏的跳动, 产生异位心律, 如交界性心律和室性心律 2. 影响自律性的因素自律细胞的自动兴奋, 是 4 期自动去极化使膜电位从最大复极电位达到阈电位水平而引起的 因此, 自律性的高低, 既受最大复极电位与阈电位的差距的影响, 也取决于 4 期自动去极化的速度 ( 图 4-7) 54

183 图 4-7 影响自律性的因素 A:4 期自动去极化速度由 a 减小到 b 时, 自律性降低 B: 最大复极电位 a 达到 d 时, 或阈电位由 TP-1 升到 TP-2 时, 自律性降低 1 最大复极电位与阈电位之间的差距 : 最大复极电位绝对值减小和 ( 或 ) 阈电位下移, 均使两者之间的差距减小,4 期自动去极化达到阈电位水平所需的时间缩短, 自律性增高 ; 反之, 则自律性降低 24 期自动去极化速度 :4 期自动去极化速度与膜电位从最大复极电位水平达到阈电位 水平所需时间密切相关 ; 若去极化速度增快, 达到阈电位水平所需的时间缩短, 单位时间内 发生兴奋的次数增多, 自律性增高 ; 反之, 则自律性降低 ( 三 ) 传导性心肌在功能上是一种合胞体, 心肌细胞膜的任何部位产生的兴奋不但可 以沿整个细胞膜传播, 并且可以通过闰盘传递到另一个心肌细胞, 从而引起整块心肌的兴奋 和收缩 动作电位沿细胞膜传播的速度可作为衡量传导性的指标 1. 心脏内兴奋传播的途径和特点正常情况下窦房结发出的兴奋通过心房肌传播到整 个右心房和左心房, 尤其是沿着心房肌组成的 优势传导通路 迅速传到房室交界区, 经房室 束和左 右束支传到浦肯野纤维网, 引起心室肌兴奋, 再直接通过心室肌将兴奋由内膜侧向 外膜侧心室扩布, 引起整个心室兴奋 由于各种心肌细胞的传导性高低不等, 兴奋在心脏各 个部分传播的速度也不同 一般心房肌的传导速度较慢 ( 约为 0.4m/s), 而 优势传导通路 的传导速度较快 ( 可达 1m/s), 窦房结的兴奋可以沿着这些通路很快传播到房室交界区 在 心室, 心室肌的传导速度约为 1m/s, 而心室内传导组织的传导性却高得多, 末梢浦肯野纤 55

184 维传导速度可达 4m/s, 而且它呈网状分布于心室壁, 这样, 由房室交界传入心室的兴奋就沿着高速传导的浦肯野纤维网迅速广泛地向左右两侧心室壁传导 很明显, 这种多方位的快速传导对于保持心室的同步收缩是十分重要的 房室交界区细胞的传导性很低, 传导速度仅 0.02m/s 房室交界是正常生理状态时兴奋由心房进入心室的唯一通道, 交界区这种缓慢传导使兴奋在这里延搁一段时间 ( 称房 - 室延搁 ), 才向心室传播, 从而使心室在心房收缩完毕之后才开始收缩, 而不致于产生房室收缩重叠的现象 可以看出, 心脏内兴奋传播途径的特点和传导速度的不一致性, 对于心脏各部分有次序地 协调地进行收缩活动, 具有十分重要的意义 2. 影响传导性的因素心肌的传导性取决于它的结构特点和电生理特征 (1) 结构因素细胞直径与细胞内电阻呈反比关系, 直径小的细胞细胞内电阻大, 产生的局部电流小于粗大细胞, 兴奋传导速度也较后者缓慢 心房肌 心室肌和浦肯野细胞的直径大于窦房结和房室交界细胞, 其中末梢浦肯野细胞的直径最大 ( 在某些动物直径可达 70μm), 兴奋传导速度最快 ; 窦房结细胞直径很小 ( 约 5~10μm), 传导速度很慢 ; 而结区细胞直径更小, 传导速度最慢 (2) 生理因素心肌细胞的电生理特性是影响其传导性的主要因素 心肌细胞兴奋的传布也是通过形成局部电流实现的 因此, 可以从局部电流的形成和邻近未兴奋部位细胞膜的兴奋性来分析影响传导性的因素 1 动作电位 0 期去极化的速度和幅度 : 局部电流是兴奋部位膜 0 期去极化所引起的 0 期去极化的速度愈快, 局部电流形成愈快, 兴奋传导也愈快 另一方面,0 期去极化的幅度愈大, 兴奋和未兴奋部位之间的电位差愈大, 形成的局部电流愈强, 兴奋传导也愈快 2 邻近未兴奋膜的兴奋性 : 兴奋的传导是相邻细胞膜依次兴奋的过程 因此, 静息电位与阈电位的差距必然影响兴奋的传导, 当二者差距扩大时, 兴奋性降低, 同时, 膜去极化达阈电位水平所需的时间延长, 传导速度减慢 此外, 若邻近细胞膜的兴奋性为零, 例如已接受了一个刺激产生期前兴奋, 正处于有效不应期内, 便不可能再接受刺激产生兴奋, 导致传导阻滞 三 体表心电图在每一个心动周期中, 由窦房结发出的兴奋, 依次传向心房和心室, 引起整个心脏兴奋, 这种生物电变化可以通过周围的导电组织和体液, 传播到身体表面 用测量电极置于体表的一定部位记录到的心电变化的波形, 称为心电图 (electrocardiogram,ecg)( 图 4-8) 心电图反映心脏兴奋的产生 传导和恢复过程中的生物电变化 56

185 图 4-8 正常人心电模式图 ( 一 ) 正常心电图波形及其生理意义 1.P 波反映左右心房的去极化过程 P 波形小圆钝, 历时 0.08~0.11s, 波幅不超过 0.25mV 2.QRS 波群代表左右心室去极化过程的电位变化 典型的 QRS 波群, 包括三个紧密相连的电位波动 : 第一个向下波为 Q 波, 以后是高而尖峭的向上的 R 波, 最后是一个向下的 S 波 在不同导联中, 这三个波不一定都出现, 且波的幅度变化较大,QRS 波群历时 0.06~0.10s 代表兴奋在心室肌扩布所需的时间 3.T 波反映心室复极过程中的电位变化, 波幅为 0.1~0.8mV, 历时 s 在 R 波较高的导联中 T 波的波幅不应低于 R 波的 1/10 T 波的方向与 QRS 波的主波方向一致 4.PR 间期 ( 或 PQ 间期 ) 是指从 P 波起点到 QRS 波起点之间的时程, 为 0.12~0.20s PR 间期代表由窦房结产生的兴奋经心房 房室交界和房室束传到心室, 并引起心室开始兴奋所需要的时间, 也称为房室传导时间 房室传导阻滞时,PR 间期延长 5.QT 间期是从 QRS 波起点到 T 波终点的时程, 代表心室开始兴奋去极化到完全复极至静息状态的时间 6.ST 段是从 QRS 波终点到 T 波起点之间的线段 它代表心室已全部处于去极化状态, 各部分之间无电位差, 曲线回到基线水平 2. 心肌动作电位和心电图的关系图 4-9 表示心电图和心房 心室肌等动作电位在时间上的关系 QRS 波相当于心室肌细胞动作电位的 0 期,S-T 段相当于平台期,T 波反映 3 期复极 QRS 综合波和 T 波代表不同部位的心室肌细胞在不同时间去极化和复极化时所产 57

186 生的动作电位效应的总和 QRS 综合波的迅速电位变化, 反映去极化在心室中的快速传导 ; 由于不同心室肌细胞动作电位的时程有较大的差异, 复极过程先后不一, 故 T 波较宽 P 波 则反映心房肌细胞去极化的综合电位变化过程 图 4-9 心肌细胞动作电位与心电图的时间关系 第二节 心脏的泵血功能 心脏是具有泵血功能的循环动力装置, 是具有瓣膜结构的肌性空腔脏器 生命过程中, 心脏不断作收缩和舒张交替的活动, 舒张时接受静脉回流的血液, 收缩时把血液射入动脉, 为血液流动提供能量 通过心脏的这种节律性活动以及由此而引起的瓣膜的规律性开启和关闭, 推动血液沿单一方向循环流动 58

187 心脏活动呈周期性, 每个周期中心脏表现出以下三方面活动 :1 兴奋的产生以及兴奋向整个心脏扩布 ;2 由兴奋触发的心肌收缩和随后的舒张, 与瓣膜的启闭相配合, 造成心房和心室内压力和容积的变化, 从而推动血液流动 ;3 伴随瓣膜的启闭, 出现心音 心脏泵血作用是由心肌电活动 机械收缩和瓣膜活动三者相互联系配合才得以实现的 明确每个周期中这三者的变化和相互关系, 对于了解心脏如何实现其泵血功能, 以及它们将对心脏泵血产生什么影响, 都是非常必要的 一 心肌收缩的特点心肌细胞与骨骼肌细胞同属横纹肌, 细胞内含有由粗 细肌丝构成的与细胞长轴相平行的肌原纤维, 其收缩机制亦与骨骼肌相似 但心肌在结构和电生理特性方面不完全与骨骼肌等同, 所以, 心肌的收缩有其特殊之处 1. 对细胞外 Ca 2+ 的依赖性心肌细胞的肌浆网和终末池不如骨骼肌发达, 容量小, 贮存的 Ca 2+ 量少 心肌收缩时, 通过肌膜和横管膜从细胞外进入胞浆的 Ca 2+, 对于触发终 池内 Ca 2+ 的释放至关重要, 且终池释放的 Ca 2+ 量与胞外进入胞浆的 Ca 2+ 量呈正相关 心 肌细胞的结构和电生理特性为细胞外 Ca 2+ 进入细胞内提供方便 :(1) 心肌细胞的横管较粗, 其体积为骨骼肌细胞横管的 25 倍, 且横管内含有大量带负电荷的粘多糖, 能结合较多 Ca 2+ ; (2) 心肌细胞动作电位平台期 L 型 Ca 2+ 通道开放, 整个平台期都有 Ca 2+ 流入细胞内 收缩 结束时, 通过位于肌浆网膜上的钙泵活动, 将 Ca 2+ 主动转运到肌浆网内贮存, 同时通过肌膜 上的 Na + -Ca 2+ 交换体和钙泵的活动将 Ca 2+ 移出胞外, 使胞浆 Ca 2+ 浓度下降, 心肌细胞转为 舒张 2. 全或无 式收缩因为心脏内存在快速的特殊传导系统以及相邻细胞间由大量的 闰盘相联系, 使整个心房或心室构成功能合胞体, 心房或心室的全部心肌细胞同步地收缩, 产生最大收缩反应, 且不会因刺激强度的继续增大而增强 因此, 整块心肌收缩强度的变化 只能通过各心肌细胞的收缩强度的变化来调节, 而参加活动的肌细胞数目不会改变 3. 不发生完全强直收缩因为动作电位平台期的存在, 心肌细胞的有效不应期特别 长, 当有效不应期结束时, 该次电兴奋所引起的机械收缩活动已进入舒张早期 所以, 即便 是高频率的外部刺激作用, 心肌组织也不会发生完全性强直收缩 这一特征保证心脏交替进 行收缩和舒张活动, 有利于心室充盈和泵血 二 心脏的泵血过程和机制 ( 一 ) 心动周期的概念心脏一次收缩和舒张, 构成一个机械活动周期, 称为心动周期 (cardiac cycle) 由于心脏由心房和心室这两个功能合胞体构成, 心动周期包括心房的收缩期和舒张期以及心室的收 59

188 缩期和舒张期 心脏的活动由一连串的心动周期组合而成, 因此, 心动周期可以作为分析心脏机械活动的基本单元 心动周期持续的时间与心跳频率有关 成年人心率平均每分钟 75 次, 每个心动周期持续 0.8s 一个心动周期中, 两心房首先收缩, 持续 0.1s, 继而心房舒张, 持续 0.7s 当心房收缩时, 心室处于舒张期, 心房进入舒张期后, 心室开始收缩, 持续 0.3s, 随后进入舒张期, 占时 0.5s 心室舒张的前 0.4s 期间, 心房也处于舒张期, 这一时期称为全心舒张期 ( 图 4-10) 可见, 一次心动周期中, 心房和心室各自按一定的时程进行收缩与舒张相交替的活动, 而心房和心室两者的活动又依一定的次序先后进行, 左右两侧心房或两侧心室的活动几乎是同步的 另一方面, 无论心房或心室, 收缩期均短于舒张期 如果心率增快, 心动周期持续时间缩短, 收缩期和舒张期均相应缩短, 但舒张期缩短的比例较大 ; 因此, 心率增快时, 心肌工作的时间相对延长, 休息时间相对缩短, 这对心脏的持久活动是不利的 图 4-10 心动周期中心房心室活动的顺序和时间关系 ( 二 ) 心脏的泵血过程和机制 1. 心室的射血和充盈过程在心脏的泵血活动中, 心室起主要作用 左右心室的活动几乎同步, 其射血和充盈过程极为相似, 排血量也几乎相等 下面就以左心室为例, 说明心室的泵血过程 泵血过程包括心室将血液射入主动脉的射血过程和血液进入心室的充盈过程 ( 图 4-11) (1) 心室收缩与射血过程该过程包括等容收缩期 快速射血期和减慢射血期 1 等容收缩期 : 心房进入舒张之际, 心室即开始收缩, 室内压升高, 当压力超过房内压 60

189 时迫使房室瓣关闭, 血液因而不会流入心房 此时室内压尚低于主动脉压, 动脉瓣仍处于关闭状态 由于封闭的心室腔中充满着不可压缩的血液, 心肌的强烈收缩使室内压急剧升高, 但容积不变, 故称为等容收缩期 (period of isovolumic contraction) 持续约 0.05 秒 这段时间内心室内压急剧升高 2 快速射血期 : 心肌的收缩使室内压继续升高并超过主动脉压时, 血液就冲开主动脉瓣由心室突然射入主动脉, 即进入快速射血期 (period of rapid ejection) 此期室内压随着心室肌的强烈收缩而继续升高直到峰值, 心室容积随着血液的射出而明显减小 快速射血期历时 0.1 秒, 射出的血液量占总射血量的 2/3 左右 3 减慢射血期 : 快速射血期内已有大量的血液射入主动脉, 主动脉压相应增高, 心室容积迅速减小, 心室肌的收缩强度逐步减弱, 室内压由峰值逐步下降, 射血速度逐渐减慢, 这段时期称为减慢射血期 (period of slow ejection) 在此期, 虽然室内压已低于主动脉内压, 但心室内的血液因受到心室收缩的挤压具有较高的动能, 依其惯性作用逆着压力差继续射入主动脉 减慢射血期历时 0.15 秒 (2) 心室舒张与充盈过程心室的舒张与充盈包括等容舒张期 快速充盈期 减慢充盈期和心房收缩期 1 等容舒张期 : 心室开始舒张后, 室内压急剧下降而低于主动脉压时, 主动脉内血液的返流, 冲击主动脉瓣使其关闭 但此时心室内压仍明显高于心房内压, 房室瓣依然关闭着, 心室又成为密闭的腔 这时心室肌舒张, 室内压快速下降而容积不发生变化, 称为等容舒张期 (period of isovolumic relaxation), 历时约 秒 2 快速充盈期 : 当室内压下降到低于房内压时, 房室瓣被血液冲开, 心房和大静脉内的血液顺房室压力梯度被 抽吸 快速流入心室, 心室容积随之增大, 这一时期称为快速充盈期 (period of rapid filling) 历时 0.11 秒, 其间流入心室的血液量约占总流入量的 2/3 3 减慢充盈期 : 快速充盈期后, 心室内已有相当的充盈血量, 大静脉 房室间的压力梯度逐渐减小, 血液以较慢的速度继续流入心室, 心室容积继续增大, 称减慢充盈期 (period of slow filling), 历时 0.22 秒 4 房缩充盈期 : 在心室充盈期末, 随着血液不断流入心室, 房室间的压力趋于平衡 在此基础上, 心房开始收缩, 提高房内压, 心房内的血液继续被挤入已有相当充盈但仍处于舒张状态的心室 心房收缩期历时 0.1 秒, 其增加的心室充盈量占心室总充盈量的 10%-30% 61

190 图 4-11 犬心动周期各时相中心脏 ( 左侧 ) 内压力 容积和瓣膜等的变化 1. 心房收缩期 2. 等容收缩期 3. 快速射血期 4. 减慢射血期 5. 等容舒张期 6. 快速充盈期 7. 减慢充盈期 AO 和 AC: 分别表示主动脉瓣开启和关闭 MO 和 MC: 分别表示二尖瓣开启和关闭 (1mmHg=0.133kPa) 62

191 从以上对左心室射血和充盈过程的描述中, 可以理解泵血机制 心室肌的收缩和舒张引起室内压的升降, 是导致心房和心室之间 心室和主动脉之间压力梯度形成的基本原因, 而压力梯度又是血液流动和瓣膜启闭的直接动力 瓣膜启闭既在血液单向流动方面起关键作用, 又对室内压的急剧变化起重要作用, 没有瓣膜的配合, 等容收缩期和等容舒张期室内压的大幅度升降是不可能圆满实现的 当然瓣膜的启闭完全是被动的, 它取决于室内压的升降 总之, 心动周期中心室的收缩与舒张是主要变化, 它引起压力 瓣膜 血流和容积的改变, 决定了心脏充盈和射血的交替进行 2. 心动周期中心房压力的变化每一心动周期中, 左心房压力曲线依次出现了三个小的正向波, 即 a 波 c 波和 v 波 首先, 心房收缩, 房内压升高, 形成 a 波, 随后心房舒张, 压力又回降 以后心室收缩, 室内压升高, 室内血液推顶并关闭了房室瓣, 使瓣膜叶片向心房腔一侧凸出, 造成房内压轻度上升, 形成 c 波 随着心室射血, 体积缩小, 心底部向下移动, 房室瓣从而也被向下牵曳, 以致心房的容积趋于扩大, 房内压下降 以后, 静脉血不断流入心房, 而房室瓣尚关闭着, 血液不能进入心室, 心房内血液量不断增加, 房内压缓慢而持续地升高, 直到心室等容舒张期结束, 心房血得以进入心室为止, 由此形成的上升波称 v 波 随后房室瓣开放, 血液由心房迅速进入心室, 房内压下降 心房的压力波可沿着静脉管壁传到大静脉, 用脉搏描记仪可在颈外静脉记录到每个心动周期中的 a c v 波, 具有一定临床应用价值 3. 心音和心音图心动周期中, 心肌收缩 瓣膜启闭 血液速度改变对心血管壁的加压和减压作用 以及形成的涡流等因素引起的机械振动, 可通过周围组织传递到胸壁, 如将听诊器放在胸壁某些部位, 就可听到声音, 称为心音 若用传感器将这些机械振动转换成电信号记录下来, 便得到心音图 (phonocardiogram) 每一心动周期中, 可听到两个心音, 分别称为第一心音和第二心音 在正常人偶尔可听到第三心音和第四心音 第一心音发生在心室收缩期, 音调低, 持续时间相对较长, 是由于心室肌收缩 房室瓣关闭以及心室射出的血液冲击动脉壁引起振动而形成的, 可作为心室收缩期开始的标志 第二心音发生在心室舒张期, 频率较高, 持续时间较短, 与主动脉瓣和肺动脉瓣的关闭有关, 标志心室舒张期开始 第三心音发生在快速充盈期末, 是一种低频 低振幅的心音, 是由于心室快速充盈期末, 血流充盈减慢, 流速突然改变, 使心室壁和瓣膜发生振动而产生的 第四心音是与心房收缩有关的心室壁和瓣膜的振动所造成的, 故也称心房音 三 心脏泵血功能的评定心脏泵血功能是否正常, 是医疗实践以及实验研究工作中经常遇到的问题 因此, 用什么样的方法和指标来测量和评定心脏功能, 在理论上和实践中都是十分重要的 ( 一 ) 心脏的输出量 63

192 1. 每搏输出量与射血分数一侧心室每次收缩时射出的血量, 称为每搏输出量 (stroke volume), 简称搏出量 在静息状态下, 左心室舒张末期容积约为 125ml, 收缩末期容积约为 55ml, 搏出量为 70ml 可见每一次心跳心室内血液并没有全部射出 搏出量占心室舒张末期容积的百分比, 称为射血分数 (ejection fraction) 正常情况下, 搏出量与心室舒张末期容积是相适应的, 即当心室舒张末期容积增加时, 搏出量也相应增加, 故射血分数改变很少, 可维持在 55%~65% 在心室功能减退 心室异常扩大的情况下, 虽然搏出量可能与正常人没有明显区别, 但射血分数明显下降, 若单纯依据搏出量来评定心脏的泵血功能, 不考虑心室舒张末期容积是不全面的, 可能作出错误的判断 2. 每分输出量与心指数每分钟一侧心室泵出的血量称为每分输出量, 或称心输出量 (cardiac output), 它等于搏出量与心率的乘积 假如健康成年男性在静息状态下, 心率为 75 次 / 分, 搏出量为 70ml(60~80ml), 心输出量则为 5L/min(4.5~6.0L/min) 女性比同体重男性的心输出量约低 10%, 青年人的心输出量高于老年人 ; 心输出量在剧烈运动时可高达 25~35L/min, 而麻醉情况下则可降低到 2.5L/min 心输出量是以个体为单位计算的 身体矮小和高大者, 其新陈代谢总量并不相等, 因此, 用心输出量的绝对值作为指标进行不同个体之间心功能的比较, 是不全面的 调查资料表明, 人体静息时的心输出量, 也和基础代谢率一样, 并不与体重成正比, 而是与体表面积成正比 以单位体表面积 (m 2 ) 计算的心输出量, 称为心指数 (cardiac index) 中等身材的成年人体表面积约为 1.6~1.7 m 2, 安静和空腹情况下心输出量约 5~6L/min, 故心指数约为 3.0~3.5 L/min m 2 安静和空腹情况下的心指数, 称之为静息心指数, 是分析比较不同个体心功能时常用的评定指标 心指数随不同生理条件而异 年龄在 10 岁左右时, 静息心指数最大, 可达 4 L/min m 2 以上, 以后随年龄增长而逐渐下降 ; 到 80 岁时, 静息心指数接近于 2 L/min m 2 肌肉运动时, 心指数随运动强度的增大而成比例地增高 妊娠 情绪激动和进食时, 心指数亦增高 ( 二 ) 心脏作功量血液在心血管内流动过程中所消耗的能量, 是由心脏作功所供给的 ; 换句话说, 心脏作功所释放的能量转化为压强能和血流的动能, 血液才能循环流动 心室一次收缩所作的功, 称为每搏功, 可以用搏出的血液所增加的动能和压强能来表示 心脏射出的血液所具有的动能在整个搏功中所占比例很小, 可以忽略不计 搏出血液的压强能是指心脏将静脉内较低的血压变成动脉内较高的血压所消耗的能量 因此 : 搏功 = 搏出量 ( 平均动脉压 - 平均心房压 ) 每分功 = 搏功 心率右心室搏出量与左心室相等, 但肺动脉平均压仅为主动脉平均压的 1/6 左右, 故右心室作功量也只有左心室的 1/6 在动脉压增高的情况下, 心脏要射出与原先同等量的血液就必须加强收缩 ; 如果此时心 64

193 肌收缩的强度不变, 那么, 搏出量将会减少 这就是说, 心肌收缩释放的能量主要用于维持 血压 由此可见, 作为评定心泵血功能的指标, 心脏作功量要比单纯的心输出量更为全面 四 心脏泵血功能的贮备健康成年人静息状态下的心输出量为 5L 左右, 而强体力劳动时可达 25~30L, 为静息时的 5~6 倍, 表明健康人心脏泵血功能有相当大的储备 心输出量随机体代谢需要而增长的能力称为泵功能贮备或心力贮备 (cardiac reserve) 心力贮备取决于心率和搏出量的贮备 1. 搏出量的贮备搏出量是心室舒张末期容积和收缩末期容积之差, 搏出量贮备的变化又可分为舒张期贮备和收缩期贮备 (1) 舒张期贮备静息状态下舒张末期容积约为 125ml, 由于心肌的伸展性小, 心室不能过分扩大, 一般最大只能达到 140ml 左右, 即舒张期贮备只有 15ml 左右 (2) 收缩期贮备安静状态下舒张末期容积约为 125ml, 搏出量为 70ml, 射血后心室剩余血量 55ml 当心肌收缩能力增加时, 能射出更多的血, 使心室剩余血量不足 20ml 可见通过动用收缩期贮备, 就可使搏出量增加约 35~40ml 2. 心率的贮备心率的最大变化约为静息时心率的 2 倍 充分动用心率贮备, 就可以使心输出量增加 2~2.5 倍 在正常成人, 能使心输出量增加的最高心率为 160~180 次 / 分钟, 这就是心率贮备的上限 当进行强烈体力活动时, 由于交感 - 肾上腺系统活性增加, 主要通过动用心率贮备以及收缩期贮备 ; 另一方面由于肌肉泵的作用, 使静脉回流增加, 心舒末期的心室容积有所增大, 也动用了舒张期贮备, 使心输出量增加 坚持体育锻炼可使心肌纤维变粗, 心肌收缩能力增强, 因此收缩期贮备增加, 同时, 心率贮备也增加 这说明经常进行体育锻炼可以增进心脏健康, 提高心力贮备 五 影响心输出量的因素心输出量取决于搏出量和心率, 机体通过对搏出量和心率这两方面的调节来改变心输出量 ( 一 ) 每搏输出量的调节搏出量的多少取决于心肌收缩的强度和速度 与骨骼肌类似, 心肌收缩的强度和速度也受前负荷 后负荷和肌肉收缩能力的影响 1. 前负荷在完整心脏, 心室肌的前负荷就是其舒张末期的充盈量, 舒张末期充盈量的多少决定了心室肌收缩前的初长度, 而初长度可影响心肌的收缩功能 为了分析前负荷和初长度对心脏泵血功能的影响, 可以在实验中逐步改变心室舒张末期压力和容积, 并测量搏功, 将一系列搏功对心室舒张末期压力或容积作图, 即为心室功能曲线 (ventricular function curve), 或称为 Starling 曲线 ( 图 4-12), 心室功能曲线反映了左室舒张末期容积或充盈压与 65

194 心室搏功的关系 通常情况下, 左室充盈压为 5~6mmHg, 从图 4-12 可见心室具有较大程 度的初长度储备 这种由于心肌细胞本身初长度的改变引起心肌收缩强度的改变的调节形式 称为异长调节 图 4-12 心室功能曲线 ( 犬 ) 在体内, 心室前负荷是由心室舒张末期血液充盈量决定的, 心室充盈量是静脉回心血量和心室射血后剩余血量的总和 静脉回心血量主要受两个因素的影响 :1 心室舒张充盈期持续时间 心率增加时, 心舒张期缩短, 充盈不完全, 充盈压降低, 使搏出量减少 2 静脉回流速度 静脉回流速度取决于外周静脉压与心房 心室压之差 压力差增大, 可促进静脉回流 射血后剩余血量与心肌收缩力有关 心肌收缩强, 射血分数大, 剩余血量就减少 此外, 心房收缩也能增加心室舒张末期的充盈量, 从而增强心室收缩的强度 每次射血后心室剩余血量对心室充盈量的影响是多方面的 如果静脉回心血量不变, 心室剩余血量的增加将导致心室总充盈量的增加, 故心室充盈压增高, 搏出量也随之增加, 另一方面, 心室内剩余血量增加时, 心室舒张期的压力也增高, 因此静脉回心血量将有所减少, 心室总充盈量不一定增加 总之, 在心室射血功能不变的情况下, 心室内剩余血量的增减对搏出量的影响取决于心室总充盈量是否改变以及发生何种改变 异长调节的生理意义在于对搏出量进行精细的调节, 当体位改变使静脉回流突然增加或减少, 或动脉血压突然增高时, 或当左 右心室搏出量不平衡等情况下所出现充盈量的微小变化, 都可以通过异长调节来改变搏出量, 使之与充盈量保持平衡 2. 心肌收缩能力当人们在运动或强体力劳动时, 搏出量可成倍增加, 而此时心室舒张末期容积不一定增大, 甚至可能减小 即此时心脏收缩强度和速度的变化并不主要依赖于 66

195 前 后负荷的改变, 机体可通过改变心肌收缩能力来适应不同代谢水平的需要 心肌收缩能力 (cardiac contractility) 是指心肌不依赖于前 后负荷而能改变其力学活动的一种内在特性 图 4-13 所示, 当心肌收缩能力增强时 ( 如在去甲肾上腺素的作用下 ) 其心室功能曲线向左上方移位 ; 当心肌收缩能力下降时 ( 如心力衰竭 ), 心室功能曲线向右下方移位, 心脏泵血功能的这种调节是通过收缩能力这个与初长度无关的因素改变而实现的, 故称等长调节 图 4-13 心肌收缩能力对心室功能曲线的影响 心肌收缩能力受兴奋 - 收缩耦联过程中各个环节的影响, 包括兴奋时胞浆中的钙离子浓度, 横桥与肌纤蛋白联结体的数量, 横桥 ATP 酶的活性等 3. 后负荷后负荷是指肌肉开始收缩后才遇到的负荷 对心室而言, 动脉血压起着后负荷的作用, 在心率 前负荷和收缩能力不变的情况下, 当动脉血压升高时, 后负荷增大, 导致等容收缩期延长而射血期缩短 ; 再加上射血期心肌纤维缩短速度和程度均减小, 搏出量暂时减少 然而, 搏出量的减少, 使心室剩余血量增加, 充盈量增加, 初长度增加, 通过异长调节搏出量又可以恢复到原有正常水平 如果动脉血压长期持续升高, 机体将通过增加心肌收缩能力, 使机体在动脉血压升高的情况下, 能够维持适当的心输出量 但这种心输出量的维持是以增加心肌收缩力为代价的, 久而久之, 心脏将出现逐渐肥厚的病理改变, 最终导致泵血功能的减退 当大动脉血压降低时, 若其他条件不变, 则心输出量将增加 临床上用舒血管药物降低 67

196 后负荷以提高心输出量, 就是这个道理 ( 二 ) 心率对心输出量的影响正常成年人在安静状态时, 心率约在 60~100 次 / 分之间, 有明显的个体差别 心率的高低与年龄 性别和处于不同生理条件有关 心率是决定心输出量的基本因素之一 在一定的范围内, 心率加快可使心输出量增加, 但是如果心率太快 ( 超过 170~180 次 / 分 ), 舒张期缩短, 心室缺乏足够的充盈时间, 充盈量减少, 搏出量可减少到正常的一半左右, 心输出量开始下降 反之, 如心率低于 40 次 / 分时, 心舒期延长, 心室充盈早已接近最大限度, 不能再继续增加充盈量和搏出量, 故每分心输出量下降 可见, 心率最适宜时, 心输出量最大, 心率过快或过慢, 心输出量都会减少 生理条件下的正常心率, 取决于窦房结活动的节律性, 窦房结的节律受到神经 体液 温度 代谢和环境等多种因素的影响 ( 徐和靖杜友爱陈莹莹 ) 68

197 第三节血管生理 一 各类血管的结构和功能特点 不论体循环 (systemic circulation) 或肺循环 (pulmonary circulation), 由心室射出的血 液都流经由动脉 毛细血管和静脉相互串联构成的血管系统 (vascular system), 再返回心房 在体循环, 供应各器官的血管相互间又呈并联关系 这种并联的排列方式有利于机体对不同 器官的血流量进行调节以适应生理活动的需要 根据血管的生理功能, 可将血管分为以下几类 : 1. 弹性贮器血管指主动脉 肺动脉主干及其发出的最大分支 这些血管的管壁厚, 壁内含有丰富的弹性纤维, 故有较大的顺应性和弹性 当心室射血时, 大动脉血压升高, 一 方面推动大动脉内的血液向前流动, 使一部分血液进入毛细血管和静脉 ; 另一方面使动脉被 动扩张, 使另一部分血液暂时储存, 缓冲收缩压过高 ; 当心室舒张时, 被扩张的大动脉发生 弹性回缩, 将射血期贮存的这部分血液在心舒张期继续推向外周血管, 同时维持一定的舒张 压 大动脉的这种功能称为弹性贮器作用, 它可以使心脏间断的射血变为血管系统中连续的 血流, 并减小每个心动周期中动脉血压的波动幅度 2. 分配血管从弹性贮器血管以后到分支为小动脉前的动脉管道, 其管壁主要由平滑 肌组成, 收缩性较强 其功能是将血液输送至各器官组织, 故称为分配血管 3. 毛细血管前阻力血管小动脉 ( 直径 1mm) 和微动脉 ( 直径 20~30 µm) 的管径 小, 管壁富有平滑肌, 后者的舒缩活动可使局部血管的口径和血流阻力发生明显的变化, 从 而影响所在器官 组织的血流量 小动脉和微动脉对血流的阻力约占总的外周阻力的 47%, 故称为毛细血管前阻力血管 4. 毛细血管前括约肌在真毛细血管的起始部常有平滑肌环绕, 称为毛细血管前括约 肌 它的收缩和舒张控制了其后真毛细血管的关闭和开放, 同时也决定血液和组织液进行物 质交换的面积 5. 交换血管是指真毛细血管, 其管壁由单层内皮细胞和基膜组成, 通透性高, 且血 流速度最慢, 是血液和组织液之间进行物质交换的场所 6. 毛细血管后阻力血管指微静脉 由于管径小, 对血流也可产生一定的阻力 它们 的舒缩可影响毛细血管前 后阻力的比值, 从而改变毛细血管压和体液在血管内外的分配 7. 容量血管指微静脉以后到大静脉的整个静脉系统 与相应的动脉相比, 其数量多 管径大 管壁薄且易扩张 在安静状态下, 静脉系统容纳了整个循环血量的 60~70%, 起了 贮血库的作用, 故称为容量血管 8. 短路血管指一些血管床中小动脉和小静脉之间的吻合支, 多见于手指 足趾 耳 廓等处的皮肤, 与体温调节有关 69

198 二 血流量 血流阻力和血压血液在心血管系统内流动的流体力学称为血流动力学, 其研究的基本问题是血流量 血流阻力和血压之间的相互关系 由于血液是含有血细胞和胶体物质等多种成分的液体, 血管是有可扩张性和弹性的管道, 因此血流动力学除了符合一般流体力学的规律外, 还有其自身的特点 ( 一 ) 血流量和血流速度单位时间内流过血管某一截面的血量称为血流量 (blood flow), 也称容积速度, 通常以 ml/min 或 L/min 来表示 根据流体力学规律, 血流量 (Q) 与血管两端的压力差 (P1- P2) 成正比, 与血流阻力 (R) 成反比, 即 P P 1 = R Q 2 循环系统是一个封闭的系统, 因此在各个截面血管中的血流量是相等的, 都等于心输出量 对于体循环来说, 上式中的 Q 就是心输出量,R 为体循环的总外周阻力,P1 为主动脉压, P2 为右心房压 对于器官循环来讲, 其血流量则取决于灌注该器官的动 静脉压之差和该器官内的血流阻力 血液中的一个质点在血管内移动的直线速度, 称为血流速度 血液在血管内流动时, 其血流速度与血流量成正比, 与血管的任一处的总横截面积成反比 在体循环, 主动脉处的总横截面积最小, 血流速度最快 ; 毛细血管处的总横截面积最大, 血流速度最慢 血液在血管内流动的方式可分为层流 (laminar flow) 和湍流 (turbulent flow) 两类 在层流情况下, 血液中各个质点流动的方向一致, 与血管的长轴平行 但各个质点的流速不一, 在血管轴心处最快, 越靠近管壁, 流速越慢, 如图 4-14 所示 箭头指示血流的方向, 箭头的长度表示流速, 在血管纵剖面上各箭头的连线形成一抛物线 当血流速度加快到一定程度后, 会发生湍流 此时血流中各个质点流动的方向不再一致而出现旋涡 在血流速度快 血管口径大 血液粘滞度低的情况下, 容易发生湍流 层流不引起管壁振动, 但湍流的部位常可因局部的管壁振动产生杂音 图 4-14 血液在血管中的流动状态 - 层流 : 各层血液的流速 70

199 ( 二 ) 血流阻力血液在血管内流动时遇到的摩擦力, 称为血流阻力, 主要来自血液内部各成分之间的摩擦和血液与血管壁之间的摩擦 摩擦消耗的能量一般表现为热能 这部分热能不可能再转换成血液的势能或动能, 故血液在血管内流动时压力逐渐降低 血流阻力一般不能直接测量, 需通过计算得出 根据血流量公式, 若测得血管两端的压力差和血流量, 即可计算出血流阻力 另外, 若比较血流量公式和泊肃叶定律的公式 : 则可得出血流阻力 (R) 的方程式, 即 π(p P )r 1 2 Q= 8ηL 8ηL R = π r 4 根据这一方程式, 血流阻力 (R) 与血管长度 (L) 和血液粘滞度 (η) 成正比, 与血管半径 (r) 的 4 次方成反比 由于血管的长度很少变化, 可看作不变的常数, 故血流阻力主要取决于血管口径和血液粘滞度 血液粘滞度主要与红细胞比容有关, 红细胞比容越大, 血液粘滞度越高, 血流阻力也越大 由于血流阻力与血管半径的 4 次方成反比, 血管半径减小一倍, 则血流阻力增加 16 倍, 因此血管口径是形成血流阻力的主要因素 在整个体循环总血流阻力中, 大 中动脉约占 19%, 小动脉 微动脉约占 47%, 毛细血管约占 27%, 静脉约占 7%, 可见小动脉和微动脉 ( 毛细血管前阻力血管 ) 是产生血流阻力的主要部位 小动脉和微动脉管壁富有平滑肌细胞, 收缩时血管口径明显缩小, 此处的血流阻力显著增大 因此, 将小动脉和微动脉处的血流阻力称为外周阻力 综上所述, 对于一个器官来说, 如果动 静脉间的压强差不变, 血液粘滞度不变, 则器官血流量主要取决于该器官阻力血管的口径 阻力血管口径增大时, 血流阻力降低, 器官血流量就增多 ; 反之, 当阻力血管口径缩小时, 血流阻力增大, 器官血流量就减少 机体对循环功能的调节, 就是通过影响阻力血管平滑肌的舒缩活动, 调控各器官阻力血管的口径, 改变不同器官的血流分配, 使机体产生适应性变化 ( 三 ) 血压血压 (blood pressure) 是指血管内流动的血液对单位面积血管壁的侧压力, 即压强, 常用高于大气压的千帕 (kpa) 或毫米汞柱 (mmhg) 值表示 (1mmHg=0.133 kpa) 血压形成的前提是循环系统内有足够的血液充盈, 其充盈的程度可用循环系统平均充盈压来表示, 即血液停止流动时, 血液对血管壁的侧压力, 此时循环系统各处的压强均相同, 其大小取决于循环血量和血管容量之间的相对关系 如果循环血量增多或血管容量减小, 则循环系统平均充盈压增高 ; 反之, 循环血量减少或血管容量增大, 循环系统平均充盈压就降低 在对狗的实验中, 测得的循环系统平均充盈压为 7mmHg(0.93kPa), 人的循环系统平均 4 71

200 充盈压也接近这一数值 形成血压的另一个基本因素是心脏射血 心室收缩所释放的能量可分为两部分, 一部分用于推动血液流动, 是血液的动能, 表现为推力 ; 另一部分形成对血管壁的侧压, 并使血管壁扩张, 是血液的势能, 表现为血压 在心舒期, 扩张的大动脉弹性回缩, 可将一部分势能转变为动能, 推动血液继续向前流动 在推动血流的过程中, 由于不断地克服血流阻力, 消耗能量, 势能不断地转变为动能, 故从主动脉到静脉, 血压逐步递减, 血液由大静脉回到右心房时, 压力已接近于零 但各部血压的降落是不均匀的 ( 图 4-15) 由于小动脉 微动脉的血流阻力最大, 此段血压降落的幅度也最大 图 4-15 各段血管的血压 血流速度和血管总横截面积示意图 三 动脉血压和动脉脉搏 ( 一 ) 动脉血压 1. 动脉血压的概念和正常值动脉血压 (arterial blood pressure) 是指流动的血液对单位面积动脉管壁的侧压力 在一个心动周期中, 动脉血压随心脏的间断性射血发生规律性的波动 心室射血时, 动脉血压升高, 大约在快速射血期末达最高, 其最高值称为收缩 72

201 压 (systolic pressure) 心室舒张时, 动脉血压下降, 将血压降至最低值, 称为舒张压 (diastolicpressure) 收缩压和舒张压的差值称为脉搏压, 简称脉压 (pulse pressure) 整个心动周期中各瞬间动脉血压的平均值, 称为平均动脉压 (mean arterial pressure)( 图 4-16) 一般所说的动脉血压是指主动脉压 由于大动脉中血压降落不大, 为便于临床测量, 通常将上臂测得的肱动脉血压代表主动脉压 我国健康青年人在安静状态时的收缩压为 100~ 120mmHg ( 13.3 ~ 16.0kPa ), 舒张压为 60 ~ 80mmHg(8.0 ~ 10.6kPa), 脉搏压为 30 ~ 40mmHg(4.0~5.3kPa) 图 4-16 主动脉血压波形图 动脉血压存在个体 性别和年龄的差异 一般来说, 女性在更年期前动脉血压比同龄男性低, 而更年期后动脉血压则较高 男性和女性的动脉血压都随年龄的增长而逐渐升高, 收缩压的升高比舒张压的升高更为显著 新生儿的收缩压仅 40mmHg 左右 出生后第一个月内, 收缩压升高很快, 第一个月末可达到 80mmHg 以后, 收缩压继续升高, 到 12 岁时约为 105mmHg 在青春期, 收缩压上升较快, 到 17 岁收缩压可达 120mmHg 青春期以后, 收缩压随年龄增长缓慢升高, 到 60 岁, 收缩压约为 140mmHg 2. 动脉血压的形成如前所述, 循环系统内足够的血液充盈和心脏射血是形成动脉血压的两个基本因素 形成动脉血压的另一个基本因素是外周阻力, 主要指小动脉和微动脉对血流的阻力 假如不存在外周阻力, 心室每次射血所射出的那部分血液将全部流至动脉系统以后的血管, 即心室收缩释放的能量可全部表现为动能, 而不对血管壁产生侧压, 也就不能形成动脉血压 由于外周阻力的存在, 心室每次射血量的三分之二被暂时贮存在大动脉和主动脉内, 从而使动脉扩张, 动脉血压上升 另外, 由于主动脉 大动脉具有弹性贮器作用, 将心室收缩释放的一部分能量以弹性势能的形式贮存于扩张的动脉管壁中 当心室舒张, 停止射血时, 随着动脉内血液流向外周, 大动脉血压下降, 被扩张的动脉管壁随即弹性回缩, 一则使弹性势能转换为动能, 推动动脉内的血液继续向前流动, 使左心室的间断射血变为动 73

202 脉内的连续血流, 二则减小血管容积, 使动脉血压的下降得到缓冲, 不致降得太低, 以维持较高的舒张压水平, 使一个心动周期中动脉血压的变动幅度远小于左心室内压的变动幅度 3. 影响动脉血压的因素如前所述, 凡能影响动脉血压形成的因素, 包括循环系统血液充盈的程度 心脏射血量 外周阻力和大动脉的弹性贮器作用, 都能影响动脉血压 (1) 每搏输出量 : 如其它因素不变, 每搏输出量增加, 心缩期心室射入主动脉和大动脉的血量大于流出动脉系统的血量, 主动脉和大动脉内血量增加显著, 故收缩压升高明显 由于动脉血压升高, 血流速度加快, 收缩期内增多的这部分血量仍可在心舒期流入毛细血管和静脉 到心舒期末, 大动脉内存留的血量和每搏输出量增加之前相比, 有增加但不多 因此, 每搏输出量增加引起的动脉血压升高, 主要表现为收缩压升高明显, 舒张压升高不大, 脉压增大 反之, 每搏输出量减少, 血压下降, 主要是收缩压降低明显, 脉压减小 可见每搏输出量的变化主要影响收缩压, 而收缩压的高低也主要反映了每搏输出量的多少 凡是影响静脉回心血量而改变前负荷或影响心肌收缩能力的因素都能影响每搏输出量, 进而影响血压 (2) 心率 : 如其它因素不变, 心率在一定范围内增加, 心输出量增加, 动脉血压增加, 但舒张压升高明显, 而收缩压升高不多, 脉压减小 这是因为心率主要影响心舒期, 心率增快, 心舒期缩短较心缩期明显, 以致心舒期内流出动脉系统的血量明显减少, 到心舒期末存留在主动脉 大动脉内的血量增多, 舒张压较心率增加前高 由于心率对心缩期的缩短影响较小, 加之收缩期动脉血压升高本身也促进了血流速度, 也可有较多的血液流出动脉系统, 故心率增快时, 收缩压虽有升高, 但与舒张压相比, 升高幅度不如舒张压升高显著, 脉压减小 相反, 心率减慢时, 动脉血压下降, 但舒张压降低的幅度较收缩压降低幅度大, 脉压增大 (3) 外周阻力 : 如果其它因素不变, 仅外周阻力增大, 流出动脉系统的血量减少, 大动脉内存留的血量增多, 血压升高 因心舒期相对较长, 到心舒末期存留在大动脉内的血量较多, 故舒张压升高明显 由于心缩期较心舒期短, 心缩期血压也较心舒期高, 相应地血流速度也较心舒期快, 故收缩压的升高幅度不如舒张压升高显著, 脉压减小 反之, 当外周阻力减小时, 舒张压的降低幅度比收缩压的降低幅度大, 脉压加大 可见, 外周阻力主要影响舒张压 所以, 在安静状态下, 心率变化不大, 舒张压的改变主要反映了外周阻力的大小 (4) 主动脉和大动脉的弹性贮器作用 : 主动脉和大动脉的弹性贮器作用有缓冲动脉血压波动幅度的作用 老年人常因动脉管壁硬化, 大动脉的弹性贮器作用减弱, 出现收缩压升得过高, 舒张压降得过低, 脉压增大 (5) 循环血量和血管系统容积的比例 : 如前所述, 循环系统平均充盈压是形成动脉血压的前提, 而循环系统平均充盈压的大小, 又取决于循环血量和心血管系统容积二者的相应关系 在正常情况下, 神经体液调节使循环血量和血管系统容积相适应, 血管系统充盈程度的变化不大 任何原因引起循环血量相对减少和 / 或血管系统容积相对增大, 都会使循环系 74

203 统平均充盈压下降, 使动脉血压降低 相反, 循环血量相对增多和 / 或血管系统容积相对缩小, 都将导致动脉血压升高 以上对影响动脉血压各种因素的叙述, 都是在假设其他因素不变的前提下, 分析单一因素发生变化对动脉血压可能发生的影响 实际上, 在完整机体的情况下, 当一种因素发生改变时, 机体将对其他因素重新调整, 因此动脉血压的任何改变, 往往是各种因素相互作用的综合结果 ( 二 ) 动脉脉搏动脉血压随心室收缩和舒张活动而发生周期性波动 这种周期性压力变化所引起动脉血管搏动的现象称为动脉脉搏 (arterial pulse) 用手指可在身体浅表部位摸到动脉搏动, 桡动脉是临床上最常用的检测部位 动脉脉搏波首先在主动脉根部产生, 产生后沿着动脉管壁向外周血管传播 脉搏波的传播速度比血流速度快得多 脉搏波的传播与动脉管壁的弹性呈反变关系 主动脉的弹性最大, 脉搏波的传播最慢, 传播速度约为 3~5m/s, 在大动脉约为 7~10m/s, 到小动脉段可加快到 15~35m/s 老年人的动脉血管弹性降低, 故其脉搏波的传播速度较青年人为快 用脉搏描记仪记录到的浅表动脉脉搏的波形称为脉搏图 ( 图 4-17) 动脉脉搏的波形可因描记方法和部位不同而有差异, 但一般都包括以下几个组成部分 : 图 4-17 正常颈总动脉脉搏波形 1. 上升支 : 在心室的快速射血期, 动脉血压迅速上升, 管壁被扩张, 形成脉搏波形中的上升支 上升支的斜率和幅度受心输出量 射血速度和外周阻力等因素的影响 心输出量少, 射血速度慢, 外周阻力大, 则上升支的斜率小, 幅度也低 ; 反之, 则上升支的斜率大, 幅度也大 2. 下降支 : 在心室减慢射血期, 射血速度减慢, 射入主动脉的血量少于从主动脉流出的血量, 故动脉血压开始下降, 被扩张的大动脉弹性回缩, 形成脉搏波下降支的前段 随后, 心室舒张, 动脉血压继续下降, 形成下降支的其余部分 在主动脉脉搏图中, 其下降支上有一个切迹, 称为降中峡, 发生在主动脉瓣关闭的瞬间 由于随着心室舒张, 心室内压迅速下降, 主动脉内的血液向心室方向返流, 返流的血液将主动脉瓣关闭, 并撞击在闭合的主动脉瓣上被弹回, 使动脉血压再次稍有上升, 管壁又稍有扩张, 因此在降中峡的后面形成一个短暂向上的小波, 称为降中波 动脉脉搏波形中下降支的形状可大致反映外周阻力的高低 外 75

204 周阻力高, 脉搏波降支的下降速率较慢, 降中峡的位置较高 ; 外周阻力较低, 则下降支的下 降速率较快, 降中峡位置较低, 其后的下降支坡度小且较为平坦 四 静脉血压和静脉回心血量静脉不仅仅作为血液回流心脏的通道, 而且易扩张 容量大, 起着血液贮存库的作用 静脉的收缩或舒张可有效地调节回心血量和心输出量, 使血液循环能够适应机体在各种生理状态时的需要 ( 一 ) 静脉血压由于不断地克服血流阻力, 消耗能量, 血液通过动脉 毛细血管到达微静脉时, 血压已降至约 15~20mmHg, 流到达下腔静脉时为 3~4mmHg, 最后汇入右心房时, 压力已接近于零 通常将各器官静脉的血压称为外周静脉压, 而将右心房和胸腔内大静脉的血压称为中心静脉压 (central venous pressure) 中心静脉压正常变动范围为 4~12cmH2O 中心静脉压的高低取决于心脏射血能力和静脉回心血量之间的相互关系 心脏射血功能好或静脉回心血量少, 中心静脉压就低, 反之, 心脏射血功能差或静脉回心血量多并超过心脏射血能力时, 血液将堆积在大静脉和右心房, 中心静脉压升高 可见, 中心静脉压是反映心血管功能的一个指标, 可反映静脉回流血量与心脏射血功能状态的相互关系 临床上用作输血输液的参考指标, 如输液治疗休克时, 除需观察动脉血压外, 也要观察中心静脉压的变化 如果中心静脉压偏低或有下降趋势, 常提示输液不足 ; 如果中心静脉压高于正常并有进行性升高的趋势, 则提示输液过快或心脏射血功能不全 当心脏功能减弱而使中心静脉压升高时, 静脉回流将会减慢, 较多的血液滞留在外周静脉内, 外周静脉压升高 ( 二 ) 重力对静脉压的影响 76

205 图 4-18 直立体位对肢体动脉和静脉血压的影响 血管系统内的血液因受地球重力场的影响, 产生一定的静水压 因此各部分血管的血压除由于心脏作功形成以外, 还要加上该部分血管的静水压 通常以右心房平面作为静水压的参考平面, 看作零 高于右心房平面, 静水压为负, 低于右心房平面, 静水压为正 因此, 某一血管的静水压高低与机体体位有关 平卧时, 身体各处血管的位置大致与心脏处在同一平面, 故静水压也大致相同, 即足部与颈部的静水压大约都是 6.8cmH2O 但由平卧转为直立时, 足部血管内的血压比卧位时高, 其高出的部分相当于从足至心脏这样一段血液柱高度形成的静水压, 约 90mmHg( 图 4-18) 而在心脏水平以上的部分, 血管内的压力要比平卧时低, 如颅顶脑膜矢状窦内压可降至 -10mmHg 重力形成的静水压对处于同一水平的动脉和静脉是相同的, 但是它对静脉功能的影响远比对动脉的大 因为静脉管壁较薄, 管壁中弹性 77

206 纤维和平滑肌少, 较动脉有更大的可扩张性, 可扩张性是指血管跨壁压改变 1mmHg 时血管容积变化的百分数 血管跨壁压是指血管壁内外的压力差 跨壁压增大, 静脉就充盈, 容积增大 ; 跨壁压减小, 静脉就塌陷, 容积减小 因此, 当人直立时, 足部的静脉充盈饱满, 而颈部的静脉则塌陷 由于身体中大多数静脉血管都处于心脏平面以下, 其充盈扩张可比在卧位时多容纳 400~600ml 血液 这一变化可导致回心血量突然减少, 心输出量减少和动脉血压降低 在正常情况下, 这些变化会发动神经体液调节, 使动脉血压很快恢复 ( 三 ) 静脉血流 1. 静脉对血流的阻力 : 血液从微静脉回流到右心房, 血压仅降落 15mmHg 因此, 静脉血流阻力低, 约占体循环总阻力的 15% 静脉血管的口径是影响静脉血流阻力的主要因素, 而静脉血管的舒缩和跨壁压的变化可影响静脉血管的口径 如腹腔脏器对腹腔内大静脉的压迫使跨壁压减小, 静脉管壁塌陷, 管腔截面积减小, 血流阻力增大 ; 在神经体液因素的作用下, 微静脉收缩, 静脉血流阻力增大, 静脉回流减少, 并可逆行性地影响毛细血管压升高, 导致组织液生成增多 2. 静脉回心血量及其影响因素单位时间内的静脉回心血量取决于外周静脉压和中心静脉压的压力差, 以及静脉对血流的阻力 故凡能影响外周静脉压 中心静脉压以及静脉阻力的因素, 都能影响静脉回心血量 (1) 循环系统平均充盈压 : 循环系统平均充盈压是反映心血管系统充盈程度的指标, 它的高低取决于循环血量与血管系统容积的对比关系 两者的变化使循环系统平均充盈压升高, 血管系统充盈, 静脉回心血量增多 ; 反之, 则静脉回心血量减少 (2) 心脏收缩力量 : 心脏收缩时将血液射入动脉, 舒张时则从大静脉抽吸血液 如果心脏收缩力量增强时, 心室射血量大, 排空完全, 心室舒张时室内压可降得更低, 对心房和大静脉内的血液的抽吸力量增大, 回心血量增加 反之, 心脏收缩力量减弱, 心室舒张时室内压较高, 血液淤积在心房和大静脉内, 中心静脉压升高, 回心血量减少 因此右心衰竭患者可出现颈外静脉怒张, 肝充血肿大 ; 左心衰竭患者可出现肺淤血和肺水肿 (3) 体位改变 : 重力对静脉血压的影响已如前述 当平卧变为直立位时, 因重力的关系, 心脏平面以下的静脉因跨壁压增大, 可容纳比平卧时多约 500ml 的血量, 静脉回心血量减少, 心输出量也随之减少 这种改变在健康人身上由于神经系统的快速调节而不易察觉 但长期卧床的病人, 静脉管壁紧张性较低, 可扩张性较高, 加之腹壁和下肢肌肉的收缩力量较弱, 对静脉的挤压作用减小, 故由平卧位突然站起来时, 可因回心血量过少, 心输出量减少, 动脉血压下降, 导致脑供血不足而发生晕厥 在高温环境中长久站立不动, 也可因皮肤血管舒张, 回心血量过少, 出现头晕甚至昏厥 (4) 骨骼肌的挤压作用 : 静脉内有单向启闭的静脉瓣 ( 尤以四肢静脉内静脉瓣最多 ), 当肢体肌肉收缩时, 可对肌肉内和肌肉间的静脉产生挤压, 使挤压处的静脉压升高, 以致静脉远心端的静脉瓣关闭, 静脉血不能倒流, 而近心端的静脉瓣开放, 有利于血液从近心端挤 78

207 向心脏方向 ; 当肌肉舒张时, 挤压作用消失, 该处静脉压降低, 以致近心端的静脉瓣关闭而远心端的静脉瓣开放, 有利于血液从远心端流入其中 ( 图 4-19) 这样肢体骨骼肌节律性的收缩 舒张和静脉瓣有规律的开放 关闭对静脉回流起着 泵 的作用, 称为 静脉泵 或 肌肉泵, 使静脉内的血液只能向心脏方向流动而不能倒流 因此, 下肢肌肉节律性舒缩, 如步行 骑自行车时, 静脉血流加快 运动肌肉泵的这种作用, 对于在直立情况下降低下肢静脉压和减少血液在下肢静脉内潴留有十分重要的意义 长期站立工作者, 因不能充分发挥此肌肉泵的作用, 易引起血液在下肢静脉内潴留, 静脉压升高, 静脉扩张而导致下肢静脉曲张 图 4-19 骨骼肌的挤压作用对静脉回心血量的影响 A. 静息站立位 ;B. 骨骼肌收缩 ;C. 骨骼肌刚开始舒张时 (5) 呼吸运动 : 由于胸膜腔内负压的存在, 胸腔内的大静脉和右心房处于充盈扩张状态 吸气时, 胸内负压增大, 大静脉和右心房更加扩张, 中心静脉压下降, 与外周静脉压之间的压力差加大, 有利于外周静脉血液回流, 回心血量相应增加 呼气时, 胸内负压减小, 静脉回心血量相应减少 可见呼吸运动对静脉回流也起着 泵 的作用 五 微循环微循环 (microcirculation) 是指微动脉和微静脉之间的血液循环 血液循环的最根本功能是在微循环处实现血液与组织之间的物质交换 ( 一 ) 微循环的组成和血流通路 79

208 微循环的结构因器官 组织不同而有差别 典型的微循环由微动脉 后微动脉 毛细血 管前括约肌 真毛细血管 通血毛细血管 动 - 静脉吻合支和微静脉等部分组成 ( 图 4-20) 图 4-20 微循环模式图 血液从微动脉 后微动脉 毛细血管前括约肌 真毛细血管网 微静脉的通路, 称为迂回通路 微动脉分支成为管径更细的后微动脉, 其管壁有稀疏的平滑肌细胞 每根后微动脉向一根至数根真毛细血管供血 真毛细血管通常从后微动脉以直角方式分出, 在真毛细血管起始处通常由 1~2 个平滑肌细胞形成一个环, 称为毛细血管前括约肌 真毛细血管的血液汇入微静脉 由于真毛细血管网迂回曲折, 血流缓慢, 其管壁由一层内皮细胞和其外的基膜组成, 内皮细胞之间的连接部有细微的裂隙, 通透性较大, 允许较大分子的物质通过 可见, 真毛细血管网是物质交换的主要场所 因此, 迂回通路的主要功能是完成血液与组织之间的物质交换 血液从微动脉 后微动脉 通血毛细血管 微静脉的通路称为直捷通路 通血毛细血管是后微动脉的直接延续, 其管壁平滑肌逐渐稀少以至完全消失 ; 其管径比真毛细血管大, 经常处于开放状态, 血流速度较快, 直捷通路的主要功能不是物质交换, 而是使一部分血液能迅速通过微循环进入微静脉流回心脏 直捷通路在骨骼肌组织的微循环中较为多见 血液从微动脉 动静脉吻合支 微静脉的通路称为动 - 静脉短路 动 - 静脉吻合支管壁厚, 有完整的平滑肌层, 能进行舒缩活动, 不能进行物质交换 该类通路在皮肤 皮下组织较为多见, 其功能与体温调节有关 当环境温度升高时, 动 - 静脉吻合支开放增多, 皮肤血流量增加, 皮肤温度升高, 有利于散发体热 反之, 动 - 静脉吻合支关闭有利于保存体热 80

209 ( 二 ) 微循环血流量的调节微动脉管壁有完整的平滑肌层, 受交感神经和体液因素如缩血管物质肾上腺素 去甲肾上腺素 血管紧张素等的调节, 其收缩和舒张调节毛细血管前阻力, 控制进入该微循环单元的血流量, 可看作微循环的 总闸门 较大的微静脉管壁有完整的平滑肌, 但没有微动脉发达, 也受交感神经和体液因素的调节, 其收缩和舒张调节毛细血管后阻力, 控制流出该微循环单元的血流量并影响毛细血管压, 从而影响真毛细血管处的液体交换和静脉回心血量, 可看作微循环的 后闸门 因此微循环血流量和毛细血管的高低取决于毛细血管前阻力和毛细血管后阻力的比值 当毛细血管前 后阻力的比例为 5:1 时, 毛细血管的平均血压约为 20mmHg 毛细血管前 后阻力的比值增大, 意味着流入微循环的血流减少和 / 或流出增多, 毛细血管内血量减少, 毛细血管内血压降低 ; 反之, 比值减小则毛细血管内血量增多, 毛细血管内血压升高 由于在总血流阻力中微动脉处的阻力占较大比例, 故微动脉的阻力对血流量的控制起主要作用 后微动脉和毛细血管前括约肌则主要受代谢产物的调节 代谢产物如乳酸 CO 2 腺苷等有舒血管作用 毛细血管括约肌的舒缩状态可决定进入该支真毛细血管的血流量, 看作微循环的 分闸门 一般情况下, 微动脉管壁有一定的紧张性, 从而维持微循环中一定的血流量 当代谢活动加强时, 局部舒血管代谢产物增多, 后微动脉 毛细血管前括约肌开放, 微循环血流量增加 根据微循环的观察, 真毛细血管网是轮流 交替开放的 其原因是后微动脉和毛细血管前括约肌以每分钟 5~10 次的频率交替性地收缩与舒张, 称为血管运动 (vasomotion) 当后微动脉和毛细血管前括约肌收缩时, 其后的真毛细血管网关闭, 毛细血管内的血流速度减慢, 代谢产物堆积, 氧供应不足, 代谢产物和低氧都能导致局部的后微动脉和毛细血管前括约肌舒张, 真毛细血管网开放, 血流速度加快, 局部组织内堆积的代谢产物被血流清除并恢复氧的供应, 随后, 后微动脉和毛细血管前括约肌又发生收缩, 使真毛细血管网重又关闭 如此周而复始, 使真毛细血管网交替开放与关闭 ( 三 ) 毛细血管内外的物质交换组织细胞和血液之间的物质交换需通过组织液作为中介 ; 组织液与血液之间则通过毛细血管壁进行物质交换 毛细血管内外的物质交换主要通过以下三种方式 : 1. 扩散扩散是血液和组织液之间进行物质交换的最主要方式, 是溶质分子顺浓度梯度发生净移动的不耗能过程 毛细血管内外液体中的分子, 只要其直径小于毛细血管壁的孔隙, 就能通过管壁进行扩散运动 水溶性物质, 如 Na + Cl - 葡萄糖 尿素等, 可通过毛细血管壁上的孔隙进行扩散 脂溶性物质如 O 2 CO 2 等可直接通过内皮细胞进行扩散, 因此整个毛细血管壁都成为扩散面, 单位时间内扩散的速率更高 2. 滤过和重吸收毛细血管壁两侧的静水压和胶体渗透压可以影响水分子的移动 在生理学中, 将由于管壁两侧静水压和胶体渗透压的差异而引起的液体由毛细血管内向毛细血 81

210 管外的移动称为滤过, 而将液体向相反方向的移动称为重吸收 如果溶质分子的直径小于毛细血管壁的孔隙, 能随着水分子一起滤过和重吸收, 而蛋白质物质则难以通过毛细血管壁的孔隙 血液和组织液之间通过滤过和重吸收方式发生的物质交换, 仅占总的物质交换的很小一部分, 但在组织液的生成中起重要的作用 3. 吞饮在毛细血管内皮细胞一侧的液体可被内皮细胞膜包围并吞饮入细胞内, 形成吞饮囊泡 囊泡被运送至细胞的另一侧, 并被排出细胞外 因此这也是血液和组织液之间通过毛细血管壁进行物质交换的一种方式 一般认为, 较大的分子如血浆蛋白等可以由这种方式通过毛细血管壁进行交换 六 组织液组织液是存在于组织细胞间隙中的液体, 绝大部分呈胶冻状, 不能自由流动, 因此不会因重力作用而流至身体的低垂部分 组织液由血浆滤过毛细血管壁而来, 除蛋白质浓度明显低于血浆外, 其他成分基本与血浆相同 ( 一 ) 组织液的生成组织液是血浆经毛细血管壁滤过生成的, 同时它又可通过重吸收回到毛细血管内 液体通过毛细血管壁的滤过和重吸收取决于毛细血管内外的四个因素, 即毛细血管血压 (Pc) 组织液静水压 (Pif) 血浆胶体渗透压(πp) 和组织液胶体渗透压 (πif) 之间的平衡关系 其中毛细血管血压和组织液胶体渗透压是促进液体滤过 ( 即组织液生成 ) 的力量, 血浆胶体渗透压和组织液静水压是促进液体重吸收 ( 即组织液回流 ) 的力量 这两组力量的差值称为有效滤过压 (effective filtration pressure,efp), 即 EFP=(Pc+πif)-(πp+Pif) 有效滤过压是液体通过毛细血管壁滤过和重吸收的动力 如果有效滤过压是正值, 则血浆滤过毛细血管壁生成组织液 ; 如果有效滤过压是负值, 则组织液通过毛细血管壁重吸收入血液, 形成组织液回流 此外, 毛细血管壁是滤过和重吸收的结构基础, 其对液体的通透性和滤过面积即滤过系数 (Kf) 的变化也决定着组织液的生成 因此, 单位时间内通过毛细血管壁滤过的液体量 (V) 等于有效滤过压 (EFP) 与滤过系数 (Kf) 的乘积 即 V=Kf EFP=Kf [(Pc+πif)-(πp+Pif)] 人的血浆胶体渗透压为 25mmHg 毛细血管压变动较大, 受动脉压 静脉压 毛细血管前 后阻力等因素的影响, 一般取毛细血管动脉端的平均血压为 32mmHg, 而静脉端的平均压力为 14mmHg 组织液静水压和胶体渗透压较难测量, 在不同组织测量结果也不一致 在皮下等疏松组织, 组织液静水压为 -2mmHg, 组织液胶体渗透压一般为 8mmHg 如将这些数字代入有效滤过压计算公式, 毛细血管动脉端的有效滤过压为 13mmHg, 毛细血管静脉端的有效滤过压为 -5mmHg( 图 4-21) 这意味着组织液在毛细血管动脉端滤过生成, 而在静脉端重吸收回流 由于毛细血管血压从动脉端到静脉端是逐渐下降的, 所以有效滤过压也是逐渐 82

211 下降的, 液体的滤过和重吸收, 组织液的生成与回流是一个逐渐移行的过程 虽然毛细血管静脉端的有效滤过压较动脉端的小, 但毛细血管静脉端的通透性较动脉端的大, 所以仍可以重吸收较多的组织液 总体上, 毛细血管动脉端滤过生成的组织液, 大约 90% 在静脉端被重吸收到血液, 其余约 10% 组织液进入毛细淋巴管, 形成淋巴液, 再经淋巴管最终汇入大静脉 图 4-21 组织液生成与回流示意图 + 代表使液体滤出毛细血管的力量 - 代表使液体吸收回毛细血管的力量 ( 二 ) 影响组织液生成的因素在正常情况下, 组织液的生成和回流保持动态平衡, 故血量和组织液量能维持相对稳定 但在异常情况下, 发生组织液生成过多或回流减少, 就有过多的组织液潴留于组织间隙中, 形成组织水肿 (edema) 因此, 凡是影响有效滤过压 滤过系数和淋巴回流的因素都将影响组织液生成 1. 毛细血管壁的通透性 : 在正常情况下, 蛋白质难以通过毛细血管壁, 所以血浆胶体渗透压比组织液胶体渗透压高 在某些病理情况下, 如烧伤 过敏反应时, 局部释放大量组织胺 缓激肽等使毛细血管壁通透性升高, 滤过系数增大 ; 同时, 一部分血浆蛋白质也可以滤过进入组织液, 导致局部组织液胶体渗透压升高, 有效滤过压升高, 组织液生成增多, 产生局部水肿 2. 毛细血管血压 : 毛细血管血压的高低取决于动脉压 静脉压 毛细血管前 后阻力比值等因素 当微动脉舒张如运动着的肌肉或发生炎症的部位使毛细血管前阻力下降, 或静脉回流受阻如心功能不全时使毛细血管后阻力升高, 均会使毛细血管血压升高, 有效滤过压升高, 组织液生成量增多, 形成水肿 反之, 当微动脉强烈收缩如失血等, 使毛细血管前 后阻力的比值增大, 毛细血管血压下降, 组织液重吸收增多, 有利于循环血量恢复 3. 血浆胶体渗透压 : 由于营养不良, 机体摄入蛋白质不足 ; 或某些疾病如肾炎, 机体 83

212 丢失蛋白质过多, 都可使血浆胶体渗透压降低, 有效滤过压升高, 组织液生成增多而重吸收减少, 形成水肿 4. 淋巴回流 : 一部分组织液是经淋巴管回流入血液的 当淋巴回流受阻时, 受阻远端的组织间隙内组织液积聚, 导致水肿 丝虫病患者的下肢水肿属于这种情况 七 淋巴液的生成和回流淋巴管系统 (lymphatic system) 是组织液回流入血的一个重要的辅助系统 与血液循环不同, 毛细淋巴管以稍膨大的盲端起始于组织间隙, 彼此吻合成网, 并逐渐汇合成大的淋巴管 全身的淋巴液经淋巴管收集, 最后由右淋巴导管和胸导管导入静脉 ( 一 ) 淋巴液的生成组织液进入淋巴管, 即成为淋巴液 (lymph) 因此淋巴液的成分与组织液的成分非常接近 在毛细淋巴管的起始端, 管壁由单层内皮细胞构成, 管壁外无基膜 内皮细胞均以固定微丝附着于周围组织上, 内皮细胞的边缘并不直接相连, 而是像瓦片样互相覆盖, 形成向管腔内开放的单向活瓣 当组织液积聚使组织液静水压升高时, 组织中的胶原纤维和毛细淋巴管之间的胶原细丝可以将互相重叠的内皮细胞边缘拉开, 即活瓣被推开, 内皮细胞之间出现较大的缝隙, 通透性明显增大, 组织液包括其中的血浆蛋白质 血细胞 脂肪微粒等自由地进入毛细淋巴管 如液体倒流, 则活瓣关闭, 故淋巴液不能流入组织液 安静状态下, 正常成年人每小时约 120ml 淋巴液回流入血, 依此计算每天生成的淋巴液约 2~4L, 大致相当于全身的血浆总量 ( 二 ) 淋巴液的回流及其影响因素毛细淋巴管汇合形成集合淋巴管 较大的淋巴管内有单向开放的瓣膜防止淋巴液逆流, 淋巴管管壁上有平滑肌 淋巴管平滑肌的收缩和淋巴管内的瓣膜对淋巴回流起着 泵 的作用 由于瓣膜的存在, 淋巴管周围的组织如骨骼肌的舒缩 相邻动脉的搏动对淋巴管的挤压, 甚至外物对身体组织的压迫和按摩, 都能促进淋巴的回流 凡能增加淋巴生成的因素也都能增加淋巴液的回流量 淋巴液生成和回流的主要生理功能在于调节血浆与组织液间的体液平衡, 回收组织液中的蛋白质, 将小肠绒毛吸收的脂肪运输入血液, 以及清除组织中的红细胞 细菌和其他异物 第四节心血管活动的调节在不同的生理状况下, 人体各器官组织的新陈代谢情况不同, 对血流量的需求也不同 机体通过神经和体液调节, 调节心脏和各部分血管的活动, 从而调整心输出量以及各器官组织间的血流量分配, 以适应机体不同活动的需要 一 神经调节 84

213 心肌和血管平滑肌接受自主神经支配 机体对心血管活动的神经调节是通过各种心血管 反射实现的 ( 一 ) 心脏和血管的神经支配 1. 心脏的神经支配支配心脏的传出神经为心交感神经和心迷走神经 (1) 心交感神经及其作用 : 心交感神经的节前神经元位于脊髓胸段 T1-5 的中间外侧柱, 其轴突经脊髓前根进入椎旁交感神经链上行, 在星状神经节或颈交感神经节换元 节后神经 元的轴突在心脏附近组成心脏神经丛, 进入心脏后支配心脏各个部分, 包括窦房结 房室交 界 房室束 心房肌和心室肌 左 右两侧心交感神经在心脏上的分布有所差异, 支配窦房 结的交感神经主要来自右侧心交感神经, 支配房室交界的交感神经主要来自左侧心交感神 经 心交感神经节前神经元的轴突末梢释放的递质是乙酰胆碱, 与节后神经元膜上的 N1 型 胆碱能受体结合, 兴奋节后神经元 心交感节后神经元的轴突末梢释放去甲肾上腺素, 主要 与心肌细胞膜上的 β1 受体结合, 通过受体 (β1)-g 蛋白 (Gs)- 腺苷酸环化酶 (AC)-cAMP- 蛋白激酶 A(PKA) 的信号转导途径, 使细胞内蛋白质磷酸化,Ca 2+ 通道的磷酸化, 引起 C a 2+ 通道开放, 膜对 Ca 2+ 通透性增高, 膜外 Ca 2+ 内流增多, 肌质网 Ca 2+ 释放增多 ; 降低肌钙 蛋白与 Ca 2+ 的亲和力 ; 激活肌质网膜上的钙泵 ; 促进自律细胞动作电位 4 期的内向电流 If 因此, 心交感神经兴奋时引起以下效应 :1 心率加快, 即正性变时作用 由于去甲肾上腺素 可促进细胞膜对 Ca 2+ 通透性, 使窦房结细胞动作电位 4 期 Ca 2+ 内流增多, 也增强 4 期的内向 电流 If, 从而 4 期自动去极化加速, 自律性提高, 心率加快 2 心肌收缩能力增强, 即正 性变力作用 由于去甲肾上腺素可增加细胞膜上 Ca 2+ 通道开放的概率和 Ca 2+ 内流, 同时肌质 网 Ca 2+ 释放也增加, 胞浆内 Ca 2 浓度升高, 心肌收缩能力增强, 每搏功增加, 射血增多 心 肌舒张时, 去甲肾上腺素又降低肌钙蛋白与 Ca 2+ 的亲和力 ; 促进肌质网膜上的钙泵对 Ca 2+ 的回收, 使胞浆内 Ca 2 浓度下降, 有利于粗 细肌丝分离, 加速心肌舒张过程, 使心室舒张 更完全, 有利于心室充盈 3 房室传导速度加快, 即正性变传导作用 由于去甲肾上腺素使 细胞膜 Ca 2+ 内流增加, 房室交界慢反应细胞动作电位的 0 期去极化幅度和速度增大, 兴奋传 导加快 在功能上, 右侧心交感神经兴奋以增快心率为主, 而左侧心交感神经兴奋以增强心 肌收缩能力为主 总的效应是每搏量增多, 心率加快, 心输出量增加 心交感神经的兴奋效 应可被 β 受体阻断剂普萘洛尔等阻断 (2) 心迷走神经及其作用 : 心迷走神经的节前神经元位于延髓的迷走神经背核和疑核, 其轴突下行进入胸腔, 与心交感神经节后纤维一起组成心脏神经丛, 并和交感神经伴行进入 心脏, 与心内神经节细胞发生突触联系 心迷走神经节后纤维支配窦房结 心房肌 房室交 界 房室束及其分支, 仅有极少数纤维支配心室肌 左 右两侧心迷走神经对心脏的支配也 有所不同, 右侧心迷走神经主要影响窦房结的活动, 左侧心迷走神经主要影响房室交界的功 能 85

214 心迷走神经节前神经元节后神经元均属于胆碱能神经元 当迷走神经兴奋时, 心迷走神 经节后纤维末梢释放乙酰胆碱, 作用于心肌细胞膜上的 M2 型胆碱能受体, 进而激活 G 蛋白, 一方面通过一种 GK 蛋白激活细胞膜上的一种钾通道 (IKAch 通道 ), 促进 K + 外流 ; 一方面通 过 Gi 蛋白抑制腺苷酸环化酶, 降低细胞内 camp 的浓度, 抑制 Ca 2+ 通道, 使膜外 Ca 2+ 内流减 少, 肌浆网释放 Ca 2+ 减少 ; 乙酰胆碱也能直接抑制 Ca 2+ 通道, 减少 Ca 2+ 内流 ; 还能抑制 4 期的内向电流 If 因此, 心迷走神经兴奋时引起以下效应 :1 心率减慢, 即负性变时作用 由于乙酰胆碱促进细胞膜 K + 外流, 使窦房结细胞 3 期复极加快, 最大复极电位的绝对值增大, 到达阈电位所需时间延长 ;4 期 K + 外流增加和抑制 4 期的内向电流 If, 使 4 期自动去极化速 度减慢 这些因素都使窦房结的自律性降低, 心率减慢 2 心肌收缩能力减弱, 即负性变力 作用 由于乙酰胆碱抑制膜外 Ca 2+ 内流和肌浆网 Ca 2+ 释放减少, 使胞浆内 Ca 2+ 浓度下降, 心 房肌收缩能力减弱 刺激心迷走神经也能使心室肌收缩减弱, 但不如心房肌明显 3 房室传 导速度减慢, 即负性变传导作用 由于房室交界慢反应细胞膜 Ca 2+ 通道受抑制, 动作电位 0 期 Ca 2+ 内流减少,0 期去极化速度和幅度减小, 兴奋传导速度减慢, 甚至可出现房室传导阻 滞 心迷走神经和乙酰胆碱对心脏的抑制作用可被 M 型受体阻断剂如阿托品等阻断 2. 血管的神经支配除真毛细血管外, 血管壁都有平滑肌分布 绝大多数的血管平滑 肌都受自主神经支配 支配血管平滑肌的神经纤维可分为缩血管神经纤维和舒血管神经纤维 两大类 (1) 缩血管神经纤维 : 由于缩血管神经纤维都属于交感神经纤维, 故称为交感缩血管 纤维 交感缩血管纤维的节前神经元位于脊髓胸腰段 T1-L3 的中间外侧柱, 纤维末梢释放 的递质为乙酰胆碱, 作用于椎旁和椎前神经节内神经元膜上的 N1 型乙酰胆碱受体 在椎旁 神经节内换神经元后的节后纤维支配躯干 四肢血管的平滑肌 ; 在椎前神经节换神经元后的 节后纤维支配内脏器官血管的平滑肌 交感缩血管节后纤维末梢释放的递质为去甲肾上腺 素, 可与血管平滑肌上的 α β 肾上腺素受体结合 与 α 受体结合导致血管平滑肌收缩 ; 与 β 受体结合导致血管平滑肌舒张 由于去甲肾上腺素与 α 受体结合的亲和力较与 β 受体的强 得多, 故交感缩血管纤维兴奋时表现为缩血管效应 人体大部分血管只接受交感缩血管纤维 单一神经支配 在安静状态下, 交感缩血管纤维发放约 1~3 次 / 秒的低频冲动, 称为交感缩 血管紧张性, 这种紧张性活动使血管平滑肌保持不同程度的收缩状态 当交感缩血管紧张性 增强时, 血管平滑肌进一步收缩 ; 交感缩血管紧张性减弱时, 血管平滑肌收缩程度减弱, 血 管即扩张 当支配某一器官的交感缩血管纤维兴奋时, 可引起该器官血管床的血流阻力增高, 器官血流量减少 ; 与此同时, 该器官毛细血管前 后阻力比值增大, 毛细血管血压下降, 有 效滤过压下降, 组织液生成减少而重吸收增多 ; 该器官的容量血管收缩, 器官血容量减少 体内几乎所有的血管平滑肌都受交感缩血管纤维支配, 但不同部位的血管, 缩血管纤维 分布的密度不同 皮肤的血管分布最密, 骨骼肌和内脏的血管次之, 心 脑血管分布最少 在同一器官中, 交感缩血管纤维的分布密度也存在差异, 动脉的分布密度要高于静脉, 微动 86

215 脉的分布密度最高, 但后微动脉中分布很少, 到毛细血管前括约肌已没有神经纤维分布 (2) 舒血管神经纤维 : 体内部分血管除接受缩血管纤维支配外, 还接受舒血管纤维支配 舒血管神经纤维主要有以下两种 : 1 交感舒血管神经纤维 : 这类舒血管纤维常与交感缩血管纤维同行于一根神经干, 支配骨骼肌微动脉, 其末梢释放的递质是乙酰胆碱, 与血管平滑肌上的 M 受体结合, 使血管舒张 交感舒血管纤维在平时无紧张性活动, 只有在机体情绪激动或作剧烈运动时才发挥作用, 使骨骼肌血管舒张, 血流量增加 2 副交感舒血管神经纤维 : 体内少数器官如脑膜 消化腺和外生殖器等的血管平滑肌, 除接受交感缩血管神经支配外, 还接受副交感舒血管神经纤维的支配 这些舒血管纤维末梢释放的递质是乙酰胆碱, 能与血管平滑肌上的 M 受体结合, 使血管扩张 副交感舒血管纤维一般无紧张活动, 仅对所支配的器官的血流起局部调节作用, 对循环系统总外周阻力的影响不大 3 脊髓背根舒血管纤维 : 当皮肤受到伤害性刺激时, 感觉信号一方面沿传入纤维向脊髓传导 ; 另一方面可通过其分支到达受刺激部位邻近的微动脉, 使微动脉舒张, 局部皮肤出现红晕, 这种仅通过神经元轴突外周部位完成的反应, 称为轴突反射 这类神经纤维也称为背根舒血管纤维 关于背根舒血管纤维释放的神经递质尚不清楚, 有人认为是 P 物质 组胺 ATP 缓激肽等 近年来, 免疫细胞化学实验表明可能是降钙素基因相关肽 (CGRP) ( 二 ) 心血管中枢心血管中枢 (cardiovascular center) 是指在中枢神经系统内, 控制心血管活动有关的神经元的集中部位 这些神经元分布在从脊髓到大脑皮层的各级水平上, 它们各具不同的功能, 又互相密切联系, 使整个心血管系统的活动协调一致, 并与整个机体的活动相适应 1. 延髓心血管中枢一般认为, 延髓是心血管活动的基本中枢 许多基本的心血管反射都在延髓接通, 高位中枢的作用是通过延髓中枢下传到脊髓交感节前神经元而产生效应 这一概念源于动物实验, 从中脑向延髓方向逐段横断脑干, 只要保持延髓与脊髓的完整及其正常联系, 动物的动脉血压无明显变化, 一些心血管反射仍然存在 ; 当横断水平下移, 动脉血压逐步下降, 一些心血管反射的效应也逐步减弱, 横断到延髓闩部时, 血压降至约 40mmHg, 心血管反射也基本消失 这些结果说明, 延髓维持着心血管正常的紧张性活动, 并完成一定的心血管反射活动 延髓心血管神经元是指位于延髓内的心迷走神经元和控制心交感神经和交感缩血管活动的神经元 这些神经元在平时均有紧张性活动, 分别称为心迷走紧张 心交感紧张和交感缩血管紧张, 表现为心迷走 心交感和交感缩血管神经纤维维持持续的低频放电活动 心交感中枢与心迷走中枢之间存在交互抑制作用 心交感中枢兴奋性增强时, 可抑制心迷走中枢的活动 ; 反之亦然 一般认为, 延髓心血管中枢至少可包括以下四个部位的神经元 : 87

216 (1) 延髓头端腹外侧部 : 延髓头端腹外侧部 (rvlm) 是交感缩血管中枢和心交感中枢所在的部位 实验资料证明, 延髓头端腹外侧部的神经元不仅和交感神经紧张性放电活动有关, 而且还参与许多心血管活动的调节 它们的轴突下行直接支配脊髓胸腰段的中间外侧柱的心血管交感神经节前神经元 电刺激或局部微量注射兴奋性氨基酸于 rvlm 内, 可使交感神经活动加强, 心率加快, 血压上升 (2) 延髓尾端腹外侧部 : 延髓尾端腹外侧部 (cvlm) 的神经元兴奋时, 可抑制延髓头端腹外侧部神经元的活动, 使交感缩血管紧张性降低, 血管舒张 (3) 延髓的迷走背核和疑核 : 延髓的迷走背核和疑核是心迷走中枢所在部位, 从这里发出心迷走神经的节前纤维 (4) 延髓孤束核 : 延髓孤束核 (NTS) 是心血管反射活动第一级传入神经接替站 它接受颈动脉窦 主动脉弓和心脏感受器经舌咽神经 迷走神经传入的信息, 换元后发出纤维到延髓 cvlm, 转而抑制 rvlm 和兴奋心迷走中枢 延髓孤束核也发出纤维到下丘脑 脊髓及其他心血管中枢部位的神经元, 其作用是抑制心交感神经及交感缩血管神经的紧张性活动, 兴奋心迷走神经紧张性活动 2. 延髓以上的心血管中枢在延髓以上的脑干 下丘脑 小脑和大脑中, 都存在与心血管活动有关的神经元 它们除了调节心血管反射活动之外, 还起着协调心血管与其他生理机能活动之间的整合功能 中枢部位越高, 整合功能越强 例如下丘脑是一个非常重要的功能整合部位, 在对体温调节 摄食 水平衡以及情绪反应的整合功能中都包含有相应的心血管活动的变化 大脑边缘系统的结构能影响下丘脑和脑干其他部位的心血管神经元活动, 使心血管活动与情绪激动相配合 大脑皮层运动区兴奋时, 除引起相应的骨骼肌收缩外, 还引起该骨骼肌血管的舒张 ( 三 ) 心血管反射神经系统对心血管活动的调节是通过各种心血管反射来实现的 当机体处于不同的生理状态或内外环境发生改变时, 都可刺激相应的感受器引起各种心血管反射, 改变心脏和各器官的血管舒缩状况, 从而一方面维持动脉血压的相对稳定, 一方面调配各器官的血流量, 移缓济急, 使循环系统的功能适应于当时机体所处的状态或环境的变化 1. 颈动脉窦和主动脉弓压力感受性反射当动脉血压升高时, 可引起压力感受性反射 (baroreceptor reflex), 其反射效应是心率减慢, 心肌收缩力减弱, 心输出量减少, 血管舒张, 总外周阻力降低, 血压回降 (1) 动脉压力感受器 : 动脉压力感受器主要分布于颈动脉窦和主动脉弓区的血管外膜下 ( 图 4-22), 为对牵张敏感的感觉神经末梢, 适宜刺激是血管壁的机械牵张 当动脉血压升高时, 动脉管壁被牵张的程度增加, 压力感受器发放的神经冲动也就增多 在一定范围内, 压力感受器的传入冲动频率与动脉管壁的扩张程度或动脉血压的高低成正比 由图 4-23 可见, 在一个心动周期内, 随着动脉血压的波动, 窦神经的传入冲动频率也发生相应变化 88

217 动脉压力感受器的特点是对波动性的压力变化刺激敏感 图 4-22 颈动脉窦和主动脉弓区的压力感受器与化学感受器 图 4-23 单根窦神经压力感受器传入纤维在不同动脉压时的放电 89

218 (2) 传入神经和中枢联系 : 颈动脉窦压力感受器的传入神经纤维组成窦神经 窦神经加入舌咽神经进入延髓孤束核 ; 主动脉弓压力感受器的传入神经组成主动脉神经, 主动脉神经并入迷走神经干进入延髓孤束核 在孤束核替换神经元后, 可通过延髓内的神经通路, 使位于延髓头端腹外侧部的心交感和交感缩血管中枢的紧张性下降, 从而使交感神经紧张性活动减弱 ; 使位于迷走背核 疑核的心迷走中枢紧张性活动增强, 迷走神经的活动加强 ; 也有部分纤维上传到下丘脑等较高级的心血管中枢使交感神经紧张性活动减弱 (3) 传出神经和反射效应 : 中枢紧张性活动的改变经传出神经心交感神经 交感缩血管神经和心迷走神经, 将信息传递到心脏和血管 当动脉血压升高时, 该反射的效应是心率减慢, 心肌收缩力减弱, 心输出量减少, 同时外周血管舒张, 阻力减小, 血压回降, 故又称降压反射 (depressor reflex) 反之, 当动脉血压下降时, 压力感受性反射活动减弱, 出现血压回升效应 在动物实验中, 将颈动脉窦与体循环隔离开来, 保留窦神经与中枢神经的联系, 然后人为改变颈动脉窦内的灌注压, 可获得颈动脉窦内压力与主动脉压力之间的关系, 称为压力感受性反射功能曲线 ( 图 4-24) 该曲线两端逐渐平坦, 中间较陡 当窦内压低于 60mmHg 时, 窦神经无传入冲动, 降压反射活动停止, 动脉血压维持在高水平 当窦内压超过 180mmHg 以后, 压力感受器兴奋已接近饱和, 动脉血压不再下降 这表明压力感受性反射的效应范围是在窦内压 60~180mmHg 之间 当窦内压在正常平均动脉压水平 ( 约 100mmHg) 上下变动时, 该段曲线最陡, 压力感受性反射最为敏感, 即纠正偏离正常水平的血压的能力最强 如果窦内压偏离正常血压水平越多, 压力感受性反射纠正异常血压的能力越弱 图 4-24 压力感受性反射功能曲线 (4) 压力感受性反射的生理意义 : 压力感受性反射是一种负反馈调节, 其生理意义主 要在于快速调节动脉血压, 使动脉血压不致发生过大的波动, 而在正常范围之内保持相对稳 90

219 定 在压力感受性反射功能曲线上有一个点, 该点在两个坐标上的数值相等, 即平均动脉压和窦内压数值相等, 这个点称为压力感受性反射的调定点 在正常情况下, 平均动脉压就处在调定点水平 对于长期的 慢性的动脉血压升高, 压力感受性反射调节作用不大 这时压力感受性反射的曲线右移, 调定点上移, 称为压力感受性反射的重调定, 即在较正常高的血压水平进行调节, 而不能降到正常血压水平 2. 心肺感受器引起的心血管反射在心房 心室和肺循环大血管壁存在许多调节心血管活动的感受器, 总称为心肺感受器 由于这些感受器位于循环系统压力较低的部分, 又称为低压感受器 一类心肺感受器的适宜刺激是牵张刺激, 当心房 心室或肺循环大血管中压力升高或血容量增多时, 感受器兴奋 通常将心房中感受容量增大的感受器, 称为容量感受器 ; 这类心肺感受器 ( 容量感受器 ) 的传入神经纤维沿迷走神经干进入延髓心血管中枢和下丘脑, 引起反射效应是 :1 心交感和交感缩血管紧张性降低, 心迷走紧张性增强, 导致心率减慢, 心输出量减少, 外周血管阻力下降, 血压下降 ;2 肾交感紧张性降低, 肾素释放减少, 同时肾血管扩张, 肾血流量增加, 二者均可使肾排水 排钠增多 ;3 抑制下丘脑合成和释放血管升压素, 使肾脏排水增多 表明心肺感受器引起的反射在对血量及体液的量和成分的调节中有重要的生理意义 另外, 还有一类心肺感受器的适宜刺激是某些化学物质, 如前列腺素 缓激肽等, 其传入冲动引起的效应是心率加快 3. 颈动脉体和主动脉体化学感受性反射在颈内外动脉分叉处 主动脉弓与肺动脉之间的血管壁外存在一些对血液 CO2 分压过高 H + 浓度过高 缺氧等化学成分变化敏感的感受装置 ( 图 4-23), 分别称为颈动脉体和主动脉体化学感受器 (chemoreceptor) 颈动脉体和主动脉体兴奋, 信号分别经窦神经和迷走神经传入延髓孤束核, 换神经元后传入延髓呼吸中枢和心血管中枢, 改变它们的活动 化学感受性反射对血管活动的效应, 使交感缩血管中枢紧张性增强, 主要表现为骨骼肌 内脏和肾脏等器官的血管收缩, 外周阻力增大, 血压升高 ; 对心脏活动的效应则受呼吸的影响, 在人为地保持呼吸频率和深度不变的情况下, 使心迷走中枢紧张性增强, 心交感中枢紧张性下降, 表现为心率减慢, 心输出量减少, 但由于外周阻力增大的作用超过心输出量的减少作用, 血压仍升高 ; 在保持自然呼吸的情况下, 由于化学感受性反射主要使呼吸加深加快, 可间接地引起心率加快, 心输出量增加 在平时, 化学感受性反射的作用主要是调节呼吸运动, 对心血管活动的影响则很小 只有在低氧 窒息 失血 动脉血压过低和酸中毒时才发挥比较明显的作用 因此, 化学感受性反射主要参与应急状态时的循环机能调节 大多数心肺感受器受刺激时引起的反射效应是交感紧张性降低, 心迷走紧张性加强, 导致心率减慢, 心输出量减少, 外周血管阻力降低, 故血压下降 在多种动物实验中, 心肺感受器兴奋时肾交感神经活动的抑制特别明显, 使肾血流量增加, 肾排水和排钠量增多 这同时, 心肺感受器的传入冲动可抑制血管升压素的释放 91

220 二 体液调节心血管活动的体液调节是指血液和组织液中一些化学物质对心肌和血管平滑肌活动的调节作用 这些体液因素中, 有些是通过血液运输, 广泛作用于心血管系统 ; 有些则在组织中形成, 主要作用于局部的血管, 调节局部组织的血流量 ( 一 ) 肾素 - 血管紧张素系统肾素是由肾近球细胞合成和分泌的一种蛋白水解酶, 当肾血流灌注减少或血浆中 Na + 浓度降低时释放增多 肾素进入血液循环后, 可作用于血浆中由肝脏合成和释放的血管紧张素原, 使之水解生成血管紧张素 Ⅰ 血管紧张素 Ⅰ 在流经肺循环时, 受肺血管内皮表面的血管紧张素转换酶的降解作用, 变为血管紧张素 Ⅱ 血管紧张素 Ⅱ 在血浆和组织中的血管紧张素酶 A 的作用下生成血管紧张素 Ⅲ( 图 4-25) 图 4-25 肾素 - 血管紧张素系统 对体内多数组织 细胞来说, 血管紧张素 Ⅰ 不具有活性 血管紧张素 Ⅲ 可强烈刺激肾上腺皮质球状带细胞合成和释放醛固酮, 有较弱的缩血管作用 血管紧张素 Ⅱ 是已知最强的缩血管物质之一, 对循环功能的调节起着重要的生理作用 在血管平滑肌 肾上腺皮质球状带细胞 脑的一些部位 心脏和肾脏等器官的细胞上存在血管紧张素受体 血管紧张素 Ⅱ 与血管紧张素受体结合, 引起相应的生理效应 : 1. 作用于血管平滑肌, 使全身微动脉收缩, 血压升高 ; 使微静脉收缩, 回心血量增加 2. 作用于交感缩血管纤维末梢上的血管紧张素受体起接头前调制作用, 使交感神经末梢释放去甲肾上腺素增多 3. 作用于脑的室周器, 使交感缩血管紧张活动加强 ; 引起渴觉, 导致饮水行为 ; 使血管升压素和促肾上腺皮质激素释放增加 ; 抑制压力感受性反射, 使血压升高引起的心率减慢效应明显减弱 4. 刺激肾上腺皮质球状带细胞合成和释放醛固酮, 后者可促进肾小管对 Na + 水的重 92

221 吸收, 使细胞外液和循环血量增加 在正常生理情况下, 肾素 - 血管紧张素系统低水平的活动可能与交感缩血管紧张的维持有一定的关系 在某些情况下, 如失水 失血时, 肾素 - 血管紧张素系统的活动增强, 使外周血管阻力增加, 体液量和血量增加, 血压升高, 对循环功能的调节起着重要的作用 ( 二 ) 肾上腺素和去甲肾上腺素肾上腺素和去甲肾上腺素在化学结构上都属于儿茶酚胺 肾上腺髓质释放的儿茶酚胺中, 肾上腺素约占 80%, 去甲肾上腺素约占 20% 交感神经节后纤维末梢释放的神经递质去甲肾上腺素也有一小部分进入血液 这两种激素对心脏和血管都有兴奋作用, 但不完全相同 这与肾上腺素和去甲肾上腺素对不同的肾上腺素受体的结合能力不同以及肾上腺素受体在心脏和各种器官血管平滑肌细胞膜上的种类和数量不同有关 1. 肾上腺素对心血管的作用肾上腺素可与 α 和 β 肾上腺素受体结合 在心脏, 肾上腺素与 β 受体结合, 使心跳加快 传导加速 心肌收缩力增强, 故心输出量增多 在血管, 肾上腺素的作用取决于血管平滑肌上 α 和 β 受体分布的情况 在皮肤 肾脏和胃肠道血管主要为 α 受体, 肾上腺素使这些器官的血管收缩 ; 在骨骼肌 肝脏和冠状血管,β 受体在数量上占优势, 小剂量的肾上腺素以兴奋 β 受体为主, 引起血管舒张, 但大剂量时, 肾上腺素也能作用于这些血管上的 α 受体, 引起血管收缩 因此, 在完整机体, 生理浓度的肾上腺素使血管的舒张作用稍大于收缩作用, 故外周阻力稍有下降, 舒张压降低, 由于心输出量的增多, 收缩压升高, 平均动脉血压无显著的变化 2. 去甲肾上腺素对心血管的作用去甲肾上腺素主要与 α 肾上腺素受体结合, 也可与心肌的 β 1 受体结合, 但对血管的 β 2 受体作用较弱 因此, 去甲肾上腺素使全身大多数血管收缩, 外周阻力增加, 舒张压和收缩压均显著升高 ; 对心脏的作用则有离体和在体的不同, 去甲肾上腺素可使离体实验的心脏收缩力加强, 心率加快 ; 对完整机体的心脏则表现为心率减慢 这是由于在整体内, 去甲肾上腺素使动脉血压明显升高, 压力感受性反射活动加强, 其对心脏的反射性抑制效应超过去甲肾上腺素对心脏的直接效应 基于肾上腺素与去甲肾上腺素的不同作用机理, 临床上常用肾上腺素作为强心药, 而用去甲肾上腺素作为升压药 ( 三 ) 血管升压素血管升压素又称为抗利尿激素, 在下丘脑视上核和室旁核一部分神经元内合成, 随其轴突下行于下丘脑 - 垂体束至垂体后叶贮存, 在适宜刺激下由垂体后叶释放入血, 发挥效应 血管升压素可提高肾远曲小管和集合管对水的通透性, 促进水的重吸收, 尿量减少, 即抗利尿效应 血管升压素作用于血管平滑肌的相应受体, 引起血管平滑肌收缩, 是已知最强的缩血管物质之一 由于血管升压素能提高压力感受性反射的敏感性, 血浆中生理剂量的血管升压素, 只出现抗利尿效应 只有剂量明显高于正常时, 才引起血管收缩, 血压升高 血管升压素在细胞外液量和渗透压的调节中起重要作用 血浆渗透压升高时, 可刺激下丘脑渗 93

222 透压感受器, 使血管升压素释放增多 在禁水 失水和失血等情况下, 容量感受器传入冲动减少, 血管升压素释放增加 而且, 血管升压素通过对细胞外液量的调节, 来实现对动脉血压的长期调节 ( 四 ) 血管内皮生成的血管活性物质多年以来, 一直认为血管内皮只是衬在血管腔面的一层单层细胞组织, 仅起到屏障和进行血管内外的物质交换的作用 近年来证明, 内皮细胞可以生成并释放多种血管活性物质, 引起血管平滑肌舒张和收缩 1. 血管内皮生成的舒血管物质血管内皮生成和释放的舒血管物质有多种, 例如前列环素 (prostacyclin,pgi2) 内皮舒张因子(endothelium-derivedrelaxing factor,edrf) 内皮超极化因子等 内皮细胞含有前列环素合成酶, 可以合成 PGI2, 在搏动性血流对其产生的切应力作用下释放出来, 作用于血管平滑肌细胞, 使血管舒张 目前认为 EDRF 就是一氧化氮 (nitric oxide, NO) 血管内皮细胞存在产生 NO 的体系, 前体 L- 精氨酸在一氧化氮合酶 (NO synthase, NOS) 作用下生成 NO NO 亲脂性强, 易透过细胞膜, 扩散至血管平滑肌细胞内, 激活鸟苷酸环化酶 (GC), 使 cgmp 浓度升高, 通过激活蛋白激酶 G(PKG), 降低细胞内游离 Ca 2+ 浓度, 产生舒血管效应 许多因素可以引起 NO 释放, 如血流对血管内皮产生的切应力和低氧等 此外, 血管内皮细胞表面还存在一些受体, 如 M 受体 P 物质受体 5- 羟色胺受体和 ATP 受体等, 这些受体被激活后, 可刺激内皮细胞释放 NO 一些化学物质如乙酰胆碱 缓激肽等的舒血管作用是通过内皮实现的 血流对血管内皮的切应力可影响 NO 的释放量, 负反馈地参与动脉血压的即刻调节 当动脉血压升高时, 血流对血管内皮的切应力增大, 内皮细胞释放 NO 增多, 阻力血管扩张, 血压回降 2. 血管内皮生成的缩血管物质血管内皮细胞也可产生多种缩血管物质, 称为内皮缩血管因子 (endothelium-derived vasoconstrictor factor,edcf) 近年来研究得比较深入的 EDCF 是内皮素 (endothelin) 内皮素是内皮细胞合成和释放的 由 21 个氨基酸组成的多肽 血管平滑肌细胞和内皮细胞上有内皮素受体 内皮素与血管平滑肌膜上的内皮素受体结合, 可促进其肌浆网释放 Ca 2+, 引起血管平滑肌收缩 内皮素与内皮细胞上的内皮素受体结合, 促进内皮细胞释放 EDRF, 使血管舒张 给动物注射内皮素, 常在升血压之前出现一个短暂的降压过程, 这一短暂的降压过程与内皮素促进内皮细胞释放 EDRF 有关 在生理情况下, 血管内血流对内皮产生的切应力可使内皮细胞合成和释放内皮素 在病理情况下, 缺血 缺氧 内毒素等都可引起内皮素的释放 ( 五 ) 激肽释放酶 - 激肽系统激肽释放酶是体内的一类蛋白酶, 可分解激肽原变为激肽 激肽具有舒血管活性, 可参 94

223 与对血压和局部组织血流的调节 激肽释放酶可分为两大类, 一类存在于血浆, 称为血浆激肽释放酶, 可水解血浆中的高分子量激肽原, 产生九肽的缓激肽 (bradykinin) 另一类存在于肾 唾液腺 胰腺 汗腺以及胃肠粘膜组织中, 称为腺体激肽释放酶或组织激肽释放酶, 可水解血浆中的低分子量激肽原, 产生十肽的赖氨酰缓激肽, 也称血管舒张素, 后者在氨基肽酶的作用下失去赖氨酸, 转变为缓激肽 缓激肽在激肽酶的作用下被水解失活 缓激肽和赖氨酰缓激肽是已知的最强烈的舒血管物质 激肽可通过血管内皮释放 NO, 使血管平滑肌舒张, 还可使毛细血管通透性增高 在一些腺体器官中生成的激肽, 可以使器官局部血管舒张, 血流量增加 循环血液中的激肽也参与对动脉血压的调节, 使血管舒张, 血压降低 ( 六 ) 心房钠尿肽心房钠尿肽 (atrial natriuretic peptide,anp) 是由心房肌细胞合成和释放的一类多肽 心房钠尿肽可使血管舒张, 外周阻力降低, 使每搏输出量减少, 心率减慢, 心输出量减少 心房钠尿肽可作用于肾的相应受体, 使肾排水和排钠增多 可抑制肾素 醛固酮和血管升压素的释放 这些作用都可使细胞外液量减少, 血压降低 当心房壁受到牵拉时如血容量增多 头低足高位等, 可刺激心房肌细胞释放心房钠尿肽 内皮素和血管升压素也能刺激心房肌细胞释放心房钠尿肽 ( 七 ) 前列腺素前列腺素 (prostaglandin,pg) 是广泛存在于动物和人体内的一组重要的脂肪酸衍生物 全身各部的组织细胞几乎都含有生成前列腺素的前体及酶, 但由于所含酶的差异而产生不同的前列腺素 各种前列腺素对平滑肌的作用是不同的, 例如 PGE2 和 PGI2 具有强烈的舒血管作用,PGF2 则使血管收缩 ( 八 ) 组胺组胺是由组氨酸在脱羧酶的作用下产生的 许多组织, 特别是皮肤 肺和肠粘膜的肥大细胞中含有大量的组胺 当组织受到损伤或发生炎症和过敏反应时, 都可释放组胺 组胺有强烈的舒血管作用, 并能使毛细血管和微静脉管壁的通透性增大, 血浆漏入组织, 导致局部组织水肿 三 局部血流调节器官血流量的调节除了神经 体液调节之外, 还存在局部组织的自身调节 即在去除神经 体液因素的情况下, 当血压在一定范围内变动时, 器官血流量能保持相对稳定 关于器官血流量自身调节的机制有两种主要学说 ( 一 ) 肌源性自身调节机制血管平滑肌本身经常保持一定的紧张性收缩, 称为肌源性活动 当血管平滑肌受到牵 95

224 张时, 该肌源性活动增强 因此当器官的灌注压升高时, 血管平滑肌受到牵张刺激, 肌源性活动增强, 阻力血管收缩, 血管口径缩小, 器官血流阻力增大, 器官血流量并不因灌注压的升高而增加 相反, 当器官的灌注压降低时, 肌源性活动减弱, 器官血流阻力减小, 器官血流量并不因灌注压的降低而减少, 从而使器官血流量能保持相对稳定 值得指出的是, 这种类型的调节范围较小 ( 二 ) 代谢性自身调节机制当组织代谢活动增强时, 局部组织相对缺氧, 并产生多种代谢产物, 如 CO2 H + 腺苷 K + 等积聚, 这些产物使局部的微动脉 毛细血管前括约肌舒张, 局部血流量增多, 从而向组织提供更多的氧, 并带走代谢产物 这种代谢产物自身调节局部血管舒张的效应可使组织的局部血流量与局部氧和代谢产物的浓度相适应 第五节器官循环 根据公式 Q=(P1-P2)/R 可知, 某一器官血流量取决于灌注这一器官的动 静脉之间的压力差, 也取决于该器官阻力血管的舒缩状态 由于各器官的结构和功能各不相同, 器官内部的血管分布也各有特征, 因此各器官血流量的调节除了服从上述规律外, 还有其本身的特点 本节主要叙述心 肺 脑器官的血液循环特点 一 冠脉循环 ( 一 ) 冠脉循环的解剖特点心脏的血液供应来自左 右冠状动脉 左右冠状动脉起自主动脉根部, 主干行走于心脏表面, 其小分支则以与心脏表面成直角的方向穿入心肌深层, 在心内膜下层分支成网 这种分支方式使冠脉血管很容易在心肌收缩时受挤压 左冠状动脉主要供应左心室的前部, 右冠状动脉主要供应左心室的后部和右心室 左冠状动脉的血液流经毛细血管和静脉后, 主要经冠状窦回流入右心房 ; 右冠状动脉的血液则主要经心前静脉直接回流入右心房 心肌毛细血管分布极为丰富, 与心肌纤维平行走行, 基本形成 1 1 的供应, 使心肌和冠脉之间的物质交换可很快进行 心肌肥厚时, 肌纤维直径虽增大, 但毛细血管数并无相应增加, 故肥厚的心脏易发生血供不足 冠脉之间有侧支吻合, 在心内膜下的末梢动脉吻合支较多 吻合支较细小, 血流量少 当冠状动脉突然阻塞时, 不易很快建立侧支循环, 极易导致心肌梗死 但如果冠脉阻塞是逐渐形成的, 随着吻合支的逐渐扩张, 可建立新的侧支循环, 起代偿作用 ( 二 ) 冠脉血流的特点 1. 冠脉血流丰富由于冠脉血管起自主动脉根部, 血流途径短, 整个循环时间仅需几 96

225 秒钟, 故冠脉血流压力高, 流速快, 血流量丰富 安静时冠脉流量约占心输出量的 4~5%, 每分钟 225ml, 而心脏的重量仅占体重的 0.5% 心肌活动加强时, 冠脉流量还可增加 4~5 倍 2. 冠脉血流受心肌节律性收缩的影响由于冠脉的大部分分支都深埋于心肌内, 心肌收缩时对埋于其内的血管会产生压迫, 从而影响冠脉血流 图 4-28 示狗的左 右冠状动脉血流在一个心动周期中的变化 图中可见, 心脏收缩对左冠状动脉血流的影响较对右侧的更显著 在左心室等容收缩期, 由于心肌收缩的强烈压迫, 左冠状动脉的血流急剧减少, 甚至发生倒流 在左心室射血期, 主动脉压升高, 冠状动脉血压也随着升高, 冠脉血流量增加 到减慢射血期, 冠脉血流量又有下降 心肌舒张时, 其对冠脉血管的压迫解除, 故冠脉血流的阻力显著减小, 血流量增加 在等容舒张期, 冠脉血流量突然增加, 在舒张期的早期达到最高峰, 然后逐渐回降 一般说来, 左心室在收缩期血流量大约只有舒张期的 20~30% 当心肌收缩加强时, 心缩期血流量所占比例更小 影响冠脉血流量的重要因素是动脉舒张压的高低和心舒期的长短 如体循环外周阻力增大时, 动脉舒张压升高, 冠脉血流量增多 心率加快时, 由于心动周期的缩短主要是心舒期的缩短, 故冠脉血流量减少 97

226 图 4-26 心动周期中左 右冠状动脉血流量的变化 ( 三 ) 冠脉血流量的调节在对冠脉血流量进行调节的各种因素中, 最重要的是心肌本身的代谢水平, 其次是神经 激素对冠脉血管平滑肌的调节 1. 心肌代谢水平对冠脉血流量的影响心肌收缩的能量来源几乎唯一地依靠有氧代谢 心肌耗氧量较大, 人体安静时, 心肌对单位血液氧的摄取率已达 65~70%( 骨骼肌的血液氧摄取率约 25%) 因此, 在肌肉运动 精神紧张等情况下, 心肌代谢活动增强, 耗氧量增加, 心肌从单位血液中再提高氧摄取率的可能性很小, 主要通过舒张冠脉血管, 增加冠脉血流量来满足心肌对氧的需求 心肌代谢水平与冠脉血流量之间呈正比关系 这种关系在没有神经支配和循环激素作用的情况下仍然存在 其原因是心肌代谢水平增强时, 心肌代谢产物也增加, 它们有直接舒 98

227 张冠状血管的作用 其中, 以腺苷 (adenosine) 的作用最强, 具有强烈的舒张小动脉的作用 心肌代谢水平增强时, 心肌细胞中的 ATP 分解为 ADP 和 AMP AMP 在 5 - 核苷酸酶的作用下分解生成腺苷, 使冠脉舒张 腺苷生成后, 在几秒钟内即被破坏, 因此不会引起其他器官的血管舒张 心肌的其他代谢产物如 H + CO 2 乳酸等, 虽也能使冠脉舒张, 但作用较弱 2. 神经调节冠状动脉受迷走神经和交感神经支配 迷走神经对冠脉的直接作用是冠脉舒张, 但迷走神经兴奋时又使心率减慢, 心肌代谢水平降低, 这些因素可抵消迷走神经对冠脉血管的直接舒张作用 交感神经对冠状动脉的直接作用是使血管收缩 但交感神经兴奋使心率加快, 心肌收缩加强, 耗氧量增加, 心肌代谢产物增加, 继发性地使冠脉舒张 因此刺激交感神经的效应常是冠脉先收缩后舒张, 血流增加 总之, 在整体条件下, 冠脉血流量主要是由心肌本身的代谢水平来调节 神经因素对冠脉血流的影响在很短时间内就被心肌代谢改变所引起的血流变化掩盖 3. 激素调节肾上腺素和去甲肾上腺素可通过增强心肌的代谢活动和耗氧量使冠脉血流量增加 ; 也可直接作用于冠脉血管的 α 和 β 肾上腺素受体, 引起冠脉血管收缩或舒张 甲状腺素增多时, 心肌代谢加强, 耗氧量增加, 使冠脉舒张血流量增加 血管紧张素 Ⅱ 和大剂量血管升压素均可使冠脉收缩, 冠脉血流量减少 二 肺循环肺的血液供应来源有二 : 一为体循环中的支气管循环, 供应呼吸性小支气管以上的呼吸道组织 ; 一为肺循环, 使血液在流经肺泡时和肺泡气之间进行气体交换 由于两种循环在末梢血管之间有吻合支沟通, 因此, 有一部分支气管静脉血液可通过这些吻合支进入肺静脉和左心房, 使主动脉血液中掺入 1~2% 的静脉血 ( 一 ) 肺循环的生理特点 1. 血流阻力小 血压低由于右心输出量和左心输出量基本相同, 但肺循环途径短于体循环, 分支多而短, 管径粗, 加之肺动脉管壁厚度仅为主动脉的三分之一, 弹性纤维较少, 易于扩张, 故肺循环血流阻力较小 ( 只有体循环的 1/10), 因此肺动脉压也低 肺动脉的收缩压为 22 mmhg, 舒张压为 8 mmhg, 平均压约为 13mmHg, 肺毛细血管血压平均为 7 mmhg, 肺静脉和左心房内压力为 1~4 mmhg 2. 肺血容量变化大安静时, 肺部的血容量约为 450ml, 占全身血量的 9% 但由于肺组织和肺血管的可扩张性大, 故肺部血容量的变动范围较大 在用力呼气时, 肺血容量可减少到 200ml, 约占全身血量的 6%, 用力吸气时可增加到 1000ml, 约占全身血量的 12% 由于肺循环的血容量受呼吸的周期性影响, 因此呼吸也将影响左心室输出量和动脉血压 这种因呼吸引起的血压波动, 称为动脉血压的呼吸波 ( 二级波 ) 安静时, 呼吸引起的血压波动范围在 4~6mmHg; 深呼吸时, 血压波动范围可达 20mmHg 另外, 肺循环血管也起着贮血库的作用 当机体失血时, 肺循环可将一部分血液转移至体循环, 起代偿作用 99

228 3. 无组织液生成肺循环毛细血管处无组织液生成 由于肺毛细血管平均压约为 7mmHg, 远低于血浆胶体渗透压 (25mmHg), 故组织液重吸收力量大于滤过的力量, 肺组织间隙内无组织液生成, 肺泡内也没有液体积聚 加之肺组织间隙压力为负压, 使肺泡膜和毛细血管壁紧贴, 呼吸膜维持正常厚度, 有利于肺气体交换 在某些病理情况下, 如左心衰竭时, 肺静脉压升高, 逆行性地使肺循环毛细血管压升高, 组织液生成增多, 液体在肺泡和组织间隙积聚, 形成肺水肿 (pulmonary edema) ( 三 ) 肺循环血流量的调节 1. 肺泡气氧分压的调节肺泡气的氧分压对肺血管的舒缩活动有明显的影响 肺泡气低氧能使肺部血管收缩, 血流阻力增大 在肺泡气 CO 2 分压升高时, 肺泡气低氧引起的肺部血管收缩更加显著 肺泡气低氧引起局部缩血管反应的机制尚不清楚, 但具有一定生理意义 当一部分肺泡因通气不足而氧分压降低时, 这些肺泡周围的血管收缩, 血流减少, 可使较多的血液流经通气充足 肺泡气氧分压高的肺泡, 有助于肺泡气体交换的进行 假如没有这种缩血管反应, 血液流经通气不足的肺泡时, 气体交换效率降低, 血液不能充分氧合, 这部分含氧较低的血液回流入左心房, 就会降低体循环血液的含氧量 肺泡气低氧引起肺血管收缩, 也是产生肺动脉高压, 导致肺心病的重要原因 长期居住在高海拔地区的人常因右心负荷加重而导致右心室肥厚 在有些慢性肺部疾患的病人, 也可因肺动脉高压导致右心衰竭 2. 神经 体液调节肺血管受交感神经和迷走神经支配 刺激交感神经对肺血管的直接作用是引起收缩, 刺激迷走神经可使肺血管舒张 在体液因素中, 肾上腺素 去甲肾上腺素 血管紧张素 Ⅱ 血栓素 A2 前列腺素 F2α 等能使肺循环的微动脉收缩, 组胺 5- 羟色胺则能使肺循环的微静脉收缩, 乙酰胆碱使肺血管舒张, 但在流经肺循环后即分解失活 三 脑循环脑血液供应来自颈内动脉及椎动脉, 在脑的底部联成脑底动脉环, 由此分支分别供应脑的各部 脑静脉血进入静脉窦, 主要通过颈内静脉流回腔静脉 ( 一 ) 脑循环的特点 1. 血流量大 耗氧多脑组织的代谢率高, 血流量较大 在安静情况下, 脑血流量每分钟 750ml 左右, 约占心输出量的 15%, 其耗氧量约占全身耗氧量的 20%, 而脑的重量仅占体重的 2% 此外, 由于脑组织代谢率高, 脑神经细胞对缺氧的敏感性高, 耐受力低, 这就要求脑循环有充足的血液供应, 以保证代谢的需要 若脑血流中断 10 秒左右, 就可能出现意识丧失 2. 血流量变化小脑组织 脑血管和脑脊液都位于颅腔内 由于骨性的颅腔容积是固定的, 以及脑组织和脑脊液都是不可压缩的, 故脑血管的舒缩活动受到一定的限制, 其血流量的变化较其他器官要小 3. 血 - 脑屏障和血 - 脑脊液屏障正常毛细血管血浆成分与脑组织液不同, 表明血液 100

229 和脑组织之间存在可限制物质自由交换的屏障, 称为血 - 脑屏障 血 - 脑屏障对脂溶性物质很容易通过, 对水溶性物质的通透不一定和分子大小相关, 有些物质如葡萄糖 氨基酸通透性较高, 有些物质如离子 甘露醇 蔗糖通透性很低, 甚至不通透, 表明物质的转运是主动的过程 脑循环的毛细血管壁内皮细胞相互接触紧密, 形成无孔的毛细血管壁, 其表面被星状神经胶质细胞伸出的血管周足所包绕 血液和脑组织液之间的物质交换要通过胶质细胞中介 因此, 血 - 脑屏障的结构基础是无孔的毛细血管壁和星状神经胶质细胞的血管周足以及它们对各种物质特殊的通透性 脑脊液主要是由脉络丛分泌的, 但其成分和血浆不同 这表明血液和脑脊液之间的物质交换不是被动转运过程, 而是主动运输过程, 仿佛在血液和脑脊液之间存在着限制某些物质的交换的屏障, 称为血 - 脑脊液屏障 血 - 脑脊液屏障的结构基础是无孔的毛细血管壁和脉络丛细胞中运输各种物质的特殊载体系统 血 - 脑屏障和血 - 脑脊液屏障的生理意义在于保持脑组织内环境的稳定, 防止血液中有害物质进入脑内, 为脑神经元的正常活动创造必要条件 ( 二 ) 脑血流量的调节 1. 脑血管的自身调节脑血流量主要取决于脑动 - 静脉的压力差和脑血管的血流阻力 在正常情况下, 颈内静脉压接近于右心房压, 且变化不大, 故影响脑血流量的主要因素是颈动脉压 当平均动脉压在 60~140mmHg(8.0~18.67kPa) 的范围内变动时, 脑血流量可通过其自身调节机制使脑血流量保持相对稳定 血压在此范围内变动时, 血压升高则脑血管收缩, 血压下降则脑血管舒张 当血压超过 140mmHg 时, 脑血流量将随血压升高而明显增加, 若血压过高, 可因毛细血管血压过高而引起脑水肿 2.CO 2 和 O 2 分压对脑血流量的影响 当血液 CO 2 分压升高和低氧时, 脑血管舒张非 常明显, 脑血流量增加 反之, 过度通气使 CO 2 分压降低时, 脑血流量减少, 可引起头晕等症状 CO 2 对血管的舒张作用是通过生成 NO 的环节实现的 ; 低氧的舒血管效应则依赖于 NO 腺苷的生成和 K + 通道的激活 3. 脑的代谢对脑血流量的影响脑各部分的血流量与该部分脑组织的代谢活动程度有关 当脑的某一部位活动加强时, 该部分的血流量就增多 代谢活动加强引起局部脑血流量增加的机制, 可能是通过增加代谢产物如 H + K + 腺苷 CO 2 分压增加和 O 2 分压降低, 引致脑血管舒张 近年的研究指出, 脑的代谢产物可使有些神经元释放 NO, 后者扩散到血管平滑肌细胞, 使血管舒张 4.NO NO 是由内皮细胞合成和释放的一种舒血管物质 血液中的一些活性物质, 如乙酰胆碱 缓激肽 组胺 ATP 等, 可以通过脑血管内皮细胞膜上的相应受体, 使内皮产生 NO, 后者扩散到血管平滑肌细胞, 引起脑血管舒张 5. 神经调节脑血管受交感缩血管纤维与副交感舒血管纤维支配, 但在脑血流量的调节中所起作用不大 刺激或切除支配脑血管的交感或副交感神经, 脑血流量无明显变化 在 101

230 多种心血管反射中, 脑血流量一般变化都很小 有人认为, 刺激交感神经可使较大的脑动脉 收缩, 但这些动脉下游的小动脉则通过自身调节机制而舒张, 因此脑组织的血流并不减少 ( 杨午鸣单绮娴 ) 复习思考题 : 1. 名词解释 : 最大复极电位, 期前收缩, 代偿间歇, 自动节律性, 房室延搁, 心动周期, 每搏输出量, 心输出量, 心指数, 射血分数, 心力贮备, 心室功能曲线, 心肌收缩能力, 血压, 循环系统平均充盈压, 收缩压, 舒张压, 平均动脉压, 中心静脉压, 微循环, 有效滤过压, 心血管中枢, 动脉压力感受性反射 2. 试述心室肌动作电位的特点及形成原理 3. 试述心肌细胞中快反应细胞与慢反应细胞的区别 4. 试述快慢反应自律细胞 4 期自动除极的形成机制 5. 试述心肌动作电位和心电图的关系 6. 何谓心动周期? 在一个心动周期中心房和心室活动的顺序是怎样的? 心率加快时, 对心动周期有何影响? 7. 试述评价心脏泵功能的指标及生理意义 8. 分别增加心室的前负荷和后负荷对心输出量有何影响? 9. 试述影响动脉血压的因素 10. 试述影响静脉回流的因素 11. 微循环是如何进行调节的? 12. 试述心交感神经的生理作用及其作用机制 13. 试述心迷走神经的生理作用及其作用机制 14. 人体动脉血压是如何保持相对稳定的? 15. 试述肾上腺素和去甲肾上腺素对心血管的生理作用 16. 试述冠状循环的特点及其血流量的调节 102

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233 目 录 第一部分人体形态学实验概论 第一章人体形态学实验概述 (1) 第二章人体形态学实验的历史与发展 (1) 第三章人体形态学实验常用仪器介绍 (2) 一 光学显微镜的结构与使用 (2) 二 几种特殊光学显微镜 (4) 三 电子显微镜技术 (4) 第四章人体形态学实验方法学 (5) 一 组织切片的一般制作方法 (5) 二 实验方法及基本要求 (7) 三 组织化学和免疫组织化学 (9) 第五章人体形态学实验的教学要求 (9) 第六章人体形态学实验与医学伦理 (10) 第七章实验室规则与制度 (11) 一 实验室规则 (11) 二 赔偿制度 (11) 三 实验室注意事项 (11) 第二部分人体形态学实验基础 第一篇正常人体基本组织学实验 实验一实验二实验三实验四 上皮组织 (13) 结缔组织 (17) 肌肉组织 (22) 神经组织 (24)

234 第二篇胚胎学实验 实验五 胚胎发育 (27) 第三篇人体病理学实验基础 实验六 实验七 实验八 主要脏器观察 (33) 细胞和组织的损伤 (37) 修复 代偿与适应 (43) 实验九血液循环障碍 (45) 实验十 炎症 (50) 实验十一肿瘤 (53) 第三部分系统人体形态学实验 第一篇运动系统 实验十二骨与骨连接 (58) 实验十三骨骼肌 (61) 第二篇血液与造血系统 实验十四血细胞与骨髓 (63) 第三篇循环系统 实验十五心脏的解剖结构 (65) 实验十六心脏的组织结构 (66) 实验十七脉管系统解剖结构 (68) 实验十八动 静脉组织结构 (71) 实验十九淋巴系统解剖与组织结构 (74) 实验二十心血管系统病理 (77) 第四篇呼吸系统 实验二十一呼吸系统解剖结构 (81)

235 实验二十二呼吸系统组织结构 (83) 实验二十三呼吸系统病理 (86) 第五篇消化系统 实验二十四消化系统解剖结构 (89) 实验二十五消化管组织结构 (91) 实验二十六消化腺组织结构 (96) 实验二十七消化系统病理 (99) 第六篇泌尿系统 实验二十八泌尿系统解剖结构 (104) 实验二十九泌尿器官组织结构 (105) 实验三十 泌尿系统病理 (108) 第七篇神经系统 实验三十一周围神经解剖结构 (110) 实验三十二中枢神经解剖结构 (113) 实验三十三传导路解剖结构 (117) 实验三十四内脏神经解剖结构 (119) 实验三十五脑和脊髓的被膜 血管和脑脊液循环 (121) 实验三十六神经系统组织结构 (123) 第八篇感觉器官 实验三十七视器的解剖与组织结构 (125) 实验三十八位听器的解剖与组织结构 (127) 实验三十九皮肤组织结构 (129) 第九篇内分泌系统 实验四十 内分泌系统解剖与组织结构 (131) 实验四十一内分泌系统病理 (134)

236 第十篇生殖系统 实验四十二男性生殖系统 (135) 实验四十三女性生殖系统 (139) 第十一篇免疫系统 实验四十四免疫系统解剖与组织结构 (144) 第十二篇感染性疾病 实验四十五传染病与寄生虫 (146) 第四部分临床病理讨论 病例一 (149) 病例二 (150) 病例三 (151) 病例四 (152) 病例五 (153) 病例六 (153) 病例七 (154)

237 第一部分 人体形态学实验概论 第一章人体形态学实验概述 人体形态学属于医学科学中形态学科的范畴, 以人体各系统 器官和组织的形态结构 位置毗邻 相互关系 基本功能以及生长发育规律为观察研究的主要目标 在我国, 人体形态学教学主要指解剖学 组织胚胎学和病理解剖学 解剖学和组织学以研究正常的形态为主, 也包括畸形和变异 ; 病理解剖学则是研究病理状态的形态学 形态学的研究方法主要有肉眼观察 光学显微镜观察和电子显微镜观察 肉眼观察包括进行尸体解剖和对标本进行观察 ; 光学显微镜观察和电子显微镜观察需要制作相应的切片进行 现代的形态学研究还利用 X 线 计算机辅助 X 线断层扫描 (CT) 及核磁共振 (MRI) 等影像学先进技术进行观察 在医学及相关专业的本科生教学中, 形态学的实验方法基本以肉眼观察和显微镜观察为主, 包括亲自动手进行尸体解剖和观察各种标本和组织学 病理学切片, 也辅以光学显微镜和电子显微镜照片和图像示教等 第二章人体形态学实验的历史与发展 人体解剖学具有漫长的发展历史, 可以说是一门伴随医学的发展而发展的科学 早在公元前 400 多年前, 我国的第一部医学巨著 内经 中就曾有人体构造方面的论述, 并提出 解剖 一词, 即使用解开剖视的方法来研究人体的构造, 但由于长期受封建制度的束缚, 解剖学始终融合在传统医学之中, 没有形成独立的学科体系 西方医学对解剖学的记载, 始于古希腊名医 Hippocrates( 公元前 460~377), 他认为心脏有两个心室和两个心房, 并对头骨作了较为正确的描述 之后 古希腊学者 Aristotle( 公元前 384~322) 在研究动物结构的基础上使用了 anatome 一词, 其原意也是切开进行观察 16 世纪比利时医学家 Vasalius( 维萨里,1514~1564) 冒着被宗教迫害的危险, 亲自解剖人尸, 于 1543 年出版了巨著 人体构造 一书, 成为国际公认的人体解剖学奠基人 M. Malpighi(1628~1694) 用显微镜观察了动 植物的微细结构, 提出动 植物均由细胞组成的概念, 为组织学从解剖学中分出并形成一门学科奠定了基础 20 世纪发明电子显微镜, 广泛应用于细胞的超微结构与三维构筑的研究, 使形态学跨入细胞和亚细胞水平并进而达到分子水平 由此可见, 形态学的发展是随着科学技术的发展不断创新而逐渐发展的, 形成了大体解剖学 显微解剖学和超微解剖学这三个不同的阶段 随着影像技术和计算机技术大发展, 促使人们必须研究人体人体断面和器官内部结构, 对形态学提出了更深入的要求, 从而产生了断面解剖学这一新的学科

238 第三章人体形态学实验常用仪器介绍 一 光学显微镜的结构与使用 光学显微镜是本课程学习时最重要的工具之一, 属贵重仪器, 因此我们必须在了解它的 构造基础上妥善使用和保护 光学显微镜结构见图 1 图 1 光学显微镜结构示意图 ( 一 ) 显微镜的一般构造 1. 镜座 : 最下部, 起支持作用 在镜座左侧下方有一电源开关和电光源亮度调节器 电光源亮度调节器用来调节光源强弱, 来选择自己最适亮度

239 2. 镜臂 : 位中部, 起支持和握取作用 3. 镜筒 : 一般分为内 外二层 4. 目镜 : 为双筒, 它嵌于镜筒之顶端, 根据需要, 可自行调节双筒目镜的间距 目镜上刻有 5 或 10 等字样, 表示其目镜放大倍数 5. 旋转盘 : 接于筒镜下方, 上嵌物镜, 可以旋转, 来更换物镜 6. 物镜 : 嵌于旋转盘下, 分低倍 高倍和油镜三种, 其上均刻有物镜放大倍数, 如 低倍镜 : 它有二种, 一种放大约 4 倍, 镜头最短, 有红线标记 ; 另一种放大约 10 倍, 镜头较长, 镜面较小, 有浆红色线作标记 2 高倍镜 : 放大约 40 倍, 镜头较长, 镜面较小, 有绿线标记 3 油镜 : 放大约 100 倍, 镜头最长, 镜面最小, 有淡蓝色线作标记, 使用时在镜头与玻片之间要加香柏油, 以提高显微镜的分辨率 7. 粗调节器 : 位于镜臂下方, 转轮较大 8. 细调节器 : 位于粗调节器中间, 转轮较小, 在外并有一升降刻度 9. 镜台 : 为放置玻片的平台, 中央有一园孔, 光线可通过此孔, 镜台上装有玻片推进器 10. 副镜面 : 1 集光器 : 由多块透镜组成, 用以集聚光线 2 光圈 : 位于集光器下方, 可任意缩小和扩大 11. 光源 : 位于镜座中间的园柱形结构, 内装有小灯泡 为本显微镜光源, 灯泡上面可放置各种滤色镜片 ( 二 ) 显微镜的使用规则 1. 携取 右手握持镜臂, 左手托住镜座 2. 放置 镜臂向前 镜台向后, 置座位偏左侧 3. 对光 本显微镜光源不来源于外界自然光, 而它本身有一电光源作自己光源, 因此插上电源插头后, 打开开关, 转低倍镜上观察, 使视野内明亮度自己感觉舒适为宜 两目镜之间距离可自行调节, 如光源太强, 观察时则刺眼 ; 光源太弱, 观察时有不舒服之感 4. 装上组织切片 对光后, 用粗调节器升高镜筒, 将切片标本平置镜台上 ( 注意 : 盖玻片必须向上, 否则用高倍镜时不能看清并易压碎切片和损坏镜头 ) 然后将标本片移至园孔中央 5. 使用低倍镜 依下列步骤进行 : 1 先将粗调节器往外转, 并用双眼在镜侧看好, 使镜筒慢慢下降至距玻片约 3 mm 止 ( 注意 : 勿使镜头与玻片直接接触 ) 2 双眼注视目镜, 并将粗调节器向内转,( 使镜筒慢慢上升 ) 至见到物像止 3 转动细调节器, 使物像达到最清晰止 4 如光线太强或太弱时, 或切片位置不当, 均于此时调节改正 注意 : 低倍镜视野大而清晰, 可以看清较多的结构, 因此在观察和寻找组织器官时, 尽量在低倍镜下用功夫 如欲观察细胞的结构, 再用高倍镜, 但在高倍镜的视野中能看见的范围小, 故在使用之前, 必须在低倍镜下把要观察的部分先移到视野中央, 再转用高倍镜 否则, 在高倍镜下很难找到需要观察的结构 6. 使用高倍镜 在低倍镜下将需观察的结构移至视野中央后, 把高倍镜转至镜筒下方, 再用细调节器调节焦距, 即可得到清晰的物像

240 7. 使用油镜 在使用油镜之前需作好二个准备 : 将油镜镜头和玻片用 1:1 乙醚纯酒精或二甲苯拭净, 先用低倍镜和高倍镜找到需要观察的物体, 并移至视野中央 接着 : 1 先把镜头升高约 1 cm 2 油镜头转至镜筒下方 3 滴香柏油一滴于切片上欲观察之处 ( 注意 : 滴香柏油时, 勿产生气泡 ) 4 两眼从侧面看镜头慢慢下降至镜头浸入油滴, 但与玻片相隔约 0.5 mm 左右 5 双眼注视目镜, 并用细调节器调节至最清晰时止 ( 注意 : 使用油镜时, 光线需强 ) 6 油镜使用后, 必须用擦镜纸抹去镜头和玻片上的油迹, 然后再用少量 1:1 的乙醚纯酒精拭净 8. 收藏 使用完毕后, 首先关掉电源开关, 拔掉电源插头, 移去玻片 再将镜头下降, 把物镜转到两侧 然后转动粗调节器, 使镜筒下降至最低处, 最后放回橱内 ( 三 ) 显微镜的保护 1. 必须用两手来携取和送还显微镜, 即用右手握住镜臂, 左手托住镜座 2. 使用时, 勿使尘埃 湿气 水滴 药品等沾及显微镜的任何部位 3. 目镜和物镜上遇到灰尘或污物时, 禁止口吹和手后, 以免损伤透镜, 而需用擦镜纸或绸布擦净, 如果干拭不净则用擦镜纸或绸布蘸一滴 1:1 乙醚纯酒精将污物拭去 4. 严禁拆卸 调换和玩弄目镜和物镜, 取用镜头时, 手指切勿触及它 5. 使用细调节器或推进器时勿用力过猛, 以免受损 6. 离开座位时, 需将镜身推向桌子中央, 以免撞翻 ( 四 ) 其他 1. 必须牢记 先低倍, 后高倍, 盖玻片向上 2. 显微镜放大倍数 = 目镜放大倍数 物镜放大倍数 二 几种特殊光学显微镜 1. 荧光显微镜 (fluorescence microscope) 可用来观察标本内的自发荧光物质或荧光素染色或标记的结构, 由光源 滤片系统和显微镜三个部分构成 光源为高压汞灯, 可产生短波的紫外光, 受检标本内的荧光, 取决于光源激发光的强度 细胞内的某些成分可与荧光染料结合而发出荧光, 如溴乙啶与吖啶橙可与 DNA 结合而发荧光, 以此进行细胞内 DNA 测定 荧光显微镜也广泛用于免疫化学研究, 首先用荧光素标记抗体, 然后用该标记抗体直接地与细胞内相应抗原结合, 以测定该抗原的分布 2. 倒置相差显微镜 (inverted phase contrast microscope) 此种显微镜是把光源和聚光器安装在载物台上方, 物镜放置在载物台的下方, 这样可将细胞培养标本直接放在载物台上观察 相差显微镜是将活细胞不同厚度及细胞内不同结构对光产生不同折射, 转换成光密度差异, 使镜下结构反差明显, 图象清晰 倒置相差显微镜常用于组织培养, 能观察活细胞形态及生长情况 3. 暗视野显微镜 (dark-field microscope) 主要观察反差小或分辨力不足的微小颗粒 此种显微镜有一个暗视野集光器, 使光线不直接进入物镜, 故称暗视野 标本内的小颗粒产生的衍射光或散射光进入物镜, 故使暗视野中的小颗粒呈明亮小点 暗视野显微镜的分辨率可达 µm, 适用于观察细胞内线粒体的运动及液体介质中未染色的细菌 酵母 霉菌等微粒的运动 4. 激光共聚焦扫描显微镜 (confocal laser scanning microscope, CLSM) CLSM 是 20 世纪 80 年代初研制成功的一种高光敏度 高分辨率的新型生物学仪器 它主要由激光光源 共聚焦成像系统 电子光学系统和微机图像分析系统四部分组成 此外, 还附有外接探测器

241 ( 由电脑进行遥控或图像传送 ) 高分辨率的彩色显示器 图像打印机和 35 mm 照相装置等 CLSM 可以更准确地检测 识别组织或细胞内的微细结构及其变化, 也可对细胞的受体移动 膜电位变化 酶活性以及物质转运进行测定, 并以激光对细胞及染色体进行切割 分离 筛选和克隆 三 电子显微镜技术 (electron microscopy) 电子显微镜 (electron microscope) 简称电镜 电镜的发明和使用, 使形态学研究发生了深刻变化 光镜分辨率为 0.2 µm, 放大倍数约为 1,000 倍, 而电镜的分辨率为 0.2 nm, 比光镜高 1,000 倍, 可放大几万倍至几十万倍, 因此电镜能观察到更细微的结构 在电镜下所见的结构称为超微结构 (ultrastructure) 根据电镜的结构和功能又可以分为透射电镜和扫描电镜 (1) 投射电镜 (transmission electron microscope) 用于观察细胞内部结构, 标本制备比光镜的要求严格, 组织块要更新鲜, 体积更小 (1 mm 3 ), 固定常用戊二醛和锇酸 切片则用超薄切片机, 制成 50~80 nm 的超薄切片, 用醋酸铀和柠檬酸染色, 然后在电镜下观察并摄片 (2) 扫描电镜 (scanning electron microscope) 用于观察组织或细胞表面的细微结构, 标本需经喷镀金属膜特殊处理, 然后在扫描电镜下观察, 在荧光屏上扫描成像, 呈现富于立体感的表面图像, 如细胞表面的微绒毛 纤毛和细胞伸出的伪足等 第四章人体形态学实验方法学 一 组织切片的一般制作方法 ( 一 ) 制片方法的种类在实验教学中所观察的组织切片种类较多, 各种组织切片所采取的制片方法种类也有所不同, 主要有以下几种 : 1. 切片标本 : 此种组织标本制片法是组织学研究中最为广泛应用的基本方法 根据所用的支持物质不同, 切片方法可分为石蜡包埋切片 火棉胶包埋切片和冰冻切片, 尤以石蜡包埋切片最常用 石蜡和火棉胶包埋切片制作过程中, 组织都得经过取材 固定 脱水 透明 石蜡或火棉胶包埋 切片 染色和封固等步骤 而冰冻切片只经过取材 固定 冰冻 切片 染色和封固等步骤 后者通常用于组织化学研究 2. 涂片标本 : 把人体内液态的组织成分如血液 骨髓或内脏器官的排出物如精液 阴道脱落细胞等直接涂抹在载玻片上, 经固定和染色制成组织标本 用以观察细胞的形态及其微细结构 3. 铺片标本 : 将膜状组织结构如大网膜 肠系膜或皮下疏松结缔组织 神经丛等结构成分伸展后平铺于载玻片上, 经固定 染色和封固等步骤制成组织标本 主要用于观察各种结构成分的整体形态和微细结构 4. 磨片标本 : 把坚硬的骨和牙, 不经脱钙而直接磨成薄片, 不染色或经过染色后, 封固制砀标本, 如骨磨片 牙磨片等 5. 压片标本 : 将小块组织经药物处理 染色后, 用盖玻片压平于载玻片上所制成的标本, 如运动终板 肌梭等 用以观察其结构的整体形状

242 6. 分离标本 : 把组织块浸入化学药品分离液内, 分解细胞间质, 使细胞分离, 再染色和封固制成的组织标本, 即可观察单个完整的细胞如肌纤维 神经原等 7. 血管注射标本 : 将卡红 普鲁士兰 墨汁等染料加明胶配制成染色液注入血管内, 然后取材 固定, 包埋 切片和封固所制成的标本, 如肝 肾 肺 小肠等血管注射切片标本, 以观察这些器官的血管分布特点 8. 整体装片标本 : 将很小的动物或早期胚胎, 经固定 染色和封固制成的标本, 例如鸡胚整体标本, 以观察胚体的表面立体形态特征 9. 活体标本 : 指光镜下直接观察活细胞或组织的形态和动物状况的标本, 如精子运动 纤毛运动等 ( 二 ) 制片方法的主要程序组织标本的各种制片方法在具体操作上虽然有所不同, 但其基本程序是类同的, 都需要经过取材 固定, 染色和封固等主要步骤 如果是切片标本, 则需要增加一个切片步骤 现把各种制作方法归纳为切片法和非切片法两大类, 并将其主要操作程序列表介绍如下 ( 见图 2) 至于详细操作过程, 可查阅有关技术书籍 ( 三 ) 几种常用的染色方法在自然状态下绝大多数组织是无色 不透明的, 需要相应的方法制成薄片, 再经过染色和透明后才能供显微镜观察 组织制片中最常用的方法是石蜡包埋切片, 经苏木素 (Hematoxylin) 和伊红 (Eosin) 染色 ( 简称 HE 染色切片 ), 通常称之为普通染色切片或常规染色切片 除此以外的其它各种染色方法则称为特殊染色 现对该种常规制片染色方法的制作过程详细介绍如下, 并举一反三地例举其它几种常用的特殊染色方法, 使同学对实验中将要观察的组织标本的染色和制作过程有所了解 切片法非切片法 血管注射切片冰冻切片火棉胶切片石蜡切片分离法整体装片 涂片 压片 铺片 磨片 注色取材取材取材取材取材取材 取材固定固定固定固定固定磨片 固定浸洗浸洗浸洗浸洗浸洗浸洗 脱水脱水脱水分离 透明纯酒精乙醚透明浸洗 包埋冰冻透胶浸蜡 切片 包埋 切片

243 染色 脱水 透明 封固 图 2 制片方法和主要操作程序 1. 石蜡包埋切片与 HE 染色法 (1) 取材 : 材料愈新鲜愈好, 以防组织的死后变化 组织块厚度不应超过 0.5 cm (2) 固定 : 将组织块放入 10% 福尔马林 Bouin 液等固定剂中固定 24 小时, 使组织细胞的蛋白质变性, 以保存其原有的形态 (3) 浸洗 : 固定后须经流水或酒精洗涤, 直至组织内的固定剂洗净为止, 一般约 24 小时 (4) 脱水 : 经过 50% 70% 80% 90% 95% 100% 各级酒精脱水, 每级为 2~6 小时, 其目的在于除去组织中的水分, 代之以酒精 (5) 透明 : 组织脱水后, 浸入二甲苯内直至透明为止, 使组织中的酒精被透明剂取代后才能浸蜡包埋 一般为半小时至 2 小时 (6) 浸蜡 : 入温热熔融的石蜡内浸透数小时, 通常为 2~4 小时即可 (7) 包埋 : 将温热之石蜡倒入一定形状的容器内, 使组织凝固其中, 以待切片 (8) 切片 : 用切片机将含有组织的蜡块切成厚度 5~8 µm 薄片 (9) 贴片与烘干 : 在清洁的载玻片上匀涂微量蛋白甘油, 再滴上数滴蒸馏水, 并将蜡片置于水面上, 在烘片台上使蜡片展平后烘干 (10) 脱蜡与入水 : 切片浸入二甲苯内 10~20 分钟, 再依次经过 100% 95% 90% 80% 70% 酒精各 5 分钟, 然后入蒸馏水 2 分钟 (11) 染色 : 切片放入苏木精染液 5~10 分钟 自来水洗 2 分钟 0.5% 盐酸溶液分色数秒钟 ( 光镜下检查胞核呈浅红色, 细胞质及胶原纤维几乎无色 ) 蒸馏水洗 流水冲洗半小时 蒸馏水 1 分钟 70% 80% 90% 酒精各 5 分钟 0.5% 伊红染液 ( 以 90% 酒精为溶剂 ) 3~5 分钟 95% 酒精分色 ( 至无红色自组织上脱下为止 ) (12) 脱水 : 已染色的组织切片依次放入 95% 酒精 1~2 分钟 100% 酒精 (Ⅰ) (Ⅱ) 各 10 分钟 (13) 透明 : 切片脱水后放入二甲苯 (Ⅰ) (Ⅱ) (Ⅲ) 内, 每道各 10 分钟 (14) 封固 : 将已透明的组织切片从二甲苯中取出, 滴加树胶, 盖上盖玻片封存 染色结果 : 细胞核呈紫蓝色, 细胞质和细胞间质的某些有形成分则呈粉红至红色 2. 镀银染色法 : 机体中某些组织结构成分, 经硝酸银处理后形成细小的银微粒附着在组织结构上, 再经还原使其呈棕黑色, 便于光镜下观察 此法主要用于显示网状纤维, 嗜银细胞, 神经组织等组织结构成分, 应用范围仅次于 HE 染色 3.Wright s 染色法 : 常用于血涂片的制作 4. 活体染色法 : 把无毒或毒性很小的染料如台盼蓝 墨汁等注射到动物体内, 通过巨噬细胞的吞噬作用, 将染料吞噬于细胞内, 以此识别巨噬细胞

244 二 实验方法及基本要求 1. 观察 : 本课程的实验标本主要是切片, 观察切片时, 对每张切片都应按照实验指导, 先用低倍将切片全部观察一遍, 然后选择适当的部位转高倍镜仔细观察 显微镜下看到的形态结构往往和理论上所描写的情况并不完全一样, 追寻原因, 大致有如下几种 : (1) 出现情况不同, 其形态结构可能产生差异 如腺细胞一般呈立方形, 但充满分泌物时, 细胞可转为柱形 ; 分泌物完全排出时, 则可变成低立方形, 甚至是扁平形 (2) 由于切面关系, 在立体结构不同切面上, 其形态不可能全部一样 在理论讲解时, 我们总是以全面地 立体地观点加以介绍, 但在实际观察切片时, 由于切面限制, 我们只能看到立体结构的一个切面, 如图 3 (3) 由于染色的限制, 在理论上所描述的组织结构, 不能用 HE 染色显示出来, 而要通过各种特殊染色才能加以补充显示, 如肥大细胞 神经原纤维 小肠内的嗜银细胞等 (4) 由于人工伪像的干扰, 活细胞或组织在制片过程中会受到某些因素的影响, 例如脂肪细胞的脂滴被溶后形成空泡, 软骨细胞的皱缩现象, 组织结构之间的裂隙以及染料残渣, 刀痕 气泡等都属于人工伪像, 观察时应注意加以识别 图 3 神经细胞的不同切面, 有不同表现 2. 绘图 : 为加强记忆, 选择某些重点切片, 在仔细观察的基础上进行绘图 绘图要求做到 : (1) 科学性 : 所绘结构和文字说明应当要概念清楚, 正确无误 (2) 真实性 : 力求反映镜下所见的真实微细结构, 颜色应尽量与其相应 (3) 特征性 : 图中应突出所观察的细胞 组织或器官的结构特征 (4) 艺术性 : 图面设计 大小比例 颜色深浅 线条粗细等都应合理适当, 要有艺术感 (5) 认真程度 : 一幅图的质量和认真程度如何, 可以反映同学的学习态度是否端正 图 4 示范绘图记录格式

245 图 4 绘图格式示范 绘图过程中注意用相应的彩色笔 例如 HE 染色切片, 可用蓝色绘胞核, 红色绘胞质, 绘好图后, 将各种结构引出标线, 用铅笔分别用中英文标明内容, 标线要平行整齐, 图下面应注明标本名称 染色方法 放大倍数 3. 示教 : 按实验指导及示教简图辨认管状器官的切面 ( 图 5) 和束状器官的切面 ( 图 6) 4. 电镜图片观察 : 认识重点内容的超微结构 (1) 透射电镜图像的观察 : 着重观察细胞膜 细胞外形, 细胞器和细胞核的超微结构 (2) 扫描电镜图像的观察 : 着重于细胞 组织或器官表面的形成结构及整体 立体关系 5. 观看录像 : 了解一些基本实验操作, 进一步深化理论内容的理解

246 图 5 管状器官的不同切面 图 6 束状器官的不同切面 三 组织化学与免疫组织化学 ( 一 ) 组织化学 (histochemistry, HC) 组织化学是应用化学反应与物理反应原理检测组织或细胞内某种化学成分并进行定位 定量及相关功能研究的技术 (1) 多糖显示多糖或蛋白多糖的常用方法是过碘 - 雪夫反应 (periodic acid Schiff reaction, PAS 反应 ) 组织或细胞中的多糖被结合形成紫红色沉淀物 此反应称 PAS 阳性反应,PAS 阳性部位为多糖存在的部位 (2) 脂类标本用甲醛固定, 冷冻切片, 用油红 O 尼罗蓝或苏丹类染料染色, 使组织和细胞中的类脂物质显示相应颜色 亦可用锇酸固定兼染色, 脂类呈黑色 (3) 酶酶细胞化学反应的基本原理是利用酶对其相应底物的水解 氧化等作用, 使底物的反应产物被某种捕获并在原位沉淀, 形成有色的终产物, 借此测定该酶在细胞内的分布及活性强弱 (4) 核酸显示 DNA 的传统方法是 Feulgen 反应 (Feulgen reaction) 组织切片或细胞涂片先经盐酸处理, 使 DNA 水解, 醛基暴露, 再用雪夫试剂处理, 形成紫红色产物 ( 二 ) 免疫组织化学 (immunohistochemistry, IHC) 免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一门技术, 它是免疫学和传统的组织化学相结合而形成的 免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性, 其特点是将形态学改变与功能 代谢变化结合起来, 直接在组织切片 细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质或多肽物质的存在, 并可精确到亚细胞结构水平, 结合电子计算机图像分析系统或激光共聚焦显微镜等可对被检物质进行定量分析 第五章人体形态学实验的教学要求 学习人体形态学必须以探索和掌握形态特征为主, 然而, 形态不是孤立静止的, 故学习

247 时应该运用进化发展的观点, 形态与功能结合的观点, 局部与整体统一的观点, 和理论联系实际的观点来观察与研究人体的形态构造, 这样才能正确地 全面地认识人体的形态 人体形态学名词多, 描述多是其特点, 那种脱离标本实物, 死记硬背的方法是难以学好的 在学习过程中要逐步地学会动手解剖, 准确地辨认所解剖或观察到的结构, 注意分析归纳以理解其形态特征, 在理解的基础上进行记忆 重视实验 ( 对尸体解剖 组织切片 模型等的学习 ), 加深印象 端正学习态度, 认真进行尸体解剖, 珍惜爱护尸体和标本 不怕脏, 不怕累, 不怕异味刺激 勤动手, 善观察, 多动脑 认真做好预习, 了解要实验的内容和重点以及实验程序, 做到心中有数 实验进程中严格按照操作的要求和顺序进行 对尸体标本, 既要解剖清楚, 充分暴露, 又不可盲目切割, 任意行事 实验中要相互帮助, 在教师的指导下展开讨论, 解决学习中的重点 难点和疑点 第六章人体形态学实验与医学伦理 人体形态学实验是以人体标本为主要实验材料, 属于人体实验范畴 由于人体实验在现代医学和医学研究中有着极其重要且不可替代的作用和地位, 所以现代人体实验的道德争议已不在能不能在人体上进行实验, 而在于如何进行人体实验, 杜绝滥用 在历史上, 我国由于封建社会伦理道德的长期统治和影响, 尸体解剖是被禁止的, 被认为是大逆不道的事情 所谓 身体发肤, 受之父母, 损坏了就是 不孝, 而毁人尸体, 更是不合封建的仁义之道 据 南史 顾凯之传 记载 : 一妇女因遵丈夫遗嘱, 解剖了丈夫的尸体, 结果以 伤夫五脏不道 的罪名被判处徒刑, 子不能劝阻, 竟以 不孝 之罪被杀头 因此, 我国虽早在二千多年前的医书就有关于人体解剖的位置的粗略描述, 到近代也有像王清任那样敢冒不讳的医家在坟山弃尸身上作解剖的探求, 但却由于封建伦理道德的长期影响和束缚, 尸体解剖一直被认为是不道德的事, 因而人体解剖在我国一直没有能够发展成为一门独立的学科, 这给祖国医学的发展带来了一定的局限性 在中世纪的欧洲, 由于教会的统治和禁令, 人体解剖同样被视为有违圣经, 属于不道德的行为而被禁止 长期来, 人们只能凭借直观和臆测来解释一些病理生理现象, 其中不可避免地夹杂有许多错误的成分 近代医学是随着资本主义的兴起而发展起来的 资产阶级在反对中世纪宗教统治中提倡科学和理性, 主张人的自由解放, 这对于医学的发展有着积极的影响, 使医学从神学的束缚中解放出来, 一些医学家冲破了教会的禁令, 用唯物主义的观点进行了对人体解剖和研究 16 世纪比利时医学家维萨里敢于向宗教神权挑战, 在进行尸体解剖的基础上, 出版了 人体构造 一书, 用事实驳斥了圣经上关于 上帝抽出亚当的一根肋骨而创造了夏娃 的传说, 纠正了古希腊盖伦学说的错误 200 余处, 给了人们新的人体科学认识, 使解剖研究工作得到了公认, 成为近代人体解剖学的奠基人 原来认为尸体解剖是不道德的观点, 在科学的发展中有了较快的改变 到今天, 这种用于医学目的的尸体解剖再也不被社会一般人们视为不道德的了, 更有一些人出于对发展医学科学事业的关心, 还自愿在死后将遗体捐献给医学的研究, 博得了社会的敬重和赞誉 人体解剖的发展对尸体的需求, 以及现代医学发展中器官移植的需要, 产生了尸体和移植体的来源问题 这中间存在着医学道德与医学科学发展的矛盾 目前, 西方资本主义社会都是以征购 出售 捐赠 交换等几种办法作为尸体和移植体的来源 怎样是合乎道德的? 哪些是不合乎道德的? 是需要研究解决的问题 随着我国医学科学的发展, 这类问题也已经

248 碰到, 需要以正确的道德原则来加以协调 毫无疑问, 经死者生前自愿或死者亲属同意作为捐赠的尸体和器官, 在办理合法手续后再进行尸体解剖或采用某种器官用作医学目的的, 应该说是合乎道德的 反之, 如果不经死者生前或死后家属的同意, 又未办理合法手续或由特定部门批准, 而擅自进行尸体解剖和摘取器官的, 应该说是不合乎道德的 当然, 当医学上需要作解剖, 对医学发展有利, 而死者家属不同意时, 仍要依靠医务工作者做科学的说服工作, 在坚持知情同意的医学道德原则下给予妥善处理 社会主义医德反对那种尸体一点动不得的封建伦理道德观念, 因为它不利于医学科学的发展, 但是不等于说可以不要尊重尸体, 不要尊重死者生前或死后亲属正当的意愿 从发展医学, 维护人类利益出发, 社会主义医德要求爱护尸体和尊重尸体, 特别对自愿捐献者来说, 更应予以尊重 因为, 无论是捐献的或有价提供的, 他们都为医学科学的研究和发展作出了贡献 认识这点, 对于医学院校学生来说是十分必要的 在尸体解剖过程中, 应当保持严肃认真的态度, 秩序井然, 不可嬉笑, 体现出作为一个医务人员应有的道德修养, 培养自己应有的良好学风和在将来工作中对待病人极端负责的态度 在社会主义社会, 如何对待尸体和器官移植体的来源问题, 应该既有利于医学科学的发展, 又必须符合社会主义医德要求的原则, 坚持两者的辨证统一 在我们进行人体实验时, 实验的对象是多层次的 从纵向看包括了胚胎 胎儿 新生儿 儿童 成年人 老年人, 从横向看有正常人 ( 包括男人 女人 ), 以及各类不同疾病的病人, 也有一些特殊人员, 如收容人员和囚犯等 不同的人体实验对象在生前所体现的道德价值可以是不一样的, 但是有一点是共同的, 即在人体实验必须保护和尊重人体的价值和尊严 在实验中, 每个实验者, 包括教师 学生和技术人员都必须尊重和爱护人体材料, 严禁肆意损毁和破坏 这不仅是尊重尸体和人体材料贡献者, 而且体现了实验者的价值观和道德观 第七章实验室规则与制度 一 实验室规则 ( 一 ) 实验室应保持安静和整洁, 做到讲文明, 以提高教学和实验效果 ( 二 ) 实验室提供每人一个坐位, 一架显微镜和组织学切片, 同学应按自己的编号取用 ( 三 ) 实验前应先检查所用的显微镜和切片, 如有损坏, 立即报告教师和登记, 以便检查和补充 ( 四 ) 显微镜属贵重仪器, 严禁私自更换显微镜和拆卸镜头 ( 五 ) 组织学切片不得乱弄, 必须小心爱护, 如果打碎, 则需赔偿 ( 六 ) 实验完毕后, 应把显微镜 组织切片等放回原处, 并及时打扫卫生, 以保持室内整洁 ( 七 ) 爱护公物, 包括桌子 凳子 门窗 日光灯 镜柜等一切公共财物 二 赔偿制度 ( 一 ) 组织切片赔偿价为每张拾元 大体标本的损坏赔偿视标本损坏情况以及标本珍贵程

249 度而定 ( 二 ) 显微镜镜头或其它部件损坏, 由形态中心酌情议定赔偿价格 ( 三 ) 其它如桌凳 门窗等公共财物因不遵守课堂秩序损坏者, 一律报有关部门议价赔偿 三 实验注意事项 ( 一 ) 实验前 做好准备工作 1. 实验课前, 必须先复习好理论和预习实验指导, 以便正确利用实验时间, 提高实验效率 2. 实验前应带实验指导 实验报告 铅笔 ( 普通 HB 铅笔及红 兰彩色笔各一支, 禁止使用水彩笔 ) 橡皮等进入实验室, 所用铅笔应预先削好 3. 实验前先检查所用之显微镜和标本片, 是否有破损和缺失 ( 二 ) 实验时 认真做好实验 1. 实验时讲文明, 不迟到, 不早退, 爱护公共财物 2. 实验时, 按实验指导进行实验, 按时完成作业 如实验已完, 仍应留在实验室内复习组织学切片, 不得任意离开实验室 3. 实验时不私自更换显微镜, 不拆卸镜头, 不损坏切片等 4. 示教标本不得随意移动 5. 显微镜镜头如不清洁, 可用擦镜纸擦拭, 但要注意节约 禁止用手指或手帕等擦显微镜镜头 ( 三 ) 实验后 做好清洁工作 1. 实验结束, 将实验报告交给老师 2. 实验后应把显微镜和组织学切片放回原处, 并把实验室整理干净

250 第二篇血液与造血系统 (BLOOD AND HEMATOPOIETIC SYSTEM) 实验十四血细胞与骨髓 (BLOOD CELL AND MARROW) 实验目的和要求 1. 掌握血液有形成分的形态结构 2. 了解血涂片制作方法 实验用品和标本 血涂片标本 实验内容和方法 一 观察血涂片血细胞 (bloob cells) 片名 : 人的血涂片,Wright 氏染色 目的 : 了解各种血细胞的形态特点 低倍观察 : 所见大量红色小点为红细胞, 散在于红细胞之间少量紫色小点即白细胞, 白细胞在血涂片边缘较多 高倍观察 : (1) 红细胞 (eryghrocyte): 双凹圆盘状, 直径约 7.5 µm, 无胞核, 胞质桔红, 边缘染色深, 中央色浅 ( 为什么? 其形态结构与其功能有何关系?) (2) 中性粒细胞 (neutrophilic granulocyte): 数量较多, 细胞圆形, 核分 2~5 叶, 多数 3 叶, 叶间有极细的染色质丝相连 胞质内含有细而均匀淡紫红色颗粒, 并间以少量稍粗大, 深紫蓝色的嗜天青颗粒 (3) 嗜酸性粒细胞 (eosinophilic granulocyte): 细胞圆形较大, 核常分二叶, 胞质中充满粗大 均匀的鲜红色颗粒 (4) 嗜碱性粒细胞 (basophilic granulocyte): 数量极少, 不易找到, 细胞圆形, 核形态不规则, 常被嗜碱性颗粒遮盖以致看不清, 胞质内含有大小不等, 分布不均的紫蓝色颗粒, 若找不到该细胞, 可见示教 (5) 淋巴细胞 (lymphocyte): 细胞有大有小, 以小淋巴细胞为多, 核圆形或卵圆形, 染色深, 一侧常有凹痕, 胞质少, 呈天蓝色 (6) 单核细胞 (monocyte): 细胞最大, 呈圆形, 胞核呈肾形或马蹄形, 胞质较多呈灰蓝色并可见少量细小的嗜天青颗粒 (7) 血小板 (blood platelet): 常呈星形或多角形的灰蓝色小体, 体积很小, 其中可见细小红紫色的血小板颗粒, 常三五成群于红细胞之间

251 二 示 教 嗜碱性粒细胞 (basophilic granulocyte) 人血涂片,Wright 氏染色 目的 : 认识嗜碱性粒细胞的形态特征 观察 : 细胞圆, 胞核常呈 S 形或不规则形, 染色浅, 胞质内含有嗜碱性颗粒, 大小不等, 分布不均, 染成紫蓝色, 可覆盖在核上 三 电镜图像 (1) 红细胞扫描目的 : 熟悉扫描电镜下红细胞的形态特征 观察 : 红细胞形状 (2) 中性粒细胞 (neutrophilic granulocyte) 目的 : 熟悉中性粒细胞的超微结构特征 观察 : 细胞表面结构 细胞核 嗜天青颗粒 特殊颗粒和糖原颗粒等 (3) 嗜酸性粒细胞 (eosinophilic granulocyte) 目的 : 熟悉嗜酸性粒细胞的超微结构特征 观察 : 细胞表面结构 细胞核 嗜酸性颗粒等 (4) 嗜碱性粒细胞 (basophilic granulocyte) 目的 : 熟悉嗜碱性粒细胞的超微结构特征 观察 : 细胞表面结构 细胞核 嗜碱性颗粒等 (5) 淋巴细胞 (lymphocyte) 目的 : 熟悉淋巴细胞的超微结构特征 观察 : 细胞表面结构 细胞核 嗜天青颗粒 游离核糖体等 (6) 晚幼红细胞目的 : 了解晚幼红细胞的超微结构特征 观察 : 可见胞核, 染色质致密块状 无核仁 (7) 巨核细胞目的 : 熟悉巨核细胞的超微结构特征 观察 : 可见细胞质内有大量颗粒和囊泡, 胞质成块脱落 (8) 血小板目的 : 熟悉血小板的超微结构特征 观察 : 血小板含多种细胞器, 在透明区内有微丝和微管, 颗粒区内含血小板颗粒 小管系 线粒体和糖原颗粒等 四 录像 : 骨髓涂片

252 第三篇循环系统 (CIRCULATORY SYSTEM) 从第三篇至第十二篇为内脏有关内容 1. 了解内脏的概念 内脏学的范围及各系统的主要机能 内脏各系统之间以及与其他系统之间的关系 2. 熟悉内脏的一般形态和和胸腹部的标志线和腹部的分区 3. 熟悉内脏的组织学构造 4. 掌握内脏的病理学改变 实验十五心脏解剖结构 (ANATOMY OF HEART) 实验目的和要求 1. 掌握心脏的位置 外形 心脏各腔 ( 右心房 右心室 左心房 左心室 ) 的形态结构 房中膈与室中膈的形态结构及缺损部位 2. 了解心壁构造, 并掌握心瓣膜的结构和功能 3. 掌握心脏传导系的构成和机能 4. 掌握左 右冠状动脉的起始 行径 重要分支及其分布 心大 中 小静脉的行径 冠状窦的位置与开口 5. 掌握心包及其临床意义 6. 了解心脏的体表投影 瓣膜位置 听诊部位 实验用品和标本 尸体和心脏标本 实验内容和方法 动手进行尸体解剖, 辨认和掌握心脏的解剖结构 思考题 : 1. 身体的物质代谢与循环系统有什么关系? 肺循环与循环的路径如何? 2. 心的正常血流方向是怎样的? 有哪些结构保证血液正常运行? 3. 从心脏外形上, 如何辨别左 右心房, 左 右心室? 有何大血管出入? 4. 为什么心房和心室能有节律地交替舒缩? 心脏的起搏点位于何处? 其兴奋是如何传布的? 5. 如何在胸前壁确定心脏的位置? 心的尖瓣 肺动脉瓣和主动脉瓣的听诊部位各在何处? 6. 谈谈心脏本身的动脉供应及静脉回流 其血液循环有何特点? 7. 谈谈心包的解剖形态和作用 8. 出生后, 如果房中隔的卵圆孔未闭或动脉导管未闭时, 可使血流出现何现象?

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254 实验十六心脏组织结构 (HISTOLOGY OF HEART) 实验目的和要求 掌握心壁的组织结构 实验用品和标本 组织切片 实验内容和方法 一 观察切片切片名 : 人心室壁切面,HE 染色 要求 : 认识心壁三层结构及心内膜和心外膜的特点 低倍观察 : 1. 区别心内膜 心肌层和心外膜 ; 2. 心肌层最厚, 心外膜次之, 心内膜最薄 高倍观察 : 1. 心内膜 (1) 内皮 : 薄而平整, 为心脏腔表面的单层扁平上皮 ; (2) 内皮下层 : 为一薄层较细密的结缔组织, 染色较淡, 胶原纤维和弹性纤维细而均匀, 有时还可见散在的平滑肌纤维 ; (3) 内膜下层 : 在内皮下层下方, 由疏松结缔组织组成, 内有毛细血管和束细胞 ( 浦肯野氏纤维 ) 束细胞比一般心肌纤维粗大, 细胞中央有 1~2 个核, 肌浆较多 染色较淡, 肌丝较少, 多分布于细胞的周边部 细胞连接处闰盘较发达 ( 如制片未切到浦肯野氏纤维, 则切片上看不见 ) 2. 心肌层此层最厚, 要区别心肌的各种切面, 在心肌纵切面上可见闰盘, 心肌纤维之间有少量结缔组织和丰富的毛细血管, 有些部位还有较多的脂肪细胞 3. 心外膜 (1) 间皮 : 位于最外表的一层扁平细胞 ; (2) 间皮以内是结缔组织, 内含较多脂肪细胞 小血管和神经束 二 示 教 1. 浦肯野氏纤维 (Purkinje fiber) 人的心室壁切面,HE 染色 要求 : 认识心内膜下层中浦肯野氏纤维的特点 观察 : 浦肯野氏纤维较粗大, 胞浆丰富, 染色较淡肌丝少, 多分布于细胞周边部分, 细胞可有 1~2 个核 细胞间闰盘较发达 2. 心瓣膜 (cardiac valve)

255 人心瓣膜切面,HE 染色 观察 : (1) 心瓣膜二面均有内皮, 内皮下层, 但心房面和心室面内皮下层不尽相同 ; (2) 心房面较平整, 内皮下层中胶原纤维细, 弹性纤维多 心室面高低不平, 内皮下层中胶原纤维多, 弹性纤维少 ; (3) 心瓣膜中间为致密结缔组织, 其中可见类似软骨基质的蓝色结构, 瓣膜根部可见一些平滑肌束

256 实验十七脉管系统解剖结构 (ANATOMY OF VESSEL) 实验目的和要求 一 目的 : 掌握脉管系统 (vascular system) 的组成 机能意义以及其他系统的相互关系 二 要求 : 1. 了解动脉和静脉在整个人体中的分布规律和器官内血管的分布规律 2. 体循环的动脉 : 掌握主动脉的起止 行程及分部 掌握主动脉弓的分支 ( 无名动脉 左颈总动脉 左锁骨下动脉 ) 3. 体循环的静脉 : 掌握静脉系的组成及静脉的结构特点, 了解几种特殊静脉 ( 硬脑膜窦 板障静脉等 ) 了解静脉的机能和临床意义 4. 肺循环的动脉 : 了解左 右肺动脉的行程, 了解动脉导管索的位置及其未闭的临床意义 5. 肺循环的静脉 : 了解左 右肺静脉的行程 实验用品和标本 尸体及标本 实验内容和方法 一 动脉 ( 一 ) 颈总动脉 1. 掌握左右颈总动脉的起始 位置 行程和体表投影, 掌握颈内动脉窦 颈动脉球的形态位置与功能概念 2. 掌握颈外动脉的行程及甲状腺上动脉 面动脉 颞浅动脉 脑膜中动脉的行程 分布及临床意义 3. 了解舌动脉 上颌动脉 枕动脉 耳后动脉的行径和分布 4. 掌握颈内动脉在颈部的行程 ( 二 ) 锁骨下动脉及上肢动脉 1. 掌握锁骨下动脉 液动脉 肱动脉 桡动脉和尺动脉的起止 行程 了解其体表投影及临床意义 2. 掌握锁骨下动脉的主要分支 : 甲状腺下动脉 椎动脉 胸廓内动脉的分布 3. 了解动脉的主要分支 : 胸肩峰动脉 胸外侧动脉 肩胛下动脉及旋肱后动脉的分布 4. 掌握肱深动脉的行程分布 5. 掌握桡 尺动脉分支 6. 了解掌浅弓 掌深弓的组成和位置 分支及掌浅弓的体表投影 ( 三 ) 胸主动脉 1. 掌握胸主动脉的起止 行程及分支 ; 肋间动脉的行程和分支 2. 了解支气管动脉 食管动脉的行径和分布 ( 四 ) 腹主动脉 1. 掌握腹主动脉的起止 行程和分支

257 2. 了解膈下动脉 腰动脉的行程和分布 3. 掌握腹腔动脉 肠系膜上动脉 肠系膜下动脉及其分支的行程和分布, 并了解各支间的吻合 4. 了解肾上腺动脉 肾动脉 精索内动脉 ( 或卵巢动脉 ) 的发起 行程和分布 ( 五 ) 髂总动脉 1. 掌握髂总动脉的起止和行程 2. 掌握髂内动脉的起止 行程和子宫动脉与输尿管关系的临床意义 3. 掌握直肠的动脉供应 4. 了解髂内动脉的分支 : 膀胱上动脉 膀胱下动脉 闭孔动脉 臀上动脉 臀下动脉, 阴部内动脉的行径和分布概况 ( 六 ) 髋上动脉和下肢动脉掌握髂外动脉 股动脉 腘动脉 胫动脉 胫后动脉 足背动脉的起止 行程和分布 了解腓动脉 ( 胫骨滋养 A) 足底内外侧动脉的分布及足底弓的组成 掌握股动脉及腹壁下动脉的体表投影 ( 七 ) 掌握全身体表可摸到脉搏或压迫止血的动脉位置 思考题 : 1. 试画表示主动脉及其分布到全身各大局部的主干简图 2. 在头颈部能摸到哪些动脉的搏动? 根据哪些标志去摸到它们? 3. 甲状腺由哪些动脉分布? 这些血管周围在哪些重要毗邻? 4. 一位伤员右前臂外伤出血 急救时应在何处压迫止血? 另一伤员手指外伤出血, 应在何处压迫止血? 5. 左侧胸腔积液病人在液后线第 8 肋间抽液, 穿刺刻在上位肋骨下缘还是下位肋骨上缘? 为什么? 6. 腹主动脉有哪些主要分支? 供应哪些器官? 胃由哪些动脉分布? 能否绘图说明? 7. 试述肝 胆囊 脾 胰 阑尾 卵巢 子宫及直肠的动脉供应 8. 髂内动脉有哪些分支? 分布到哪些器官? 9. 你在下肢能摸到哪些动脉搏动? 凭什么标志找到它们? 10. 大腿 小腿外伤时, 见伤口喷射性出血时, 你如何作急救压迫止血? 为什么? 二 静脉体循环的静脉 : ( 一 ) 上腔静脉系 1. 掌握上腔静脉的组成 起止 行程 掌握无名静脉的组成和行程 2. 掌握颈内静脉的起止 行程 属支及颅内外静脉的交通 3. 掌握锁骨下静脉的起止 行程 临床意义 颈外浅静脉 颈前浅静脉的行径 4. 掌握头静脉 贵要静脉, 肘正中静脉的行程及临床意义, 了解上肢深静脉的概况 5. 掌握奇静脉 半奇静脉, 付半奇静脉 椎静脉丛的起始 回流 ( 二 ) 下腔静脉系 1. 掌握下腔静脉 髂总静脉 髂内静脉 髂外静脉的起止 行程 2. 掌握下腔静脉的属支 3. 掌握下肢的浅静脉 : 足背静脉弓 小隐静脉 大承包商静脉的行程 临床意义, 并了解下肢的深静脉

258 4. 掌握门静脉的组成 行程 分支及属支 门静脉系结构的特点及与上 下腔静脉的吻合部位 思考题 : (1) 头颈部和上 下肢浅静脉各收集哪些范围的静脉血液? 其走行和回流如何? 有何临床意义? (2) 为什么静脉曲张多见于下肢? 其浅深静脉交通多见于何处? (3) 当面部上唇和鼻周部感染时需及时慎重处理 切忌挤压, 为什么? (4) 左精索内静脉行径有何特点? 为什么左精索内静脉易发生静脉曲张? (5) 门静脉有几条属支? 它收集哪些脏器血液? 门静脉高压的病人, 为什么会有呕血 便血 脾肿大 腹水 甚至发生腹壁静脉曲张现象, 能否运用解剖学知识加以解释? (6) 食物摄入人体后通过哪些消化器官被消化吸收, 经过哪些管道结构输送到全身每个细胞供细胞新陈代谢所需? (7) 大隐静脉内血栓脱落, 通过哪些途径最后梗塞于肺?

259 实验十八动 静脉组织结构 (HISTOLOGY OF ARTERY AND VEIN) 实验目的和要求 1. 掌握大 中 小动脉的组织结构 2. 掌握毛细血管的光 电镜结构及分类 3. 掌握静脉的一般结构特点 实验用品和标本 动 静脉的组织标本 实验内容和方法 循环系统包括心血管系统和淋巴管系统 心血管系统是一个封闭式的循环管道系统, 需从管腔面逐层向外观察 管壁结构一般可分为内膜 中膜 外膜三层, 但因各部分所执行的功能不同, 其结构上也有差异, 观察时应多加注意 在掌握基本组织学知识基础上学习各器官系统的组织结构并不困难, 但还应注意以下几点 : 1. 先低倍, 后高倍 先用低倍镜观察整个器官的轮廓及基本组织分布情况, 然后用高倍镜仔细观察各部分的微细结构 2. 观察有腔器官管壁时, 由管腔内表面向外逐层观察, 实质性器官从外向内观察 3. 看各系统时, 先找同性, 再抓个性 如观察消化管时, 先区分四层, 再找胃 小肠 大肠等个别特征 4. 看切片, 想整体 同一器官因切面方向不同, 切面上就出现不同形态, 通过观察, 理解其整体结构 一 观察切片 ( 一 ) 小动脉 小静脉和毛细血管 (small artery, small vein, and copillary) 切片名 : 人肠系膜切面,HE 染色 要求 : 认识小动 静脉结构及比较两者的差异 低倍观察 : (1) 小动脉管壁厚而圆, 内弹性膜呈波浪形, 中膜明显 (2) 小静脉管壁薄而不规则, 内膜不易看清, 外膜较厚 (3) 小动 静脉周围有脂肪组织, 疏松结缔组织 神经和毛细血管 高倍观察 : 1. 小动脉 (1) 管壁可分内膜 中膜 外膜三层结构 (2) 内膜 : 可见一层红色波浪形结构, 为内弹性膜 内弹性膜的内侧见到的椭圆形胞核是内皮细胞核 内弹性膜和内皮细胞之间的内皮下层不很清楚 (3) 中膜 : 由六一七层左右的平滑肌环行排列而成, 在肌纤维之间有少量纤维的弹性纤

260 维分布 (4) 外膜 : 较薄, 可见许多较粗 色淡红的胶元纤维和深红色折光性强的弹性纤维, 一般没有外弹性膜 2. 小静脉 (1) 管壁内膜的层次不易分清, 中膜薄, 外膜明显 (2) 内膜 : 薄, 仅见一层内皮, 内皮下层分不清 (3) 中膜 : 有 2~3 层排列较疏松的环行平滑肌构成 (4) 外膜 : 为结缔组织 3. 毛细血管 (1) 毛细血管横切面呈指环状, 由 2~3 个内皮细胞围成, 小的只有一个内皮细胞, 内皮细胞核因细胞收缩突入管腔, 有时腔内可见一个红细胞 ( 如腔内无红细胞又怎样与脂肪细胞区别?) (2) 毛细血管的纵切面细长, 内皮细胞核排列于腔面, 腔内有时可见红细胞 ( 二 ) 中等动 静脉 (medium-sized artery and vein) 切片名 : 人的中动 静脉横切面,HE 染色 要求 : 认识中等动 静脉形态结构 肉眼观察 : 标本上壁厚而圆的是中动脉, 壁薄而形状不规则的是中静脉 低倍观察 : (1) 中等动脉 : 管壁厚而圆, 中膜比外膜厚, 管腔面呈波纹状 (2) 中等静脉 : 管壁薄, 外膜比中膜厚, 管腔面平整 (3) 在中等动脉和静脉周围可见神经 疏松结缔组织 脂肪组织 小血管等 高倍观察 : 1. 中等动脉 : (1) 内膜 : 薄, 内皮细胞衬于管腔内面, 其核紫色, 排列在腔面, 细胞界线不清 内皮下可见内弹性膜, 为一层波浪形发亮的粉红色带状结构 它是内膜和中膜的分界线, 内弹性膜和内皮之间是内皮下层 (2) 中膜 : 此层最厚, 由 20 层左右的环行平滑肌组成, 其间有少量弹性纤维和胶原纤维 (3) 外膜 : 外膜比中膜薄, 胶原纤维排列较紧密, 并间杂折光性强的弹性纤维 外膜和中膜交界处有外弹性膜, 多为纵行弹性纤维的横切面, 大小不等的亮红色点状结构, 有的为一层较明显的波浪状亮红色的带状结构 外膜和周围组织分界不明 2. 中等静脉 : (1) 内膜 : 薄而平膜, 仅见一层内皮, 内皮下层和内弹性膜均不明显 (2) 中膜 : 中膜比外膜薄, 有 5~6 层纵切或横切的平滑肌且排列疏松, 弹性纤维细而少 (3) 外膜 : 较厚, 由结缔组织构成, 可见平滑肌束的横切面 ( 为什么?), 无外弹性膜 ( 三 ) 大动脉 (Large artery) 切片名 : 人主动脉,HE 染色 要求 : 区别大动脉三层膜, 特别是中膜, 并和中动脉比较 低倍观察 : (1) 区别大动脉内膜 中膜和外膜 (2) 内膜可见内皮, 内弹性膜不易与中膜的弹性膜区别, 内皮和内弹性膜之间的结缔

261 组织是内皮下层 (3) 中膜很厚, 可见 40~60 层弹性膜, 弹性膜间为环行挟滑肌纤维和少量胶原纤维的弹性纤维 (4) 外膜由较薄结缔组织组成, 并可见营养血管和小神经束 高倍观察 : 大动脉中膜内可见大量红色折光性强的呈波浪形线条的弹性膜 其间夹有平滑肌纤维弹性纤维和胶原纤维 二 示教 1. 大动脉 (large artery) 猫的大动脉横切面,Weigert 弹性纤维染色 要求 : 认识大动脉弹性膜的结构特点 观察 : 中膜内可见数十层呈紫蓝色结构的弹性膜, 其他各层内的弹性纤维呈散在分布 2. 大静脉 (large vein) 人的大静脉,HE 染色 要求 : 认识大静脉的结构特点并与大动脉相比较观察 : 管擘内膜较薄, 仅见内皮, 中薄膜, 只有几层排列疏松的环行平滑肌 外膜厚, 胶原纤维间夹有大量纵行的平滑肌束的横切面 三 电镜图像 1. 连续毛细血管 (continuous capillary) 要求 : 掌握连续毛细血管的超微结构特征 观察 : 可见内皮细胞连续, 细胞间有紧密连接, 胞质内含吞饮小泡 基膜完整 2. 有孔毛细血管 (fenestrated capillary) 要求 : 掌握有孔毛细血管的超微结构特征 观察 : 可见内皮细胞质薄, 有许多小孔, 孔上有隔膜, 基膜完整 3. 血窦 (sinsoid) 要求 : 掌握血窦的超微结构特征 观察 : 可见内皮细胞间间隙明显, 内皮细胞有孔, 胞质内含有吞饮小泡, 基膜不完整 思考题 : 1. 光镜下如何区别各种动脉和静脉? 2. 光镜下如何判断心内膜与心外膜 心肌纤维与束细胞? 3. 毛细血管直径一般为 6~8 µm, 体积较大的白细胞是怎样通过毛细血管的?

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263 实验十九淋巴系统解剖与组织结构 (ANATOMY AND HISTOLOGY OF LYMPHATIC SYSTEM) 实验目的和要求 1. 掌握淋巴系统的构成及配布特点 2. 了解淋巴架流的因素及侧支循环 3. 掌握淋巴系统的组织结构 实验用品和标本 尸体及标本 ; 切片 实验内容和方法 一 淋巴系统解剖结构 ( 一 ) 人体的淋巴导管掌握胸导管的起始 行程 注入及集范围 右淋巴导管的组成 注入和收集范围 ( 二 ) 人体各部的淋巴管和淋巴结 1. 头颈的淋巴管和淋巴结掌握头颈部主要淋巴结群的分布部位及其收集范围和输出, 颈干的形成和注入 2. 上肢的淋巴管和淋巴结 (1) 掌握肘淋巴结的分布 收集范围 ; (2) 掌握锁骨下淋巴结 腋淋巴结各群的分布和收集范围 锁骨下淋巴干的形成和收集范围 3. 胸部的淋巴管和淋巴结掌握胸壁和胸腔内和各主要淋巴结群 : 如胸骨淋巴结, 纵隔淋巴结 肺门和气管支气管周围的淋巴结的分布和收集范围 临床意义 支气管纵隔干的形成和收集范围 4. 腹部的淋巴管和淋巴结掌握腰淋巴结 腹腔淋巴结 肠系膜上淋巴结 肠系膜下淋巴结的分布 收集范围, 掌握腰淋巴干和肠淋巴干的形成和收集范围 5. 骨盆部的淋巴管和淋巴结 (1) 掌握腹股沟深 浅淋巴结的分布及收集范围 ; (2) 了解腘淋巴结的分布及其收集范围 ( 三 ) 脾 1. 掌握脾的形态 位置 ; 2. 了解脾的功能概念 思考题 : 1. 头颈部的淋巴要分别通过哪些淋巴结回流到颈干? 2. 左锁骨上淋巴结 ( 颈深下淋巴结 ) 位于何处? 它收集哪些范围的淋巴? 临床上有何意义? 3. 肺的淋巴是怎么回流的?

264 4. 腹股沟浅淋巴结肿大时应考虑到什么部位可能病变? 5. 胸导管和右淋巴导管收纳身体哪些局部的淋巴? ( 一 ) 淋巴结 (Lymph node) 切片名 : 猫淋巴结切面,HE 染色 要求 : 认识淋巴结皮质和髓质的形态结构肉眼观察 : 切片呈圆形或椭圆形, 一侧凹陷处为淋巴结门 最外面的粉红色结构为被膜, 被膜下周围色深的是皮质, 中央色浅的是髓质 低倍观察 : (1) 外表是结缔组织被膜, 并向内伸入实质形成小梁 ; (2) 皮质周围为深紫色圆形结构是淋巴小结, 其中央染色浅区为生发中心, 小结之间的少量弥散淋巴组织为结间区, 淋巴小结深面的弥散淋巴组织为付皮质区 ; (3) 在付皮质区内可见由单层立方上皮围成的血管, 则是毛细血管后微静脉 被膜与淋巴小结之间和小梁周围为皮窦 ; (4) 髓质 : 由深紫色索条状的髓索和其周围的髓窦构成, 髓索和皮质相连 ; (5) 淋巴结门部有血管 输出淋巴管和脂肪组织 高倍观察 : 1. 被膜和小梁由致密结缔组织构成, 被膜内有输入淋巴管, 有时可切到瓣膜 ; 2. 皮质 : (1) 淋巴小结 : 在网状组织基础上, 大量淋巴细胞密集成圆球形 其中网状细胞的核较大, 呈椭圆形, 色浅 淋巴小结中央着色浅的部分是生发中心, 其中的淋巴细胞较大 生发中心的深部着色深的为暗区, 其上方着色较浅的为明区, 由密集的小淋巴细胞形成的帽区呈新月形覆盖于生发中心上方 ( 各区的淋巴细胞形态有什么不同?) (2) 皮窦 : 为皮质的淋巴窦 窦壁由扁平的内皮细胞衬里 窦腔中可见星形的网状细胞突起相连成网, 网孔中有巨噬细胞和淋巴细胞 皮窦根据所处的位置不同可分为被膜下窦和小梁周窦 3. 髓质 : (1) 髓索 : 淋巴细胞和网状细胞密集成条索状结构并相互交织成网 ; (2) 髓窦 : 位于髓索之间, 结构和皮窦相同, 但窦腔较大而不规则, 窦壁内皮紧贴于髓索边缘, 窦内巨噬细胞和网状细胞较多 ( 二 ) 脾脏 (spleen) 切片名 : 人的脾脏切面,HE 染色 要求 : 认识脾脏的形态结构肉眼观察 : 标本边缘粉红色部分为被膜, 内部为脾实质 在实质中可见散在的深蓝色圆形或椭圆形结构为白髓部分, 其余部分主要为红髓 低倍观察 : (1) 被膜表面覆盖一层内皮, 被膜和小梁均是由致密结缔组织组成, 其中含有较多的弹性纤维和散在的平滑肌, 从被膜伸入脾实质的小梁被切成大小不等的切面, 从门部伸入的小梁内可见小梁动脉和小梁静脉, 这是脾脏的特点之一 ; (2) 实质内以淋巴细胞为主密集成大小不等蓝色圆形或不规则形的团块即白髓, 其中围绕在中央动脉周围的弥散淋巴组织为动脉周围淋巴鞘, 位于动脉周围淋巴鞘一侧的淋巴小

265 结即为脾小结 ; (3) 除小梁和白髓外, 其余均为红髓, 由脾索和脾血窦组成 ; (4) 白髓与红髓交界处为边缘区, 该区淋巴细胞较白髓稀疏, 但较红髓密集 此区的脾血窦称为边缘窦 高倍观察 : (1) 小梁静脉管壁只见一层内皮, 管壁其余层次与小梁难以区分 小梁动脉则可见到内皮 内弹性膜和中膜平滑肌 ; (2) 白髓由密集的淋巴细胞组成, 中央动脉可偏于脾小结一侧或位于动脉周围淋巴鞘的中央, 有时可见 2~3 个中央动脉的切面 ; (3) 红髓内脾索由富含血液的索状淋巴组织构成, 并相互连结成网, 除其含有淋巴细胞 浆细胞外, 还有许多血细胞和巨噬细胞 ; (4) 脾血窦 : 为脾索之间不规则的腔隙, 窦壁可见圆形或椭圆形内皮细胞核, 窦腔内有各种血细胞 ( 脾血窦与淋巴窦在结构和内容上有何不同?) ( 三 ) 腭扁桃体 (tonsil) 切片名 : 人腭扁桃体切面,HE 染色 要求 : 认识腭扁桃体的陷窝及其上皮和淋巴小结排列方式肉眼观察 : (1) 红色一边是被膜, 并伸出小梁 ; (2) 紫色一边是咽黏膜, 黏膜向深部凹陷处及中部的裂缝为隐窝 ; (3) 紫色团块状的结构均是淋巴组织 低倍观察 : (1) 咽黏膜上皮是复层扁平上皮 ; (2) 隐窝深部的复层扁平上皮内常见有大量的淋巴细胞浸润, 因此, 隐窝从凹陷处到深部复层上皮结构逐渐模糊不清 ; (3) 固有层内的淋巴小结沿黏膜及隐窝分布, 其间还有弥散淋巴组织, 淋巴小结常见生发中心, 其帽朝向上皮 ; (4) 弥散淋巴组织中常可见到高内皮的毛细血管后微静脉, 此外在被膜的深面常可见到骨骼肌, 扁桃体周围黏膜中还可见到黏液性的小唾液腺 思考题 : 1. 在光镜下怎样区别淋巴结和脾脏? 2. 淋巴窦与脾血窦 髓索与脾索在结构和功能上有何异同? 3. 淋巴结小结的数量和形态改变意味着什么? 三 示教 ( 一 ) 毛细血管后微静脉 (postcapillary venule) 淋巴结切面,HE 染色 要求 : 了解淋巴组织内毛细血管后微静脉的组织结构特征 观察 : 淋巴结的副皮质区内可见内皮细胞呈立方形的毛细血管后微静脉, 着色较浅, 腔内含血细胞 ( 二 ) 脾血窦 (splenic sinusoid) 人脾脏切面,HE 染色 要求 : 了解脾血窦的组织特征

266 观察 : 脾血窦横切面内皮细胞呈小点状围绕一圈, 细胞间隙大, 有胞核部位细胞切面较 大, 并突向腔内 窦腔内充满各种血细胞

267 实验二十心血管系统病理 (PATHOLOGY OF CARDIOVASCULAR SYSTEM) 实验目的和要求 1. 风湿性心内膜炎好发部位, 病变瓣膜厚度 透明度变化及疣状赘生物位置 大小 色泽等特点 2. 急性风湿性心内膜炎反复发作所致瓣膜变化及继发的心脏各房室病理变化的规律 3. 风湿性心肌炎风湿小体形态特点及风湿细胞的形态特点 4. 学习如何观察 分析及判断心脏病的思维方法, 及其描写方法 5. 急性和亚急性细菌性心内膜炎好犯及哪些心瓣膜, 病变性质, 疣状赘生物形态特点及病变有临床联系 6. 第二期缓进高血压病的血管变化及第三期时心 肾 脑改变 7. 主动脉冠状动脉及脑动脉粥样化的病变好发位置, 眼观及镜下病变特点 8. 初步掌握观察分析和判断心脏病的思维方式 熟悉心脏病的描述方法 实验用品和标本 病理标本与切片 实验内容和方法 一 眼观标本 ( 一 ) 心血管系统标本临床病历简要 : 年轻女性, 不规则发热伴肢体大关节游走性肿痛, 脉搏,180 次 / 分, 心界扩大 心尖区可闻及 Ⅱ 级以上收缩期吹风样杂音, 呼吸音粗糙, 并有细小湿罗音 器官 : 心脏 病变描写 : 1. 二尖瓣增厚, 不透明, 二个瓣叶互相黏连 融合 二尖瓣闭锁缘上可见呈淡黄色的排列成单行的疣状赘生物 2. 三尖瓣增厚, 不透明, 但形态未明显改变, 也未发生黏连, 融合等 在其闭锁缘上, 可清楚发现多个赘生物呈单行排列, 其大小约粟粒大小, 与瓣膜紧密相贴 病理学诊断 : 风湿性心内膜炎 ( 赘生物形成 ) 思考题 : 瓣膜上的赘生物是如何形成的? 二尖瓣与三尖瓣为何在形态上有差异? ( 二 ) 心血管系统标本临床病历摘要 : 成年男性, 游走性关节炎已 5 年, 劳累后心悸气促三年, 一年来轻劳动也心悸 气促, 并反复咯血 体检 : 心界扩大, 心尖区闻及 Ⅱ 级舒张期杂音, 两肺布满湿罗音 X 线检查 : 左心房与右心室明显扩大器官 : 心脏 病变描写 : 1. 二尖瓣增厚, 不透明, 瓣膜明显变形, 瓣膜孔周径较正常明显缩小

268 2. 左心室腔增大不明显 ( 有者可有左心室腔增大 ), 心室壁厚度正常, 心尖圆钝, 左心房腔增大, 心房壁增厚不明显 病理学诊断 : 风湿性心瓣膜病, 二尖瓣狭窄 ( 或伴关闭不全 ) 思考题 : 本例患者反复咯血的形态学基础是什么? ( 三 ) 心血管系统标本器官 : 心脏 病变描写 : 1. 二尖瓣的厚度增加, 不透明, 瓣膜明显变形, 瓣膜之间相互黏连融合致二尖瓣粘连 同时, 瓣叶缩短卷曲, 并与腱索黏连, 导致二尖瓣缩短 乳头肌增大, 增粗 2. 左心室腔扩大, 心尖部圆钝, 腔内壁的肉柱由圆形变成扁平状, 左心室壁厚约 1.5cm, 较正常明显增厚 左心房腔扩大, 左心室壁厚约 0.3cm, 较正常明显增厚 上述变化导致整个心脏外观变大 病理学诊断 : 风湿性心瓣膜病, 二尖瓣狭窄伴关闭不全 ( 四 ) 心血管系统标本临床病历摘要 : 成年男性, 肢体大关节反复疼痛已数年, 不规则持续发热二个月 体检 : 心尖区和主动脉瓣区均可闻及响亮之收缩期杂音, 肝大肋下二指, 脾大肋下三指, 皮肤有少数瘀点 器官 : 心脏 病变描写 1. 主动脉瓣形状明显改变, 瓣膜增厚及透明度减低 ; 2. 瓣膜上可见一明显的赘生物, 大小约 2 1.5cm, 形态不规则, 表面粗糙, 颜色暗红, 质地脆, 与瓣膜的附着不牢固 3. 整个心脏体积增大, 左心腔明显增大, 心室壁厚约 2cm 病理学诊断 : 亚急性细菌性心内膜炎伴主动脉瓣赘生物形成 思考题 : 赘生物与心脏体积变化及瓣膜变化有何因果关系? ( 五 ) 心血管系统标本器官 : 心脏 病变描写 : 1. 二尖瓣或主动脉瓣形态未改变, 厚度 透明度及弹性等未改变 2. 二尖瓣瓣膜可见一个赘生物附着, 大小约 cm, 形状不规则, 表面粗糙, 颜色暗红, 质地脆 在赘生物的附着处, 可见二尖瓣上 0.5cm 大小穿孔形成 病理学诊断 : 急性细菌性心内膜炎伴二尖瓣穿孔 思考题 : 请比较风湿病 急性和亚急性细菌性心内膜炎的病因 瓣膜病变及赘生物 ( 眼观, 镜检 ) 特点及结果 ( 六 ) 心血管系统标本临床病历摘要 : 中年男性病人 脑力劳动者 五年前发现高血压, 初起时血压时高时正常, 近三年多来, 血压持续保持于 188/120 mmhg 左右 器官 : 心脏 病变描写 : 1. 整个心脏体积增大, 左心室壁厚约 3cm, 左心室腔变小, 乳头肌增粗, 二尖瓣及主动脉瓣形态正常, 呈透明状 2. 心脏的颜色较正常深, 呈红褐色 病理学诊断 : 高血压性心脏病 ( 代偿期 )

269 ( 七 ) 心血管系统标本器官 : 肾 肾脏体积变小, 质地变硬, 表面呈细小均匀颗粒状, 切面皮质及髓质均有萎缩, 其间小动脉管壁变硬, 开口呈哆开状 病理学诊断 : 颗粒性固缩肾 ( 八 ) 心血管系统标本器官 : 心脏 病变要求 : 自行描述病变特点 病理学诊断 : 高血压性心脏病 ( 失代偿期 ) ( 九 ) 心血管系统标本器官 : 主动脉 病变描写 : 1. 病变见于主动脉内膜 2. 标本可见内膜面的脂质条纹, 颜色呈浅黄色, 呈细长形与动脉长轴平行 3. 标本可见内膜面的纤维斑块及粥样病灶, 呈不规则圆形, 有的颜色灰白, 表面光滑似蜡 有的稍黄, 有的表面破溃形成溃疡 病理学诊断 : 主动脉粥样硬化症 ( 十 ) 心血管系统标本器官 : 心脏 临床病历摘要 : 成年男性, 三个月前行走时突感心前区疼痛, 并放射至左上肢, 伴气急 当时跌倒在地, 大汗淋漓, 肢体厥冷, 而神志清楚, 经医师检查诊断为 心肌梗死 次日即发生咳嗽 咳粉红色泡沫样痰, 气促不能平卧 经住院治疗后渐有好转 今晚去厕所大便时, 突然心悸气促, 心前区隐痛, 当时检查 : 心率 120 次 / 分, 血压 110/80 mmhg, 较平时低, 两肺布满湿罗音 经抢救无效而死亡 病变描写 : 心脏切面上观察冠状动脉横断面 : 见内膜增厚, 小血栓形成, 占据动脉管径的 2/3 左右 ( 不同标本程度不等 ) 观察左室前壁及室间隔前 2/3 部分, 此部位相当于冠状动脉前降支支配区域 其颜色较周围组织浅, 肌纹理不清, 病灶边缘不整齐 病理学诊断 : 心肌梗死 ( 十一 ) 心血管系统标本器官 : 大脑基底动脉环病变描写 : 标本通过动脉外膜 中膜, 可见整个动脉环有多个局灶性病灶, 病灶颜色加深, 大小约 0.5cm; 整个动脉环僵硬, 粗细不等 病理学诊断 : 脑基底动脉环动脉粥样硬化 二 镜检切片 ( 一 ) 心血管切片器官 : 心脏 请画出病变示意图并加文字说明 提示 : 重点病变位于间质及内膜中 病理学诊断 :1. 风湿性心肌炎, 风湿小体形成 思考题 : 本例心肌间质的病灶时隔 2~3 个月后, 形态上出现哪些变化?

270 ( 二 ) 心血管切片 ( 示教 ) 器官 : 心瓣膜 病变要点 : 1. 瓣膜上有大而不规则血栓附着, 其中有菌丛 2. 瓣膜本身急性化脓性炎症 病理学诊断 : 急性细菌性心内膜炎伴赘生物形成 ( 三 ) 心血管切片 ( 示教 ) 1. 主动脉瓣心室面有多数红染的均质的血栓附着 2. 血栓基部有成纤维细胞增生 机化 3. 瓣膜中有淋巴细胞等炎症细胞浸润 病理学诊断 : 亚急性细菌性心内膜炎伴赘生物形成 ( 四 ) 泌尿系统切片器官 : 肾 请画出病变示意图并加文字说明 病理学诊断 : 颗粒性固缩肾 ( 五 ) 心血管系统切片 ( 甲 乙 ) 器官 : 甲 : 冠状动脉, 乙 : 主动脉 病变要点 : 1. 病变时动脉内膜的厚度及其中膜厚度有何变化 ; 2. 内膜深层局灶性坏死, 其中有多量针状空隙, 即制片时溶解的胆固醇结晶 ; 3. 观察动脉管腔大小, 及管腔中的成分, 并在病灶边缘观察泡沫细胞 请画出病变示意图并加文字说明 病理学诊断 : 动脉粥样硬化症伴粥样灶形成

271 第四篇呼吸系统 (RESPIRATORY SYSTEM) 实验二十一呼吸系统解剖结构 (ANATOMY OF RESPIRATORY SYSTEM) 实验目的和要求 掌握呼吸系统的组成和结构 实验用品和标本 尸体和标本 实验内容和方法 一 鼻和喉 ( 一 ) 鼻 1. 了解外鼻的形态结构 2. 掌握鼻腔的分部及各部的形态结构 3. 掌握鼻旁窦的名称 位置和开口, 并了解其临床意义 ( 二 ) 喉 1. 掌握喉的位置 体表标志 2. 掌握喉的软骨, 了解喉的连结 肌肉及其机能 3. 掌握喉腔的形态结构, 了解活体喉口所见 二 气管和支气管 ( 一 ) 气管 1. 掌握气管的位置 2. 掌握气管的构造 ( 二 ) 支气管掌握左 右支气管形态上的区别及其临床意义 三 肺和胸膜 ( 一 ) 肺 1. 掌握肺的位置 形态结构和分叶 2. 了解肺的构造和肺段的概念 ( 二 ) 胸膜 1. 掌握胸膜和胸膜腔的概念 2. 掌握胸膜的分部 膈肋窦的位置及其临床意义 3. 了解胸膜和肺的体表投影 ( 三 ) 纵膈

272 了解纵膈的概念 纵膈的区分及其组成器官 思考题 : 1. 呼吸系统包括哪些器官? 什么叫上呼吸道? 如何区分上 下呼吸道? 2. 试述鼻付窦的位置 ( 包括额窦 上颌窦的最浅表部位 ) 及开口 ( 试结合形态特点分析脓鼻涕的来源 ) 3. 喉腔分几部? 喉镜检查时可见到哪些结构? 如何确认声带? 为什么小儿呼吸道感染时易发生呼吸困难和窒息? 4. 试述气管的位置及左右支气管的形态特点, 气管切开手术在何处进行? 5. 试述肺的形态位置, 肺尖及肺叶下界的体表投影 6. 试述胸膜的分部, 膈肋窦的位置及胸膜下界的体表投影 7. 试述纵膈的位置 分部和内容

273 实验二十二呼吸系统组织结构 (HISTOLOGY OF RESPIRATORY SYSTEM) 实验目的和要求 掌握气管和肺的组织结构 实验用品和标本 组织切片 实验内容和方法 呼吸系统由鼻 咽 喉 气管 支气管和肺等器官组成 从鼻腔到肺内的肺泡是一系列连续而反复分支的管道系统 鼻腔至肺内的终末细支气管因无气体交换功能称为导气部, 各段管壁的组织结构一般可分为三层 : 黏膜 黏膜下层和外膜 但在不同部位其管壁结构又有与其功能相适应的结构变化 呼吸部是从肺内呼吸性细支气管至肺泡, 因其管道都有肺泡开口, 能行使气体交换功能而得名 本章实验着重观察支气管树各段管壁的组织结构和肺泡的光镜结构 一 切片观察 ( 一 ) 气管 (trachea) 切片名 : 人气管横切,HE 染色 要求 : 掌握气管的组织结构 肉眼观察 : 在横切面上, 管壁中间一条紫蓝色的结构, 为 C 字形的软骨环 这部分的管壁称为软骨部, 无软骨部分即为膜壁部 低倍观察 : 自腔面向外观察, 先观察软骨部, 区分出三层结构 : (1) 黏膜层 : 包括上皮和薄层的固有层 ; (2) 黏膜下层 : 疏松结缔组织中充满了腺泡, 与固有层没有明确的界线 ; (3) 外膜 : 包括透明软骨环和其周围的结缔组织 软骨环可因切面偏斜, 使上 下两个软骨环的部分软骨呈不连续的片状在一个切面上出现 膜壁部的黏膜多皱褶, 黏膜下层腺体丰富, 外膜与黏膜下层中有较大的呈团索状的纵行和环行平滑肌的切面, 黏膜下层和外膜界线不清 高倍观察 : 重点观察下列结构 : (1) 上皮 : 假复层纤毛柱状上皮 并注意观察厚而明显的基膜 ( 淡红 均质 折光性较强 ); (2) 固有层 : 细密的疏松结缔组织中有许多纵行排列的弹性纤维, 被横切成红色较明亮的点状, 此外尚有淋巴组织 小血管 腺导管, 导管的上皮为单层立方或单层柱状, 近开口处与假复层纤毛柱状上皮相延续 ; (3) 黏膜下层的腺体是混合性腺 注意区分三种不同的腺泡 ; (4) 外膜 : 复习透明软骨的结构特点

274 ( 二 ) 肺 (lung) 切片名 : 猫肺切面,HE 染色 要 求 : 掌握肺内导气部和呼吸部各段结构特点, 找出各级支气管结构的变化规律 掌握肺内各级血管的分布, 理解其血液循环特点及其功能的联系 肉眼观察 : 结构疏松, 呈大小不一的网眼状 低倍观察 : 肺表面覆有脏层胸膜, 间皮下有一条红色均质的弹力纤维层 移动切面 见许多蜂窝状的薄壁囊泡, 为肺泡 并见许多管径大小不一, 管壁结构不尽相同的各级支气管以及一些血管 在低倍镜下区别各类支气管, 并结合高倍观察, 找出上皮 腺体 软骨和平滑肌的变化规律 1. 导气部 (1) 肺内小支气管 : 管径较大, 管壁较厚, 仍可分为黏膜 黏膜下层和外膜三层, 黏膜有许多皱褶, 上皮为假复层纤柱状上皮, 有杯状细胞 黏膜下层中亦有混合性腺体, 在黏膜深面有不连续的环行平滑肌, 外膜中有大小不一的软骨片 ; (2) 细支气管 : 管径较小, 管壁较薄, 且分层不明显, 上皮为假复层纤毛柱状上皮或单层纤毛柱状上皮 杯状细胞很少或消失 黏膜下层的腺体和外膜的软骨片更少或消失 而黏膜深层的平滑肌呈完整的环状 ; (3) 终末细支气管 : 无软骨片, 无腺体, 上皮为单层纤毛柱状上皮, 平滑肌形成完整的环行层 2. 呼吸部 (1) 呼吸性细支气管 : 管壁薄且因有肺泡或肺泡管的开口而不完整 上皮为单层柱状, 或单层立方上皮 其外方为薄层的平滑肌和弹性纤维 ; (2) 肺泡管 : 管壁更不完整, 仅有二列不连续的结节形膨大组成, 结节间均为肺泡和肺泡囊的开口 上皮为单层立方上皮, 其外方有薄层弹性纤维, 并有少量平滑肌 ; (3) 肺泡囊和肺泡 : 为大小不一的薄壁囊泡, 肺泡囊是几个肺泡共同开口的地方 ; (4) 肺动 静脉 : 与小支气管伴行的小动静脉即为肺动 静脉 较小的肺静脉单独存在于肺泡之间 高倍观察 : 重点观察以下结构 : (1) 肺泡与肺泡囊 : 肺泡为大小不甚一致的多边形囊泡, 常呈梅花形排列 ; (2) 肺泡隔 相邻肺泡之间的薄层组织称为肺泡隔, 由少量结缔组织组成, 内有非常丰富的毛细血管, 肺泡上皮在光镜下不易分辨 ; (3) 支气管动 静脉 : 位于支气管外膜中, 管径小, 与肺动 静脉相比大小悬殊 ; (4) 尘细胞 : 位于各级支气管壁和肺泡隔下, 亦可位于肺泡与细支气管上皮的表面 呈棕褐色小点或集结成团 高倍下选择吞噬灰尘少的细胞观察, 可以看到不规则形的细胞和圆形的胞核, 胞浆内有棕褐色的吞噬颗粒 ( 尘粒 ) 二 示教 ( 一 ) 肺泡毛细血管 (alveolar capillaries) 人肺 墨汁血管灌注片 制法 : 向肺动脉注射墨汁后将肺烘干再制成厚片 要求 : 了解肺泡壁上丰富的毛细血管立体图像观察 : 镜下大小不一的肺泡上布满黑色的毛细血管 ( 二 ) 气管基膜 (basement membrane of trachea)

275 人气管横切,HE 染色 要求 : 了解气管基膜的组织结构 观察 : 上皮下有厚而明显的基膜, 呈淡红 均质 折光较强的细带状 三 电镜图像 尘细胞 (dust cell) 要求 : 了解尘细胞的微细结构 观察 : 不规则 有胞突的细胞体内可见溶酶体和吞程式体等超微结构 思考题 : 1. 在光镜下如何区别气管, 肺内小支气管, 细支气管和终末细支气管? 2. 氧气从鼻腔吸入后需经过哪些管道和结构才能进入血液?

276 实验二十三呼吸系统病理 (PATHOLOGY OF RESPIRATORY SYSTEM) 实验目的和要求 1. 掌握支气管扩张症 肺不张 肺气肿及肺心病的形态特点及其观察 分析描述 2. 掌握大叶性 小叶性肺炎的眼观及镜下表现, 并加以区别 3. 掌握肺原发综合征 慢性纤维空洞型肺结核的形态特点, 结核结节镜下表现的特点 4. 学习和练习观察 分析 判断疑为肺结核标本和切片的思维方法 实验用品和标本 病理标本和切片 实验内容和方法 一 眼观标本 ( 一 ) 呼吸系统标本器官 : 肺 病理学诊断 : 支气管扩张症 ( 二 ) 呼吸系统标本器官 : 肺 病变要点 : 体积 肺膜有何变化, 切面见肺组织较致密, 质地较实, 外观似脾脏 病理学诊断 : 急性大块性肺不张 (acute massive collapse of lung) ( 三 ) 呼吸系统标本器官 : 肺 请自行描写病变 ( 提示 : 注意肺体积, 边缘 切面及肺小叶间隔的情况 ) 病理学诊断 : 大泡性肺气肿 (bullous emphysema) ( 四 ) 呼吸系统标本器官 : 心脏 请自行描写病变 ( 提示 : 注意体积, 心腔, 房室壁 瓣膜等的变化? 同时观察肉柱 乳头肌有可改变?) 病理学诊断 : 右心肥大 ( 肺源性心脏病 ) ( 五 ) 呼吸系统标本器官 : 肺 病变 : 切面上, 肺上叶或下叶部分地区的质地和颜色有何变化? 该侧肺膜表面可见什么? 病理学诊断 : 大叶性肺炎 ( 六 ) 呼吸系统标本器官 : 肺 请自行描写病变

277 病理学诊断 : 小叶性肺炎 ( 七 ) 呼吸系统标本器官 : 肺 病变要点 : 右肺上叶肺膜下约 cm 病灶是什么病变? 边界与质地如何? 同侧肺门淋巴结肿大融合, 切面与为相同病变 他处肺组织可见散在粟米大小病灶 病理学诊断 : 原发综合征 ( 八 ) 呼吸系统标本器官 : 肺 肝 脾 请自行描写病变 ( 提示 : 注意肺有哪些病变? 肺门淋巴结? 肝 脾等器官可见粟米大小的灰白病灶 ) 病理学诊断 : 全身粟粒性结核病 ( 九 ) 呼吸系统标本器官 : 肺 病变要点 : 切面上在什么部位可见几个不规则形的空洞? 大小如何? 壁厚多少? 腔内壁附有什么? 其余肺组织还有什么灶状病变? 整个肺组织质地以及肺膜有什么异常? 病理学诊断 : 慢性纤维空洞性肺结核 ( 十 ) 呼吸系统标本器官 : 肺 病变要点 : 该标本过去已实习过, 现在有什么进一步体会? 病理学诊断 : 结核球 ( 十一 ) 呼吸系统标本器官 : 肺 病变 : 肺组织内因炭末沉着而呈灰黑色或暗黑色, 在暗黑色的背景上, 可见粟米大小灰白色的病灶, 称为什么? 有些地区组织结构消失, 呈灰黄 灰白色, 质软而细腻, 这是什么病变? 病理学诊断 : 硅肺伴结核 (silicosis with tuberculsis) ( 十二 ) 呼吸系统标本器官 :(1) 肾 ;(2) 膀胱 请自行描写病变 病理学诊断 : 泌尿生殖系统结核病 ( 十三 ) 呼吸系统标本器官 : 肺 请自行描写病变 ( 请注意肿块与支气管的关系 ) 病理学诊断 : 肺癌 (carcinoma of lung) 二 镜检标本 ( 一 ) 呼吸系统切片器官 : 支气管及肺组织 病变要点 : 支气管黏膜杯状上皮增生, 上皮脱落, 管腔内充有脱落上皮细胞 黏液及炎细胞 管壁充血, 少量慢性炎细胞浸润 病理学诊断 : 慢性支气管炎 ( 二 ) 呼吸系统切片

278 器官 : 肺 请画出病变示意图并加文字说明 ( 注意肺泡壁 肺泡腔的变化 ) 病理学诊断 : 肺气肿 ( 三 ) 呼吸系统切片 ( 示教 ) 器官 : 肺 病变要点 : 肺泡腔显著狭窄, 肺泡壁毛细血管扩张, 肺泡上皮近似立方形 病理学诊断 : 肺不张 ( 四 ) 呼吸系统切片器官 : 肺 请画出病变示意图 提示 : 观察肺泡壁变化 肺泡内充有哪些炎性渗出物? 理解后自行画图 诊断 病理学诊断 : 大叶性肺炎 ( 五 ) 呼吸系统切片器官 : 肺 请画出病变示意图 提示 : 对比四 呼吸系统切片, 找出它们的异同点, 如支气管内渗出物等, 然后自行画图 诊断 病理学诊断 : 小叶性肺炎 ( 六 ) 呼吸系统切片器官 : 肺 病变要点 : 全面观察切片后, 选择眼观比较致密的部分作重点观察, 肺泡壁及支气管轻度充血, 其中可见少量淋巴细胞及单核细胞 中性粒细胞浸润, 肺泡壁增厚, 肺泡腔内仅见少量渗出物 病理学诊断 : 间质性肺炎 ( 七 ) 呼吸系统切片器官 : 肺 请画出病变示意图并加文字说明 病理学诊断 : 粟粒性肺结核 ( 八 ) 呼吸系统切片 : 自行观察 诊断 器官 : 肺 请画出病变示意图并加文字说明 病理学诊断 : 干酪性肺炎 ( 九 ) 呼吸系统切片 : 切片中见多数结节, 其呈同心圆样层状排列者是什么成分? 结节周围组织有何改变? 器官 : 肺 请画出病变示意图并加文字说明 病理学诊断 : 硅肺

279 第五篇 消化系统 (DIGESTIVE SYSTEM) 实验二十四 消化系统解剖结构 (ANATOMY OF DIGESTIVE SYSTEM) 实验目的和要求 掌握消化系统的组成和结构 实验用品和标本 尸体和标本 实验内容和方法 一 消化管 ( 一 ) 口腔 (oral cavity) 1. 掌握口腔的分部及界限, 了解唇的活体所见 2. 了解乳牙和恒牙的牙式, 掌握牙形态和构造 3. 了解舌的形态和黏膜, 了解舌肌的一般分布和机能 掌握颏舌肌的起止, 位置和作用 4. 掌握腮腺 颌下腺 舌下腺的位置 形态和腺管的开口部位 5. 掌握活体口腔所见 ( 牙 牙龈 舌 舌系带 舌下肉阜 咽峡 舌腭弓 咽腭弓 悬雍垂 腭扁桃体等 ) ( 二 ) 咽 (pharynx) 掌握咽的位置和形态 咽的分部 ; 掌握扁桃体的位置和机能 ( 三 ) 食管 (esophagus) 1. 掌握食管的长度 形态 位置 狭窄部位及其意义 2. 了解食管的构造 3. 了解食管的 X 线像 ( 四 ) 胃 (stomach) 1. 掌握胃的形态 位置 毗邻及构造 2. 了解胃的 X 线像 ( 五 ) 小肠 (small intestine) 1. 掌握小肠的分部 2. 掌握十二指肠的位置 形态及各部的结构 3. 掌握空肠 回肠的位置 形态及肠壁的构造 4. 了解美克尔憩室的位置 形成及其临床意义 ( 六 ) 大肠 (large intestine) 1. 掌握大肠的分部及形态学上的特点 2. 掌握盲肠和阑尾的位置 形态结构及阑尾根部的体表股影

280 3. 掌握结肠的分部及部位的位置 4. 掌握直肠的位置 形态和构造 二 消化腺 ( 一 ) 肝 (liver) 1. 掌握肝的形态 位置 ( 体表投影 ) 和毗邻 2. 了解肝的分区及其机能 ( 二 ) 胆囊 (gall-bladder) 及输胆管道 (bile duct) 1. 掌握胆囊的形态 位置及胆囊底的体表股影 2. 掌握输胆管道组成, 胆总管与胰管的汇合和开口部位 掌握胆汁的排出途径 3. 了解胆囊和输胆管道的变异 ( 三 ) 胰 (pancreas) 1. 掌握胰的位置 分部并了解其临床意义 2. 掌握胰液的排出途径 思考题 : 1. 试举例表明成人或小孩病齿的方式并解释为何牙根暴露的人, 当饮用过泠热的饮料时感到牙痛? 牙周炎系泛指哪些组织发炎? 2. 舌可几部? 舌背黏膜结构有哪些特点? 颏舌肌的起止和作用怎样? 3. 结舌活体试述三对大唾液腺的位置及导管的开口部位 4. 咽峡是怎样围成的? 腭扁桃体位于何处? 试结合活体叙述 5. 试述咽的位置 分部和邻通 6. 空 回肠的鉴别要点有哪些? 7. 阑尾根部的体表投影怎样? 在手术时如何导找阑尾? 8. 试述直肠的形态 构造 何谓痔? 内痔和外痔的位置有何不同 9. 消化管上有哪些定名的弯曲 瓣膜和括约肌? 各部黏膜皱襞的形态结构名称有哪些? 消化管的哪些部位相对狭窄? 10. 试述胆囊的形态和位置 ( 包括胆囊底的体表投影 ) 以及胆汁和胰液的排出径路 11. 试述成人肝的形态结构名称, 肝的位置 ( 结合活体描述 ) 和邻接 小儿肝的位置与成人有何不同? 如何确定肝下垂或肝肿水

281 实验二十五消化管组织结构 (HISTOLOGY OF DIGESTIVE TRACT) 实验目的和要求 1. 掌握消化管的一般组织结构 2. 掌握食管 胃 小肠和结肠各段黏膜层的结构特点及其功能的关系 3. 熟悉阑尾的组织结构 实验用品和标本 组织切片 实验内容和方法 消化管 (digestive tract) 包括口腔 咽 食管 胃 小肠 大肠 阑尾和肛门, 是一条连续性的管道, 管壁均由黏膜, 黏膜下层, 肌层, 外膜四层结构组成 其中变化最大, 最能体现各段结构特征的是黏膜层 观察时须特别注意 一 观察切片 ( 一 ) 牙 (tooth) 切片名 : 人牙磨片,AgNO 3 染色 要求 : 了解牙的一般结构 肉眼观察 : 辨认牙冠 牙颈 牙根和牙髓腔, 牙冠是较粗的一端, 其外围有一层乳白色的釉质, 牙根是较细的一端, 其外周有一薄层淡棕色的牙骨质 牙冠与牙根之间为牙颈, 牙中间的腔是牙髓腔 牙本质位于牙釉质和牙骨质的深面 低倍观察 : 牙的各部分结构在低倍上观察 : (1) 牙釉质 : 呈浅棕色, 在牙冠顶部厚, 愈近牙颈愈薄, 釉柱很细, 自釉质与牙本质交界处呈放射状向外伸展, 与牙表面垂直, 芮氏线为粗褐色的条纹, 自釉质与牙本质交界处斜向外方伸出, 施氏线是与牙表面垂直的一些明暗相间的粗纹 (2) 牙本质 : 色淡, 有许多小管自牙髓腔面呈放射状向外周伸展 (3) 牙骨质 : 在牙根部较厚, 可见骨陷窝和骨小管, 牙颈部较薄, 无骨陷窝和骨小管 ( 二 ) 食管 (esophagus) 切片名 : 人食管横切,HE 染色 要求 : 了解消化管壁的四层结构和掌握食管结构的特点 肉眼观察 : 腔面上有多个皱壁, 使管腔呈不规则的裂隙状, 靠腔面一层紫色的是上皮, 其下方淡红色的是黏膜下层, 再向外是红色的肌层, 外膜不易看见 低倍观察 : 从管腔面依次向外观察 :

282 1. 黏膜 : (1) 上皮 : 为复层扁平上皮 ( 有无角化现象?) (2) 固有层 : 由细密的结缔组织构成, 可见淋巴组织, 小血管及食管腺导管 (3) 黏膜肌层 : 为纵行的平滑肌束横切面, 这是食管结构特征之一 2. 黏膜下层 : 由疏松结缔组织构成, 可见有较大的血管和神经, 可以观察到灰蓝色团块样的黏液性食管腺的腺泡和导管, 导管上皮为单层立方, 渐次为复层立方, 最后变为开口处的复层扁平 3. 肌层 : 为内环 外纵二层, 注意骨骼肌与平滑肌的区别, 以确定本片中的食管属于哪一段? 肌层之间有肌间神经丛 4. 外膜 : 为疏松结缔组织构成的纤维膜 高倍观察 : 注意观察食管腺的黏液性腺泡及其导管和肌间神经丛, 后者包括核大而圆, 染色浅, 核仁明显, 胞质嗜碱性的神经元和无髓神经纤维 ( 三 ) 胃 (stomach) 切片名 : 人胃底切面,HE 染色 要求 : 掌握胃壁的一般结构及胃黏膜的详细结构 肉眼观察 : 紫蓝色有高低不平皱襞的为黏膜, 其深部红色的为黏膜下层 肌层和外膜 低倍观察 : 先全面观察切片, 分清管壁四层结构, 然后选择一胃底腺呈纵切的部位自内向外逐层观察 1. 黏膜层 : 表面不平整, 和黏膜下层共同形成皱襞, 向腔内突起 黏膜表面下陷 形成胃小凹 (1) 上皮 : 单层柱状上皮, 胞质内有较多黏原颗粒, 将细胞核挤向基底部 (2) 固有层 : 结缔组织中分布着大量的胃底腺, 它们均开口于胃小凹底部 由于切面关系, 胃底腺和胃小凹多不连续而被切成不同的断面 胃底腺中, 大致可区分出红色的壁细胞和紫蓝色的主细胞 注意它们在胃底腺中的分布规律 (3) 黏膜肌层 : 为疏松结缔组织, 内含血管 淋巴管和神经等 2. 肌层 : 较厚, 分内斜 中环 外纵三层平滑肌, 内斜和中环的两层之间, 界线不甚分明, 肌层间有肌间神经丛 3. 外膜 : 为浆膜, 由薄层疏松结缔组织和其表面的间皮组成 高倍观察 : 着重观察下列结构 : (1) 上皮 : 较高的单层柱状上皮, 细胞核圆, 近基部, 柱状细胞顶部的胞质内充满黏原颗粒,HE 染色不易着色, 因此呈现透亮区,( 上皮内有无杯状细胞?) (2) 胃底腺 : 由主细胞 壁细胞和颈黏液细胞等组成 主要辨认主细胞和壁细胞 1 主细胞 : 体积较小, 呈柱状, 胞质着紫蓝色, 胞核圆形, 位于细胞基部 多分布于胃底腺的体部和底部 2 壁细胞 : 体积较大, 呈圆形或不规则圆形, 胞质着红色, 核圆居中, 少数壁细胞有二个核, 多分布在胃底腺的颈部和体部 3 颈粉液细胞 : 体积小, 呈低柱状或烧瓶状, 胞质透亮, 核扁, 紧贴基部, 颈黏液细胞数量少, 分布在胃底腺颈部 (3) 固有层 : 结缔组织中除了大量的胃底腺外, 还有散在的平滑肌 淋巴组织 浆细胞和颗粒白细胞 (4) 肌间神经丛 : 包括神经元和无髓神经纤维 ( 四 ) 小肠 (small intestine) 切片名 : 人空肠纵切面,HE 染色

283 要求 : 掌握小肠壁的结构特点及小肠绒毛和小肠腺的详细结构 肉眼观察 : 纵切面可见数个较高的隆起, 是小肠的环行皱襞, 在皱襞表面可见有许多细小的突起, 即绒毛 深面红色的为黏膜下层 肌层和外膜 低倍观察 : (1) 黏膜 : 小肠黏膜表面有许多指状突起的绒毛 有些绒毛被横切或斜切成圆形或椭圆形的断面, 游离于肠腔内 绒毛基部的上皮向固有层内下陷, 形成管状的小肠管, 故小肠腺开口于相邻绒毛的基部 部分肠腺可被横切或斜切成圆形或椭圆形的断面 固有层的结缔组织中还可见孤立淋巴小结和弥散淋巴组织 ( 注意与小肠腺的边切区别 ) 黏膜肌层为一薄层内环外纵的平滑肌 (2) 黏膜下层 : 为疏松结缔组织, 内有丰富的小动 静脉和小淋巴管等 (3) 肌层 : 为内环外纵的两层平滑肌 (4) 外膜 : 为浆膜, 由薄层结缔组织和覆盖在外表面的单层扁平上皮组成 高倍观察 : 着重观察下列结构 : (1) 肠上皮 : 为单层柱状上皮, 其胞核的形态 位置与胞质的着色均与胃上皮不同 上皮的游离面可见着色红亮呈茸状的纹状缘 若将光线调暗些, 则更清楚 柱状细胞之间散布着少量的杯状细胞, 其胞质透亮呈水滴样 核位于较细的基部, 呈三角形 (2) 绒毛的轴心 : 为固有层, 疏松结缔组织中细胞较多且含有丰富的毛细血管和毛细淋巴管, 此外尚有少量散在纵行平滑肌纤维 (3) 小肠腺 : 除了柱状细胞和杯状细胞外, 在小肠腺的底部, 有三 五成群的潘氏细胞, 其胞体呈锥体形, 核圆形近基部, 核上方有粗大的嗜酸性颗粒 本片在制片过程中, 颗粒大多溶解, 仅见颗粒的轮廓, 故胞质着色浅 (4) 肌间神经丛 : 由神经元和无髓神经纤维组成 神经元大小不一, 胞质淡紫色, 核大, 染色浅, 核仁清楚 单层扁平的囊细胞 ( 卫星细胞 ) 围绕在神经细胞周围, 其胞核染色深呈圆形 (5) 黏膜下神经丛 : 结构同肌间神经丛 ( 五 ) 大肠 (large intestine) 切片名 : 人结肠纵切面,HE 染色 要求 : 掌握大肠的结构特点, 并与小肠的结构对比 肉眼观察 : 大肠黏膜面可见较低而宽的皱襞 低倍观察 : 基本结构与小肠相同, 也可分四层, 但有下列不同 : (1) 黏膜只有皱襞, 无绒毛, 表面较平整, 上皮中杯状细胞较多 (2) 大肠腺 : 较大肠腺粗 长 直, 整齐地排列在固有层中, 其中有大量杯状细胞 (3) 固有层中的孤立淋巴小结常可伸达黏膜下层, 黏膜下层中常有脂肪细胞存在 内有较大的血管和淋巴管 (4) 肌层 : 亦为内环外纵两层平滑肌, 局部外纵肌增厚成结肠带 (5) 外膜 : 在有腹膜覆盖的部分为浆膜, 其余部分为纤维膜, 常含较多的脂肪细胞 高倍观察 : 着重观察下列结构 : (1) 上皮 : 注意柱状细胞游离面的纹状缘较薄, 杯状细胞较多 (2) 大肠腺的形态和细胞构成 (3) 黏膜下神经丛和肌间神经丛 ( 六 ) 阑尾 (appendix) 切片名 : 人阑尾横切,HE 染色 要求 : 比较阑尾与大肠结构上的异同, 了解阑尾中特别丰富的淋巴组织在免疫功能

284 中的意义 肉眼观察 : 阑尾管腔小而不规则, 腔内常有食物残渣存在, 黏膜中连成环状的紫蓝色团块, 即是淋巴组织 周围色浅处为黏膜下层, 最外面粉色红的结构为肌层 低倍观察 : 基本结构与大肠同, 但肠腺不发达 固有层内淋巴组织特别丰富, 淋巴小结和弥散淋巴组织连成一环, 并伸入黏膜下层, 黏膜肌层被冲散, 使固有层与黏膜下层界线不清, 肌层较薄, 外膜为浆膜 阑尾腔内常有肠内容物和脱落的上皮细胞, 呈紫红色 高倍观察 : 观察上皮和肠腺, 并与大肠比较 二 示教 ( 一 ) 丝状乳头 (filiform papillae) 人舌丝状乳头,HE 染色 要求 : 了解丝状乳头的形态和结构 观察 : 丝状乳头为舌背部黏膜表面的锥形突起, 形同烛焰 其表面为复层扁平上皮, 上皮表层细胞染成红色, 胞核固缩或呈薄层无核的角化层, 并与深层细胞有分离现象 固有层的结缔组织从乳头基部高低不一地突向上皮, 形成乳头的轴心 ( 二 ) 菌状乳头 (fungiform papillae) 人舌菌状乳头,HE 染色 要求 : 了解菌状乳头的形态和结构观察 : 乳头基部细而窄, 顶部较大, 呈略扁的半圆形, 形似蘑菇 其结构与丝状乳头同, 唯其轴心的结缔组织富含血管, 且发出较多分支 ( 即次级乳头 ) 突向上皮 ( 三 ) 轮廓乳头 (circumvallate papillae) 人舌轮廓乳头,HE 染色 要求 : 了解轮廓乳头的形态和结构观察 : 轮廓乳头大, 顶部平, 不突出舌面, 在切面上, 其两侧以深陷的轮廓沟与周围组织分界, 乳头侧面的复层扁平上皮中, 成单行排列着椭圆形浅染的味蕾, 沟底附近的黏膜中有浆液性的味腺 ( 四 ) 味蕾 (taste bud) 兔的叶状乳头,HE 染色 要求 : 了解味蕾的结构观察 : 叶状乳头在切面上由脊和沟交替排列成整齐的一行 每个叶状乳头侧面的复层扁平上皮中, 浅色的椭圆形小体就是味蕾, 其中胞体较大, 着色浅的梭形细胞是味细胞, 其顶部有味毛伸入味孔 ; 胞体纤细, 着色较深的梭形细胞是支持细胞, 位于味蕾基部的锥体形细胞是基底细胞 味蕾顶端与表面相通连的小凹即味孔 ( 五 ) 中央乳糜管 (central lacteal) 猪的十二指肠绒毛,HE 染色 要求 : 熟悉中央乳糜管的位置和结构观察 : 中央乳糜管位于绒毛中轴, 由一层内皮围成, 腔内有许多红色的乳糜颗粒, 其周围分布有毛细血管和散在的纵行平滑肌纤维 ( 六 ) 小肠腺中的内分泌细胞 (endocrine cell) 人小肠横切,AgNO 3 染色 要求 : 了解内分泌细胞在小肠腺中的分布及其嗜银性 观察 : 内分泌细胞散在小肠腺上皮细胞之间, 胞质中有大量深褐色的嗜银颗粒, 胞核往

285 往被其掩盖而不易看清 ( 七 ) 十二指肠腺 (duodenal gland) 人十二指肠纵切,HE 染色 要求 : 了解十二指肠腺的分布与结构 观察 : 十二指肠黏膜下层内, 分布着大量黏液性腺泡即为十二指肠腺 三 电镜图像 ( 一 ) 主细胞 (chief cell) 要求 : 掌握主细胞的超微结构观察 : 在细胞游离面可见微绒毛, 酶原颗粒, 核下区胞质内有丰富的粗面内质网, 核上区可见高尔基复合体等 顶部胞质中充满粗大的酶原颗粒 ( 二 ) 壁细胞 (parietal cell) 要求 : 掌握壁细胞的超微结构观察 : 可见细胞内分泌小管中发达的微绒毛, 微管泡系, 丰富的线粒体, 并可见高尔基复合体及粗面内质网等超微结构 ( 三 ) 小肠黏膜吸收细胞 (absorptive cell of small intestine) 要求 : 熟悉肠吸收细胞的超微结构特征观察 : 可见游离面密集的微绒毛和胞质内的线粒体 滑面内质网 高尔基复合体等超微结构 思考题 : 切片上如何鉴别小肠和大肠?

286 实验二十六消化腺组织结构 (HISTOLOGY OF DIGESTIVE GLAND) 实验目的和要求 1. 了解消化腺的一般组织结构 2. 掌握胰腺 肝脏的组织结构特点和与其功能的关系 3. 熟悉颌下腺 舌下腺 腮腺 胆小管的组织结构特点 实验用品和标本 组织切片 实验内容和方法 消化腺 (digestive gland) 可分大 小两种类型, 小消化腺如食管腺 胃腺 肠腺等 ; 大消化腺如大唾液腺 胰腺和肝脏是实质性器官, 均由腺组织和结缔组织构成 本章着重观察大消化腺在 HE 染色标本中的组织结构特征 一 观察切片 ( 一 ) 颌下腺 (submandibular) 切片名 : 人颌下腺切面,HE 染色 要求 : 掌握颌下腺的结构特征, 辨认腺泡和导管, 区分二种腺细胞和三种腺泡 低倍观察 : 从外周向中央观察 : (1) 被膜 : 为疏松结缔组织, 该片仅为颌下腺的一部分, 故被膜不全 被膜伸入实质, 将腺泡隔成许多小叶 小叶间的结缔组织中有较大的小叶间导管和丰富的血管 ; (2) 腺泡 : 小叶内有大量腺泡, 其中大多数是染成红紫色的浆液性腺泡, 此外尚有少量紫蓝色或透亮的黏液性腺泡和混合性腺泡 腺泡之间还有散在的脂肪细胞和小叶内导管, 其中最醒目的是分泌管 高倍观察 : 着重观察下列结构 : (1) 浆液性腺泡 : 由浆液性腺细胞组成 细胞呈锥体形, 核圆近基部, 核上区着红紫色, 有许多红色的酶原颗粒, 核下区深紫色 有的细胞染色浅, 应与黏液性腺泡区分 ; (2) 黏液性腺泡 : 由黏液性腺细胞组成, 细胞锥体形或低柱形, 核扁, 紧贴基部, 核上区着灰蓝色, 或因制片过程中黏原颗粒溶解而透亮 ; (3) 混合性腺泡 : 由浆液性和黏液性二种腺细胞组成 浆液性腺细胞常三 五成群, 形成半月形贴于黏液性腺泡的一侧, 称浆性半月 ; (4) 小叶内的导管 : 包括 (1) 闰管 : 由单层扁平或低立方上皮组成的小管, 着色较浅 (2) 分泌管 : 管腔较大, 由单层柱状上皮组成, 上皮细胞的核靠近游离面, 胞质着色最红 (3) 小叶内导管 : 上皮着较浅的红色, 导管外有少量结缔组织 (5) 小叶间导管 : 为单层高主状上皮或假复层柱状上皮组织, 导管周围有较多的结缔组织 ( 二 ) 胰腺 (pancreas)

287 切片名 : 人胰腺切面,HE 染色 要求 : 掌握胰腺的结构特点, 区分腺泡 导管和胰岛 低倍观察 : (1) 被膜 : 为疏松结缔组织, 并伸入实质, 将其分隔成大小不一的小叶, 小叶间可见由单层柱状上皮组成的小叶间导管 (2) 腺泡与胰岛 : 小叶内大部分为红紫色的腺泡 ; 散布在腺泡之间, 大小不一, 着色浅的细胞团块即为胰岛 高倍观察 : 着重观察下列结构 : (1) 腺泡 : 为浆液性腺泡 细胞锥体形, 核圆近基部, 核上区有许多红色的酶原颗粒, 核下区嗜碱性 ( 为什么? 超微结构如何?) 腺腔中可见数量不等的椭圆形胞核, 细胞较小, 其胞质透亮, 即为泡心细胞 ; (2) 闰管 : 由单层扁平或低立方上皮组成, 管腔小, 因其上皮细胞的胞质着色浅, 因而在纵切面上常仅见到两列扁圆形的胞核 ; (3) 小叶内导管 : 由单层立方上皮组成, 管径小, 周围有少量结缔组织 ; (4) 小叶间导管 : 由单层柱状上皮组成, 周围结缔组织较多 ; (5) 胰岛 : 由大小不一, 着色浅的细胞集结成索 网 团状, 细胞界限不清, 在 HE 染色的切片中不能区分 A B D 三种细胞 胰岛内有丰富的毛细血管 ( 三 ) 肝脏 (liver) 切片名 : 人肝脏切面,HE 染色 要求 : 掌握肝小叶和门管区的形态结构, 联系两者的关系, 理解肝小叶中血液循环和胆汁排出的途径 低倍观察 : 自边缘向中央观察 : (1) 被膜 : 为致密结缔组织, 其表面有间皮覆盖 ; (2) 门管区 : 为实质部分的岛状的结缔组织, 其中有小叶间动, 静脉和小叶间胆管 ; (3) 肝小叶 : 由门管区分隔成的多边形结构, 相邻肝小叶之间界线不清, 小叶中央为中央静脉, 肝细胞索与索间的肝血窦均以此为中心, 呈放射状排列 ; (4) 小叶下静脉 : 为单独存在于肝小叶之间的较大的小静脉 高倍观察 : 着重观察以下结构 : 1. 门管区的三种管道 : (1) 小叶间静脉 : 管壁薄, 管腔最大而不规则 ; (2) 小叶间动脉 : 管壁较厚, 管壁主要由数层平滑肌构成, 管腔最小 ; (3) 小叶间胆管 : 由单层立方或单层柱状上皮组成, 胞质着色较浅, 界线不清, 核呈串珠状排列, 排列整齐 2. 肝小叶 (1) 中央静脉 : 壁薄而不完整, 与肝血窦相通连 ; (2) 肝细胞索 : 由多边形的肝细胞单行排列而成 肝细胞核圆, 位于细胞中央, 部分肝细胞为大核或双核 细胞质染成红色 ; (3) 肝血窦 : 为肝细胞索之间的缝隙, 与中央静脉相通连 窦壁由扁平的内皮细胞组成 在窦腔内有体积较大, 不规则星形 核圆形成椭圆形的枯氏星形细胞, 其胞质染成粉红色 胞体常位于血窦腔内以伪足附于内皮细胞表面或之间 二 示教

288 ( 一 ) 腮腺 (parotid gland) 人腮腺切面,HE 染色 要求 : 认为腮腺的结构特点 观察 : 基本结构同颌下腺, 但腮腺仅由浆液性腺泡组成 ( 二 ) 舌下腺 (sublingual gland) 人舌下腺切面,HE 染色 要求 : 认识舌下腺的结构特点观察 : 基本结构同颌下腺, 但以黏液性和混合性腺泡为主, 没有闰管 ( 三 ) 胰岛 A B 细胞 (A-cells, B-cells of pancreas) 豚鼠胰岛, 三色染色法 要求 : 了解胰岛中 A B 两种细胞 观察 : 胰岛甲细胞数量较少, 胞体较大, 着色鲜红, 多分布在胰岛的边缘部分 ; 乙细胞较小, 数量最多, 着色暗红 ; 丁细胞为蓝色, 数量很少, 不易见到 胰岛四周为外分泌部的腺泡, 其中深红色的颗粒为酶原颗粒 ( 四 ) 肝糖原 (hepatic glycogen) 小白鼠肝,PAS 染色 要求 : 了解糖原在肝细胞中的分布观察 : 糖原在肝细胞质中呈红紫色颗粒状 ( 五 ) 胆小管 (bile canaliculi) 人肝脏切面,AgNO 3 染色 要求 : 了解胆小管的位置和形态观察 : 切片中, 肝细胞索呈浅棕色 在肝细胞索内, 肝细胞之间的黑褐色小管即是胆小管, 它们互连成网状 思考题 : (1) 切片中如何区分颌下腺和胰腺? (2) 光镜下如何区分浆液性腺泡, 黏液性腺泡和混合性腺泡?

289 实验二十七 消化系统病理 (PATHOLOGY OF DIGESTIVE SYSTEM) 实验目的和要求 1. 胃和十指肠溃疡的病理形态及其常见合并症 ; 2. 肝炎时肝细胞变性坏死的几种形态特点 ; 3. 急性亚急性重型肝炎的病理形态及其后果 4. 结节性肝硬变的形态特点及其形态发生机制 5. 大结节性肝硬变化和小结节性肝硬变的后果 6. 胃癌 肝癌的病理形态 实验用品和标本 病理标本和切片 实验内容和方法 一 眼观标本 ( 一 ) 消化系统标本器官 : 胃或十二指肠 请自行描写病变 : 溃疡位置 数目 大小 深度 ; 溃疡形状 : 其边缘 底部 周围黏膜皱襞, 溃疡之切面呈斜漏斗形 病理学诊断 : 胃或十二指肠溃疡 思考题 : 1. 胃 十二指肠溃疡尤其是胃溃疡的大小 形状 边缘 底部及切面的形态学特点在诊断及鉴别诊断上有何重要意义? 2. 有人说胃溃疡就是局限性胃黏膜坏死和缺损, 这句话对吗? 为什么? ( 二 ) 消化系统标本器官 : 十二指肠 请自行描写病变 病理学诊断 : 十二指肠溃疡 ( 三 ) 消化系统标本器官 : 十二指肠 观察要点 : 注意病变的部位 形状 大小 边缘状况等, 尤其注意观察病变部位底部的改变 病理学诊断 : 十二指肠溃疡伴穿孔 思考题 : 1. 胃和十二指肠溃疡病的常见并发症有哪些? 2. 为什么十二指肠溃疡比胃溃疡更易合并穿孔? 它们穿孔后可能会造成什么严重后果?

290 ( 四 ) 消化系统标本器官 : 阑尾 观察要点 : 注意器官体积的大小有无明显改变, 表面的血管有何改变, 有无渗出物? 病理学诊断 : 单纯性阑尾炎 临床病历摘要 : 男性,25 岁 一天前开始有轻微上腹部疼痛, 逐渐加重, 入院前 3 小时疼痛局限于下腹部, 检查发现麦氏点轻度压痛 化验白细胞总数为 8,500, 中性 78% ( 五 ) 消化系统标本器官 : 阑尾 观察要点 : 参考上例 病理学诊断 : 蜂窝织性阑尾炎 ( 化脓性阑尾炎 ) 临床病历摘要 : 男性,45 岁 入院前 10 小时开始脐周痛,4 小时后局限于右下腹, 阵发性加剧, 伴发热 恶心 呕吐 体检 : 右下腹肌紧张, 麦氏点附近有明显压痛及反跳痛 化验 : 白细胞总数 :18,000, 中性 :90% ( 六 ) 消化系统标本器官 : 阑尾 观察要点 : 注意器官表面的颜色有何明显改变, 有无穿孔, 内腔有无阻塞? 病理学诊断 : 坏疽性阑尾炎 ( 七 ) 消化系统标本器官 : 肝 自行描写病变 : 注意肝脏的体积, 左 右叶比较 ; 质地, 包膜, 边缘, 切面颜色, 又称为急性黄色肝萎缩或急性红色肝萎缩 病理学诊断 : 急性重症肝炎 临床病历摘要 : 男性,28 岁 三个月来不规则发热伴食欲减退 肝区疼痛, 皮肤巩膜发黄, 经常鼻, 大便灰白色 ; 近一周来腹部膨胀, 黄疸加剧, 二天来烦燥不安, 以后转入昏迷 思考题 : 以上症状是怎样引起的 ( 八 ) 消化系统标本器官 : 肝脏 病变描写 : 肝脏体积缩小, 表面凹凸不平, 切面颜色深黄色, 可见散在的米粒大小之岛屿状结节, 颜色为灰白或灰黄色 病理学诊断 : 亚急性重症肝炎 思考题 : 1. 结合上述病变, 试述可能产生黄疸 腹水的原因 2. 上述病变发展下去, 会产生什么病变? ( 九 ) 消化系统标本器官 : 肝 病变描写 : 肝体积缩小, 质地变硬, 肝表面及切面可见结节 : 大小比较一致, 形状圆形或卵圆形, 紧密排列, 颜色灰白 纤维间隔宽度 2~3mm, 颜色灰白 病理学诊断 : 门脉性肝硬化 ( 十 ) 消化系统标本器官 : 肝

291 请描写病变 ( 对照上例描写 ) 病理学诊断 : 坏死后性肝硬化 思考题 : 门脉性肝硬变小 ( 小结节性肝硬变 ) 和坏死后性肝硬变 ( 大结节性肝硬变 ) 在眼观标本中怎样区别? 临床病历摘要 : 男性,45 岁 6 年前曾患肝炎, 以后曾数次出现黄疸 乏力 最近一次在二个月前, 自觉腹胀 倦怠 食欲差, 三天前转入半昏迷状态 体检 : 黄疸 腹胀 胸壁静脉怒张 碑大 下肢浮肿, 面部及肩部见蜘蛛痣 化验 : 肝功能检查证明肝功能不全 思考题 : 根据临床表现能鉴别门脉性有硬变和坏死后性肝硬变吗? 为什么? ( 十一 ) 消化系统标本器官 : 肝 自行描写病变 : 注意肝脏体积 质地 切面颜色 表面和切面有无结节及分布特点 病理学诊断 : 胆汁性肝硬化 临床病历摘要 : 成年男性, 因患慢性胆囊炎急性发作而入院手术 术中见总胆管及胆管内均有结石形成 思考题 : 结合上述病理形态和临床情况, 想一想本病是怎样造成的 ( 十二 ) 消化系统标本器官 : 食道 病变描写 : 食道黏膜下可见明显行走的静脉 因食道下端静脉周围缺乏支持组织, 又易受食物摩擦之影响及腐蚀, 故易并发食道下端出血 病理学诊断 : 食道下端静脉曲张 ( 十三 ) 消化系统标本器官 : 脾 病变要点 : 1. 脾体积增大, 被膜可见白色片状絮状物附着及白色斑块形成 2. 切面脾小梁增多增粗, 脾小结节不明显 病理学诊断 : 脾肿大 ( 脾亢 ) 思考题 : 上述片状絮状物及白色斑块是如何形成的? ( 十四 ) 消化系统标本器官 : 胃 病变描写 : 胃窦部见一溃疡型肿块, 肿块直径 8.5cm 切面见肿块颜色灰白, 浸及胃壁全层 病理学诊断 : 胃腺癌 临床病历摘要 : 女性,51 岁 近半年来上腹部饱胀不适, 食欲不振, 明显消瘦, 近十天来食后呕吐 体检 : 上腹部扪及硬块, 胃有震水声, 左锁骨上淋巴肿大如鸽蛋, 纤维胃镜检查可见胃窦部一肿块, 胃脱落细胞发现有成堆核大深染 异型明显的细胞 ( 十五 ) 消化系统标本器官 : 肝病变描写 ( 提示 : 标本中有癌变区和非癌变区 ): 肝脏之大部见一巨大肿块, 大小因标本而异 切面肿物颜色灰白, 部分区域可见坏死, 其境界不清 肿物周围肝组织呈结节性肝硬变改变 病理学诊断 : 肝硬化伴肝细胞性肝癌

292 临床病历摘要 : 老年男性, 近一个月来感右上腹饱胀, 深呼吸时疼痛, 食欲差, 消瘦明显, 近几天来卧床不起, 出现衰竭 10 年前曾患肝炎, 脾肿大 6 年, 曾于 2 年前出现过腹水 体检 : 以度黄疸, 肝在右肋下 9 cm, 有腹水, 腹壁静脉怒张, 下肢浮肿 超声波检查肝有实质性肿块,AFP 阳性 二 镜检切片 ( 一 ) 消化系统切片器官 : 胃 请画出示意图并加文字说明 病理学诊断 : 胃溃疡 思考题 : 切片中底部血管有什么改变? 底部血管还可能有什么改变? 这些改变对疾病有什么影响? ( 二 ) 消化系统切片器官 : 阑尾 病变描写 : 阑尾全层均可见充血, 水肿及中性粒细胞弥漫性浸润 : 浆膜层可见纤维素及中性粒细胞等炎性渗出物覆盖 病理学诊断 : 蜂窝织性阑尾炎 ( 三 ) 消化系统切片肠上皮化生 ( 示教 ): 胃黏膜上皮细胞变成分泌黏液的杯状细胞, 似小肠黏膜上皮 ( 四 ) 消化系统切片器官 : 肝 病变描写 : 肝实质细胞呈一片荒芜, 小叶门管区周边可见残存之肝细胞, 肝窦扩张, 门管区还可见淋巴细胞浸润, 枯否氏细胞增生 病理学诊断 : 急性重症肝炎 ( 五 ) 消化系统切片器官 : 肝 请画出病变示意图 病变描写 : 1. 肝正常结构破坏, 假小叶形成 2. 假小叶有片状变性坏死的肝细胞和增生的肝细胞, 并有肝细胞浆内淤胆, 小胆管和毛细血管胆管内有胆栓 3. 假小叶外有大片增生的纤维组织和小胆管 病理学诊断 : 门脉性肝硬化 ( 六 ) 示教 1. 小灶性坏死肝细胞小灶性坏死区见核碎片及少量中性粒细胞浸润 2. 气球样变 : 肝细胞高度疏松 肿胀, 肝窦受压消失 3. 嗜酸性小体 ( 凋亡小体 ) 肝细胞核消失, 呈均匀一致的嗜伊红球形结构 4. 毛玻璃样肝细胞肝细胞肿大, 胞浆内充满嗜酸性细颗粒物, 不透明似毛玻璃样 ( 七 ) 消化系统切片器官 : 肝

293 请画出病变示意图 病变要点提示 : 1. 肝正常结构已不存在, 大多构成结节 包含一个或数个假小叶 2. 结节内的肝细胞形态和结构发生什么改变? 3. 结节之间的改变怎样? 病理学诊断 : 坏死后性肝硬化 ( 八 ) 印戒细胞癌 ( 示教 ): 胃癌的癌细胞浆内出现大量黏液, 细胞核被挤向一侧, 如同戒指形状 ( 九 ) 消化系统切片器官 : 肝 请画出示意图并文字说明 提示 :1. 本切片有癌和非癌病变 ;2. 重点观察癌细胞的形态及其排列结构 病理学诊断 : 肝硬化伴肝细胞性肝癌

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296 目 录 第一章 绪论 第一节生理科学实验课程简介 ( 1 ) 第二节生理科学实验课程的教学内容和教学目标 ( 1 ) 一 生理科学实验课程的教学内容 ( 1 ) 二 生理科学实验课程的教学目标 ( 2 ) 第三节生理科学实验课程的教学要求 ( 3 ) 一 课前准备要求 ( 3 ) 二 课堂要求 ( 3 ) 三 课后要求 ( 4 ) 第四节实验报告的格式和内容 ( 4 ) 一 实验报告撰写的意义 ( 4 ) 二 实验报告格式及内容 ( 4 ) 三 生理科学实验报告撰写的具体要求 ( 7 ) 第二章 生理科学实验常用仪器 设备 ( 8 ) 第一节生物信号特性及处理技术 ( 9 ) 一 生物信号的基本特性 ( 9 ) 二 生物信号的交 直流特性 ( 10) 三 信号的交流 直流耦合输入方式 ( 11) 四 生物信号的输入方式 ( 12) 五 生物信号的频率及滤波处理 ( 13) 六 生物信号放大器的特点 ( 17) 七 模拟测量与数字测量 ( 18) 第二节微机生物信号采集处理仪 ( 20) 一 微机生物信号采集处理仪系统构成 ( 20) 二 硬件平台 ( 21) 三 软件平台 ( 22) 四 技术指标 ( 22) 第三节 RM6240 微机生物信号采集处理系统 ( 23) 一 系统特点 ( 23) 二 仪器面板 ( 23) 三 软件窗口界面 ( 24) 四 基本功能及使用 ( 25) 五 标记 ( 34) 六 数据存取和输出 ( 35) 七 数据编辑 ( 36) - 3 -

297 第四节 PcLab 和 MedLab 微机生物信号采集处理系统 ( 37) 一 系统特点 ( 37) 二 仪器面板 ( 37) 三 软件窗口界面 ( 38) 四 基本功能及使用 ( 39) 五 标记 ( 44) 六 数据存取和输出 ( 44) 七 数据编辑 ( 45) 第五节记录和放大仪器 ( 46) 一 SBR-1 型二线示波器 ( 46) 二 LMS-2B 型生理记录仪 ( 48) 三 平衡记录仪 ( 52) 四 心电图机 ( 52) 五 记纹鼓 ( 54) 六 FZG-81A 型直流前置放大器 ( 54) 七 微电极放大器 ( 56) 第六节刺激器 ( 57) 第七节分析仪器 ( 59) 一 721 型分光光度计 ( 59) 二 7200 型分光光度计 ( 61) 三 血气分析仪 ( 64) 第八节恒温器和人工呼吸机 ( 64) 一 数控超级恒温水槽 ( 64) 二 动物人工呼吸机 ( 65) 第九节实验装置和器械 ( 66) 一 换能器 ( 66) 二 常用器械及使用方法 ( 68) 第三章实验动物基本知识 (74) 第一节生理科学实验常用实验动物的种类 ( 74) 一 蟾蜍 ( 74) 二 小鼠 ( 74) 三 大鼠 ( 75) 四 豚鼠 ( 76) 五 兔 ( 77) 六 猫 ( 78) 七 狗 ( 79) 第二节实验动物的品系 ( 79) 一 按遗传学特征分类 ( 80) 二 实验动物的微生物学分类 ( 81) - 4 -

298 第三节实验动物选择的一般要求 ( 82) 一 种属的选择 ( 82) 二 品系的选择 ( 82) 三 个体的选择 ( 82) 第四节实验动物的选择与应用 ( 83) 一 中枢神经系统实验 ( 83) 二 心血管系统实验 ( 85) 三 消化系统实验 ( 86) 四 呼吸系统实验 ( 87) 五 泌尿系统实验 ( 88) 第四章动物实验技术 ( 90) 第一节动物实验的基本操作 ( 90) 一 常用实验动物的捉拿和固定方法 ( 90) 二 实验动物性别的辨别 ( 93) 三 实验动物的编号 ( 94) 四 常用给药方法 ( 95) 五 动物被毛的去除法 (100) 第二节实验动物的麻醉 (100) 一 常用麻醉药 (101) 二 麻醉方法 (103) 三 麻醉操作要求 (105) 第三节实验动物用药剂量的计算方法和生理溶液 (106) 一 药物剂量的确定 (106) 二 试剂 ( 药物 ) 配置及生理溶液 (108) 第四节实验动物手术 (112) 一 术前准备 (112) 二 手术 (112) 三 颈部手术及插管方法 (113) 四 家兔胸部手术 (119) 五 腹部手术 (121) 六 股部手术及插管方法 (124) 七 开颅术 (125) 第五节实验动物体液的采集方法 (128) 一 血液的采集 (128) 二 尿液的采集 (132) 三 脑脊液的采集 (133) 四 消化液的采集 (134) 五 淋巴液的采集 (135) 六 阴道液和精液的采集 (135) - 5 -

299 七 骨髓的采集 (135) 第六节实验动物的处死方法 (136) 第五章实验研究基础知识 (137) 第一节动物实验研究 (137) 第二节实验研究设计的基本原则和程序 (138) 一 实验研究设计的基本原则 (138) 二 实验研究工作的基本程序 (139) 三 实验设计 (139) 第三节常用的动物实验设计方法 (142) 一 完全随机化设计 (142) 二 配对设计 (143) 三 配伍组设计 (144) 四 均衡不完全配伍组设计 (145) 五 拉丁方设计 (146) 六 序贯实验设计 (147) 七 正交设计 (148) 八 科研数据与显著性检验对照表 (149) 第四节常用统计指标和统计方法 (150) 一 计量资料的常用统计指标 (150) 二 计数资料的常用统计指标 (150) 三 显著性检验 (151) 四 Excel 中常用的数据统计分析功能 (152) 第五节生物医学文献检索 (164) 一 光盘数据库 (165) 二 全文数据库 (174) 第六节实验研究论文的撰写 (179) 一 实验研究论文撰写的基本要求 (179) 二 实验研究论文的写作步骤 (179) 三 实验研究论文的格式与内容 (179) 四 实验研究论文撰写应注意的几个问题 (183) 五 生理科学实验研究论文撰写要求 (184) 第七节科研训练项目的申请 (184) 第六章 一 SRTP 项目的申请 (185) 二 挑战杯 学生科研立项资助项目的申请 (187) 生理科学模拟实验 (188) 第一节生理科学模拟实验系统介绍 (188) 第二节生理科学模拟实验 (192) 实验 1 实验 2 刺激强度 频率对骨骼肌收缩的影响 (192) 骨骼肌兴奋时的电活动与收缩的关系 (193) - 6 -

300 实验 3 神经干动作电位及其传导速度的测定 (195) 实验 4 神经干不应期测定 (196) 实验 5 蟾蜍心室期前收缩和代偿间歇 (198) 实验 6 离子与药物对离体蟾蜍心脏活动的影响 (199) 实验 7 家兔动脉血压的神经 体液调节 (200) 实验 8 主动脉神经放电 (202) 实验 9 人体心电图 (205) 实验 10 家兔呼吸运动调节 (206) 实验 11 家兔血液酸碱度变化与血气分析 (208) 实验 12 尿生成的影响因素 (209) 实验 13 体液分布改变在家兔急性失血中的代偿作用 (211) 实验 14 药物对离体肠肌的作用 (212) 实验 15 药物对家兔动脉血压的作用 (214) 实验 16 尼可刹米对抗度冷丁抑制呼吸作用 (216) 实验 17 膈肌电活动与呼吸运动 (217) 第七章 生理科学基础实验 (219) 实验 1 蟾蜍坐骨神经腓肠肌标本制备 (219) 实验 2 不同强度和频率的刺激对肌肉收缩的影响 (222) 实验 3 神经干动作电位及其传导速度的测定 (226) 实验 4 坐骨神经干不应期的测定 (230) 实验 5 神经干 肌膜动作电位和骨骼肌收缩同步记录 (232) 实验 6 药物对兔坐骨神经 - 胫骨前肌的作用 (235) 实验 7 血浆胶体渗压降低在水肿发生中的作用 (238) 实验 8 蟾蜍心室期前收缩与代偿间歇 (241) 实验 9 人体动脉血压的测定及运动 体位对血压的影响 (243) 实验 10 人体心电图的描记 (248) 实验 11 心音和心音图 (251) 实验 12 人体无创性左心室功能测定 - 收缩时间间期测定 (255) 实验 13 缺氧动物模型复制及中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧的影响 (259) 实验 14 Nikethamide 对抗 Dolantin 抑制呼吸作用 (262) 实验 15 药物对离体豚鼠回肠的作用 (264) 实验 16 家兔动脉血压的神经与体液调节 (267) 实验 17 家兔呼吸运动的调节 (270) 实验 18 反射弧的分析和反射时的测定 (273) 实验 19 药物的抗惊厥作用 (276) 实验 20 热板法镇痛实验 (278) 实验 21 药动学实验 (280) 第八章 生理科学综合实验 (289) 实验 22 离子与药物对离体蟾蜍心脏活动的影响 (289) - 7 -

301 实验 23 影响家兔动脉血压的因素 (292) 实验 24 急性心力衰竭及治疗 (297) 实验 25 尿液生成的影响因素 (300) 实验 26 家兔急性弥散性血管内凝血 (303) 实验 27 影响家兔呼吸运动和血气酸碱度的因素 (305) 实验 28 离体大鼠主动脉环实验 (309) 实验 29 离体豚鼠气管平滑肌实验 (312) 实验 30 子宫兴奋药对离体大鼠子宫的作用 (314) 实验 31 离体家兔心脏 Langendorff 灌流 (316) 实验 32 药物对兔血压的作用 (320) 实验 33 急性肾功能不全 (322) 实验 34 Carbachol pd2 和 atropine pa2 计算 (326) 实验 35 普鲁卡因半数致死量 (LD 50 ) 的测定和计算 (329) 附录临床前药理基本知识 (334) 一 药效动力学研究 (334) 二 药代动力学研究 (334) 三 毒理学研究 (334) 四 新药的临床前药理 毒理研究的结论及综述 (339) 第九章生理科学研究型实验 (341) 一 生理科学研究型实验教学程序 (341) 二 立题要求 (341) 三 研究型实验教学内容 (342) 四 研究型实验教学要求 (342) 第十章疾病动物模型 (343) 第一节神经系统疾病动物模型 (343) 一 脑出血动物模型 (343) 二 癫痫动物模型 (343) 三 帕金森病动物模型 (343) 四 坐骨神经长段缺损模型 (344) 五 周围神经牵长效应的实验模型 (344) 第二节呼吸系统疾病动物模型 (345) 一 慢性支气管炎动物模型 (345) 二 支气管哮喘动物模型 (345) 三 肺水肿动物模型 (346) 四 急性呼吸窘迫综合征动物模型 (347) 五 肺气肿和肺心病动物模型 (348) 第三节消化系统疾病动物模型 (349) 一 胃溃疡动物模型 (349) 二 溃疡性结肠炎动物模型 (350) - 8 -

302 三 肝疾病动物模型 (350) 第四节心血管系统疾病动物模型 (351) 一 心肌缺血动物模型 (351) 二 心肌梗死动物模型 (352) 三 心力衰竭动物模型 (353) 四 心律失常动物模型 (354) 五 高血压病动物模型 (357) 六 高血脂和动脉粥样硬化动物模型 (359) 第五节泌尿系统疾病动物模型 (360) 一 肾小球肾炎动物模型 (360) 二 急性肾盂肾炎动物模型 (361) 三 急性肾功能衰竭动物模型 (361) 四 慢性肾功能衰竭动物模型 (362) 五 坏死性肾病动物模型 (363) 第六节内分泌系统疾病动物模型 (364) 一 甲状腺疾病动物模型 (364) 二 垂体疾病动物模型 (364) 三 肾上腺皮质疾病动物模型 (365) 四 糖尿病动物模型 (365) 五 肥胖动物模型 (365) - 9 -

303 第一章绪论 第一节生理科学实验概述 生理科学实验是一门用实验方法观察正常 疾病和药物作用下的机体功能和代谢变化, 研究这些变化的机制及规律的科学 生理学 病理生理学和药理学同属生理科学, 在实验研究和实验教学方面有很大的共性, 基本以动物为实验对象, 观察和测定机体的功能和代谢变化 随着科学技术的发展, 生理科学有了很大的发展, 实验技术日趋复杂, 其涉及的知识也越来越广, 实验教学也从单纯的验证性的定性实验发展到定量实验和研究型实验 为了适应这些变化和发展, 同属生理科学的三门课程的实验教学需要有一门新的课程来承载 生理科学实验 是将生理学 病理生理学和药理学的实验教学部分从原课程中分离出来并进行有机整合而形成的一门新的综合研究型课程 生理科学实验 是一门医学专业基础必修课程, 课程知识涉及生理学 药理学 病理生理学以及其它密切相关的如电子学 统计学 实验动物学 计算机等理论及实验方法和技术 课程在教学中比较系统的介绍生理科学实验的基本理论 实验方法 现代实验技术和实验研究的知识, 并通过基础 综合实验教学和研究型实验教学, 培养学生的基本技能 知识应用和科学研究的能力 第二节生理科学实验课程教学内容和教学目标 一 生理科学实验 课程教学内容 生理科学实验 课程分基础实验教学和研究型实验教学二个教学阶段, 二个阶段的教学内容及重点如图 所示 1. 基础实验教学内容 (1) 生理科学实验基本理论实验动物, 生物信号测量, 常用仪器的原理和使用方法, 生理科学实验基本方法和技术 实验数据的采集和统计处理, 生理科学实验研究的基本程序, 实验报告撰写的要求和格式 这部分内容通过课堂教学与自学结合的形式进行 (2) 基础和综合性实验内容涉及离体组织 器官实验, 整体动物实验和人体实验 基础实验安排一些单一因素 单一观察指标的实验, 教学重点是学习和训练生理科学实验的基本方法 技能 仪器使用, 学习实验数据的记录 统计和实验报告的撰写 综合性实验安排多指标 多因素的实验 教学重点是强化实验操作 掌握实验方法 实验结果的统计分析和规范的实验报告撰写 2. 研究型实验教学内容

304 在完成第一阶段基础性教学, 学生已具备生理科学实验的基本能力 第二阶段进行生 理科学研究型实验教学 在教师的指导下, 学生自己完成网上文献检索 阅读文献 立题 实验设计 开题报告, 进行实验准备 预实验 实验 实验数据的统计分析 撰写实验研 基础实验教学 研究型实验教学 基本理论 实验方法 实验技术 数据采集处理 实验报告撰写 文献检索阅读 立 题 实验设计 实验研究 论文撰写 图 生理科学实验 课程教学流程和主要内容 究论文和答辩 通过本阶段的教学, 使学生经历一次初步的科学研究训练 二 生理科学实验 课程的教学目标 生理科学实验 课程是一门综合研究型课程, 通过课程教学, 使学生了解和掌握生理科学实验的基本方法和技术, 了解生理科学研究的基本程序, 具备初步的科研能力 生理科学实验课程分二个阶段的教学目标 : 1. 第一阶段教学目标 (1) 通过生理科学实验基本理论的教学, 了解和初步掌握生理科学实验的基本理论和研究方法 (2) 通过基础性实验和模拟实验的教学, 初步掌握基本实验方法和技术, 初步掌握实验数据记录 测量 数据统计处理 实验报告撰写 培养应用理论知识的能力 (3) 通过综合性实验的教学, 掌握和应用生理科学实验方法和技术, 具备对复杂实验的观察 记录 数据统计处理和分析的能力, 能撰写出高质量的实验报告, 培养严谨的科学作风和严密的科学思维方法 2. 第二阶段教学目标通过研究型实验教学, 了解生理科学实验研究的基本程序, 初步掌握文献检索 实验设计 科学实验和论文撰写的方法和知识, 培养知识应用和科学研究能力, 提高创新能力

305 第三节 生理科学实验 课程的教学要求 一 课前准备要求 生理科学实验 是一门实验研究型课程, 实验是本课程的主要教学内容 本课程实验所用实验仪器设备操作比较复杂, 实验动物的手术 标本制备技术难度较高, 实验时间较长, 处理因素多, 干扰因素常会影响实验结果, 实验涉及多个学科知识 课前充分的准备工作是实验顺利进行和获得真实实验结果的重要保证 课前必须按实验预习要求预习和准备, 要求如下 : ( 一 ) 实验准备 1. 仔细阅读与本实验有关的章节内容, 了解实验的目的 要求和操作程序, 充分理解实验设计的原理 2. 设计好实验原始记录项目和数据记录表格 具体项目有 : (1) 实验名称 实验日期 时间 环境温度 实验组成员 ; (2) 受试对象 : 动物种类 品系 编号 性别 体重 健康状况 离体器官名称, 人体性别 体重 年龄等 ; (3) 实验仪器 : 主要仪器名称 规格型号 生产厂商 ; (4) 实验药物或试剂 : 名称 来源 ( 厂商 剂型 规格 含量和批号 ); (5) 实验方法步骤 : 分组 动物处理 ( 麻醉, 手术, 刺激, 给药途径 剂量 时间和间隔等 ); (6) 实验观察指标 : 指标名称 单位 指标测量方法 数据形式, 记录曲线的标注 ; (7) 实验结果 : 原始数据记录表格, 统计数据表格, 坐标图 直方图等 ; (8) 数据处理 : 实验数据的表示方法, 统计方法与结果 ( 二 ) 理论准备 1. 查阅有关文献资料, 对各种处理的可能结果作出科学的预测, 对结果进行初步分析 2. 编写部分参考文献目录及相应的引用内容 二 课堂要求 1. 遵守实验室规章制度, 有序进行实验, 人道对待动物 2. 明确分工, 密切配合 3. 按规定程序操作, 全面观察, 准确 如实记录实验数据 3. 如实记录实验过程中的意外情况 4. 爱护实验设施, 珍惜实验材料 5. 做好实验结束的善后工作, 清洁整理实验器具并清点归还, 处理实验动物 6. 离开实验室须请示指导教师

306 三 课后要求 及时整理实验记录和数据, 按要求认真独立完成实验报告或论文并准时呈交 第四节实验报告的格式和内容 一 实验报告撰写的意义实验报告是对实验的全面总结 通过书写实验报告, 可学习和掌握科学论文书写的基本格式 图表绘制 数据处理 文献资料查阅的基本方法, 并利用实验资料和文献资料对实验结果进行科学的分析和总结, 提高作者分析 综合 概括问题的能力, 为今后撰写科学论文打下良好的基础 实验报告的内容和格式通常包括实验目的 方法 结果 讨论和参考文献五个部分 它们分别回答为什么进行这项实验 实验的具体方法 有何结果 该结果在医学理论和技术上有何意义以及文内的引证出自何处等 这种固定和符合逻辑的内容和格式, 既方便作者写稿, 也使读者阅读方便 一目了然 二 实验报告格式及内容 ( 一 ) 实验报告题目题目是实验报告中心思想和主要内容的高度概括, 应言简意赅 题目象一种标签, 切忌冗长, 也要避免过分笼统, 反映不出报告的主题特色 学生实验报告可用实验讲义上的题目, 也可根据实验内容自己拟定 题目前加实验序号 ( 二 ) 作者署名作者系指实验的参加者和实验报告的撰写者 署名应写全名, 署名后列出作者的单位全称或通信地址 ( 学生实验报告须写学校 专业 班级和学号 ) 署名应署在题目的下方和报告正文前面 如 : 实验 12 家兔动脉血压的神经和体液调节李文 ( 浙江大学医学院 99 级临床医学专业 4 班 2 组,960407) ( 三 ) 实验目的实验目的作为实验报告正文的开端, 主要提出本实验需要解决的问题, 可以包括一个以上问题 实验目的要求精练 简短 ( 四 ) 摘要摘要是从报告内容中提炼出来的要点, 是概括而不加注释或评论的简短陈述 摘要按目的 方法 结果 结论格式书写 尽量不采用公式 图表或参考文献 以 200 字左右为宜

307 ( 五 ) 引言或背景 引言作为实验报告正文的开端, 主要介绍实验的背景 与本实验相关的研究现状等 作者也可以将自己的发现及解决方案和理论依据在引言中简短地叙述 引言要求精炼 简 短, 一般为 200~300 字 ( 六 ) 材料和方法 生理科学实验报告的材料和方法一般的格式内容如下 : 年龄等 1. 实验对象实验动物的种类 品系 性别 年龄和健康情况, 人体性别 体重 2. 实验仪器仪器设备的名称 生产厂商, 实验仪器系统的组成方法及参数 3. 实验药品和试剂药品和试剂的名称 规格 剂型和生产厂商 4. 实验方法实验环境和条件的控制, 样品的制备方法 实验动物的饲养条件, 药 物 试剂的配置过程和方法 实验对象的分组及处理, 实验步骤或流程, 操作方法 5. 数据记录观察方法和指标, 数据记录方式, 资料和结果的收集整理 6. 统计学分析统计学方法的选用 ( 七 ) 结果 实验结果的表达形式有表 图和文字叙述三种 图表设计要恰当 实验报告须提供如 下实验结果内容 : 1. 以表格形式记录的实验原始数据, 实验原始数据记录表如表 1 2. 经过统计处理的图 表 实验数据统计结果表如表 2 3. 经过编辑标注的原始记录曲线 实验原始记录曲线的标注如图 1 4. 对图 表的说明文字 5. 对结果的文字叙述 表 1 肾上腺素 (E) 和乙酰胆碱 (ACh) 对心肌收缩力和心率的影响心肌收缩力 (g) 心率 ( 次 /min) 样本号对照 E ACh 对照 E ACh x±s 表 2 静脉注射 X 溶液对家兔呼吸运动的影响 组 别 动物数 (n) 呼吸频率 ( 次 / 分 ) 气道压力 (cmh 2 O) 生理盐水组 ± ±0.37 X 溶液组 ±7.34* 3.01±0.51** 数据以 x±s 表示, 采用 t 检验 * p<0.05,** p<0.01, 与生理盐水组比

308 mmhg s 图 1 电刺激迷走神经 减压神经 静脉注射去甲肾上腺素对家兔动脉血压的影响 1 3 5: 处理前对照 ;2: 刺激迷走神经末梢端 ;4: 静注去甲肾上腺素 ;6: 刺激减压神经中枢端 仪器灵敏度 :20mmHg/cm; 纸速 :50mm/min 家兔体重 2.6kg ,13:30; 气温 20 实验者 : 朱军 ( 八 ) 讨论讨论是从实验和观察到的结果出发, 从理论上对其进行分析 比较 阐述 推论和预测 1. 讨论的内容包括 : (1) 作者用已有的理论对本实验和观察结果进行讨论, 从理论上对实验结果的各种资料 数据 现象等进行综合分析, 应引用相关文献资料进行比较和分析 (2) 指出结果和结论的理论意义及其大小, 对实践的指导作用与应用价值 (3) 实验过程中遇到的问题 差错和教训, 与预想结果不一致的原因, 有何尚待解决的问题及其解决的方法, 提出在今后的实验中需注意和改进地方 2. 讨论的依据 : (1) 归纳分析问题须以实验资料为依据, 要观点明确, 摆事实讲道理 实验中如有不足之处, 须加以说明 在解释因果关系时, 应说明偶然性与必然性 (2) 用科学的理论阐述自己的观点, 分析实验结果 要引经据典, 注意逻辑性 ( 九 ) 结论结论是对整篇论文的主要内容和主要论点进行概括性总结 文字要简短, 不用表和图 它并非是简单重复正文各部分内容的小结, 而是作者在实验结果和理论分析的基础上, 经过严密的逻辑推理, 更深入地归纳报告中能反映事物本质的规律得出的结论 措辞要严谨 精练, 表达要准确, 有条理性, 结论要与实验目的相呼应 ( 十 ) 参考文献参考文献是实验报告在引用他人的资料, 在报告最后列出的文献目录, 这既是为了反映实验报告的科学依据, 表明作者尊重他人的研究成果, 同时也向读者提供有关原文信息的出处, 故参考文献不能省略, 同时应符合下列要求 : (1) 尽可能选用最新的已公开发表 出版的书刊 (2) 作者亲自阅读过的

309 (3) 与实验报告中的方法 结果和讨论关系密切的 必不可少的 参考文献的书写格式按 Vancouver 格式, 主要的期刊论文和书籍引用举例如下 : 参考文献 [1] 徐淑君, 沈海清, 陈忠, 朱丽君, 朱朝阳, 罗建红. 大鼠海马 NMDA 受体 NR1 亚单位蛋白的基础表达量与学习记忆相关. 浙江大学学报 ( 医学版 ) 2003; 32(6): [2] Klausmeier CA, Litchman E, Daufresne T, Levin SA. Optimal nitrogen-to- phosphorus stoichiometry of phytoplankton. Nature 2004; 429(6988): [3] 张志敏. 实验小儿腹泻病学. 第 1 版. 北京 : 人民卫生出版社 ; [4] PhilipsSJ, Whisnant JP. Hypertension and stroke. In: Laraph JH, Brenner BM, editors. Hypertension: pathophysiology, diagnosis, management. 2 nd ed. New York: Raven Press; p 如果需要在文中使用英文缩略词, 必须在第一次出现时给出该专业词的中文和英文全 称及缩略词, 如肾上腺素 (adrenaline, Adr) 三 生理科学实验报告撰写的具体要求生理科学实验的实验报告的格式按本节 实验报告格式及内容 要求并参考浙江大学学报 ( 医学版 ) 的论文格式撰写, 具体要求如下 : 1. 独立完成实验报告 2. 书写工整, 文字简练, 术语正确, 规范使用英文缩写 3. 格式及内容要求 : (1) 题名实验名称 (2) 作者作者姓名及单位 ( 年级 专业和班级 ) (3) 结构式摘要按目的 方法 结果 结论书写 (4) 引言或背景 (5) 材料和方法材料应包括主要实验器材和实验药品试剂, 实验方法应详细, 并明确数据的表示方法和统计方法 (6) 实验结果客观的实验结果用数据表示, 要求统计的实验结果, 用统计表或图, 显著性检验应标注 P 值, 图表应标注图序 图题 表序和表题 须用文字叙述结果, 条理清楚 (7) 讨论及结论从实验结果出发, 结合文献, 探讨分析每一项实验结果产生的机理, 并得出结论或总结 (8) 参考文献参考文献引用处, 在引用句末根据引用顺序用上标序号表示, 用方括弧括住序号 参考文献索引按引用序号, 作者, 题名, 杂志名称, 出版时间, 卷 ( 期 ) 页格式书写 4. 原始数据整理成表, 原始记录曲线剪贴标注, 放在报告的结果项中 ( 陆源夏强 )

310 第二章生理科学实验常用仪器和设备 生理科学实验主要以动物为实验对象, 观察和研究机体功能和代谢变化, 机体的功能和代谢变化以生物信号的形式表达, 生物信号中有一些是生理过程自发产生的, 例如血压 心电信号 体温 血液氧分压 神经细胞动作电位等 另一些信号是外界施加于机体, 机体响应后再产生出来的, 例如超声信号 同位素信号 X 射线信号 血药浓度等 人的感官对绝大多数的生物信息不能直接感知, 需要借助仪器设备对其进行观察和测量 机体是一个包含成千上万信息的复杂信号源, 一般可将生物信号分成三大类 : 1. 化学信号机体各种生命物质的化学组成成分和机体内物质含量 2. 生理信号包括生理和心理信息, 如血压 呼吸 肌肉张力 视觉 情绪等 3. 物理信号生物电 生物声 生物光 生物磁等 生理科学实验研究涉及上述三类生物信号, 但有所侧重, 在化学信号中比较侧重于机体内物质含量的信号如血糖浓度等, 在生理信号中主要研究肌肉张力 血压 血流量等生理信号, 在物理信号中目前以研究生物电 生物声为主 在生理科学实验中多数实验通过观察测量生物信号来了解机体功能代谢的情况, 其实验过程如图 2-1 所示 在这一过程中, 实验对象 ( 动物 ) 的信号反映机体功能代谢的情况, 通过换能器从实验对象拾取生物信号并变换成电信号, 该电信号 ( 比较微弱 ) 经记录测量仪器的放大并以人感官所能感知的信息形式显示和记录 对实验对象施加刺激, 反映机体功能代谢变化情况的信号也相应改变, 对这些变化的信号进行分析, 便可获知机体功能代谢变化情况 刺激 实验对象 换能器 记录测量仪器 信号源生物信号拾取生物信号放大和记录 图 2-1 生物信号测量

311 第一节 生物信号特性及处理技术 我国生理学科教学实验室在 70 年代还在使用杠杆 检压计 记纹鼓 感应线圈做实验,70 年代中期至 80 年代初, 沿用了一百多年的杠杆 检压计等被各种传感器替代, 感应线圈被电子刺激器替代, 记纹鼓被记录仪替代, 生物信号前置放大器和示波器进入实验室 新技术的应用, 极大地提高了实验水平和实验效率, 同时应用新技术开设了一大批新的实验 进入 90 年代, 随着计算机技术的迅猛发展和普及, 计算机生物信号实时采集处理系统开始进入实验室, 为实验技术的自动化 信息化及开展研究型实验教学提供有力支持 生理科学实验仪器是根据被检测信号的性质而设计的, 正确使用实验仪器 保证实验顺利进行必须了解和掌握生物信号的基本特性及生物信号处理的基本知识 一 生物信号的基本特性在生理科学实验中, 生物信号 ( 如血压 肌肉张力 生物电等 ) 通过换能器 ( 如压力换能器 张力换能器 电极 ) 将其转换为电信号, 再经过放大后显示或记录 生物信号是一类比较复杂的信号, 了解生物信号的基本特性有助于实验的顺利和正确的进行, 有助于对实验结果进行分析 从表 列出的一些典型的生物电信号反映了生物电信号低幅 低频 源阻抗大的基本特性 生物电信号的振幅最高的约为 100mV 左右, 低的仅 0.01mV, 多数为 1mV 以下, 与数百 mv 的电极极化电压和数 V 的干扰信号比, 生物电信号振幅就比较低 生物电信号的频率范围从 0Hz~10KHz, 多数信号在 0.2~100Hz, 从电信号频率的角度来看, 生物电信号属低频信号 生物电有一定的电压和电流, 根据欧姆定律, 生物电信号源也有电阻 ( 或阻抗 ), 生物电信号源的阻抗 ( 称源阻抗 ) 达几万欧姆 用电极拾取生物电信号, 电极常被称之为引导电极, 拾取生物电信号的过程称为生物电信号引导 在生物电信号的引导时, 生物电信号受多种干扰信号的干扰, 主要的干扰信号有 : 1. 电极极化引起的电极电位电极电位为直流成分, 用直流放大器时, 信号直流成分被干扰, 在高放大倍数时, 使放大器饱和 2. 电辐射干扰 50Hz 市电干扰信号, 供仪器设备 照明等使用的电源, 其 50Hz 及其谐波通过仪器 辐射等途径干扰生物电信号, 其干扰信号的频率与生物电的频率重叠 3. 生物电信号的相互干扰肌电 皮肤电干扰心电, 心电 皮肤电干扰脑电等 生物电信号的检测是从各种生物电 背景干扰和极化电压中检出需要测量的信号 二 生物信号的交直流特性生物电信号可根据其与时间的关系分为交流信号 直流信号和交直流叠加信号 1. 交流信号振幅和方向随时间变化的信号为交流信号, 如交流电 ( 图 2-1-1) 细胞外记录的生物电信号多数为交流信号, 如心电信号 ( 图 2-1-2) 脑电信号 神经干动作电位等

312 V mv 0 t 0 t 图 交流电 图 人体心电图 2. 直流信号振幅和方向不随时间变化的信号为直流信号, 如直流电 ( 图 2-1-3) 振幅和方向随时间变化很缓慢的信号可视其为直流信号, 如电极电位 细胞内记录的细胞静息电位 ( 图 2-1-4) 3. 交 直流混合信号生物信号中既有直流成分又有交流成分的信号 如细胞内引导膜电位变化过程, 细胞静息时, 记录到的静息电位是直流电信号, 细胞兴奋时记录到的动作电位是交流电信号 ( 图 2-1-5) 有些细胞的动作电位含有直流信号成分, 如心肌细胞动作电位平台期电位 生物信号通过直流应变式换能器转换为电信号, 这类信号往往为交直 流混合信号, 如反映肌肉舒张期张力 动脉血压舒张压等是直流信号, 而反映肌肉收缩 心脏射血引起张力和动脉血压变化过程是交流信号 ( 图 2-1-6) V 1.5 mv 0 t 0 t -70 图 直流电 图 细胞静息电位 mv t mmhg 图 心肌细胞动作电位 0 图 家兔动脉血压波 t

313 三 信号的交流 直流耦合输入方式生物信号放大器都设置有交流和直流耦合两种耦合输入方式, 生物电信号和通过换能器转换后的电信号输入放大器进行放大和处理时, 首先需要确定信号的耦合方式 1. 直流耦合输入方式电信号不通过耦合器件 ( 电容器或电感器 ) 直接送入放大器的输入端进行放大的方式 图 显示了一直流耦合输入方式模式图, 输入信号通过电阻输入放大器, 信号经放大器放大后输出, 输出信号的振幅变大, 但时程和相位不变 直流耦合输入方式能观察到信号真实情况 用金属电极引导生物电时, 金属电极在极性溶液 ( 如 0.9%NaCl) 中发生电化学反应, 使电极间产生电位, 这种电位称电极电位 电极电位的大小由电极的材质和电极处理情况所决定, 在生理盐水中银电极的电极电位可达 100mV 电极电位一般表现为直流信号特性 电极电位比多数生物电信号的振幅大得多, 用直流耦合方式放大生物电信号时, 生物电信号放大到能被观察记录的程度时, 电极电位也被放大并使放大器出现饱和, 生物电信号就不能被观察记录到 电极电位也干扰了生物电信号的直流成分 用交流耦合方式可消除电极电位的影响 2. 交流耦合输入方式电信号经耦合器件 ( 如电容器 ) 送入放大器的输入端进行放大的方式称交流耦合输入方式 电容器有 隔直 效应, 阻止直流电通过电容器 直流电信号不能通过电容器送入放大器的输入端进行放大, 交流耦合方式的 隔直 的作用, 使放大器只放大交流信号而不放大直流信号 交流耦合输入方式在放大生物电信号时避免了电极电位被放大后使放大器出现饱和的情况发生 交流耦合输入方式下观察和记录到的信号直流成分往往发生较大的改变 ( 变化大小取决时间常数 ), 如图 所示, 方波信号经电阻 - 电容耦合输入放大器的输入端, 方波信号的顶 ( 直流 ) 被电容器阻隔, 方波信号通过交流耦合放大后变成了微分波 电阻放大器 输入信号 输出信号 图 直流耦合输入方式 输入信号 电阻电容 放大器 输出信号 图 交流耦合输入方式 3. 信号的直流耦合输入细胞内引导的生物电信号和应变式换能器输出的电信号应 选择直流耦合方式将信号输入到放大器

314 4. 信号的交流耦合输入细胞外引导的生物电信号采用交流耦合方式将信号输入放 大器 在采用交流耦合方式时应根据信号频谱选择合适的时间常数 ( 或下限转折频率 ), 以避免信号的有用频率成分被衰减 ( 请参见本节 信号的滤波 ) 四 生物信号的输入方式 1. 单端输入方式单端输入方式如图 所示 生物电信号输入以地电位为参考点, 放大器在放大生物电信号的同时, 干扰信号也被放大 放大的生物电信号混杂在各种干扰信号之中 单端输入方式抗干扰能力差, 在生物电测量中较少采用 R 输入端 放大器输出端信号源图 单端输入方式 2. 双端输入方式 ( 差分输入 ) 双端输入方式如图 所示 生物电放大器多采用双端输入方式, 即生物电信号通过两个输入端送入放大器放大, 双端输入方式的优点是放大器在放大生物电信号的同时抑制干扰信号 双端输入放大器由两个对称的放大器组成, 参数对应相同 信号经输入端 1 和输入端 2 送入放大器 1 和放大器 2 放大, 放大器 1 和放大器 2 的输出信号分别为 Uo 1 和 Uo 2, 放大器 3 的输出信号 Uo 3 = A(Uo 1 -Uo 2 )( A 是常数 ) 输入端 1 U i1 R 1 放大器 1 Uo 1 信号源 输入端 2 U i2 R 2 放大器 2 Uo 2 放大器 3 Uo 3 图 双端输入方式两个输入端送入幅度 相位和频率相同的信号 U i1 和 U i2 ( 共模信号 ), 信号经放大器放大后,Uo 1 =Uo 2,Uo 3 = A(Uo 1 -Uo 2 )=0( 理想情况 ) 输入的共模信号被抑制 两个输入端送入幅度 相位和频率不同的信号 ( 差模信号 ), 信号经放大器放大后,Uo 1 Uo 2, 在放大器输出端获得的输出信号 Uo 3 = A(Uo 1 -Uo 2 ) 0, 输入的差模信号被放大 生物电信号混杂在各种干扰信号之中, 对两个输入端而言, 干扰信号被视作共模信号 ( 幅度 相位和频率相同 ), 而生物电信号是差模信号 生物电放大器采用双端输入方式能极大的抑制干扰信号并放大生物电信号 生物电放大器采用双端输入方式, 所观察和记录的生物电信号是生物体 组织或细胞的二点之间的电位差

315 五 生物信号的频率及滤波处理 生物电信号的检测是从各种生物电信号 背景干扰信号 极化电压中检出需要测量的 生物电信号, 通过滤波的方法, 使背景干扰信号 极化电压和不需要的生物电信号衰减并 获得所需的生物电信号 1. 信号的频谱从理论上讲, 任何一个信号都可以用一系列不同频率的正弦波迭加 而成, 其函数的表达式为 : f ( x) = A n= 如一周期为 2π 的方波, 可用下式函数表达 : 1 a (sin 2π f t + φ n 2A 1 ( ) = n f ω t (1 ( 1) ) sin nω t π n= 1 n 4A = (sin ωt + sin 3ω t+ sin 5ω t+ sin 7ω t+ sin 9ω t+ π 令 V=4A/π, 函数的图形显示于图 (a~h): n n ) 1 11 sin 11ω t +L ) 图 显示, 函数 f(ωt) 的频率越高,f(ωt) 的值越逼近方波 利用信号的频谱特性, 采用滤波技术衰减干扰信号, 以获取生物信号 常用的滤波有高通滤波 低通滤波和 50Hz 陷波等 2. 高通滤波器在放大器的输入端接入电容器 C, 放大器输入电阻 Ri 和电容器 C 构成高通滤波器 ( 图 ), 根据该电路分别可得时间常数 τ 下限转折频率 f L 和放大器输入电压 Ui Us C Ii Ui Ri 放大器 Uo A 图 高通滤波器 f L f τ = C ω = 2πf f L = R i 1 2πτ (1) f 输入信号的频率 (2) Ui = Us Ri 1 Ri + jωc (3)

316 当输入信号的频率 f=0 时, 根据 (3) 式可得放大器输入端获得的信号电压 Ui=0, 信号不被放大 下限转折频率 f L 是指输入信号中频率等于 f L 的成分被衰减 -3dB( 约 ) 时的信号频率, 信号频率低于 f L 频率的成分被衰减更多, 高于 f L 频率成分的几乎不被衰减 R i 和 C 的乘积称时间常数 τ, 生物信号放大器的时间常数一般设有 0.001s~5s 多档供放大不同的生物电信号使用 选用不同的时间常数对一方波进行滤波, 图 显示了方波的直流成分被衰减的情况 τ= τ= 1s τ= 0.001s 图 不同时间常数的滤波效果 3. 低通滤波器如图 所示的电阻 R 和电容器 C 构成低通滤波器 根据该电路可得上限转折频率 f H 和放大器输入电压 Ui: 当输入信号的频率 f= 时, 根据 5 式可得放大器输入端获得的信号电压 Ui=0, 信号不被放大 上限转折频率 (f H ) 是指输入信号中频率等于 f H 的成分被衰减 -3dB( 约 ) ) 时的信号频率, 信号频率高于 f H 频率的成分被衰减更多, 低于 f H 频率成分的几乎不被衰减 生物信号放大器的低通滤波一般设 100Hz~100KHz 多档, 供滤去不同高频信号使用 图 显示了一方波的选用不同滤波频率, 信号高频成分被衰减的情况 Us R C U Ii Ui 放大器 Uo A 图 低通滤波器 f H f 1 f H = 2πRC ω = 2πf (4)

317 1 Us jωc Ui = 1 R + jωc (5) f H =100KHz f H =1KHz f H =0.1KHz 图 不同滤波频率的滤波效果 4. 信号滤波在交流耦合输入方式下, 生物电信号经高通滤波器输入放大器, 信号的低频成分会被衰减, 如果高通滤波器的时间常数 ( 下限转折频率 ) 选择不当, 信号的有用成分就会失去 在放大生物信号时, 如果有高频干扰信号干扰生物信号, 并影响观察和测量时, 可利用放大器的低通滤波器, 上限转折频率从高到低, 逐渐降低, 使干扰信号对生物信号的观察测量的影响较小时为止 上限转折频率过低, 会将有用的信号衰减掉 生物信号放大器一般都设有高通滤波器和低通滤波器 设放大器的放大倍数为 A, 放大器对下限转折频率 f L 和上限转折频率 f H 范围内的信号的放大能力大于 A,f L 与 f H 之间的信号频率范围称放大器的通频带 ( 图 ) 正确的调节放大器的通频带, 对衰减高频 低频干扰信号, 获得所需的高质量的生物电信号是非常重要的 实验前掌握被观察测量的生物信号的频率参数是非常必要的, 表 提供了部分生物信号记录参数供参考 A A A f L f H 图 放大器上 下限转折频率与信号放大倍数的关系 f 表 生物信号记录参数 信号名称 振幅 时间常数上限转折滤波 (s) (KHz) 坐骨神经动作电位 5~30mV 0.01~0.1 3~5 减压神经传入冲动 100~500µV 0.01~

318 膈神经传出冲动 50~300µV 0.01~0.1 5 植物性神经冲动 50~100µV 0.01~0.1 3~5 骨骼肌动作电位 5~20mV 0.01~0.1 3~5 肠平滑肌慢波 2~10mV 1.5~ 1 肌电图 (EMG) 50~300µV 0.01~0.1 5 心电图 (ECG) 0.1~2mV 0.1~1.0 1 脑电图 (EEG) 30~200µV 0.3~1.0 1 视网膜电图 (ERG) 0.5~1mV 0.3~1.0 1 神经细胞膜电位 50~100mV (DC) 10~20 骨骼肌细胞膜电位 50~120mV (DC) 10~20 心肌细胞动作电位 60~120mV (DC) 5~10 中枢单位放电 ( 细胞外 ) 100~300µV 0.01~0.1 5~10 应变式换能器输出信号 0.01~50mV DC 0.1 心音换能器输出信号 0.1~2mV 0.2~ 脉搏换能器输出信号 1~10mV DC 0.1 六 生物信号放大器的特点 1. 高灵敏度生物电信号比较微弱, 要使生物电信号能在记录显示设备上记录和显示, 必须对生物电信号进行放大, 驱动记录显示设备进行记录和显示的电压需要 5~10V 0.1mV 振幅的生物电放大到 10V, 放大器的放大倍数需要达到 100,000 倍,0.01mV 振幅的生物电放大到 10V, 放大器的放大倍数需要达到 1000,000 倍 2. 高输入阻抗生物电的源阻抗达几千至几十千欧姆, 图 显示生物放大器输入阻抗与信号源阻抗的关系, 要使生物电信号的 99% 以上输入到生物电放大器, 根据 6 式计算可知, 放大器的输入阻抗大于生物电信号源阻抗的 100 倍以上, 放大器输入端电压 Ui Us 普通的生物电放大器的输入阻抗 10 6 ~10 8 Ω 3. 频率响应多数生物电信号的频率在 0.2~300Hz 之间, 有的生物电信号频率比较高, 如耳蜗微音器的频率达 5000Hz 生物电信号的高保真放大有赖于生物电放大器良好的低频特性和高频响应 一般生物电放大器频响为 DC~10KHz Us Zs Ui Zi 放大器 Uo 图 生物放大器输入阻抗与信号源阻抗的关系 Us 生物电信号源电压 Zs 生物电信号源阻抗 Ui 放大器的输入端电压 Zi 放大器输入阻抗 Zs Ui = Us ( 1 ) Zi 100 Zs Ui Us Zs + Zi ( 6 )

319 七 模拟测量与数字测量 血压 张力 体温 动作电位等生物信号从理论上讲大都是连续变化的模拟量, 即在 时域是连续的 传统的测量仪器的显示数值都模拟着被测量的变化 由于仪器本身的局限 性, 显示数值的分辨率只能达到 2~3 位有效数字 ( 如指针式仪表 ), 而且模拟式信号 ( 测 量数据 ) 在测量过程中易受噪声干扰的影响而变值 随着数字技术的发展, 测量仪器日渐 数字化 它使测得的模拟量通过模 - 数转换为数字量, 再利用数字技术和计算机技术来提 高测量的精确度 可靠性 灵活性和自动化程度 数字式仪器用数码显示结果, 读数方便, 不易读错, 显示的示值分辨率可达 6 7 位有效数字或更高, 而且数字 信号 ( 测量数据 ) 采用高 - 低两个 电平编码信号, 不易受干扰而出 错 实现数字测量的第一步就是 用模 - 数转换器将模拟量转换为数 字量 数字量是离散量的, 以一定 的跨步 ( 量子值 ) 跃变 每个数字 量是一系列阶跃跨步的总和, 通常 用 n 比特二进制编码来表示, 图 中, 细斜线表示一 0~10 的 模拟量 ( 十进制 ), 模 - 数变换后的 数字量 模拟量图 模 - 数变换 数字量为 0000~1010( 二进制 ) 模 - 数变换的结果 ( 图中粗线 ) 只能在一些个别点完全等 同于模拟量 ( 细线 ) 模拟量与数字量之间不可避免的差异, 称为量化误差或量化噪声 二进制编码时, 分辨率 ( 一个量子 ) 为 1/(2 n -1),8 比特的分辨率为 ± 模 - 数和数 - 模转换器电子系统中用来连接数字部件与模拟部件的信息转换装置, 以实现数字信号和模拟信号的相互转换的装置, 统称为数据转换器 模 - 数转换器 (analog-to-digital converter) 简称 A/D, 数 - 模转换器 (digital-to-analog converter) 简称 D/A 数据转换器用途很多 数字技术和微处理机在信息处理 测量 通讯和自动控制系 统等领域里的广泛应用需要信息转换技术, 于是数据转换器成为电子系统的关键构件之 一 70 年代初出现的集成化数据转换器, 大多是用混合和单片集成电路工艺实现的 (1) 模 - 数转换器主要有积分式转换 逐次逼近转换和并行比较转换三种, 积分 式转换器, 具有高的分辨率和低的噪声灵敏度, 但转换速度低, 主要用于数字电压表一类 测量仪器 逐次逼近转换器具有高的转换精度和速度, 主要用于数据采集和通信系统 并行比较转换器 ( 图 ) 由比较器阵列组成 n 位数码需 2 n 个比较器 输入信号 同时送至所有的比较器输入端 每个比较器的参考电平都不相同, 分为 2 n 个量级, 由电 阻串分压器供给 输入电压值落入某个量级区间时, 此量级以下的比较器输出逻辑 1 信号, 而其余的比较器则输出逻辑 0 信号 比较器阵列的输出经过编码电路转换为标 准二进制代码输出 并行转换器属于大规模集成电路 例如, 一个双极型 10 位转换器, 它有 1024 个比较器, 包含几万个元件, 并行比较转换器有极高的转换速度, 主要用于雷

320 达 电视图像和波形存储等高速信息处理系统 (2) 数 - 模转换器模 - 数转换的逆过程就是数 - 模转换, 即从数字式编码信号转换为对应的模拟信号 当被转换的信号变化时, 所得模拟信号呈现出量化阶梯 用低通滤波器滤除阶跃所产生的谐波, 即得到平滑的模拟信号 数 - 模转换器常用来产生模拟信号以驱动模拟终端设备 ( 例如 X-Y 绘图仪 记录仪和示波器等 ) 2. 数据转换器的主要指标模 - 数转换器和数 - 模转换器的主要指标有转换时间 ( 转换速度 ), 转换电平, 精度, 分辨率等 根据使用对象的不同, 转换设备有通用型 高性能型 高分辨率型 高速型 (1) 分辨率模 - 数转换器的分辨率用位数表示, 位数越高, 分辨率越强, 转换绝对精度也越高, 转换的数字量越接近模拟量 16 位模 - 数转换器, 转换绝对精度可达满表值的 0.025% 如 12 位 A/D, 转换电平为 ±5V, 则分辨率 : ± 5V ± 5V 分辨率 = = = ± 2.44mV (2) 转换时间模 - 数转换过程需要一定时间 τ, 即模 - 数转换器的采样时间和转换时间 τ 值正比于转换位数 n 实际使用中,τ 应与被测之量的变化率 (dv/dt) 相适应 根据采样定律 : 采样频率 信号频谱中的最高频率的 5~10 倍 1 采样频率 = 采样时间 模 - 数转换器的采样时间是一个不变的值, 而仪器的采样时间可使用软件和硬件延迟技术进行设置, 仪器的最小采样时间总是大于或等于模 - 数转换器的标称时间 生物信号模 - 数转换时, 采样频率取信号频谱中的最高频率的 10 倍可获得比较好的效果 如心电信号频谱中的最高频率为 100Hz( 高频心电信号除外 ), 用 1000Hz 的采样频率, 即 1ms 的采样时间, 转换得到的数字量保留心电信号绝大部分信息 第二节 微机生物信号采集处理仪 近年来随着计算机技术的迅猛发展和普及及信号实时采集处理技术日趋成熟, 生物信号采集处理仪器已在生理学科实验室得到普及应用 一台生物信号采集处理仪往往具有对多个生物信号放大 记录 信号输出和刺激输出的功能, 有的还具有对信号进行滤波 微分和积分的功能, 生物信号采集处理仪能替代目前生理学科教学实验室中使用的前置放大器 示波器 记录仪 监听器和刺激器, 甚至可替代微分器和积分器 生物信号采集处理仪能对采集的信号进行自动分析 变换 频谱和功率谱分析 生物信号采集处理仪能大大简化实验室仪器设备, 提高实验效率, 为深化现有实验和开设新的实验提供了非常好的实

321 验平台 一 微机生物信号采集处理仪系统构成生物信号采集处理仪由硬件与软件两大部分组成 硬件主要完成对各种生物电信号 ( 如心电 肌电 脑电 ) 与非电生物信号 ( 如血压 张力 呼吸 ) 的调理 放大, 并进而对信号进行模 / 数 (A/D) 转换, 使之进入计算机 软件主要用来对信号调理 放大 A/D 转换的控制及对已经数字化了的生物信号进行显示 记录 存储 分析处理及打印 工作原理如下图所示 ( 见图 2-2-1) 系统硬件 放大器转换器刺激器 生物信号 信号调理放大 A/D 转换刺激输出 控制调节 控制调节数据输入 控制调节 数据的处理 记录 分析 存储 输出 系统软件 图 生物信号采集处理仪模式图 二 硬件平台微机生物信号采集处理仪 ( 图 2-2-2) 利用微型计算机实现对生物信号的采集和处理, 不同的微机生物信号采集处理仪对微机的要求有所不同 国产微机生物信号采集处理仪要求普通 PC 机,MacLab 则要求以 Macintosh 计算机为硬件平台 微机生物信号采集处理仪与计算机的连接方式有 : 1. 通过计算机的 ISA(Industry Standard Architecture) 槽口连接, 其信号采集卡插在计算机主板的 ISA 槽口上 现在生产的计算机, 其主板上很少有 ISA 槽口 2. 通过计算机的 USB(Universal Serial Bus) 接口连接,Pentium Ⅱ 及以上的微机都有 USB 接口 3. 通过计算机的 EPP(Enhanced Parallel Port) 接口连接, 目前生产的计算机都有 EPP 接口 有的仪器通过计算机的 PCI 接口 (Peripheral Component Interconnect) RS-232 接口生物信号采集处理仪硬件设计有二种类型, 一种是外置型, 如 MacLab PowerLab

322 RM-6240A/B/C PcLab-UE MedLab-U BL-420 DS-WSII 微机生理实验系统等, 这类仪器将调理仪或多功能放大器 刺激器等外置仪器用数据线与微机相联 另一种是内置型, 如 PcLab/MedLab-E BL-410 Doctor-951 超级实验站等, 这类仪器将所有部件都安装在微机内部 图 微机生物信号采集处理仪 三 软件平台微机生物信号采集处理仪需借助计算机的操作系统进行工作, 微机生物信号采集处理仪根据其对操作系统的要求可分为 DOS 系统 Windows 系统和 Mac TM OS 系统三种 1.DOS 操作系统的生物信号采集处理仪早期的国产微机生物信号采集处理仪如 MS-302 多媒体化生物信号记录分析系统 Doctor-951 超级实验站等 这些仪器因其操作不方便, 数据处理功能有限, 网络功能差, 目前正逐渐被 Windows 操作系统的生物信号采集处理仪所替代, 就象 Windows 替代 DOS 一样 有些 DOS 版的生物信号采集处理仪, 也可在 Windows 下启动工作, 其界面和操作与 Windows 的应用软件相似, 但数据处理功能有限, 不能或很难利用 Windows 的资源和网络功能 2.Mac TM OS 系统的生物信号采集处理仪 MacLab 是以 Macintosh 计算机为硬件平台的 Mac TM OS 版生物信号采集处理仪,Macintosh 计算机和 Macintosh 操作系统在我国使用面不是很广 3.Windows 操作系统的生物信号采集处理仪这类仪器因具有良好的操作性 网络功能, 共享 Windows 资源, 强大的数据处理功能, 已成为生物信号采集处理仪的主流机型, 如国产的 RM-6240A/B/C PcLab MedLab-U BL-420 和澳大利亚的 PowerLab 等

323 四 技术指标生物信号采集处理仪的通道数一般有 3~4 个通道 多功能生物放大器有交流 直流耦合功能, 能适应直流信号输入如各种应变式换能器和交流信号输入如生物电 频率响应 DC~10kHz, 通频带内输入噪声小于 10µV( 可将放大器输入端短路, 增益调至最大进行测试 ), 输入阻抗大于等于 10MΩ; 共模抑制比大于等于 80db; 放大器增益多级可调 上述放大器的技术指标能满足普通生理实验和电生理实验的一般要求 生物信号采集处理仪的系统采样速率小于等于 10µs,AD 位数以大于或等于 12 位 国产微机生物信号采集处理仪多数带程控刺激器, 程控刺激器比一般的刺激器功能要强 现将常用的 RM6240 PcLab 和 MedLab 生物信号采集处理仪作一简要介绍 第三节 RM6240 微机生物信号采集处理系统一 系统特点 RM6240 微机生物信号采集处理系统是一个系列产品, 有多种型号, 其中 RM6240B/C 型是国产同类仪器系统唯一的可用于人体的医疗仪器级产品 RM6240 有 EPP USB 二种类型接口 RM6240 微机生物信号采集处理系统适用于 Windows9x Windows2000 Windows NT 和 Windows XP 操作系统, 共享 Windows 资源 仪器采用 12 位 A/D 转换器, 采样频率 100kHz( 并口机型 ) 或 200KHz(USB 高速机型 ), 仪器全程控调节控制 RM6240 有 4 个输入阻抗 100MΩ 信号输入通道, 频率响应为 DC~10KHz, 每一通道的放大器均可作生物电放大器 血压放大器 桥式放大器使用, 还可作肺量计 ( 配接流量换能器 ) 温度计( 配接温度换能器 ) ph 计 ( 配接 ph 放大器 ), 具有记滴 监听 全隔离程控刺激器 ( 刺激器自带刺激隔离器 ) 功能,6240C 型有符合国际标准的 12 导联转换器, 可同时在任意通道观察不同导联的心电波形 另有 4 个模拟通道, 可在物理通道和模拟通道对各通道动态地进行微分 积分 频谱分析及相关分析等数据处理 系统可处理多种生理信号, 具有信号实时显示 记录 波形分析 处理 打印等多种功能 二 仪器面板 RM6240 生物信号采集处理系统面板见图 通道输入接口通道是模拟信号输入 处理放大 转换成数字信号并被显示记录的物理通路 一般生物信号采集处理系统有四个物理通道, 可同时处理放大和记录四路信号 RM6240 四个物理通道输入接口采用五芯航空插座, 插头与插座有对应的凹凸槽 2. 刺激输出接口输出刺激电压或电流, 刺激波形为方波 3. 受滴器输入接口 : 用于插入受滴器, 记录液体的滴数 该接口也可用于外触发 4. 监听输出接口 : 接有源音箱可监听第 1 通道信号的声音

324 5.ECG 接口 : 接 ICE 标准导联线, 可观察记录 12 导联心电图 图 RM6240 生物信号采集处理系统面板 三 软件窗口界面 RM6240 软件窗口界面 RM6240 软件窗口界面如图 所示, 可划分 6 个功能区 : 信号记录按钮 实验项目菜单 测量方式选择 采样频率 通道模式 分析处理选择 信号显示区 灵敏度时间常数 低通滤波 刺激模式选择 刺激参数调节 图 RM6240 系统软件窗 1. 菜单条显示顶层菜单项 选择其中的一项即可弹出其子菜单 2. 工具条工具条的位置在菜单条的下方 工具条提供了仪器基本功能的快捷按钮

325 3. 参数设置区位于窗口的右侧 有 采样频率 及各通道的 通道模式 灵敏度 时间常数 滤波 扫描速度 等功能键, 选择各功能键可调节各通道的参数 4. 数据显示区实验数据以波形的形式显示于该区域内 5. 标尺及处理区该区显示各通道的通道号及对应信号量纲的标尺 鼠标点击 处理 按钮, 弹出菜单, 有对应通道定标 标记显示 分析测量 数据处理等功能选项 图 参数的快捷设置方法 6. 刺激器程控刺激器为一弹出式浮动窗口, 该刺激器可满足各种实验刺激的需要 四 基本功能及使用 ( 一 ) 仪器参数及设置 1. 仪器参数的快捷设置方法仪器本身及实验室事先已将大多数实验项目的参数进行了预先设置, 实验时仅需打开相应的实验项目, 就可进行实验, 无须进行各项参数设置 操作方法 : 系统软件启动后, 在 实验 菜单选择所需实验项目或 自定义实验项目 ( 图 2-3-3), 实验项目选择完成后, 系统自动将仪器参数设置为该实验项目所要求的状态 2. 仪器参数的通用设置方法 (1) 通道模式选择点击 通道模式, 在下拉采单中选择记录的信号形式 ( 图 2-3-4) 通过通道模式选择使各通道的放大器成为生物电放大器或桥式放大器或呼吸流量放大器等, 如作血压实验时, 应选择血压模式, 并根据习惯选择血压单位 系统软件启动后, 首先进行通道选择 根据信号输入的物理通道, 在系统软件窗口选择对应的信号显示记录通道, 关闭不使 采样频率通道模式时间常数图 通道模式和时间常数设置

326 用的通道 (2) 交 直流耦合及时间常数设置直接点击 时间常数 按钮, 在下拉采单中选 择 ( 图 2-3-4) 时间常数键用于调节放大器高通滤波器的时间常 数 高通滤波器用来滤除信号的低频成份, 时间常数代 表放大器低频滤波的程度, 如 1s 0.1s 0.01s 0.001s 分别对应放大器的下限截止频率为 0.16Hz 1.6Hz 16Hz 160Hz 时间常数越小, 下限截止频率就越高, 亦即对低频成分的滤波程度越大 当选择直流时, 系统 对信号的低频和直流成分不进行衰减 信号的有效成份 频率越高, 应选择的时间常数越小, 有效信号频率低时, 应选择大的时间常数或选择直流, 如作胃肠电实验时选 择 5s 的时间常数, 作张力记录时选择直流等等 根据 信号的交 直流特性, 选择交流或直流耦合, 引导细胞 外生物电信号一般采用交流 (AC) 耦合方式, 根据信 号低频特性选择时间常数 引导细胞内生物电信号和记 录应变式换能器的信号采用直流 (DC) 耦合方式 (4) 采样频率 采样频率 ( 图 2-3-4) 在下拉 采单中选择 采样频率 是指系统每秒采集数据个数, 如采集频率 100kHz 表示系统以 100,000 点 / 秒的速度采 集数据 系统采集频率从 1Hz~100kHz 共 21 档, 实验时应根据信号的频率选择合适的采 集频率, 采集频率一般取信号最高频率的 10 倍 (5) 灵敏度 灵敏度 在下拉采单中选择 ( 图 2-3-5) 系统可对小信号进行放大, 调节灵敏度使信号在显示区有适当的幅度以便观察和分析 (6) 滤波频率点击 滤波 按钮 ( 图 2-3-5) 进行选择 滤波是用来滤除信号的高频成分 当信号有效成分的频率较低时, 应选择低的滤波频率, 以滤除高频干扰 如观察脉搏波时, 选择 10Hz 的滤波, 代表此时放大器的上限截止频率为 10Hz, 可将 10Hz 以上的各种干扰滤掉 上述 时间常数 和 滤波频率 均指硬件实现的高通和低通滤波的参数 该仪器还 具有数字滤波功能, 当需要更宽的滤波范围, 或者在实验以后需对滤波效果进行调整时, 可以使用数字滤波功能 该功能在效果上与硬件滤波相当, 但需消耗计算机的系统资源, 并会产生延时, 因此更适合于在实验后处理波形时使用 基本实验项目的仪器参数设置参见表 RM6240 微机生物信号采集处理系统实验 项目参数设置表 ( 二 ) 信号记录 1. 信号记录快捷按钮如图 所示, 四个按钮的 功能分别是 : (1) 示波按钮启动示波按钮, 信号实时动态的显 示在 信号显示记录区 内, 此时可进行系统参数设置 灵敏度 滤波 图 灵敏度和滤波设置 示波记录暂停停止 图 示波记录按钮

327 采样频率 调节 打开 实时显示 定标等操作 但系统不保存数据 (2) 记录按钮启动记录, 信号实时动态显示在 信号显示记录区 内同时将数据保存在计算机硬盘上 (3) 暂停按钮点击暂停按钮, 信号停止数据采集存盘, 屏幕显示暂停前所采集的数据 如再点击记录, 信号继续采集存盘于同页内 屏幕显示新采集的数据 (4) 停止按钮点击停止按钮, 信号停止数据采集和存盘, 并将已经记录的数据静态的显示于 信号显示记录区 如再点击记录, 信号将换页显示和存盘 ( 可用键盘上的 Page Up 和 Page Down 键显示各记录页 ) 2. 同步触发记录打开刺激器窗口 ( 图 2-3-7), 选中 触发同步 功能, 此时记录观察信号需要点击 开始刺激 按钮, 信号从左至右显示一 屏 信号显示的 屏 数由 重复次数 决定 选中 记录当前波形 功能, 信号同步显示和存盘 每一 屏 波形存放一子文件 图 刺激器窗口 ( 三 ) 刺激器功能及设置需要对实验对象进行刺激时, 可打开刺激器 ( 图 2-3-7), 选择刺激方式, 调节刺激参数, 设置完成后, 启动 刺激 按钮, 刺激器按设定的刺激方式和刺激参数输出刺激脉冲 1. 功能选项 (1) 同步触发一旦选择同步触发, 系统采集信号和刺激器发刺激脉冲即同步进行, 每发一次刺激, 系统采集并显示一屏波形 (2) 记录当前波形选中此项, 系统以子文件形式保存当前屏幕波形 每点击一次该键, 即保存一屏波形, 子文件以数码号 编号 可通过键盘上的 Page Up 和 Page Down 键依次查看各子文件的实验波形 在退出系统前, 若选择保存命令保存实验结果, 系统将全部子文件保存在同一文件内 (3) 不叠加每发一次刺激, 显示一屏最新采集的原始波形 (4) 叠平均每发一次刺激, 以当前采集的一屏波形和此前同步采集的所有波形叠加平均再显示 (5) 叠累积以当前采集的一屏波形和此前同步采集的波形叠加后再显示 (6) 开始刺激按钮点击按钮, 刺激器按设定的刺激方式和刺激参数发出刺激脉冲 (7) 停止刺激按钮点击按钮, 刺激器停止发出刺激脉冲 2. 刺激参数刺激器输出的刺激脉冲的波形是方波 刺激器的基本参数如下 ( 图 2-3-8): (1) 强度输出脉冲的电压或电流的强度 脉冲电压范围为 0~50V,0~10V 内以步长 0.02V 增减,10~50V 内以步长 0.05V 增减 脉冲电流范围为 0~10mA

328 (2) 波宽单个脉冲 ( 方波 ) 高电平的持续时间, 即刺激的持续时间, 波宽可在 0.1~1000ms 调节 (3) 波间隔连续脉冲刺激, 刺激脉冲之间的时间间隔, 波间隔在 0.1~1000ms 调节 波间隔与波宽之和的倒数可理解为刺激频率, 调节范围为 1~3000Hz (4) 主周期刺激器以周期为时间单位输出序列脉冲, 一个主周期内, 刺激脉冲可以是一个 数个, 甚至数百个, 且波间隔可因需设定 周期数 或 重复次数 是指以主周期为单位序列脉冲的循环输出次数, 如 主周期 =1s 脉冲数 =3 延迟 =5ms 波间隔 =200ms 波宽 =1ms 强度 =1V 重复次数 =7, 点击 刺激按钮, 刺激器在 1 秒内发出强度为 1V 波宽为 1ms 的 3 个脉冲, 脉冲的时间间隔为 200ms, 第一个脉冲在开始刺激的第 5ms 发出 如此重复 7 次 主周期 延迟 波宽 波间隔和脉冲数设置要符合 : 主周期 (s)> 延时 (s)+ [ 波宽 (s)+ 波间隔 (s)] 脉冲数 (5) 脉冲数刺激器在设定的时间内发出刺激脉冲的个数 (6) 延迟延迟是指刺激器启动到刺激脉冲输出的延搁时间 在触发同步记录时, 延迟可用来调节反应信号在屏幕上的水平位置 U(V) 波宽 0 强度 延时 波间隔 延时 T(ms) 主周期 主周期 图 刺激脉冲参数图 3. 输出方式刺激器有恒压 ( 电压 ) 和恒流 ( 电流 ) 两种输出方式, 刺激脉冲的波形是方波, 恒压输出方式有正电压和负电压两种脉冲, 恒流输出方式也有正电流和负电流两种脉冲 (2) 专用实时测量心率和呼吸率实时显示波动率 ( 频率 ) 或间期 ( 周期 ) 选中波动率/ 间期选项后, 在所选通道用鼠标左键确定基线, 系统即自动计算出当前屏信号的平均波动频率或间期血压 心室内压 肌肉收缩选中所选测量项目后, 在弹出的对话框中输入测量时间长度 ( 应大于 4 个信号周期 ), 系统将定时在所选通道左上角显示上述时间间隔内的测量结果 (3) 专用静态测量 1 张力分析测量肌肉收缩单波分析用鼠标左键在一个肌肉收缩波起始点各一下, 数据板中自动给出 : 收缩最大张力 (Tmax) 舒张最小张力 (Tmin) 张力增量( T) 收缩间期(STI) 舒张间期 (DTI) 肌肉收缩时张力最大变化速率(+dT/dt max) 肌肉开始收缩至发生 dt/dt max 的间隔时间 (t-dt/dt max) 等指标

329 肌肉收缩连续波分析用鼠标左键在连续几个肌肉收缩波起始点各一下, 数据板中自动给出 : 平均收缩峰张力 平均舒张谷张力 平均张力 平均收缩间期 (msti) 平均舒张间期 (mdti) 频率 收缩最大张力(Tmax) 舒张最小张力 (Tmin) 张力增量 ( T) 等指标 2 压力分析测量压力测量区间有 全屏平均值 全屏原始值 和 区域, 全屏平均值 全屏原始值 测量区间为一屏信号, 区域 的测量区间由测量者选择 全屏原始值 给出的指标为主要指标, 全屏平均值 和 区域 给出的指标由测量者选取 动脉血压测量该测量项可得到的指标有 : 平均收缩压 (msp) 平均舒张压 (mdp) 平均压 (map) 平均脉压差 心率 (HR) +dp/dt max t-dp/dtmax 等 心室内压测量该测量项可得到的指标有 : 平均心室峰压 (mlvsp) 平均心室舒张压 (mlvdp) 平均心室内压 (mlvp) 心率 (mhr) mdp/dt max m-dp/dt max mt-dp/dt max 最大心室内压 (LVPmax) 最小心室内压 (LVPmin) 平均收缩间期 (msti) 和平均舒张间期 (mdti) 用手动测量方式可实现对单个波形的测量 图 数据测量和处理中心静脉压测量用鼠标左键在测量波形上选择 A B 两点, 系统将自动将该测量区域内的最大静脉压 最小静脉压和平均静脉压 3 呼吸波分析测量测量呼吸道压力和呼吸气体流量单波分析用鼠标左键在一个完整的呼吸波的吸气开始 呼气开始和呼气结束选择三点, 系统给出该呼吸波的最大呼气峰压 最小吸气谷压 +dp/dt max -dp/dtmax 呼气间期 吸气间期 呼吸时比 呼吸频率等指标 连续波压力法 ( 流量法 ) 用鼠标左键在连续数个呼吸波起始点个点击一次, 系统在数据板中给出测量区间内呼吸指标 : 平均呼气峰压 ( 流量 ) 平均吸气谷压( 流量 ) 最大呼气峰压 ( 流量 ) 最小吸气谷压( 流量 ) 呼吸频率 +dp/dt max -dp/dtmax 4 生物电分析测量神经放电用鼠标左键在测量波形的起始点各点击一次选择测量区间, 然后在波形上再点击一次选取测量阈值线, 数据板即给出信号的最大电平 最小电平 平均电平 脉冲数 放电频率 放电周期 波形合适的地方点击可调整阈值线 在该通道用鼠标右键点击一下, 再按上述操作可改变测量区间 心肌动作电位用鼠标左键在一完整的动作电位起始点给点击一次, 系统将下列指标自动显示于数据板上 : 振幅 静息电位 超射幅度 APD10 APD20 APD50 APD90 最大上升速度 (dv/dt) 等 兴奋性突触后电位 (EPSP) 测量指标 : 峰 - 峰值 (Vp-p) 斜率 (Slope) 等 (4) 专用静态统计该测量功能可对较长时间区间内的数据进行自动测量和统计, 测量的指标有 放电事件统计 波动率 / 间期 放电事件概率调节 血压平均值

330 血压原始值 左心室内压平均值 左心室内压原始值 (5) 波动率 / 间期测量用于测量当前屏信号的平均波动频率或间期, 如对心电, 波动率代表心率, 对呼吸代表呼吸率等 方法选中波动率或间期选项后, 在所选通道用鼠标左键确定基线, 系统即自动计算出当前屏信号的平均波动频率或间期 ( 波动频率由波形在基线位置上下次数确定, 故应确保每一周期只有一个峰通过基线 ) 分析结果在数据板中显示 (6) 心电测量选择该项中的 心率自动测量, 且通道模式设置为 心电, 记录心电图时, 在通道左上部分实时显示心率 ( 五 ) 数据处理用数学的方法对观察记录的生物信号进行分析计算和处理, 给出分析计算结果或衰减信号中的某些成分 1. 微分分析对信号进行微分计算, 并将计算结果以波形形式显示于物理通道或模拟通道中 微分分析可在实时或静态下进行 在微分分析的对话框中, 放大倍数用于调节微分波的幅度 高频截止频率用于调节微分通道的数字滤波截止频率, 以滤除微分波中不需要的高频信号 2. 积分分析对信号进行积分分析, 并将计算结果以波形形式显示于物理通道或模拟通道中 积分分析可在动态或静态下进行 如果选择时间回零, 则在到达规定时间后重新从零值开始积分, 如果选择满度归零, 则在积分值积至满度值后, 重新从零值开始积分 第五章实验研究基础知识 第一节 动物实验研究 动物实验研究的对象是实验动物, 与临床试验相比, 动物实验具有一些独特的特点和优点 : 1. 实验条件的控制虽然在临床试验中也可能对试验条件加以控制, 但由于人的高度复杂性, 多数情况下难以控制试验条件, 法律和社会伦理道德对临床试验有严格限制, 这些给试验的设计和进行带来很多困难 但是在动物实验中, 受试对象和整个实验进程可以进行严格控制 机体的某一种功能同时都受许多因素的影响, 因而要研究某一特定因素对某一功能的影响往往要将该特定因素以外的其它因素保持不变, 人体试验是比较难以做到这一点的, 但动物试验比较容易做到 如动物实验可以严格控制实验室的温度 光线 声音 动物的饮食 活动等, 临床试验难以对病人的生活条件 活动范围加以严格控制 又如动物实验完全可以选择品种 品系 性别 年龄 体重 活动性 健康状态和携带微生物都相同的动物的, 但临床试验中, 病人的年龄 性别 体质 遗传等方面是不可能加以选择的 特别是健康状况, 动物是健康的或是人工造成的某种疾病模型, 而临床试验的人是在生活中先天的或后天的自然环境下所患的病 既使是同一疾病, 临床试验中每个人的疾病情况都很复杂, 对同一药物反应也不尽相同等, 这些常常影响或掩盖试验效果 动物实验可以一

331 次性选取所需动物的数量, 同时进行实验取得并获得结果, 而临床试验中, 病人的疾病是陆续发生, 陆续进入试验, 试验结果资料是逐渐积累的, 试验的周期比较长, 干扰因素也随之增加 由于生物医学科研中利用动物实验的这些优点, 可以把一个非常复杂简单化, 解决许多医学上的实践问题和重大理论问, 推动了医学科学的发展 2. 研究周期医学的宗旨是防病治病, 增进健康 任何一种处理因素都不得有害于人的健康, 因此任何一种预防或治疗措施 ( 如一种药物 一种手术等 ), 在未证明其利与害之前, 严格他说是不允许在临床应用的, 更不用说一些已知对机体有害的因素了 任何新的药物在临床应用前必须先通过动物实验, 肯定疗效, 确定剂量, 弄清有无毒副作用和远期后果 ; 一种新手术也必须在动物身上先试验其可行性 效果及问题, 并已在动物身上充分掌握其技巧之后, 才可用于临床 至于研究各种因素的致病作用, 如毒物 病原生物 极恶劣环境等等, 动物实验不仅是必不可缺的, 而且常常是唯一方法 临床上很多疾病潜伏期或病程很长, 研究周期也拖得很长, 采用动物复制疾病模型可以大大缩短其潜伏期或病程 尤其是那些在人体上不便进行的研究, 完全可以在实验动物身上进行 应用动物模型, 除了能克服在人类研究中会遇到的伦理和社会限制外, 还容许采用某些不能应用于人类的方法学途径 这些途径对于研究低发病率疾病 ( 各种癌症 遗传缺损 ) 和那些因其危险性而对人类进行实验是不道德的疾病, 具有特别意义 例如, 急性白血病的发病率较低, 研究人员可以有意识地提高其在动物种群中的发生频率而推进研究 同样的途径已成功地应用于其他疾病的研究, 如血友病 周期性中性白细胞减少症和自身免疫介导的疾病 动物模型的另一个富有成效的用途, 在于能够细微的观察环境或遗传因素对疾病发生发展的影响 这对于长潜伏期疾病的研究特别重要 为确定特定的环境成分在某些疾病诱发中的作用, 可将动物引入自然的或控制的环境中去 人类的寿命是很长的, 一个科学家很难有幸进行 3 代以上的观察 许多动物由于生命的周期很短, 在实验室观察几十代是轻而易举的, 如果使用微生物甚至可以观察几百代 3. 实验效应的样本和资料在临床试验中, 从受试对象取得反映实验效应的资料, 往往要受一系列限制, 例如对象拒绝提供 可能损害健康等等 但在动物实验中, 几乎可以不受限制地获得资料, 而所有这些资料对于机制分析是至关重要的 临床上平时不易遇到的疾病, 应用动物实验可以随时进行研究 使人们得以对这些疾病进行深入的研究, 例如放射病 毒气中毒 烈性传染病等 以放射病为例, 平时极难见到, 而采用实验方法在动物身上可成功地复制成造血型 胃肠型 心血管型和脑型放射病 大大促进了这种病的研究 因此, 今天我们对辐射损伤的大部分知识, 是通过动物实验积累起来的 关于辐射的远期遗传效应至今只有动物实验的材料 4. 药物疗效和效应的观察药物的长期疗效和远期效应, 在实验室采用动物实验方法来观察, 没有太大问题, 但在临床研究中间题就比较复杂, 如病人多吃或少吃药 病人自动停药 病人另外求医 病人又患其他疾病, 病人死亡以及病人失去联系等均可使治疗的最终效果很难判定 5. 临床上无法进行的实验医学上有些重要的概念确立只有通过动物实验才能做到,

332 临床上是根本做不到的 例如, 关于神经与内分泌的关系早就引起了人们的注意, 早在 30 年代临床上就观察到下丘脑损伤可引起生殖 代谢的紊乱, 尸体解剖与动物实验都强烈地提示下丘视脑可能通过分泌某些激素调节垂体前叶的功能从而控制许多内分泌器官的功能, 如果这一现象能得到肯定, 神经体液调节的概念将得到决定性的支持, 但是花费了 40 年人们即无法找到下丘脑调节垂体的物质 直到 70 年代两组科学家分别用 10 多万个羊和猪的下丘脑提取出几毫克下丘脑的释放激素, 而仅需几微克这类激素就可导致垂体分泌大量激素, 才最后确定了丘脑对垂体的激素调节的新概念, 由于下丘脑释放激素的分离 合成, 为神经内分泌和调节的概念提供了有力的证据并改变了许多内分泌疾病诊断与治疗的方法 如果不用动物下丘脑而企图由几万个人的下丘脑提取释放素那是非常困难甚至于是不可能的 可见医学研究发展到目前已进入一些研究工作非在动物身上进行不可的阶段 第二节 实验研究设计的基本原则和程序 一 实验研究设计的基本原则 1. 需要性原则选择在科学上有重要意义或社会生产 人民生活需要解决的问题 2. 目的性原则选题必须目的明确, 应目标集中, 不含糊, 不笼统 3. 创新性原则选择前人没有解决或没有完全解决的问题, 善于捕捉有价值的线索, 勇于探索 深化 4. 先进性原则创新性与先进性是密切相关的, 创新往往指科学而言, 而先进多对技术而言 5. 科学性原则选题必须有依据, 要符合客观规律, 科研设计必须科学, 符合逻辑性 ( 手段 方法 实验 ) 6. 可行性原则要求科研设计方案和技术路线科学可行外, 还必须具备一定的条件, 如 : 人员 仪器 动物 试剂等 7. 效能性原则研究中所消耗的人力 物力 财力同预期成果的科学意义 水平 社会和经济效益等综合衡量 二 实验研究的基本程序科学研究就方法来说是提出假说 验证假说的过程, 其工作程序是紧紧围绕这条主线进行的 其基本程序如下 : 1. 立题确定所要研究的课题 课题决定科研方向和总体内容, 是实验设计的前提 (1) 课题的确定分析总结前人和别人的研究工作及进展情况 取得的成果和尚未解决的问题, 找出所要探索的研究课题的关键所在, 或在实际研究工作中发现问题, 查阅有关文献, 建立假说 (2) 立题的原则课题目的性明确, 具有创新性和科学性, 且现实可行

333 2. 实验设计制定实验的具体内容 方法和任务, 有效控制干扰因素, 确保数据的可靠性和精确性 3. 实验和观察 (1) 理论准备实验的理论基础, 假说的理论基础, 实验方法 技术等的参考文献资料查阅和备档 (2) 实验材料与设施准备仪器设备 药物试剂 剂量的初步选定, 实验方法与指标的建立, 实验对象的准备 (3) 预备实验对课题的初步实验 为课题和实验设计提供依据, 为正式实验熟悉实验技术, 修正实验动动物的种类和例数, 改进实验方法和指标, 调整处理因素的强度或确定用药剂量等 (4) 实验及其结果的观察记录 : 按照预备实验确定的方法 步骤进行实验, 根据预先拟定的原始记录方式和内容记录文字 数据 表格 图形 照片 原始记录应及时 完整 精确和整洁 4. 实验结果的处理分析根据实验设计时确定的统计学方法, 将原始数据整理成表, 进行数据处理和统计学显著性检验 5. 研究结论从实验观察结果得出研究的结论, 以回答原先的假说是否正确 6. 论文撰写将实验研究结果撰写成实验报告或论文 三 实验设计实验设计是否严密, 直接关系到实验结果的准确性和结论的可靠性 良好的实验设计是由比较经济的人力 物力和时间, 获得较为可靠的结果, 使误差减至最低限度 还可使多种处理因素包括在很少的几个实验中, 达到高效的目的 不重视实验设计或设计不周密, 可因获得的数据不完全或不可靠而使实验失败 ; 也可能是大量浪费人力而事倍功半 进行新课题的研究或初做科学实验者, 很难一开始就做出周密的设计 因此需要做预备试验 预备试验是根据原始假说作初步探索, 也是对原始假说作非正式验证 同时也是对初步确定采取的实验方法和操作步骤进行演习 根据预备试验结果对原始假说, 实验方法和技术操作作必要的修改, 为正式实验设计做好准备 ( 一 ) 实验设计的三大原则实验设计的三大原则是指对照 随机和重复 原由 Fisher 氏提出, 现被普遍接受 1. 对照一般来说, 实验都应有实验组 ( 处理组 ) 和对照组, 对照组与实验组具有同等重要的意义 这是因为在实验中很难避免非实验因素的干扰而造成误差 用对照组的方法能比较有效地消除各种非实验因素的干扰所造成的误差 对照可分为 : (1) 空白对照不对受试对象作任何处理的对照 (2) 假处理对照 ( 实验对照 ) 不进行实验特定的处理, 其余处理相同 (3) 自身对照对照与处理在同一受试对象中进行, 这种对照可以最大限度地减少抽样误差, 应考虑处理的后效应问题 (4) 标准处理 ( 阳性对照 ) 用现有的标准方法或典型同类药物作为对照 (5) 相互对照处理组间互为对照

334 (6) 历史对照用以往的研究结果或历史文献资料为对照, 但由于时间 地点和条件不同, 差异相当大, 动物实验一般不采用 2. 随机化随机含有是随机遇而定, 也就是指被研究的样本是由总体中任意抽取的, 即在抽取时要使每一样本有同等机会被抽取, 随机抽样是缩小抽样误差的基本方法 在实验中, 对照组与实验组除某种特定处理因素不同外, 其他非特定因素最好是完全一样 均衡 事实上完全一致和绝对均衡是不可能的, 只做到基本上的一致和均衡, 这主要通过随机抽样来完成 随机抽样方法很多, 如抽签法 摸球法等, 也可查随机数字来确定 3. 重复每一实验应有足够数量的例数和重复数, 样本所含的数目越大或重复的次数越多, 则越能反映机遇变异的客观真实情况, 因此重复可反映实验结果的可靠性 但是样本例数很多或实验重复次数很大, 非但在实验上有一定困难而且也是不必要的, 实验设计就是要使样本的重复次数减少到不影响实验结果的最小限度 实验结果的重现率至少要超过 95%, 这样做出假阳性的错误判断的可能性小于 5%(P<0.05) 如果一定数量的样本就能获得 P<0.05 水平的实验, 当然要比过量样本获得 P<0.05 的实验更可取 决定样本的例数取决于 : (1) 处理效果效果越明显所需重复数越小 ; (2) 实验误差误差越小所需样本数减少 ; (3) 抽样误差样本的个体差异越小, 反映越一致, 所需样本数就小 ; (4) 资料性质计数资料样本数要多些, 计量资料则相应减少 ( 二 ) 实验对象的选择在基础医学研究中, 实验对象包括动物 离体器官组织 分离而得的活细胞成分 实验室中培养的细胞或细菌 生理科学实验课程中的实验的对象以实验动物为主 实验动物选择合适与否与实验成败及误差大小有很大关系 其选择要点是 : 1. 根据实验要求进行品种和纯度的选择 在有些实验中, 需用纯种 ( 近交系 ) 动物 2. 以医药为目的的研究, 实验动物的生物学特性应尽量接近于人类 3. 动物的健康状态和营养状况良好 4. 最好选用年龄一致或接近的动物, 体重一致或相近的动物 在年龄大小上一般应选择发育成熟的年轻动物 5. 动物的性别最好相同 如对性别要求不高的实验可雌雄混用, 分组时应雌雄搭配 与性别有关的实验, 应用某单一性别的动物 ( 三 ) 观察指标的选择指标是在实验观察中用来指示 ( 反映 ) 研究对象中某些特征 ( 如对药物的效应 ) 的可被研究者或仪器感知的一种现象标志, 也就是说, 生物医学实验指标是反应试验对象所发生的生理现象或病理现象的标志 指标可分为计数指标和计量指标, 或主观指标和客观指标等等 所选定的指标, 至少要符合下述基本条件 : 1. 特异性指标应特异地反映所观察的事物 ( 现象 ) 的本质, 即指标特异地反映某一特定的现象, 不致于与其他现象的混淆 如高血压中的血压尤其是舒张压就可作为高血压病的特异指标 2. 客观性最好选用可具体数值或图形表达的指标 ( 如脑电图 心电图 血压和呼吸

335 描记 化验检查等等 ) 因为主观指标( 如肝脾触诊 目力比色等 ) 易受主观性因素的影响而造成较大的误差 3. 重现性一般来说, 客观性指标在相同条件下可以重现, 重现性高的指标一般意味着无偏性或偏性小, 误差小, 从而较正确的反映实际情况 重现性小可能与仪器稳定性 操作误差, 受试动物的机能状态和实验环境条件影响有关 若非这些因素影响而重现性小的指标不宜采用 4. 灵敏性指标测量的技术方法或仪器灵敏是极其重要的 方法不灵敏, 该测出的变化测不出来, 就会得出 假阴性结果, 仪器不精密, 所获阴性数值不真实 5. 可行性尽量选用即灵敏客观, 又切合实验室和研究者技术和设备实际的指标 6. 认可性即被以往研究所采用和普遍认可的指标, 并有文献依据 自已创立的指标必须经过专门的实验鉴定 ( 四 ) 实验观察和记录观察和记录在科学实验活动中, 占有十分重要的地位 为了正确地观察和记录, 实验记录时应严谨 细致, 实事求是 重视原始记录 在实验设计中应预先规定或设计好原始记录方式, 原始记录要及时 完整 正确和整洁, 严禁撕页或涂改 并保存好 原始记录不管是什么记录方式都必需写明实验题目 实验对象 实验方法 实验条件 实验者 实验日期 记录好观察测量的结果和数据 规定填写的项目要及时 完整 正确地填写好 图形 图片一定要整理保存 研究者不仅要设法取得原始资料或数据, 而且要应用数理统计学原理和方法来处理数据和对数据进行分析判断 首先必须把实验中的原始资料或数据完整地收集起来, 经过归纳 整理使之系统化 标准化 其次进行统计指标的计算, 算出各组数据的均值或百分数 ( 率或比 ) 如是计数指标, 一般用百分数表示之 ; 若为计量指标, 则计算出均值, 最好还标明均数的标准差, 进而标明百分数或均数的标准误 最后进行统计学的显著性测验, 测量均值或百分数对估计总体的可能程度 ; 比较两组以上统计数值之差异是否显著, 以此推论事物的一般规律, 或否定原先假说或使上升为结论或理论 第三节 常用的实验设计方法

336 一 完全随机化设计 完全随机化设计亦称单因素设计, 是将每 个研究对象随机地分配到对照组和各水平组 ( 处理组 ) 该设计的优点是设计和处理读比 较简单, 分组时可以用抽签法, 也可以用随机 数字表来解决 例 1 将研究对象分为两组 : 设有小白鼠 16 只, 试用随机数字表把它们 分成两组 先将小白鼠按体重依次编为 1,2 16 号, 然后在随机数字表 ( 可用 Microsoft Excel 数据分析 工具中的 随机数发生器 产生 随机数字表 ) 内任意确定一个起始点和走向 假定自随机数字表第六行第一个数字开始, 依 横的方向抄录, 得 等 16 个 现令单数代表 A 组, 结果列入 A 组的动物共 7 头, 列入 B 组的动物共 9 头, 详见 5-1 表 照上面的分配, 两组数目不相等 如要使 它相等, 须把 B 组白鼠减少一头改归 A 组 应 把哪一只白鼠改变组别呢? 一般采用的方法是仍在随机数字表第六行里继续抄录一个数 字 78, 此数以 9 除之 ( 因为归入 B 组的动物有 9 只故用 9 除之 ) 得余数为 6, 于是我们把 B 组 的第六个 ( 即第 13 号白鼠 ) 改归给 A 组, 经过这样调整以后, 两组白鼠编号的分配如下 : A 组 B 组 例 2 将研究对象分为三组 : 表 5-1 随机化设计实验动物分组表 动物编号 随机号 A 组动物 B 组动物 合计 7 9 动物 18 只, 随机等分成 A B C 三组 将动物编号后, 应用随机数字表来分配, 假定 从第十一行第一个数目开始, 依照行线抄下 18 个数目, 将各数一律以 3 除之, 并以余数

337 2 0 代表 A B C, 结果归入 A 组的动 物 10 只, 归入 B 组的动物 5 只, 归入 C 组的动物 3 只, 详见 5-2 表 结果三组的动物数不相等, 须把原归入 A 组的动物中的 1 只改配到 B 组去,3 只改配到 C 组去, 使 3 组各有 6 只动物 从表中继续向下查 阅, 抄录 4 个数字 ( 须从 A 组调出 4 只动物 ), 48,62,91,03, 分别除以 10,9,8,7 除之, 取得数据如下数据 : 随机数 除数 余数 即应把 A 组 10 只动物中的第 8 只调入 B 组, 剩 下 9 只的第 8 只调入 C, 剩下 7 只动物中的第 3 只调 入 C 组 调整后各组的动物编号如下 : A 组 B 组 C 组 完全随机设计数据的分析, 可按单因素方差分析法 (F 检验 ), 如果只有两组, 可用 成组比较 t 检验, 计数资料数据常用 χ 2 检验法 表 5-2 随机化设计实验动物分组表 动物余 A 组 B 组 C 组随机号编号数动物动物动物 合计 第四节 常用统计指标和统计方法 一 计量资料的常用统计描述指标 1. 平均数 ( Χ ) 平均数表示的是一组观察值 ( 变量值 ) 的平均水平或集中趋势 平均数计算公式 : Χ Χ = N 式中 :X 为变量值 Σ 为总和,N 为观察值的个数 2. 标准差 (S) 标准差表示的是一组个体变量间的变异 ( 离散 ) 程度的大小 S 愈小, 表示观察值的变异程度愈小, 反之亦然, 常写成 Χ ± S 标准差计算公式:

338 式中 : X 2 S ( Χ) 2 Χ Ν Ν 1 = 为各变量值的平方和,( X) 2 为各变量和的平方,N-1 为自由度 2 3. 标准误 (S x ) 标准误表示的是样本均数的标准差, 用以说明样本均数的分布情 况, 表示和估量群体之间的差异, 即各次重复抽样结果之间的差异 S x 愈小, 表示抽样 误差愈小, 样本均数与总体均数愈接近, 样本均数的可靠性也愈大, 反之亦然, 常写作 X ±S x 标准误计算公式 : 二 计数资料的常用统计描述指标 1. 率和比率是一种表示在一定条件下某种现象实际发生例数与可能发生该现象的 总数比, 用来说明某种现象发生的频率 比是表示事物或现象内部各构成部分的比重 率 和比计算公式 : S = S x Ν A(+) 率 = 100 % A(+) + A( ) A 比 = 100 % A + B + C + D + L L 2. 率和比的标准误率和比的标准误是抽样造成的误差, 表示样本百分率和比与总 体百分率和比之间的差异, 标准误小, 说明抽样误差小, 可靠性大, 反之亦然 σ P = P( 1 P) N (σ p 为率的标准误,P 为样本率, 当样本可靠且有一定数量的观察单位时可代替总体率 N 为样本观察例数 ) 三 显著性检验抽样实验会产生抽样误差, 对实验资料进行比较分析时, 不能仅凭两个结果 ( 平均数或率 ) 的不同就作出结论, 而是要进行统计学分析, 鉴别出两者差异是抽样误差引起的, 还是由特定的实验处理引起的 1. 显著性检验的含义和原理显著性检验即用于实验处理组与对照组或两种不同处理的效应之间是否有差异, 以及这种差异是否显著的方法 2. 无效假设显著性检验的基本原理是提出 无效假设 和检验 无效假设 成立

339 的机率 (P) 水平的选择 所谓 无效假设, 就是当比较实验处理组与对照组的结果时, 假设两组结果间差异不显著, 即实验处理对结果没有影响或无效 经统计学分析后, 如发 现两组间差异系抽样引起的, 则 无效假设 成立, 可认为这种差异为不显著 ( 即实验处 理无效 ) 若两组间差异不是由抽样引起的, 则 无效假设 不成立, 可认为这种差异是 显著的 ( 即实验处理有效 ) 3. 无效假设 成立的机率水平检验 无效假设 成立的机率水平一般定为 5%( 常 写为 p 0.05), 其含义是将同一实验重复 100 次, 两者结果间的差异有 5 次以上是由抽样 误差造成的, 则 无效假设 成立, 可认为两组间的差异为不显著, 常记为 p>0.05 若两 者结果间的差异 5 次以下是由抽样误差造成的, 则 无效假设 不成立, 可认为两组间的 差异为显著, 常记为 p 0.05 如果 p 0.01, 则认为两组间的差异为非常显著 公式 : ( 一 ) 计量资料的显著性检验 1.t 检验 (1) 配对资料 ( 实验前后 ) 的比较假设配对资料差数的总体平均数为零 其计算 (2) 两样本均数的比较计算公式 : 其中 Χ1 Χ2 为两数均数之差 ; x1 x 2为两组合并标准误, 计算公式 : 自由度计算 : 两组例数相等, 自由度 f = 2n 2 ; 2 2 两组例数不等, 自由度 ( 1 S 1 S 2 f = n1 + n2 2)( + ) 4 2 S + S 4 概率的确定 :t < t 0.05,p > 0.05;:t 0.01 > t > t 0.05,0.01 < p <0.05,t > t 0.01,p < 0.01 t 0.05 和 t 0.01 是对应某一自由度, 概率分别为 p=0.05 和 p=0.01 时的 t 界值, 可从 t 值表上 查得 S x1 x 2 = ( 二 ) 计数资料的显著性检验 1.χ 2 检验适用于二组或二组以上的计数资料的显著性检验 χ 2 的计算公式 : 其中 A 为实测值,T 为理论值 2. 用四格表计算 χ 2 Χ t = S x Χ t = 1 2 n1 + n2 S C( ) n1n2 Χ 2 S x1 x 2 ( A = T χ T S 2 2 ) 2 S C 2 ( n1 1) S 1+ ( n2 1) S = n1n

340 两组计数资料可用四格表格表示 如 A B 两组,A 组阳性和阴性反应例数分别为 a b, B 组阳性和阴性反应例数分别为 c d, 其四格表如表 5-10 表 5-10 四格表 组别 阳性例数 阴性例数 合计 阳性百分率 (%) A a(ta) b(tb) a+b a/(a+b) 100 B c(tc) d(td) c+d c/(c+d) 100 合计 a+c b+d a+b+c+d (a+c)/( a+b+c+d) ( ad bc N / 2) N 2 χ = ( a + b)( c + d)( a + c)( b + d) 其中 N= a+b+c+d. 自由度计算 :n =(R-1)(C-1) (R 代表行数,C 代表列数, 本例 R=2,C=2) 理论值计算 :Ta=(a+c)(a+b)/N,Tb=(b+d)(a+b)/N,Tc=(a+c)(c+d)/N,Td=(b+d)(c+d)/N 概率的确定 :χ 2 <χ ,p>0.05;χ >χ 2 >χ ,0.01< p <0.05;χ 2 >χ ,p<0.01 χ 和 χ 是对应某一自由度, 概率分别为 p=0.05 和 p=0.01 时的 χ 2 界值, 可从 χ 2 界值表上查得 四 Excel 中常用的数据统计分析功能 实验数据的统计分析可以应用专业化统计分析软件进行, 如 SPSS SigmaStat Prism 等优秀软件, 这些软件功能齐全 使用十分方便, 并可在统计后或同时作图, 结果图标准 直接可用于论文发表 本小节主要介绍 MS Office 中的 Excel 的常用数据统计功能 Excel 提供了一些常用的统计工具, 如均数 方差 t 检验等 首次使用 Excel 的 数 据分析 工具进行统计时, 需加载数据分析工具库 加载方法 : 选取菜单栏的 工具, 在弹出的下拉菜单中单击 加载宏, 在弹出的对话框的 分析工具库 选项前方的小方 框 ( 复选框 ) 打上勾, 再单击 确定 按钮结束加载 经过上述操作, 在菜单栏的 工具 中就会出现 数据分析 选项, 以后使用统计功能时单击该选项就可调出数据分析工具对 话框 当用户要进行某项统计时, 选取菜单栏 工具 下拉菜单中的 数据分析 项并单击 鼠标, 就会弹出数据分析工具箱对话框 ( 如图 5-4-1), 再在对话框中选取所需的统计工具 并单击就可进入相应统计工具对话框 ( 一 ) 用 Excel 数据分析工具进行统计 生理科学实验中常用的统计方法有描述统计 ( 均数 标准差 ) 方差分析 t 检验 回 归 相关系数等 下面简单介绍在 Excel 中如何进行这几项统计

341 图 数据分析工具箱对话框 1. 描述统计 ( 均数 标准差 ) (1) 数据输入将需要统计的数据按列输入 Excel 表格中 ( 如图 5-4-2) (2) 选择工具选取菜单栏 工具 下拉菜单中的 数据分析 项, 在弹出数据分析工具箱对话框 ( 如图 5-4-1), 选择 描述统计 项, 描述统计 对话框弹出 (3) 将分组方式设为 逐列, 选中汇总统计 ( 如图 5-4-3) 第 K 大值 和 第 K 小值 是用于排除最大值和最小值的, 可根据需要选择 (4) 对话框 输入区域 右边的有红色箭头的小按钮 ( 如图 5-4-3), 弹出区域选择对话框 ( 如图 5-4-2), 在工作簿内拖动鼠标选择要统计的数据区域后关闭该对话框

342 图 描述统计对话框及统计结果 (5) 单击 输出区域 前面的小圆点 ( 如图 5-4-3), 将统计结果输出到同一工作簿 再单击 输出区域 右方有红色箭头的小按钮, 执行类似第 (2) 步的操作以选择统计结果的输出区域 (6) 单击 确定, 描述统计的结果即出现在用户指定的区域中 ( 如图 5-4-3) 描述统计共产生 14 个统计量值, 他们分别是 : 平均值 标准误差 中值 ( 中数,Median) 模式 ( 众数,Mode) 标准偏差 样本方差 峰值 偏斜度 区域( 全距,rang) 最小值 最大值 求和 计数和置换度 如图 显示描述统计对话框及统计结果 2.t- 检验在 Excel 中提供了三种 t- 检验方法, 分述如下 : (1)t- 检验成对双样本平均差检验 比较两套数据的平均值 但数据必须是自然成对出现的, 比如同一实验的两次数据, 且必须有相同的数据点个数 两套数据的方差假设不相等 (2)t- 检验双样本等方差假设 假设两个样本的方差相等来确定两样本的平均值是否相等 (3)t- 检验双样本异方差假设 假设两个样本的方差不相等来确定两样本的平均值是否相等 (4)t- 检验方法的操作方法以上三种 t- 检验方法的操作方法相同, 介绍如下 ( 图 5-4-4): 1 打开 t- 检验 对话框 2 指定 变量 1 和 变量 2 的输入范围 3 选择输出区域 4 单击 确定 取得统计结果

343 图 t- 检验 3. 方差分析方差分析一般检验多套数据的平均值来确定这些数据集合中提供的样本的平均值是否也相等 Excel 有三种方差分析工具, 即 : (1) 单因素方差分析通过简单的方差分析, 对两个以上样本进行相等性假设检验 此方法是对双均值检验的扩充 (2) 可重复双因素方差分析该分析是对单因素分析的扩展, 要求对分析的每组数据有一个以上样本, 且数据集合必须大小相同 (3) 无重复双因素方差分析通过双因素方差分析 ( 但每组数据只包含一个样本 ), 对两个以上样本进行相等性假设检验 (4) 单因素方差分析和无重复双因素方差分析操作方法单因素方差分析和无重复双因素方差分析方法一致, 如图 打开 单因素方差分析 对话框 2 定义输入区域, 选分组方式为 逐列, 并选中 标志位于第 1 行 复选框 3 定义输出区域和显著水平 α,excel 默认 α 为 单击 确定 按钮即得统计结果

344 图 单因素方差分析和无重复双因素方差分析 (5) 可重复双因素方差分析方法如图 5-4-6, 操作方法如下 : 1 打开 可重复双因素方差分析 对话框 2 定义输入区域 该工具对输入区域内的数据排放格式有两点特殊规定 :I 数据组以列方式排放 II 数据域的第一列和第一行必须是因素的标志 图 可重复双因素方差分析

345 结果 3 定义输出区域和显著水平 α,excel 默认 α 为 0.05 单击 确定 按钮即得统计 第五节生物医学文献检索 科学研究首项工作就是获取研究信息, 充分了解国内国际相关研究领域的进展情况和发展方向, 启迪自己的研究思路, 明确自己的科研方向, 同时, 科研信息也提供研究方法 新的知识等 在生物医学研究中, 生物医学信息可从多种途径获取, 如学术期刊 图书资料 学术会议 网络数据库等 网络数据库具有所含信息丰富完整, 信息检索迅捷, 几乎不受时空限制等优点, 因此网络数据检索已成为一种主要的信息检索手段 根据生理科学实验研究型实验教学的需要, 介绍本校图书馆的几个生物医学信息网络数据库及使用方法, 读者也可以通过公共网络接入这些数据库进行文献检索, 检索方法基本相同 浙江大学图书馆的医学分馆提供多种生物医学信息数据库, 在浙江大学范围内, 通过 Intranet 接入校园网的计算机, 通过 进入浙江大学图书馆医学分馆主页 ) 在主页 信息资源 栏中有 文献检索, 其包含 光盘检索 全文检索 和 网络数据库 三个检索项 一 光盘数据库 ( 一 ) 光盘数据库介绍 ( 三 )MEDLINE 光盘数据库使用介绍 1.MEDLINE 数据库基本情况 MEDLINE 数据库是美国国立医学图书馆 (National Library of Medicine, 简称 NLM) 建立的 MEDLARS(Medical Literature Analysis and Retrival Systems) 系统中最大和使用频率最高的生物医学数据库 收录 1966 年以来世界上 70 多个国家和地区出版的生物医学及其相关学科期刊 3800 余种, 涉及 40 多种语种, 其中约 75% 为英文文献,70%-80% 有英文摘要, 年报道量约 30~40 万条 该数据库包括 3 种重要索引的内容 :Index Medicus( 医学索引 ),Index to Dental Literature( 牙科文献索引 ) 和 International Nursing Index( 国际护理学索引 ) MEDLINE 数据库在 Internet 上是完全免费的, 用户可以登陆到美国国立医学图书馆 PubMed 网站 ( 进行在线检索 MEDLINE 光盘检索系统除了可直接输入检索词进行检索外, 还可以从索引 词表和已检出文献记录中选词进行检索, 并且显示 打印和套录检出结果均很方便,MEDLINE CD-ROM 的检索软件目前有两种, 一种是在 DOS 界面下操作的 SPIRS 检索软件, 一种是在 WINDOWS 界面下操作的 WINSPIRS 检索软件 MEDLINE CD-ROM 数据库检索字段见表 MEDLINE 光盘检索的基本操作 (1) 进入数据库选择 光盘数据库 页面中的 Medline 进入该数据库, 首先出

346 现 WinSpirs 窗口, 接着点击数据库 Start 按钮, 进入数据库选择窗口 用鼠标器左键点击并向下拖动选择需要检索的数据库, 点击 vv add vv 按钮, 再点击 OK 按钮 ( 图 5-5-7), 进入 WinSpirs 主屏幕 ( 图 5-5-8) 主屏幕 ( 图 ) 分三个区域 : 检索区 检索史区和检出记录区 1 检索区 (Search) 检索区为屏幕的最上面一栏, 有 Search Suggest, Index 和 Thesaurus 四种检索指令 Search: 在 Search 框内输入检索词或检索式, 点击 Search, 立刻在检出记录区显示检索结果, 此时, 相当于自由词 ( 关键词 ) 检索状态 图 数据库选择窗口

347 图 WinSpirs 主屏幕 图 轮排词表屏幕 Suggest:Suggest 是 WIN 环境特有的检索功能, 它提示规范化的主题词 ( 即 Thesaurus 词 ) 及与该主题词有关的其它词 检索新手, 特别是不熟悉数据库词表者可从 Suggestions

348 词表中获到最佳的检索词进行检索 Index:Index 为索引检索 可从 Index 词表中连续选词, 直接进行检索, 多个检索词 之间为 OR 关系 Thesaurus: 为词表检索 输入检索词后, 点击 Thesaurus, 出现以该检索词开始的轮 排索引 (Permuted Index)( 图 5-5-9) 在选择 Single Term 进行单个主题词检索, 或 Explode 进行该主题词及下位词的扩展检索 Search Now 指令检索时, 先进入副主题词选项, 双击左边的副主题词, 在右边 Use these Subheadings 栏下出现入选的副主题词, 点击 OK 后, 即进行检索 Term Information 指令可浏览检索词定义 相关词及其在树状结构中的位置 (2) 检索史区 (Search history) 当输入检索词, 开始检索后, 检索史区便显示检 索序号, 相应的检索提问式和命中文献数 ( 图 5-5-8) Limit 指令 : 可进行限制字段检索, 如 : 语种 出版年份 特征词等限制 Retype 指令 : 可将其中某个检索式直接输入检索区 (Search), 以便重新检索或修改 Clear 指令 : 可删除不要的检索式 Show 在检出记录区显示所选检索式的检出结果 (3) 检出记录区 (Retrieved Records) 显示检索结果 数据库名 当前阅读的条目 是命中文献总数中的第几条 阅读时, 如对某文献感兴趣, 可点击记录左边的进行标记, 以便打印和套录 ( 图 5-5-8) All Fields 指令 : 显示记录的全部字段 Full Screen 指令 : 全屏显示文献记录 Add to Search 指令 : 在阅读文献时, 可对感兴趣的术语标记, 点击 Add to Search, 则此词自动进入 Search 检索区, 再点击 Search, 即可对其进行横向检索 (4) 菜单栏功能与 Windows 应用程序一样, 在菜单栏中有 WinSpirs 的重要功能, 如在 File 中有 Save Search History( 保存检索史 ),Load and Run Searches( 上载和执行检 索 ),Download Records( 套录 ) 和 Print Records( 打印 ) 等功能 在 Options 中有 Print Options, Show Options 和 Download Option, 分别可设置打印 显示和套录的参数 在 Utilities 中有 Fields to Search( 非限制字段列表 ), 选择适当的字段, 点击 OK 后, 即在该特定字段内进 行检索 如果熟知字段名缩略表, 也可在 Search 框中直接检索 二 全文数据库 ( 一 ) 全文数据库介绍 在浙江大学图书馆医学分馆主页上点击全文检索, 进入 全文数据库 页面, 部分数 据库如下 : 1. 维普中文科技文献数据库由科技部西南信息中心重庆维普资讯公司推出的, 它 收录 1998 年至现在我国出版的科技 社科各领域的期刊 余种, 包括邮发期刊和内 部自发期刊 2. 万方医药电子系统由清华大学学术期刊电子杂志社编制 收录从 1997 年以来的 6000 余种期刊全文, 包括医药期刊, 医药论文, 医药文献, 医药标准, 成果专利, 政策 法规

349 3. 万方数字化期刊子系统期刊全文内容采用 HTML 和 PDF 两种国际通用格式 所有期刊按理 工 农 医 人文等 5 大类划分, 收录 1997 年至现在 70 多个类目的 2000 多种期刊 ( 其中绝大部分是进入中国科技论文统计源的核心期刊 ) 2001 年底数字化期刊将囊括我国所有科技学术期刊, 展现网上中文期刊出版联盟的形象. 4.EBSCO( Academic Search Fulltext Elite 由 EBSCO 公司出版, 收录 1984 年以来的学术期刊 2800 多种, 其中 1200 种可看到全文 内容涉及生物科学 工商经济 资讯科技 通讯传播 工程 教育 艺术 文学 医药学等领域 其中, 含生物医学全文期刊 554 种 5. Elseevier ScienceDirect OnSit(SDOS)( Elsevier Science 公司出版的期刊是国际公认的高品位高水平的学术期刊, 大多数都被 SCI EI 所收录, 属国际核心期刊 该公司近几年已经与 Pergamon North Holland Excerpt Medica 等著名出版社合并, 将其出版的 1100 多种期刊全部数字化, 通过网络向用户提供服务 该数据库涉及数学 物理 化学 天文学 医学 生命科学 商业及经济管理 计算机科学 工程技术 能源科学 环境科学 材料科学等 在网页上可查阅 1998 年至今的全文 6.UMI Medical Library( 美国 UMI 公司的 ProQuest Medical Library 是提供有关医学期刊的全文数据库, 目前收录 1994 至现在 220 余种期刊, 均属国际著名刊物 每篇论文用 Medline 的主题词标引 UMI Medical Library( 光盘 ) 收录年限 :1994~ High Wire Press( 斯坦福大学 HighWire Press 是著名的学术出版商, 目前已成为全世界最大的 能够联机提供免费学术论文全文的出版商之一 它提供的期刊主要包括物理 生物 医学和社会学领域的核心期刊, 文献量大, 而且免费提供约 130 种医学期刊的全文 8.OCLC FirstSearch( 该数据库覆盖了所有医学领域 (1965 年至现在 ), 包括临床医学 实验医学 牙科学 护理 保健服务管理 营养学等 ; 它索引了国际上出版的 3500 多种期刊, 每月更新 ; 其最大特点是可以直接检索到部分刊物的全文 近来浙江大学建立了国外刊物的全文检索数据库链接列表, 可以在浙江大学图书馆总馆 ( 点击 数字资源 后进入 外刊导航, 然后按照刊物名称查找即可 该资源只限于校园网内使用 ( 二 ) 维普中文科技数据库使用介绍 1. 进入数据库选择 全文数据库 页面中的 维普中文科技数据库 进入该数据库, 首先出现 维普中文科技数据库 检索界面 ( 图 ) (1) 选择检索途径在检索界面左上 检索入口 旁的小窗口 点击下拉菜单, 里面有九种检索字段可供选择 : 包括 关键词 刊名 作者 第一作者 机构 题名 文摘 分类号 任意字段, 其中 任意字段 检索指在所有字段内检索 选定某一检索字段后, 可在检索输入框输入检索词, 点击 < 检索 > 按钮后, 即实现相应的检索 字段名前的英文字母为检索途径代码, 在复合检索中将要用到 例如 K 代表关键词 T 代表题名等等 这些代码可直接加在检索标识前进行相应的字段限定, 如 K= 线粒体 ' 表示在关键词字段中检索 线粒体

350 (2) 限定检索范围 ( 导航树学科范围 年限 期刊范围及同义词库 同名作者库 ) 界面左方的窗口是 中文科技期刊数据库 学科分类导航和刊名导航系统 学科分类导航是树形结构的, 参考 中国图书资料分类法 进行分类 选中某学科类别后, 任何检索都局限于此类别以下的数据 如在学科分类导航的根目录下选择 自然科学 一级类, 展开后再选 数理科学 二级类, 那么检索范围就局限于 数理科学 类别的信息 直接点击最底层类别就可以在概览区域中直接显示出该类别的记录 图 维普中文科技数据库检索界面年限默认为 1989~ 至今, 也可以逐年限定 期刊范围默认为全部期刊, 可选择只检索核心期刊 同义词库功能只有在选择了关键词检索入口时才生效, 默认为关闭, 选中则打开 同义词库的使用方法是 : 1 进入 中文科技期刊数据库 的检索界面, 在其左上角, 有 同义词 选择框, 在框内打勾 ; 2 在 检索入口 选项内, 选 关键词 ; 3 在检索框内输入您的关键词 ; 4 如果同义词表中, 有该关键词的同义词, 系统就会显示出来, 让用户决定是否也用这些同义词检索 例 : 输入关键词 土豆 检索时, 会提示 马铃薯 洋芋 等是否同时选中作为检索条件, 从而可提高检索的查全率 同名作者库功能与上类似, 默认关闭, 选中既打开 ; 只有在选择了作者 第一作者检索入口时才生效 输入作者姓名检索时系统

351 会提示同名作者的单位列表, 选择想要的单位, 点击 确定 按钮即可检出该单位的该姓名作者的文章 注意 : 检索范围的限定功能 ( 年限 期刊范围 所输入的检索式 ) 在进行导航树学科范围浏览时始终生效, 所以在概览区显示的文章篇数并不一定是该学科的文章记录总数 (3) 检索式和复合检索简单检索直接输入检索词 复合检索有两种方式 : 1 利用 二次检索 在第一次结果的基础上再次检索 例如先选用 关键词 检索途径并输入 电脑 一词, 输出结果 ; 再选择 刊名 途径, 输入 南京大学学报, 在 与 或 非 的可选项中选择 与, 点击 二次检索 按钮, 然后输出的结果就是刊名为 南京大学学报, 含关键词 电脑 的文献 二次检索可以多次应用, 以实现复杂检索 2 直接输入复合检索式例如输入 K= 电脑 *J= 南京大学学报, 和以上输出结果一样 检索词前面的英文字母是各字段的代码, 可在检索选择框中查看 本数据库检索符号的对应关系为 * = 与 + = 或 - = 非 在选用 任意字段 途径时可按布尔运算的规则写复合检索式, 例 : 输入检索式为 (CAD+CAM)* 服装, 检出结果等同用 CAD 检后, 输入 CAM 并选 或 选项进行二次检索, 再输入 服装 并选 与 选项二次检索共三步的操作 (4) 刊名浏览功能 图 文献在浏览器被打开 在检索结果显示 ( 细览区 ) 处, 点击 刊名 中表示期刊名称的链接, 可以看到

352 这种期刊在数据库中的收录年限 ( 如在图 的中下方点击 生理学报, 数据库显示如图 生理学报 的收录年限 ), 点击其中一个选项 ( 例如 :2001), 那么您就可以查看到这种期刊在本年度中的所有期 ( 例如 :2001 年总共有 12 期 ), 然后点击其中任意一期您就可以看到这一期的主要文章的题目 文摘等信息了 (5) 模糊和精确检索功能在 检索式 输入框的右侧提供了 模糊 和 精确 检索方式的可选项, 以便您进行更准确的检索 该功能在选定 关键词 刊名 作者 和 第一作者 和 分类号 这五个字段进行检索时, 该功能才生效 系统默认 模糊 检索, 用户可选 精确 例如, 检索字段选择 关键词, 然后输入 基因 一词, 在 模糊 ( 默认 ) 检索方式下, 将查到关键词字段含有 基因结构 基因表达 癌基因 人类基因组计划 线粒体基因 等词的相关文献 ; 而在 精确 检索方式下, 就只能查到含 基因 一词的相关文献 (6) 文献浏览和下载 图 刊名收录年限检索到所需的文献, 如图 中的文献 白介素 -2 对心肌细胞 [Ca 2+ ]i 的作用及其信号转导途径, 在检索结果窗中点击该条目, 检索结果显示 ( 细览区 ) 处出现该文献的 光盘号 题名 文摘 等信息 如果需要阅读该文献的全文或下载, 在安装了 维普浏览器 ( 在全文数据库中下载安装 ) 情况下, 可点击此处文献的题名 白介素 -2 对心肌细胞 [Ca 2+ ]i 的作用及其信号转导途径, 处理对话框打开, 选择 在文件的当前位置打开 项, 该文献的就会出现在浏览器上 ( 见图 ), 如选择 将该文件保存到磁盘, 该文献的文件就会下载到自己的计算机磁盘上

353 第六节 实验研究论文的撰写 一 实验研究论文撰写的基本要求 1. 科学性就描述对象而论, 是指论文只涉及科学与技术领域的命题 就描述内容来看, 是指它要求文章的论述具有真实性 可信性 它必须有足够的 可靠的和精确的实验数据或现象观察或逻辑推理作为依据 实验的整个构成可以复核验证, 论点的推理要求严密, 并正确可信 为此要求做到以下几点 : (1) 科研设计严谨 周密 合理 要排除影响结果的各种干扰因素 (2) 实验方法要正确, 设必要的对照组, 要采用随机双盲对照法 (3) 实验结果进行统计学处理 (4) 讨论从实验资料出发, 以事实为依据, 实事求是评价他人和自己的工作 结论要精确 恰当, 要有充分论据, 切忌空谈或抽象推理 2. 首创性是科技论文的灵魂 它要求论文所揭示的事物现象 属性 特点以及事物运动时所遵循的规律, 或者这些属性 特点以及运动规律的运用, 必须是前所未见的 首创的 或部分首创的, 而不是对他人工作的复述解释 3. 逻辑性指文章的结构特点 它要求论文脉络清晰 结构严谨 推论合理 演算正确 符号规范 文字通顺 前呼后应, 自成系统 不论论文所涉及的专题大小如何, 都应该有自己的前提或假说, 论证素材和推断结论, 而不应该是一堆堆数据的堆砌或一串串现象的自然描绘 4. 实用性实用性也是实践性, 是论文的基础 论文中所报道的理论性或应用性的信息, 都来源于实践, 应该具有可重复性 不论是成功的经验或失败的教训, 都可为他人所利用或借鉴 即使暂时不能解决实际问题, 而从发展角度来看仍有其重要意义者, 也应列入有实用价值的范畴 二 实验研究论文的写作步骤实验研究论文的写作一般分为选题, 取材和写作三个阶段 1. 选题选题应尽可能做到 : (1) 从创新的角度出发, 选取他人尚未做过的课题或有发展前途的课题 ; 或从国家经济建设出发, 选择有实用价值的课题 要进行充分的文献检索, 避免重复劳动 (2) 课题要明确 具体 2. 取材医学实验论文是用资料表现主题, 占有或积累的资料愈多, 愈充实, 形成的观点和提炼的主题就更能正确反映客观事物的本质和主流 3. 写作主要应做好几点 : (1) 构思 ;(2) 拟写题纲 ;(3) 成稿和润色 ;(4) 缮写 三 实验研究论文的格式与内容 为了方便写作和学术交流, 科研论文有固定而符合逻辑的格式及一定的顺序和要求, 并为医学作者接受和习惯通用 一篇优秀的论文尽管涉及的内容各不相同, 论证方法各有

354 差异, 但均有精炼的文题, 创新的内容, 科学的方法, 精确的论据, 充分的论证 论文的内容和格式通常包括引言 方法 结果 讨论和参考文献五个部分 它们分别回答为什么研究本课题 怎样研究 有何发现 该发现在医学理论和技术上有何意义以及文内的引证出自何处等 这种固定和符合逻辑的内容和格式, 既方便作者写稿, 也使读者阅读方便 一目了然 内容和格式也并非一成不变, 作者可根据论文的类型和要求的不同予以变通 或将方法与结果合并或将结果和讨论并列, 短篇报道可省去摘要, 引言和参考文献 外科新术式报道增加外科解剖学项目等 ( 一 ) 题目题目 (title) 是论文中心思想和主要内容的高度概括, 应言简意赅且具信息, 便于检索和编目 题目象一种标签, 切忌用冗长的带有主 谓 宾语结构的完整语句逐点描述论文的内容, 也要避免过分笼统, 反映不出每篇文章的主题特色 具体要求是 : 1. 醒目 ; 2. 副题尽量省略, 题目在语意未尽时才借助于主题目后面的副标题来补充论文的下层次内容 ; 3. 有特色和新意 ; 4. 准确得体 ; 5. 简短, 一般不超过 20 字, 最多 30 字, 英文文题不超过 10 个实词, 尽量省去 的研究 或 的观察 等非特定词 ; 6. 避免使用化学分子式及非众知公用的缩略词语 字符和代号 ; 7. 题目中的数字宜采用阿拉伯数字, 但作为名词或形容词的数字则仍用汉字 ( 二 ) 作者署名和单位作者系指论文主题内容的构思者 研究工作的参与者及具体的撰稿执笔人员 署名应遵从下列规定 : 1. 严肃认真, 写真名, 全名 ; 2. 个人署名是基本形式, 单位署名极少 ; 3. 署名按对论文贡献大小排序 ; 4. 署名后列出作者的单位全称或通信地址, 方便读者在需要时与作者联系 ( 三 ) 摘要摘要 (abstract) 是从论文内容中提炼出来的要点, 是概括而不加注释或评论的简短陈述, 既可供读者检索或判断, 也可为二次文献转载或重新编写提供信息 能独立成章, 尽量避免引用正文中列出的公式, 图, 表或参考文献 以 200 字左右为宜, 最多不超过 500 字 为便于国际学术交流, 我国有许多刊物发表的科技论文同时用英文给出题目, 作者及摘要 ( 包括关键词 ) ( 四 ) 关键词关键词 (key words) 是文稿中最能反映中心内容的名词或词组, 是最能说明全文含义的词 最好参照专门的主题词表查找选取 一般选用 2~5 个关键词 关键词一般在中文摘要的后面 ( 五 ) 引言

355 引言 (introduction) 作为论文正文的开端, 主要介绍论文的背景 相关领域的前人研究的历史与现状 ( 包括研究成果与知识空白 ) 以及作者的意图与依据, 包括论文的目标 研究范围 理论依据和方案选取技术设计等 引言要求精炼 简短 200~300 字, 约占全文的 1/10 ( 六 ) 材料和方法 1. 材料 (materials) (1) 实验对象 ; (2) 实验仪器 ; (3) 实验药品和试剂 2. 方法 (methods) 实验设计包括实验对象的分组, 实验仪器和试剂的选择, 实验环境和条件的控制, 样品的制备方法, 实验动物的饲养条件, 药物, 试剂的配置过程和方法, 实验步骤或流程, 操作要点, 观察方法和指标, 记录方式, 资料和结果的收集整理和统计学方法的选用 方法若为改进的, 要着重写出改进部分和原法的比较 ; 要评述创新部分 材料和方法是论文的基础, 对论文质量起关键作用 故须叙述具体真实 试剂药物等写国际通用名, 少用代号, 不用商品名, 便于供他人学习或重复验证 ( 七 ) 结果结果 (results) 的内容包括真实可靠的观察和研究结果, 测定的数据, 导出的公式, 取得的图像, 效果的差异 ( 阴性和阳性 ) 它反映了本课题水平的高低及其价值, 是结论的依据 论文的结论具有精确性和可重复性, 因此, 要对实验结果的数据作分析筛选, 在核对后作相应的统计学处理, 列出其均值, 标准差, 标准误, 根据不同的数据采取不同的显著性检验方法以观察各组与各组之间的差别有无显著性, 并标明 t 值和 P 值 同时要注意实验次数或观察例数是否足够, 有无可比性, 与结果中的数目是否一致等 结果的表达形式有表 图和文字叙述三种 图表设计恰当, 可作为文字叙述的补充, 甚至可表达用文字难以叙述的材料, 使读者直观易懂, 一目了然 ( 八 ) 讨论讨论 (discussion) 是从实验和观察的结果出发, 从理论上对其进行分析 比较 阐述 推论和预测 1. 讨论的内容包括 : (1) 对研究结果的理论阐述 作者用已有的理论对自己的研究结果进行讨论, 为了估计实验结果的正确性和实验条件的可靠性, 可与他人的结果来比较其异同, 并解释其因果关系, 从理论上对实验结果的各种资料 数据 现象等进行综合分析 (2) 指出结果和结论的理论意义及其大小, 对实践的指导作用与应用价值 ( 经济效益 社会效益 ) 如何等 (3) 类似问题的国内 外研究进展情况, 本研究资料的独特之处, 其结果和结论与国内 外先进水平比较居何地位, 实事求是地提出自己的见解 可以引用其他作者或其它领域的研究成果以说明和支持自己的观点和结果, 但无把握的看法则不能草率作出结论 (4) 研究过程中遇到的问题 差错和教训, 同预想不一致的原因, 有何尚待解决的问题及其解决的方法, 提出今后的研究方向 改进方法以及工作的设想和建议, 以便读者

356 从中受益 2. 讨论的依据 (1) 科学的材料 方法和结果归纳分析问题须以实验材料或临床资料为依据, 其所讨论的结果不仅客观真实, 数量准确, 而且研究方法正确, 要观点明确, 摆事实讲道理 实验观察中如有不足之处, 须加以说明 在解释因果关系时, 应说明偶然性与必然性 发现异常现象未能解决者, 留待他人研究解决 (2) 科学的理论用科学的理论阐述自己的观点, 分析实验结果或临床资料, 探索科学根据的假论, 但在陈述中要有一定的把握, 切不可用未经实践证明的假说当作已被证明的科学理论 讨论中的逻辑性要强, 要有新的独特的见解 提出新观点新理论时要讲清, 以便读者参考或接受 不要回避相反的理论或自身的缺点 必要时可列出不同的观点和理论, 对此, 要明确肯定什么或反对什么, 并说明理由 但避免文献堆砌 ( 九 ) 结论结论 (conclusion) 是论文最终的和总体的精华论述, 文字要简短, 一般少于 200 字 不用表和图 它总结概括了整个研究工作, 但并非简单重复正文各部分内容的小结, 而是作者在实验结果和理论分析的基础上, 经过严密的逻辑推理, 更深入地归纳文中能反映事物本质的规律和观点得出有创造性 指导性 经验性的结论 也要突出新发现, 新认识和新创造 其措词必须严谨 精炼, 表达要准确, 有条理性 结论要与引言呼应 现多数论文已不写结论部分, 而将此项内容参入讨论中或写成摘要部分 ( 十 ) 致谢致谢 (acknowledgements) 是作者对在本科研及论文的某些工作中, 曾得到有关单位或个人给予一定的帮助和指导者表示感谢的文字, 事先应征得本人同意后方可刊出其姓名, 置于文末, 参考文献著录之前 致谢对象有 : (1) 对本科研工作参加讨论或提出过指导性建议者 ; (2) 协助或指导本科研工作的实验人员 ; (3) 为本文绘制图 表和为实验提供样品者 ; (4) 提供实验材料 仪器以及给予其他方面帮助者 ( 十一 ) 参考文献参考文献 (references) 是论文在引用他人的资料, 在论文最后列写的文献目录, 这既是为了反映科研和论文的科学依据, 表明作者尊重他人的研究成果, 同时也向读者提供有关原文信息的出处, 便于检索, 故参考文献不能省略, 同时应符合下列要求 : (1) 尽可能选用最近 3~5 年内的和最主要的文献 ; (2) 作者亲自阅读过的 ; (3) 对本科研工作有启示或较大帮助的 ; (4) 与论文中的方法 结果和讨论关系密切的 必不可少的 ; (5) 已公开发表的参考资料 参考文献的书写有规定的格式, 常用的格式为 Vancouver 格式

357 第七节 科研训练项目的申请 国内有许多高校设立大学生科研训练计划 (Student Research Training Program, 简称 SRTP) 挑战杯等项目 其中 SRTP 是为本科生提供科研训练的机会而设立的, 目的是使学生尽早进入各专业科研领域, 接触学科前沿, 了解学科发展动态 ; 增强学生创新意识, 培养学生创新和实践动手能力 ; 加强合作交流, 培养团队协作精神, 提高学生综合素质 到 十五 期末, 本校 SRTP 项目数达到 1000 项, 实现 50% 以上的学生参加校 院二级科研训练活动的目标 学院积极引导本科高年级学生参与科研活动, 或者设立专项资金, 支持学生的科技发明 研究活动 医学生积极参加科研活动, 有益提高自身的工作能力 科研能力和创新能力, 有利于自己的今后医疗 科研工作或进一步深造和创业 一 SRTP 项目的申请 ( 一 )SRTP 基本情况介绍 1.SRTP 是针对本科生科研训练计划项目, 其项目来源主要是学生自定的科研项目或研究课题, 学生可以在教师指导下进行申报 2.SRTP 申报 SRTP 申请对象以本科生二 三年级为主 ( 五年制和七年制为二 三 四年级为主 ) SRTP 项目的申请, 一般为每年 3 月上旬开始, 申请者向院本科教学管理科领取和填写 浙江大学 SRTP 学生立项申请表, 申请表在 3 月下旬交院本科教学管理科, 申请时间约 20 天 5 月份, 学校印发 浙江大学 SRTP 指南 立项学生填写 本科生立项 SRTP 项目聘请指导教师申请书, 学生根据 浙江大学 SRTP 指南 申请参加合作项目 ( 教师项目 ) 的 须填写 本科生参加教师立项 SRTP 项目申请书 申请书一式二份, 在 6 月中旬交院本科教学管理科 SRTP 立项年限大部分项目为 1 年, 部分项目可为半年 3.SRTP 经费资助与实施学生 SRTP 校级和院级项目有一定资助经费 立项人应按项目进度要求组织实施并负全责 学院在 10~11 月组织项目中期检查, 半年期项目在 12 月结题答辩,1 年期项目在次年 5 月结题答辩 ( 二 )SRTP 立项申请 1. 项目 SRTP 立项申请的首要问题是提出研究项目, 可从以下几个方面着手提出研究项目 : (1) 关注某一研究领域, 经常性的查阅有关文献资料, 了解研究动态和尚需解决的问题, 提出研究项目 (2) 在课程和实验 实践教学过程中, 勤于思考和探索, 发现问题, 查阅文献资料, 提出需要改进或解决的问题, 由此提出研究项目 (3) 积极参加教师的科研工作, 查阅有关研究的文献资料, 提出见解或假设, 形成研究项目

358 (4) 通过生理科学实验课程的研究型实验教学, 全面了解自己研究项目的背景, 将 该研究项目进一步完善 深入研究或进行相关研究 (5) 积极地与教师合作, 在教师的指导下, 查阅文献资料, 提出研究项目 2. 立项申请注意事项要根据 SRTP 项目特点提出研究项目和研究计划, 主要有以 下几个问题 : (1) 研究项目依据充分, 科学合理, 切实可行, 不可为申报而申报和盲目申报, 否 则, 研究项目难以实施 (2)SRTP 项目资金有限 时间 1 年 研究的项目的内容和计划要短小精悍, 不可过 大, 否则不能按计划完成 (3) 聘请有研究经验的教师做指导教师, 并落实好项目研究的场地 设备等资源 (4) 研究项目尽可能进行可行性分析和评估, 必要时, 进行预试 3.SRTP 学生立项申请表的填写 SRTP 学生立项申请表见表 5-10, 填写要点如下 : 项目名称 表 5-10 浙江大学大学生科研训练计划 (SRTP) 学生立项申请表 立项人单位电话 1. 项目内容 : ( 研究目的 内容 价值与结果等, 要求 文字阐述 ) 2. 项目来源 :( 科研 教学 管理 生产 其它 ) 3. 项目类别 :( 人文 社科 理学 工学 农学 医学 管理 ) 4. 对合作者要求 :( 填写系别 年级 专业 ; 人数 ; 特殊要求 ) 5. 项目执行环节 : ( 文献查阅 社会调查 方案设计 实验研究 数据处理 研制加工 撰写论文或研究报告 结题和答辩 项目鉴定 成果推广或论文发表 其它 ) 6. 项目创新的体现 7. 拟聘请导师 :( 填写姓名 性别 职称 单位 ) 8. 预期成果 :( 成果形式 成果效益 学生收获 ) 9. 项目年限 :( 起止时间 项目进度安排 ) 10. 取代的环节 :( 某课程或课程设计 学年论文 ) 11. 项目经费 :( 来源 数额 ) 12. 现有资源 :( 设备 实验室 资料 ) (1) 项目名称项目名称应确切反映研究内容 范围和特点, 简明扼要, 字数约 25 个汉字 (2) 项目内容这部分是立项申请最重要的部分 应阐述与研究项目有关研究领域的背景 尚待解决或要阐明的问题, 本研究项目拟解决的问题, 研究采用的的方法和技术 本研究的特色及创新点, 预期项目所能得到结果及对科学 社会生产 医疗等的意义或应用价值 (3) 项目来源和类别项目来源主要与指导教师有关, 如项目与指导教师的研究课题有联系, 根据课题来源进行填写 项目类别根据研究项目内容所涉及学科填写 (4) 对合作者要求 : 可邀请若干名同学参加项目申请和研究, 参加项目的同学应有

359 助项目的完成 (5) 项目执行环节根据研究项目制定出项目实施的具体方案和步骤 (6) 项目创新的体现简要阐明本研究项目的特色及创新点, 依据应充分客观 该 项内容是评价研究项目价值的重要部分 (7) 拟聘请导师可聘请 1~2 位有研究经验的教师担任导师, 填写时应征得教师的 同意 导师是完成项目研究的关键, 导师将为项目研究提供设备 资金及技术和学术指导 (8) 预期成果预期项目完成可发表论文 成果鉴定等, 学习了那方面的知识和技能 (9) 项目年限本项内容应根据项目执行环节制定出完成项目每一部分的时间表 ( 项 目进度安排 ), 如 某年某月 ~ 某年某月完成某项内容 根据时间表推出完成项目的年限 项目进度安排应与导师协商制定 (10) 项目经费写明申请 SRTP 经费的数额及用途, 导师资助数额及用途 (11) 现有资源研究项目所需的设备 实验室等, 申请时一定要落实好, 并征得有 关科室负责人和教师的同意 二 挑战杯 学生科研立项资助项目的申请 1. 挑战杯 项目要求较 SRTP 项目要高, 主要支持有创新学术思想 科技发明和创 造思想的本科生 硕士和博士研究生开展研究工作 2. 项目分为自然科学类学术论文, 社会科学类社会调查报告和学术论文, 科技发明 制作共三大类 自然科学类学术论文类作者限本专科生 科技发明类要求侧重解决社会生 产生活中的具体问题 见 3. 立项年限为一年, 可跨学院联合申报, 由两名副教授以上职称的教师填写推荐意 4.SRTP 立项已结题的科研项目优先考虑 正在进行的 SRTP 立项不可重复申报 5. 挑战杯 项目申请表 ( 见表 5-11) 填写可参照 SRTP 立项申请, 但要更详尽, 作 品 ( 研究项目 ) 要有一定的水平和价值, 填写时要突出作品 ( 研究项目 ) 创新点和价值 项目名称 表 5-11 挑战杯 学生科研立项资助项目申报表 立项人性别男出生年月 学历 ( ) A 大专 B 大学本科 C 硕士研究生 D 博士研究生 学院专业年级 学制 合作者情况 入学时间 姓名性别所在单位 ( 学院 系 专业 年级 ) 学历年龄备注 有无合作者请在此说明 有 无

360 作品分类 A 机械与控制 ( 包括机械 仪器仪表 自动化控制 工程 交通 建筑等 ) B 信息技术 ( 包括计算机 电信 通讯 电子等 ) C 数理 ( 包括数学 物理 地球与空间科学等 ) D 生命科学 ( 包括生物 农学 药学 医学 健康 卫生 食品等 ) E 能源化工 ( 包括能源 材料 石油 化学 化工 生态 环保等 ) F 经济管理 ;G 法学 ;H 教育 ;I 社会 ;J 其他 作品撰写的目的和基本思路 ( 可加附页 ) 作品的科学性先进性及独特之处 ( 可加附页 ) 作品理论意义和现实意义 ( 可加附页 ) 作品的任务分工及时间安排 申请经费数额预计完成时间预期成果形式 经费预算安排 ( 陆源夏强 )

361 第七章 生理科学基础实验 实验 3 神经干动作电位及其传导速度的测定 目的 应用微机生物信号采集处理系统和电生理实验方法, 测定蛙类坐骨神经干的单相 双相动作电位和其中 A 类纤维冲动的传导速度, 并观察机械损伤 药物对神经兴奋和传导的的影响 原理 用电刺激神经, 在负刺激电极下的神经纤维膜内外产生去极化, 当去极化达到阈电位时, 膜产生一次在神经纤维上可传导的快速电位反转, 此即为动作电位 (action potential, AP) 神经纤维膜外, 兴奋部位膜外电位相对静息部位呈负电性质, 当神经冲动通过以后, 膜外电位又恢复到静息时水平 如果两个引导电极置于兴奋性正常的神经干表面, 兴奋波先后通过两个电极处, 便引导出两个方向相反的电位波形, 称为双相动作电位 如果两个引导电极之间的神经纤维完全损伤, 兴奋波只通过第一个引导电极, 不能传至第二个引导电极, 则只能引导出一个方向的电位偏转波形, 称为单相动作电位 神经干由许多神经纤维组成, 故神经干动作电位与单根神经纤维的动作电位不同, 神经干动作电位是由许多不同直径和类型的神经纤维动作电位叠加而成的综合性电位变化, 称复合动作电位, 神经干动作电位幅度在一定范围内可随刺激强度的变化而变化 动作电位在神经干上传导有一定的速度 不同类型的神经纤维传导速度不同, 神经纤维越粗则传导速度越快 蛙类坐骨神经干以 Aα 类纤维为主, 传导速度大约 30~40m/s 测定神经冲动在神经干上传导的距离 (s) 与通过这段距离所需时间 (t), 可根据 ν=s/t 求出神经冲动的传导速度 预习要求 1. 仪器设备知识参见第二章第三节 RM6240 微机生物信号采集处理系统 ( 或第四节 PcLab 和 MedLab 微机生物信号采集处理系统 ) 2. 实验理论实验动物知识参见第三章第一节生理科学实验常用实验动物的种类, 第四章第一节动物实验的基本操作 ; 统计学知识参见第五章第四节常用统计指标和方法 ; 生理学教材中兴奋性 兴奋的概念, 静息电位和动作电位的形成机制, 动作电位传导原理及神经纤维的分类 检索全文数据库中的相关研究论文, 检索方法参见第五章第五节 3. 预绘制实验原始数据记录表格和统计表格 4. 预测结果预测刺激强度对神经干动作电位的影响及机械损伤 细胞外高钾 普鲁卡因 (procaine) 对神经干兴奋传导的影响 材料

362 蟾蜍或蛙, 神经标本屏蔽盒, 任氏液,1~3mol/L KCl 溶液,3% 普鲁卡因, 微机生物信 号采集处理系统 方法 1. 系统连接和仪器参数设置 (1) 系统连接按图 所示连接生物信号采集处理系统与标本盒 须避免连接错误或接触不良 S+ S- 神经干 r 3 r 1 r 1 r 2 r RM6240 刺激 图 观察神经干动作电位和测定神经冲动传导速度装置图 S+ S- 刺激电极 ;r 3 接地电极 ;r 1 r r 1 2 r 引 2 导电极分别与生物信号采集处理系统 1 2 通道连接 (2) 启动 RM6240 或 PcLab(MedLab) 系统软件, 进入系统软件窗口, 设置仪器参数 : 1 RM6240 系统 : 点击 实验 菜单, 选择 生理科学实验 菜单中的 神经干动作电位 项目 系统进入该实验信号记录状态, 仪器参数 :1 2 通道时间常数 0.02~0.002s 滤波频率 1KHz 灵敏度 5mV, 采样频率 40KHz, 扫描速度 0.5ms/div 单刺激激模式, 刺激幅度 0.1~3V, 刺激波宽 0.1ms, 延迟 5ms, 同步触发 ( 图 7-3-2) 2 PcLab 和 MedLab 系统 : 点击 实验 菜单, 选择 常用生理学实验 或 文件 菜单 打开配置 中的 神经干动作电位 项目 系统进入该实验信号记录状态 仪器参数 :2 4 通道放大倍数 200 AC 耦合, 采样间隔 25µs; 单刺激或主周期刺激方式, 周期 1s, 波宽 0.1ms; 刺激强度 0.1~3V 记忆示波方式, 刺激器触发

363 图 神经干动作电位和测定神经冲动传导速度界面 2. 制备蟾蜍坐骨神经干标本 (1) 毁脑脊髓和下肢标本制备 : 按实验 1 介绍的方法 (2) 剥皮的下肢标本俯卧位置于蛙板上, 用尖头镊子夹住骶骨尾端稍向上提, 使骶部向上隆起, 用粗剪刀水平位剪除骶骨 (3) 标本仰卧置于蛙板上, 用玻璃分针分离脊柱两侧的坐骨神经, 穿线, 紧靠脊柱根部结扎, 近中枢端剪断神经干, 用尖头镊子夹结扎线将神经干从骶部剪口处穿出 (4) 标本俯卧位置于蛙板上, 使其充分伸展呈人字形, 用三根大头针将标本钉在蛙板上 然后再用玻璃分针循股二头肌和半膜肌之间的坐骨神经沟, 纵向分离暴露坐骨神经大腿部分, 直至分离至腘窝胫腓神经分叉处, 用玻璃分针将腓浅神经 胫神经与腓肠肌和胫骨前肌分离, 将腓肠肌剪除 (5) 用手轻提一侧结扎神经的线头, 辨清坐骨神经走向, 置剪刀于神经与组织之间, 剪刀与下肢成 30 角, 紧贴股骨, 腘窝, 顺神经走向, 剪切直至跟腱并剪断跟腱和神经 (6) 用手捏住结扎神经的线头, 用镊子剥离附着在神经干的组织, 将剥离出来的坐骨神经干标本浸入盛有任氏液培养皿中待用 观察项目 1. 神经干标本兴奋性用镊子夹持神经干扎线, 将神经干移入标本屏蔽盒内 ( 见图 7-3-1), 中枢端置于刺激电极处 使神经干与刺激电极 接地电极 引导电极均接触良好

364 盖上标本盒盖子 启动刺激器, 选中触发选项, 用波宽 0.1ms, 刺激电压 1.2V 的方波刺激神经干, 观察屏幕上是否有动作电位, 如果没有动作电位, 且神经干与电极的接触良好, 可能是神经干标本无兴奋性, 应更换神经干 神经干标本兴奋性良好, 继续下一项目 2. 中枢端引导动作电位神经干末梢端置于刺激电极处, 用刺激电压 1.2V, 波宽 0.1ms 的方波刺激神经干, 测定第 1 对引导电极引导的双相动作电位正相波和负相波的振幅和时程 3. 末梢端引导动作电位和测定动作电位传导速度 1 神经干中枢端置于刺激电极处, 用刺激电压 1.2V, 波宽 0.1ms 的方波刺激神经干, 测定第 1 对引导电极引导的双相动作电位正相波和负相波的振幅和时程 2 分别测量两个动作电位起始点的时间差和标本盒中两对引导电极之间的距离 S ( 应测 r 1 - r 2 的间距 ), 计算动作电位传导速度 4. 单相动作电位引导用镊子在第一对引导电极之间的神经夹伤, 用刺激电压 1.2V, 波宽 0.1ms 的方波刺激神经干, 使荧屏上的动作电位呈现一正相波 ( 注意 : 不能移动神经干的位置, 贴近后一电极处夹伤神经 ) 测量单相动作电位的振幅和动作电位持续时间 测量单相动作电位的上升时间和下降时间 5. 按一定步长, 刺激强度从 0V 开始逐步增加至动作电位不再增大止 测量动作电位振幅与刺激电压对应数据 ( 如采用自动强度递增刺激, 设定起始强度 0.1V, 结束强度 2V, 步长 0.02~0.05V) 6. 换一神经干, 用刺激电压 1.2V, 波宽 0.1ms 的方波刺激神经干, 若第 2 对引导电极引出一双相动作电位, 用一小块浸有 3mol KCl 溶液的滤纸片贴附在第 2 对引导电极后一电极处 (r 2 ) 处的神经干上 记录 KCl 处理前及处理后 1min 2min 5min 第 2 对引导电极 (r 2 r 2 ) 引导的动作电位振幅和时程 7. 用刺激电压 1.2V, 波宽 0.1ms 的方波刺激神经干, 用一小块浸有 3% procaine 溶液的滤纸片贴附在在第 1 对引导电极后一电极处 (r 1 ) 处的神经干上, 记录 procaine 处理前及处理后 1min 2min 5min 第 1 对引导电极 (r 1 r 1 ) 引导的动作电位振幅和时程 注意事项 (1) 神经干应尽可能分离得长一些, 要求上自脊椎附近的主干, 下沿腓总神经与胫神经一直分离至踝关节附近止 (2) 神经干分离过程中慎勿损伤神经组织, 以免影响神经的兴奋性 实验报告要求 1. 题目 2. 署名作者和合作者姓名及单位 3. 结构式摘要 ( 目的, 方法, 结果, 结论 ) 4. 材料和方法主要实验材料, 离体蟾蜍坐骨神经干标本制备方法简要, 仪器装置连接和仪器参数 5. 观察项目实验观察项目及观察指标, 数据用 x±s 表示, 统计方法 6. 结果列阈强度 最大刺激强度 传导速度 双相动作电位正相 负相振幅及持

365 续时间 单相动作电位振幅及持续时间的原始数据表格, 列神经干中枢引导和末梢引导双相动作电位正相 负相振幅及持续时间原始数据表格, 列 KCl 和 procaine 处理前后动作电位振幅及持续时间原始数据表格, 对上述数据进行统计和显著性检验 绘制刺激强度与动作电位振幅的关系图, 标注双相动作电位和单相动作电位波形图 用文字和数据 ( 包括显著性检验结果 ) 逐一描述实验结果 7. 讨论对实验结果进行分析推理 包括分析影响实验结果的主要干扰因素及改进方法 8. 参考文献 思考题 1. 什么叫刺激伪迹? 应怎样鉴别? 如何发生? 2. 神经干动作电位的幅度在一定范围内随着刺激强度的变化而变化, 这是否与神经纤维动作电位的 全或无 性质相矛盾? 3. 调换神经干标本的放置方向的目的是什么? 4. 如果在实验中发现采样窗中两个动作电位相距太近以致兴奋传导速度的测定有困难时, 应采取何种措施? 是否有其它方法测量神经干兴奋传导的速度? 5. 双相动作电位的上 下两相的幅值为何不等? 实验 9 人体动脉血压的测定及运动 体位对血压的影响 目的 本实验目的是学习袖带法测定动脉血压的原理和方法, 测定人体肱动脉的收缩压与舒张压及观察运动 体位对人体血压的影响 原理 动脉血压是指流动的血液对血管壁所施加的侧压力 人体动脉血压测定的最常用方法 是袖带间接测压法, 它是利用袖带压迫动脉使动脉血流发生湍流并产生的血管音 (Korotkoff 音 ), 通过听诊器听取血管音来测量血压的 测量部位一般多在肱动脉 血液 在血管内顺畅地流动时通常并没有声音, 但当血管受压变狭窄或时断时通, 血液发生湍流 时, 则可发生所谓的血管音 用充气袖带缚于上臂加压, 使动脉被压迫关闭, 然后放气, 逐步降低袖带内的压力 当袖带内压力超过动脉收缩压时, 血管受压, 血流阻断 此时, 听不到血管音, 也触不到远端的桡动脉搏动 当袖带内压力等于或略低于动脉内最高压力 时, 有少量血液通过压闭区, 在其远侧血管内引起湍流, 于此处用听诊器可听到血管壁震 颤音, 并能触及脉搏, 此时袖带内的压力即为收缩压, 其数值可由压力表或水银柱读出 在血液间歇地通过压闭区的过程中一直能听到声音 当袖带内压力等于或稍低于舒张压 时, 血管处于通畅状态, 失去了造成湍流的因素, 声音突然由强变弱或消失, 此时袖带内 压力为舒张压, 数值亦可由压力表或水银柱读出

366 在运动和体位变化时, 可通过神经和体液调节, 使循环机能发生一系列适应性变化而改变收缩压和舒张压 材料 人 ; 血压计, 听诊器, 手表, 微机生物信号采集处理系统, 心音换能器 预习要求 1. 仪器设备知识参见第二章第三节 RM6240 微机生物信号采集处理系统 2. 实验理论生理学教材中动脉血压的神经 体液调节 检索全文数据库中的有关运动生理的研究论文, 检索方法参见第五章第五节 3. 预绘制实验原始数据记录表格和统计表格 方法 1. 血压计测定动脉血压 (1) 血压计有两种, 即水银 式及表式 两种血压计都包括三部 分 : 袖带 橡皮球和测压计 ( 图 7-9-1) 水银式检压计在使用时先 驱净袖带内的空气, 打开水银柱根 部的开关 (2) 受试者端坐位, 脱去一 侧衣袖, 静坐 5min (3) 受试者前臂伸平, 置于 桌上, 令上臂中段与心脏处于同一 水平 将袖带卷缠在距离肘窝上方 2cm 处, 松紧度适宜, 以能插入两 指为宜 (4) 于肘窝处靠近内侧触及 动脉脉搏, 将听诊器胸件放于上 面 (5) 一手轻压听诊器胸件, 一手紧握橡皮球向袖带内充气使 水银柱上升到听不到 血管音 时, 继续打气使水银柱继续上升 2.6kPa (20mmHg), 一 般达 24kpa(l80mmHg) 随即松开气球螺帽, 徐徐放气, 以降低袖带内压, 在水银柱缓 慢下降的同时仔细听诊 当突然出现 崩崩 样的声音血管音时, 血压计上所示水银柱刻 度即代表收缩压 (6) 继续缓慢放气, 这时声音发生一系列的变化, 先由低而高, 而后由高突然变低 钝, 最后则完全消失 在声音由强突然变弱这一瞬间, 血压表上所示水银柱刻度即代表舒 张压 2. 用生物信号采集处理系统测定动脉血压 ( 必须采用可用于人体的有医疗仪器证书 的仪器 ) 肱动脉 图 听诊器 血压计测量人体动脉血压方法示意图 (1) 按图 将心音换能器和压力换能器分别插入 RM6240C 的 1 通道和 2 通道, 袖带 汞柱 40 KPa 放气螺丝打气球 0 触诊

367 压力换能器定标, 压力换能器的测压口与袖带胶管相连 有源音箱或耳机插头插入监听插 座 压力换能器 打气球 RM6240C 2 1 心音换能器 图 微机生物信号采集处理系统测量人体动脉血压方法示意图 (2) 启动 RM6240 系统, 第 1 通道模式选择 心音, 时间常数为交流低增益, 灵敏度 20mV, 滤波频率 100Hz, 数字滤波为高通 200~300 Hz; 第 2 通道模式选择 血压, 时间常数为直流, 灵敏度 90mmHg, 滤波频率 OFF; 采样频率 800 Hz, 扫描速度 1s( 见图 7-9-3) (4) 受试者端坐位, 脱去一侧衣袖, 静坐 5min (5) 受试者前臂伸平, 置于桌上, 令上臂中段与心脏处于同一水平 将袖带卷缠在距离肘窝上方 2cm 处, 松紧度适宜, 以能插入两指为宜 (6) 于肘窝处靠近内侧触及动脉脉搏, 将心音换能器放于上面 启动记录按钮 (7) 一手轻压心音换能器, 一手紧握橡皮球向袖带内充气使 2 通道压力显示 24kpa (l80mmhg) 随即松开气球螺帽, 徐徐放气, 使袖带内压缓慢下降, 当突然出现 崩崩 样的声音时, 第 1 通道出现首个血管音波, 该血管音波所对应的第 2 通道的压力即为收缩压 (8) 继续缓慢放气, 脉冲波和声音, 先由低而高, 而后由高突然变低, 最后则完全消失 末个血管音波所对应的第 2 通道的压力即舒张压 观察项目 1. 测定安静坐位状态下的心率 血压 受试者在安静环境中静坐, 左上臂缠上袖带 (1) 测收缩压用橡皮球将空气打入橡皮袖带内, 使血压表上水银拄逐渐上升到听诊器听不到脉搏声音为止 ( 一般升至 180mmHg 左右 ), 随即松开气球螺丝帽, 徐徐放气, 减少袖带内压力, 在水银柱缓慢下降的同时仔细听诊, 在开始听到 蹦蹦 样的第一声血管音时, 这时血压表上所示水银柱刻度即代表收缩压 (2) 测舒张压继续缓慢放气, 这时声音有一系列变化, 先由低而高, 而后由高突

368 然变低, 最后完全消失 在声音突然由强变弱的这一瞬间, 血压表上所示水根柱刻度即代 表舒张压 ; 有时亦可以声音突然消失时血压计所示水银柱刻度即代表之 ( 二者相差 5~l0mmHg) 可同时记录这两个读数 首个血管音波 末个血管音波 收缩压 舒张压 图 RM6240C 系统测量人体动脉血压实验界面 2. 观察运动对血压和脉搏的影响 (1) 受试者左上臂缠上袖带, 在安静环境中静坐, 不讲话, 也不要注意操作过程及水银柱的波动, 每隔 2 分钟测量血压 脉搏各一次 ( 测 15 秒的脉搏数乘以 4 作为每分钟的值 ), 直至测量数据连续三次稳定 ( 血压波动小于 4mmHg 脉搏波动小于 2 次 / 分 ), 取最后三次数据, 分别算出脉搏数 血压的平均值 (2) 作蹲下起立运动以每 2 秒 1 次的速度进行 20 次, 在运动后即刻 3 分钟 5 分钟和 10 分钟时各测定脉搏与血压一次 [ 附 ] 健康人在蹲下起立运动试验中, 运动刚停止时, 心跳数增加 30 次以上, 收缩压增加 30~40mmHg, 舒张压增加不到 10mmHg, 在 3 分钟内恢复至安静状态, 而心功能不全者运动刚结束时, 心跳数增加 30 次以上, 收缩压仅有轻度增加, 舒张压则显著增高, 心跳 血压恢复至安静状态都需要 5 分钟以上 3. 观察体位变化对脉搏和血压的影响 (1) 受试者卧床安静 10~30 分钟后, 每隔 1 分钟测定其血压和脉搏数, 直至稳定为

369 止 (2) 受试者下床站立于地上 起立后 1 分钟内, 每隔 30 秒测定其血压和脉搏数, 以后每隔 1 分钟测定其血压和脉搏数直到立起后 10 分钟为止 [ 附 ] 起立试验阳性反应判断的标准及生理和临床意义 : 脉压减小 16mmHg 以上, 收缩压降低 12mmHg 以上, 脉搏数增加 21 次 / 分以上, 符合以上一项者即为阳性反应, 本实验阳性反应系交感神经紧张度欠佳所致 有时由于脑贫血, 可出现头晕与昏厥 注意事项 1. 室内须保持安静, 以利于听诊 袖带不宜绕得太松或太紧 2. 动脉血压通常连续测 2~3 次, 每次间隔 2~3min 重复测定时袖带内的压力须降到零位后方可再次打气 一般取两次较为接近的数值为准 3. 上臂位置应于右心房同高 ; 袖带应缚于肘窝以上 听诊器胸件放在肱动脉位置上面时不要压得过重或压在袖带下测量, 也不能接触过松以致听不到声音 4. 如血压超出正常范围, 让受试者休息 10min 后再作测量 受试者休息期间, 可将袖带解下 5. 注意正确使用血压计, 开始充气时打开水银柱根部的开关, 使用完毕后应关上开关, 以免水银溢出 6. 心音换能器轻按压于肱动脉上, 不要滑动, 以减小噪声 音箱远离心音换能器, 音量适当, 以避免 啸叫 实验报告要求 1. 题目 2. 署名作者和合作者姓名及单位 3. 结构式摘要 ( 目的, 方法, 结果, 结论 ) 4. 材料和方法主要实验材料, 仪器装置连接和仪器参数, 5. 观察项目实验环境, 观察项目及观察指标, 数据用 x±s 表示, 统计方法 6. 结果列安静坐位状态下及运动后即刻 3min 5min 及 10min 的心率 收缩压和舒张压, 对数据进行统计和显著性检验, 绘制运动后即刻 3min 5min 及 10min 的心率 收缩压和舒张压变化曲线 用文字和数据 ( 包括显著性检验结果 ) 逐一描述实验结果 7. 讨论对实验结果进行分析推理 包括分析影响实验结果的主要干扰因素及改进方法 8. 参考文献 思考题 1. 何谓收缩压和舒张压? 其正常值是多少? 2. 如何测定收缩压和舒张压? 其原理如何? 3. 测量血压时, 为什么听诊器胸件不能压在袖带底下? 4. 为什么不能在短时间内反复多次测量血压? 5. 运动前后血压有何不同? 其机制如何?

370 实验 13 缺氧动物模型复制及中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧的影响 目的 本实验学习复制乏氧性缺氧和血液性缺氧的动物模型方法, 观察缺氧过程中呼吸的反应及血液色泽和全身一般情况的变化, 并了解温度和中枢神经系统机能状态对缺氧耐受的影响以及对照实验和控制实验条件重要性 原理 当供应组织的氧不足, 或组织利用氧障碍时, 机体的机能和代谢可发生异常变化, 这种病理过程称为缺氧 缺氧是多种疾病共有的病理过程 许多原因都能使机体发生缺氧 不同类型的缺氧, 其机体的代偿适应性反应和症状表现有所不同 根据缺氧的原因不同可将缺氧分为乏氧性缺氧 血液性缺氧 循环性缺氧和组织中毒性缺氧四种类型 将动物放置于密闭的容器内, 使其吸入气中的氧分压逐步降低以复制乏氧性缺氧模型 乏氧性缺氧 ( 又称低张性缺氧 ), 主要表现为动脉血氧分压降低, 氧含量减少, 组织供氧不足 正常毛细血管血液中氧离血红蛋白浓度约为 26g /L 乏氧性缺氧时, 动 静脉血中的氧离血红蛋白浓度增高 当毛细血管血液中氧离血红蛋白浓度达到或超过 50g/L 时, 可使皮肤和粘膜呈青紫色 ( 称为紫绀 ) 抑制动物中枢神经系统功能和降低体温, 降低其代谢率可增强机体的缺氧耐受性 一氧化碳 (CO) 与血红蛋白的亲和力比氧与血红蛋白的亲和力高 2l0 倍. 当吸入气中含有 0.1% 的 CO 时, 血液中的血红蛋白可能有 50% 为碳氧血红蛋白 (HbCO) HbCO 不能与 O 2 结合, 同时还可抑制红细胞的糖酵解 使 2,3- 二磷酸甘油酸 (2,3-DPG) 生成减少, 氧离曲线左移,HbO 2 中的 O 2 不易释放, 从而加重组织缺氧 当血液中的 HbCO 增至 50 % 时, 动物可迅速出现痉挛 呼吸困难 昏迷, 甚至死亡 此时, 动物的动脉血含过多的 HbCO, 其皮肤 粘膜呈 HbCO 的樱桃红 亚硝酸盐可使血红素中二价铁氧化成三价铁, 形成高铁血红蛋白 (HbFe 3+ OH), 导致高铁血红蛋白血症 高铁血红蛋白中的三价铁因与羟基结合牢固, 失去结合氧的能力, 或者血红蛋白分子中的四个二价铁中有部分氧化成三价铁, 剩余的二价铁虽能结合氧, 但不易解离, 导致氧离曲线左移, 使组织缺氧 低浓度美兰为还原剂, 可抑制氧化剂的中毒反应 亚硝酸盐等氧化剂中毒时, 如高铁血红蛋白含量超过血红蛋白总量的 10%, 就可出现缺氧表现, 当血液中 HbFe 3+ OH 达到 15g/L, 皮肤 粘膜可出现青紫颜色 达到 30%~50%, 则发生严重缺氧 预习要求 1. 预习相关理论预习病理生理学教材中缺氧内容 2. 实验方法第三章实验动物基本知识, 第四章动物实验技术, 统计学知识参见 第 5 章第四节常用统计指标和方法 ; 3. 文献检索检索相关研究论文, 检索方法参见第五章第五节 4. 预绘制实验原始数据记录表格和统计表格

371 5. 预测实验结果 材料 小白鼠, ml 广口瓶和测耗氧装置,50g/L 亚硝酸钠溶液,10g/L 美兰溶液 2.5g/L 氯丙嗪溶液 ( 新鲜配制 ) 生理盐水,CO 气体 ( 甲酸加浓硫酸制取 ), 钠石灰 一 中枢神经系统功能抑制和低温对动物耐受缺氧的影响 方法 1. 装置原理量筒充以一定量的水, 移液管用胶管与缺氧瓶塞上的一个管子相连并构成一密闭的空间 ( 图 ) 小鼠在这密闭的缺氧瓶中, 不断消耗氧气, 产生的 CO 2 被钠石灰吸收, 瓶内气压逐渐降低而产生负压, 移液管内液面因瓶内负压而上升, 而量筒内的液面却下降, 量筒内液面下降的毫升数即为小鼠的耗氧量 鼠死后从量筒上读出液面下降的毫升数, 即为小鼠的总耗氧量 (A) 移液管 2. 取性别相同, 体重相近的小鼠 2 只, 并准确称取体重 按随机分配的原则, 将其中 1 只鼠作为实验组, 另一只作为对照组 实验组鼠按量筒 0.1ml/10g 体重腹腔内注射 2.5g/L 氯丙嗪, 安放在冰浴的沙布上 10~15 分钟, 使呼吸频率降为 70~80 次 / 分 ; 对照组鼠按 0.1ml/10g 体重腹腔注射钠石灰生理盐水, 放置室温 10~15 分钟 缺氧瓶测耗氧装置 3. 将 2 只鼠分别放入 100ml 的图 缺氧瓶和测耗氧装置广口瓶内, 按图 连接测耗氧装置 观察项目 1. 从密闭测耗氧装置开始计时至鼠死亡, 记录小鼠存活时间, 用测耗氧装置测定总耗氧量 (A) 根据总耗氧量 A(ml), 存活时间 T(min), 鼠体量 W(g) 三项指标, 求出总耗氧率 R(ml/g/min): R(ml/g/min)=A(ml) W(g) T(min) 2. 列各项指标的原始数据表并进行统计处理, 数据以 x±s 表示, 对实验组和对照 组的 T R 作 t 检验

372 二 不同原因造成不同的缺氧类型 方法 1. 密闭瓶 (1) 取小鼠一只, 数正常呼吸频率 ( 次 /10 秒 ), 并注意深度 观察活动一般情况及耳 尾 口唇的颜色 (2) 将鼠放入含钠石灰 ( 约 5g) 的 100ml 广口瓶内, 待安静后塞紧瓶塞, 开始记录时间, 以每隔 5 分钟间隔数呼吸频率 ( 次 /10 秒 ) 一次, 并观察行为 ( 如挣扎 痉挛等 ) 和耳 尾 口唇的颜色变化, 直至动物死亡, 尸体留待打开腹腔观察 2. 吸入 CO (1) 取小鼠一只, 数正常呼吸频率 ( 次 /10 秒 ), 并注意深度 观察活动一般情况及耳 尾 口唇的颜色 (2) 将鼠放入 500ml 广口瓶内, 塞紧瓶塞, 用 10ml 注射器抽取 CO 气体 10ml, 注入刚密闭的广口瓶内, 形成 2%CO 的空间环境, 开始记录时间, 观察方法与指标同项目 1 的第 (2) 项 3. 注射亚硝酸盐 (1) 取体重相近的鼠 2 只, 数呼吸频率和观察皮肤粘膜色泽 向腹腔内各注射 50g/L 亚硝酸钠 0.2ml 后, 立即向其中一只腹腔内再注射 10g/L 美兰溶液 0.2ml, 另一只注射生理盐水 0.2ml (2) 观察方法与指标同项目 1 的第 (2) 项, 并观察两鼠表现及死亡时间有无差异 打开以上 4 只死亡小鼠的腹腔, 取下小块肝组织置滤纸片上一起进行血液或肝脏颜色比较 注意事项 1. 缺氧瓶和测耗氧量装置必须完全密闭不漏气 2. 小鼠腹腔注射部位应稍靠左下腹, 勿损及肝脏 还应避免将药液注入肠腔或膀胱 3. 实验组鼠应在氯丙嗪注射后稍平静时放在冰浴的纱布上, 放留时间的长短, 以呼吸频率降为 70~80 次 / 分为宜 随时观察鼠, 以防溺水死亡 实验报告要求 1. 题目 2. 署名作者和合作者姓名及单位 3. 结构式摘要 ( 目的, 方法, 结果, 结论 ) 4. 材料和方法主要实验材料, 装置连接 5. 观察项目及观察指标, 数据用 x±s 表示, 统计方法 6. 结果记录各项实验结果的数据, 原始数据列表, 进行统计处理和显著性检验 主观指标用文字描述 分析和探讨各处理因素的作用及机制 用文字和数据 ( 包括显著性检验结果 ) 逐一描述实验结果 7. 讨论对实验结果进行分析推理 包括分析影响实验结果的主要干扰因素及改进

373 方法 8. 参考文献 思考题 1. 密闭瓶内鼠, 一氧化碳中毒鼠及亚硝酸钠中毒鼠各属何种类型缺氧? 其发生机制有何不同? 2. 不同类型缺氧对呼吸和血液颜色的改变是否相同? 为什么? 3. 低温和抑制中枢神经系统功能为何能增强对缺氧的耐受? 4. 为什么要在缺氧瓶内放入钠石灰? 这对缺氧机制的分析有何意义? 5. 为什么不能只凭实验组和对照组的 T R 均数差异来得出缺氧耐受改变的结论? 应作何统计处理? ( 郭峻陆源 )

374 第八章 生理科学实验综合实验 实验 22 离子与药物对离体蟾蜍心脏活动的影响 目的 本实验的目的是学习 Straub 氏法灌流蟾蜍离体心脏方法, 并观察高钾 高钙 低钙 肾上腺素 乙酰胆碱等因素对心脏活动的影响 原理 作为蛙心起搏点的静脉窦能按一定节律自动产生兴奋, 因此, 只要将离体的蛙心保持在适宜的环境中, 在一定时间内仍能产生节律性兴奋和收缩活动 心脏正常的节律性活动需要一个适宜的理化环境, 离体心脏也是如此, 离体心脏脱离了机体的神经支配和全身体液因素的直接影响, 可以通过改变灌流液的某些成分, 观察其对心脏活动的作用 心肌细胞的自律性 兴奋性 传导性和收缩性, 都与钠 钾及钙等离子有关 血钾浓度过高时 ( 高于 7.9mmol/L), 心肌兴奋性 自律性 传导性 收缩性都下降, 表现为收缩力减弱 心动过缓和传导阻滞, 严重时心脏可停搏于舒张期 血钙浓度升高时, 心肌收缩力增强, 过高可使心室停搏于收缩期 血钙浓度降低, 心肌收缩力减弱 血中钠离子浓度的轻微变化, 对心肌影响不明显, 只有发生明显变化时, 才会影响心肌的生理特性 肾上腺素可使心率加快 传导加快和心肌收缩力增强, 乙酰胆碱则与肾上腺素的作用相反 预习要求 1. 仪器设备知识参见第二章第三节 RM6240 微机生物信号采集处理系统 P( 或第四节 PcLab 和 MedLab 微机生物信号采集处理系统 ) 2. 实验理论实验动物知识参见第二章第一节生理科学实验常用实验动物的种类和第四章第一节动物实验的基本操作 ; 统计学知识参见第五章第四节常用统计指标和方法 ; 实验理论知识参见生理学教材中有关心脏的生物电及心肌的生理特性 自主神经系统对心血管活动的调节内容 检索全文数据库中的相关研究论文, 检索方法参见第五章第五节 3. 预绘制实验原始数据记录表格和统计表格 4. 预测结果预测无钙灌流液 高钙灌流液 高钾灌流液 肾上腺素 乙酰胆碱对离体蟾蜍心脏活动的影响 材料 蟾蜍或蛙 ; 微机生物信号处理系统, 张力换能器 ; 任氏液, 无钙任氏液,30g/LCaCl 2, 10g/LKCl,0.1g/L 肾上腺素溶液,10-2 g/l 乙酰胆碱溶液,10g/L 普萘洛尔 方法 1. 仪器连接和参数设置 按图 连接, 张力换能器输出线接微机生物信号处理系统第 1 通道 ( 亦可选择其

375 它通道 ), 微机生物信号处理系统参数设置 : (1)RM6240 系统 : 点击 实验 菜单, 选择 生理科学实验中 的 蛙心灌流 项目 系统进入该实验信号记录状态 仪器参数 : 通道时间常数为直流, 滤波频率 10Hz, 灵敏度 3g, 采样频率 400Hz, 扫描速度 1s/div (2)PcLab 和 MedLab 系统 : 点击 实验 菜单, 选择 常用生理学实验 或 文件 菜单 打开配置 中的 蛙心收缩 项目 系统进入该实验信号记录状态 仪器参数 : 通道放大倍数 200~500 直流耦合( 下限频率 DC) 上限频率 10Hz, 采样间隔 5ms Hz 蛙心插管 蛙心 蛙心夹张力换能器 微距调节夹 滑轮 生物信号采集处理系统 图 蛙心灌流装置 2. 离体蛙心制备 (1) 取蟾蜍一只, 破坏脑和脊髓后, 仰卧固定在蛙板上, 从剑突下将胸部皮肤向上剪开, 然后剪掉胸骨, 打开心包, 暴露心脏, 分离左 右主动脉 (2) 在左主动脉下方穿 1 根线, 靠头端结扎作插管时牵引用, 在主动脉干下方穿 1 根线, 在动脉圆锥上方系一松结用于结扎固定蛙心插管 (3) 左手持左主动脉上方的结扎线, 用眼科剪在松结上方左主动脉根部剪一小斜口, 右手将盛有少许任氏液的大小适宜的蛙心插管由此切口处插入动脉圆锥 当插管头到达动脉圆锥时, 用镊子夹住动脉圆锥少许, 将插管稍稍后退, 并转向心室中央方向, 镊子向插管的平行方向提拉, 心室收缩期时将插管插入心室 ( 图 ) 蛙心插管进入心室后管内的任氏液的液面会随心室的舒缩而上下波动 蛙心插管进入心室后, 用预先准备好的松结扎紧, 扎线套在蛙心插管的侧钩上打结并固定 剪断主动脉左右分支

376 蛙心插管 心房 蛙心插管 V 字形切口左主动脉动脉圆锥心室 镊子 动脉圆锥 心室 图 蛙心插管示意图 (4) 轻轻提起蛙心插管以抬高心脏, 用一线在静脉窦与腔静脉交界处作一结扎, 结扎线应尽量下压, 以免伤及静脉窦, 在结扎线外侧剪断所有组织, 将蛙心游离出来 (5) 用新鲜任氏液反复换洗蛙心插管内含血的任氏液, 直至蛙心插管内无血液残留为止 此时离体蛙心已制备成功, 可供实验 (6) 将蛙心插管固定在铁支架上, 用蛙心夹在心室舒张期夹住心尖, 并将蛙心夹的线头通过滑轮连至张力换能器的应变梁上, 调节此线张力至 1g, 插管内加灌流约 1~1.5ml, 并在插管上标记灌流的高度, 在此后的实验过程中, 灌流液恒定于该高度 观察项目 1. 正常的蛙搏曲线启动微机生物信号采集处理系统记录按钮, 记录正常的心搏曲线, 注意观察心搏频率 心室的收缩和舒张程度 2. 无钙任氏液灌流把插管内的任氏液全部更换为无 Ca 2+ 任氏液, 观察心搏变化 3. 灌流液中加钙灌流在观察项目 2 的基础上中滴加 30g/L CaCl 2 1 滴, 观察心搏变化 4. 高钙任氏液灌流用正常的任氏液换洗 2 次, 心搏曲线稳定后, 滴加 30g/L CaCl 2 1~2 滴, 观察心搏变化 心搏曲线明显变化时, 立即将高 Ca 2+ 任氏液吸出, 用正常的任氏液反复换洗, 使心搏曲线恢复稳定 5. 高 K + 任氏液灌流在任氏液中加 10g/L KCl 1~2 滴, 观察心搏变化 心搏曲线明显变化时, 立即将高 K + 任氏液吸出, 用正常的任氏液反复换洗, 使心搏曲线恢复稳定 6. 肾上腺素作用在任氏液中加 0.1g/L 的肾上腺素溶液 1~2 滴, 观察心搏变化 待心搏稳定后, 向灌流液中加 30g/L 普萘洛尔溶液 1~2 滴, 观察心搏变化 心搏曲线稳定后, 用正常任氏液反复换洗至心搏曲线恢复正常 7. 在任氏液中加 10-2 g/l 的乙酰胆碱溶液 1~2 滴, 观察心搏变化 注意事项

377 1. 制备蛙心标本时, 勿伤及静脉窦 2. 上述各实验项目, 一旦出现作用应立即用正常氏液换洗, 以免心肌受损, 而且必须待心搏恢复稳定状态后方能进行下一步实验 3. 蛙心插管内液面应保持恒定, 以免影响结果 4. 滴加药品和换取正常任氏液, 须及时标记, 以便观察分析 5. 吸滴瓶中的任氏液和吸蛙心插管内溶液的吸管应区分专用, 不可混淆使用, 以免影响实验结果 6. 药物作用不明显时, 可再适量滴加药品, 密切观察药物添加后的实验结果 实验报告要求 1. 题目 2. 署名作者和合作者姓名及单位 3. 结构式摘要 ( 目的, 方法, 结果, 结论 ) 4. 材料和方法主要实验材料, 离体蛙心标本制备方法简要, 仪器装置连接和仪器参数, 5. 观察项目及观察指标, 数据用 x±s 表示, 统计方法 6. 结果列各项处理前后心率 心室的收缩和舒张张力原始数据表格, 对数据进行统计和显著性检验 用文字和数据 ( 包括显著性检验结果 ) 逐一描述实验结果 7. 讨论对实验结果进行分析推理 包括分析影响实验结果的主要干扰因素及改进方法 8. 参考文献 思考题 1. 正常蛙心搏动曲线的各个组成部分, 分别反映了什么? 2. 用低钙任氏液灌注蛙心时, 将观察到心搏曲线发生什么变化? 为什么? 3. 在任氏液中加入 30g/L CaCl 2 溶液灌注蛙心时, 将观察到心搏曲线发生什么变化? 为什么? 4. 在任氏液中加入 10g/L KCI 溶液灌注蛙心时, 心搏曲线又将出现什么变化? 为什么? 5. 在任氏液中加入肾上腺素溶液灌注蛙心时, 心搏曲线将发生什么变化? 为什么? 6. 在任氏液中加入乙酰胆碱溶液灌注蛙心时, 心搏曲线又将发生什么变化? 为什么? 实验 23 影响家兔动脉血压的因素 目的 本实验采用动脉血压的直接测量方法, 观察神经和体液因素对动脉血压的调节作用, 了解家兔急性失血模型的建立方法, 观察家兔急性失血期间及停止失血后其动脉血压的变

378 化及血红蛋白浓度的变化 原理 在生理情况下, 人和其它哺乳动物的血压相对稳定, 这种相对稳定是通过神经和体液因素的调节而实现的, 其中颈动脉窦 主动脉弓压力感受性反射起着重要作用 此反射既可在血压升高时降压, 又可在血压降低时升压, 反射的传入神经为主动脉神经与窦神经 家兔的主动脉神经为独立的一条神经, 又称减压神经, 易于分离和观察其作用 在人 犬等动物, 主动脉神经与迷走神经混为一条, 不能分离 反射的传出神经为心交感神经 心迷走神经和交感缩血管纤维, 心交感神经兴奋, 其末梢释放去甲肾上腺素, 去甲肾上腺素与心肌细胞膜上的 β 受体结合, 引起心脏正性的变时变力变传导作用, 心迷走神经兴奋, 其末梢释放乙酰胆碱, 乙酰胆碱与心肌细胞膜上的 M 受体结合, 引起心脏负性的变时变力变传导作用, 交感缩血管纤维兴奋, 其末梢释放去甲肾上腺素, 去甲肾上腺素与血管平滑肌细胞膜上的 α 受体结合, 引起阻力血管的收缩 机体对一定量的急性失血有代偿能力 急性失血使动脉血压下降, 血容量减少, 在失血的瞬时, 通过压力感受性反射和容量感受性反射, 阻力血管 容量血管收缩 心脏活动增强以维持动脉血压 急性失血引起交感 - 肾上腺髓质系统兴奋, 导致儿茶酚胺大量分泌, 出现血管的明显收缩 静脉系统属于容量血管, 可容纳血液总量的 60%~70% 静脉的收缩可以迅速而短暂地增加回心血量 微动脉和毛细血管前括约肌比微静脉对儿茶酚胺更为敏感, 导致毛细血管前阻力比后阻力升高更明显, 毛细血管灌流不足, 流体静压下降, 使组织液进入血管, 循环血量增加 抗利尿激素 血管紧张素 Ⅱ 皮质激素的产生和分泌增加也参与急性失血的代偿 本实验应用液压传递系统直接测定动脉血压 即由动脉插管 测压管道及压力换能器相互连通, 其内充满抗凝液体, 构成液压传递系统 将动脉套管插入动脉内, 动脉内的压力及其变化, 可通过密闭的液压传递系统传递压力, 通过压力换能器将压力变化转换为电信号, 用微机生物信号采集处理系统记录动脉血压变化曲线 预习要求 1. 仪器设备知识参见第二章第三节 RM6240 微机生物信号采集处理系统 ( 或第四节 PcLab 和 MedLab 微机生物信号采集处理系统 ) 2. 实验理论实验动物知识参见第二章第一节生理科学实验常用实验动物的种类 ; 第四章第一节动物实验的基本操作 第四节实验动物手术 ; 统计学知识参见第 5 章第四节常用统计指标和方法 ; 生理学教材有关动脉血压的调节理论, 病理生理学教材有关失血性休克理论 检索全文数据库中的相关研究论文, 检索方法参见第五章第五节 3. 预绘制实验原始数据记录表格和统计表格 材料 家兔,200g/L 氨基甲酸乙酯或 10g/L 戊巴比妥钠,1000U/ml 肝素,0.1g/L 去甲肾上腺素,10-2 g/l 乙酰胆碱, 放血瓶, 血红蛋白比色计全套, 动脉插管, 血压换能器, 微机生物信号采集处理系统

379 方法 1. 实验系统连接及参数设置 (1) 颈动脉血压测量记录装置见图 将血压换能器固定于铁支柱上, 其位置与心脏在同一平面 (2) 安装好放血装置使股动脉插管与放血瓶相连 ( 瓶内预先盛 60ml 生理盐水 ), 打开三通将放血系统管道内的空气排出并充满生理盐水, 然后关上三通 放血瓶内放入肝素 0.5ml, 记下瓶内液体量, 调节放血瓶高度, 使瓶内液平面距离颈心脏水平约 65cm 处可使血压维持在 6.67kPa(50mmHg) 左右 (3) 压力换能器输出线接微机生物信号处理系统第 1 或第 4 通道 (4) 微机生物信号处理系统参数设置 : 1 RM6240 系统 : 点击 实验 菜单, 选择 生理科学实验 菜单中的 兔动脉血压调节 系统进入该实验信号记录状态 仪器参数:1 通道时间常数为直流, 滤波频率 100Hz, 灵敏度 12Kpa, 采样频率 800Hz, 扫描速度 :500ms/div 连续单刺激激方式, 刺激强度 5~10V, 刺激波宽 2ms, 刺激频率 30 Hz 2 PcLab 和 MedLab 系统 : 点击 文件 菜单 打开配置 中的 动脉血压记录 项目 系统进入该实验信号记录状态 仪器参数 :1 通道放大倍数 200 直流 (DC) 耦合, 采样间隔 1ms; 串刺激方式, 波宽 2ms, 刺激强度 5~10V, 时程 1s, 频率 30 Hz.(3) 血压换能器定标实验室已将仪器和血压换能器系统进行了定标, 无须再定标 定标方法见第七章实验 16 实验过程中不能改变定标数值 放血瓶 股动脉插管 三通 排气管 弹簧夹 换能器 生物信号采集处理系统 颈动脉插管 测压管 刺激电极 图 兔动脉血压测量和动脉放血装置 2. 手术准备 ( 参见第四章第一节动物实验的基本操作 第四节实验动物手术 ) (1) 家兔称重后, 氨基甲酸乙酯按 1g/kg 体重的剂量于耳缘静脉注射麻醉 注意麻

380 醉剂不能过量, 注射速度不宜过快 (2) 动物仰卧固定缚于手术台上, 固定四肢, 前肢交叉固定, 用棉绳钩住兔门齿, 将绳拉紧并缚于兔台铁柱上 (3) 暴露颈部气管 颈总动脉 颈静脉 迷走神经和主动脉神经 用玻璃分针仔细分离右侧上述神经, 各穿以不同颜色的细丝线以供识别 分离两侧颈总动脉和两侧颈静脉, 各穿二线备用 (4) 给动物静脉注射肝素, 剂量为 1000U/kg 体重 等 1 分钟后再进行下一步骤, 以使肝素在体内血液中混合均匀 (5) 左颈总动脉插管颈总动脉远心端结扎, 近心端用动脉夹夹住, 用眼科剪在靠近结扎处动脉壁剪一 V 字形切口, 将动脉插管向心方向插入颈总动脉内, 扎紧固定 (6) 用左手拇指和另外四指将股部皮肤绷紧固定, 沿股腹面正中线从腹股沟下缘向膝部切开皮肤 4~5cm 用止血钳分离皮下组织, 暴露股部肌肉 用玻璃分针分离股动脉, 分离出血管约 2~3cm, 在其下面穿入 2 根线, 结扎远心端的血管, 近心端用动脉夹夹闭血管 靠近远心端血管结扎线 0.3cm 处, 用眼科直剪呈 45 角剪开血管直径的 1/3, 用弯型眼科镊夹住切口游离尖端并挑起, 插入血管导管 2~4cm, 在近心端结扎血管导管 利用远心端的结扎线再次结扎插管导管 观察项目 1. 启动记录按钮, 除去动脉夹, 可见血液由动脉冲入动脉插管, 微机生物信号采集 处理系统开始采样记录血压数据, 并在屏幕上显示血压波动曲线 ( 图 ) 一级波 二级波 图 家兔动脉血压波形 一级波 ( 心搏波 ): 由心室舒缩所引起的血压波动, 频率与心率一致 二级波 ( 呼吸波 ): 由呼吸运 动所引起的血压波动 三级波 : 常不出现, 可能由于血管运动中枢紧张性的周期性变化所致 2. 从颈静脉内取血 0.5ml 测定 Hb 浓度 ( 方法见附录 ) 3. 用动脉夹夹闭右侧颈总动脉 5~10 秒, 观察血压变化 4. 用两细线在减压神经中部两处结扎 在两结扎间切断神经, 用强度 5~10V, 频率 30Hz, 波宽 2ms 的电脉冲分别刺激神经中枢端和外周端, 观察血压变化 5. 将右侧迷走神经穿线结扎, 在结扎上端切断该神经, 用强度 5~10V, 频率 30Hz, 波宽 2ms 的电脉冲刺激其外周端, 观察血压变化 6. 静脉注射 0.1g/L 去甲肾上腺素 0.3ml, 观察血压变化 7. 静脉注射 10-2 g/l 乙酰胆碱 0.1ml/kg, 观察血压变化 8. 静脉注射 1g/L 阿托品 0.3ml/kg

381 9. 重复观察项目 5 和 7 操作, 观察血压变化 10. 打开放血装置上的三通阀, 使动脉血进入放血瓶, 持续失血 3 分钟后关闭三通阀, 终止失血 连续观察放血过程中血压动态变化, 于失血停止后即刻 10min 20 min 30 min 分别从颈静脉采血 0.5ml, 测定 Hb 浓度 注意事项 1. 采取保温措施, 防止动物麻醉后体温下降 2. 每一项观察须有处理前对照, 并须待其基本恢复后再进行下一步骤 实验报告要求 1. 题目 2. 署名作者和合作者姓名及单位 3. 结构式摘要 ( 目的, 方法, 结果, 结论 ) 4. 材料和方法主要实验材料, 仪器装置连接和仪器参数 5. 观察项目和观察指标, 数据用 x±s 表示, 统计方法 6. 结果列各项处理前后的动脉血压的收缩压, 舒张压, 平均动脉压,dP/dtmax, 心率原始数据表格, 并进行统计处理和显著性检验 用文字和数据 ( 包括显著性检验结果 ) 逐一描述实验结果 实验结果曲线剪贴并标注 7. 讨论分析讨论各项处理对动脉血压的影响及机制 包括分析影响实验结果的主要干扰因素及改进方法 8. 参考文献 思考题 1. 正常血压的波动情况如何? 何以会有各种波动? 心脏每搏动一次, 血压是否应波 动一次? 能否从所描曲线上看出来? 2. 未插管一侧的颈总动脉短时夹闭对全身血压什么影响? 为什么? 假使夹闭部位是 在颈动脉窦以上, 影响是否相同? 3. 刺激减压神经中枢端与外周端对血压的影响有什么不同? 为什么? 4. 静脉注射 0.1g/L 去甲肾上腺素 0.3ml, 血压上升时心率发生什么变化? 为什么? 5. 为什么要持续失血 3min, 这对失血代偿的机制分析上有何意义? 6. 失血停止后, 血压为何能缓慢上升? ( 陆源梅汝焕杨军 )

382 实验 27 影响家兔呼吸运动和血气酸碱度的因素 目的 方法 观察影响呼吸运动及血气酸碱度变化的因素, 了解动物酸中毒模型建立和纠正酸中毒 原理 呼吸运动是呼吸中枢节律性活动的反映 在不同生理状态下, 呼吸运动所发生的适应性变化有赖于神经系统的反射性调节, 其中较为重要的有呼吸中枢 肺牵张反射以及外周化学感受器的反射性调节 因此, 体内外各种刺激可以直接作用于中枢部位或通过不同的感受器反射性地影响呼吸运动 代谢性酸中毒的特征是血浆 HCO 3 浓度原发性减少 本实验通过静脉注射 NaH 2 PO 4 增加细胞外液 H + 浓度, 消耗 HCO 3 并使血浆 HCO 3 浓度降低, 复制家兔代谢性酸中毒模型 代谢性酸中毒动物呼吸加深加快, 是由血液内 H + 浓度增加, 刺激颈动脉体和主动脉体外周化学感受器及延髓中枢化学感受器, 反射性地兴奋延髓呼吸中枢所致 呼吸加深加快, 肺泡通气量增加,CO 2 排出增多, 血液 H 2 CO 3 浓度随之下降, 恢复 [NaHCO 3 ]/[H 2 CO 3 ] 的正常比值 这种代偿调节作用可在数分钟内发生, 并很快达到高峰, 但一般不容易获得完全代偿 代谢性酸中毒, 血浆 HCO 3 浓度原发性减少, 血气分析时可测得反映代谢因素的指标 AB SB BB 降低,BE 负值增大, 同时由于呼吸代偿活动, 可使 PaCO 2 降低,AB<SB 代谢性酸中毒动物血浆碳酸氢盐减少, 碳酸氢钠可作为首选补碱药物, 直接由静脉输入, 使细胞外液的 [NaHCO 3 ]/[H 2 CO 3 ] 比值恢复正常 呼吸性酸中毒是由肺通气功能障碍引起的, 其特征是体内 CO 2 潴留 血浆 H 2 CO 3 浓度原发性增高 用减少动物肺通气的方法可复制呼吸性酸中毒 呼吸性酸中毒时, 呼吸系统往往不能发挥代偿调节作用,[NaHCO 3 ]/[H 2 CO 3 ] 缓冲对不起作用, 细胞外液的缓冲作用也很有限, 不可能收到明显的调节效果 血气分析中可见反映呼吸因素的指标明显 PaCO 2 AB 明显增大 预习要求 1. 仪器设备知识参见第二章第三节 RM6240 微机生物信号采集处理系统 ( 或第四节 PcLab 和 MedLab 微机生物信号采集处理系统 ) 2. 实验理论实验动物知识参见第二章第一节生理科学实验常用实验动物的种类 ; 第四章第一节动物实验的基本操作 第四节实验动物手术 ; 统计学知识参见第 5 章第四节常用统计指标和方法 ; 呼吸运动调节和酸碱平衡紊乱知识参见生理学教材有关呼吸运动调节和病理生理学教材有关酸碱平衡紊乱内容 检索全文数据库中的相关研究论文, 检索方法参见第五章第五节 3. 预绘制实验原始数据记录表格和统计表格 材料

383 家兔 ;10g/L 肝素,200g/L 氨基甲酸乙酯或 10g/L 戊巴比妥钠,120g/L NaH 2 PO 4,50g/L NaHCO 3, 生理盐水 ; 呼吸换能器, 血气酸碱分析仪一台, 水检压计, 生物信号采集处理 系统 方法 1. 实验系统连接及参数设置 (1) 家兔呼吸运动记录装置见图 (2) 将呼吸换能器固定于铁支柱上 呼吸换能器输出线接微机生物信号处理系统第 1 通道 ( 亦可选择其它通道 ) 微机生物信号处理系统参数设置: 1 RM6240 系统 : 点击 实验 菜单, 选择 呼吸 或 自定义实验项目 菜单中的 呼吸运动调节 系统进入该实验信号记录状态 仪器参数: 通道时间常数为直流, 滤波频率 30Hz, 灵敏度 10cmH 2 O( 或 12.5ml), 采样频率 800Hz, 扫描速度 1s/div 连续单激激方式, 刺激强度 5~10V, 刺激波宽 2ms, 刺激频率 30 Hz 2 PcLab 和 MedLab 系统 : 点击 实验 菜单, 选择 常用生理学实验 或 文件 菜单 打开配置 中的 呼吸记录 项目 系统进入该实验信号记录状态 仪器参数 : 通道放大倍数 1000 直流耦合( 下限频率 DC) 上限频率 40Hz, 采样间隔 2~5ms; 刺激波宽 2ms 可调 ; 刺激强度 :5~10V; 主周期刺激方式, 连续脉冲, 脉冲数 30, 波间隔 33.3ms 2. 手术准备 ( 参见第四章第一节动物实验的基本操作 第四节实验动物手术 ) (1) 麻醉固定家兔称重后,200g/L 氨基甲酸乙酯按 1g/kg 体重, 耳缘静脉注射麻醉 待兔麻醉后, 将其仰卧固定 (2) 手术用粗剪刀剪去颈前部被毛, 颈前正中切开皮肤 6~8cm, 直至下颌角上 1.5~2cm, 用止血钳钝性分离软组织及颈部肌肉, 暴露气管及与气管平行的左 右血管神经鞘, 细心分离两侧鞘膜内的迷走神经, 在迷走神经下穿线备用 分离出一侧鞘膜内的颈总动脉, 结扎颈总动脉远心端, 用动脉夹夹住近心端, 以备抽血用 (3) 气管插管用止血钳分离气管, 在气管下穿两根粗棉线备用 在甲状软骨下约 1cm 处, 做 形切口, 用棉签将气管切口及气管里的血液和分泌物擦净, 气管插管由切口处向肺端插入, 插时应动作轻巧, 避免损伤气管粘膜引起出血, 用一粗棉线将插管口结扎固定, 另一棉线在切口的头端结扎止血 用温热生理盐水纱布覆盖手术野 (4) 用 10g/L 肝素按 1ml/kg 体重剂量经耳缘静脉行全身抗凝处理 观察项目 1. 描记正常呼吸曲线启动生物信号采集处理系统记录按钮, 记录一段正常呼吸运动曲线作为对照 辨认曲线上吸气 呼气的波形方向 ( 呼气曲线向上, 吸气曲线向下 ) 2. 血气酸碱度观察用 2ml 注射器取肝素溶液少许, 湿润注射器内壁后推出, 使注射器死腔和针头内部充满肝素溶液 然后向心方向刺入颈总动脉内, 由助手打开动脉夹, 抽血 1.0ml( 注意切勿进入汽泡 ), 夹上动脉夹, 针头拔出后立即插入小橡皮塞内以隔绝空气, 进行实验前的血液 ph PaCO 2 [HCO 3] 和 BE 测定 采血同时记录呼吸频率和幅度 3. 在气管插管一个侧管上接一根长 50cm 胶管, 观察和记录呼吸运动的变化 4. 降低吸入气中的氧分压待呼吸曲线恢复正常, 用一只小烧杯置于气管插管开口

384 前, 将氮气气囊的导管口平行于气管插管口使气体冲入烧杯, 给动物吸入含有较高浓度氮气的空气以降低家兔吸入气中的氧分压, 观察和记录呼吸运动的变化 5. 增加吸入气中二氧化碳分压待呼吸曲线恢复正常, 按观察项目 4 的操作方法打开二氧化碳气囊, 使家兔吸入含有较高浓度二氧化碳的空气 待家兔呼吸运动增强后, 立即闭合二氧化碳气囊导管 待呼吸恢复正常后再做下一步实验 6. 观察注酸和补碱对呼吸运动和血气的影响 (1) 按 5ml/kg 体重耳缘静脉注入 120g/L NaH 2 PO 4, 注射速度控制在 5~6ml/min 内, 观察并记录呼吸变化 (2) 输完后 10 分钟, 由颈动脉取血 1.0ml, 测定 ph PaCO 2 [HCO 3] 和 BE 值 (3) 按补碱公式 x ( ml) = BE 体重 ( kg) / 2 用 50g/L NaHCO 3 耳缘静脉注射纠正酸中毒, 速度应控制在 4ml/min (4) 由耳缘静脉注入碳酸氢钠后 10 分钟再从颈总动脉取血 1.0ml 测定 ph PaCO 2 [HCO 3] 和 BE 值 并观察呼吸变化 7. 观察气道狭窄对呼吸运动和血气的影响 (1) 在 Y 形气管插管侧管上套上橡皮管, 并插二个 9 号针头, 然后把橡皮管另一端夹闭, 造成不完全窒息 8~10min, 观察并记录呼吸变化 (2) 待呼吸频率降至 40 次 /min 左右, 由颈动脉取血 1.0ml, 测定 ph PaCO 2 [HCO 3] 和 BE 值 抽血后立即解除窒息 8. 观察胸内负压 (1) 将连于水检压计长胶管上的粗注射针头, 在左腋前线第四 五肋间, 沿肋骨上缘垂直刺入胸膜腔内, 首先用较大力量穿透皮肤, 然后控制力量, 用手指抵住胸壁缓进以防刺入过深 当看到检压计水柱液面产生位差, 并且随呼吸运动而上下移动时, 说明针头已进入胸膜腔内, 即停止进针并固定于这一位置 (2) 观察检压水柱随呼吸运动而升降的幅度, 记下正常平静呼吸时胸内负压数值 此时呼气和吸气应均为负值 (3) 在气管插管一个侧管上接一根长胶管, 使呼吸运动加强 ( 用力呼吸 ), 记下此时胸内负压在呼气吸气时的变化情况 (4) 去除长胶管, 等待呼吸恢复正常 9. 观察一侧气胸对呼吸运动和血气的影响 : (1) 放开水检压计侧管橡皮管上的弹簧夹, 使胸膜腔负压消失, 此时检压计水柱随呼吸运动变化的幅度减小或消失 (2) 等 10~15 分钟, 观察呼吸频率及幅度, 并由颈动脉取血 1.0ml 测 ph PaCO 2 [HCO 3] 和 BE 值 10. 观察迷走神经在呼吸运动调节中的作用 (1) 分别观察和记录切断一侧迷走神经和切断两侧迷走神经以后呼吸运动的变化 (2) 以 5~10V, 频率为 15~30Hz, 波宽为 2ms 的连续电脉冲间断刺激一侧迷走神经中枢端观察呼吸运动改变 ( 刺激迷走神经强度要适中, 避免过强而发生屏气现象 ) 实验报告要求

385 1. 题目 2. 署名作者和合作者姓名及单位 3. 结构式摘要 ( 目的, 方法, 结果, 结论 ) 4. 材料和方法主要实验材料, 仪器装置连接和仪器参数 5. 观察项目和观察指标, 数据用 x±s 表示, 统计方法 6. 结果列各种因素处理前后吸气 呼气气道压力, 吸气 呼气时间, 呼吸频率及血气分析的原始数据表格, 并进行统计处理和显著性检验 用文字和数据 ( 包括显著性检验结果 ) 逐一描述实验结果 实验结果曲线剪贴并标注 7. 讨论分析和探讨各处理因素对呼吸运动 血液酸碱度的影响及机制 包括分析影响实验结果的主要干扰因素及改进方法 8. 参考文献 思考题 1. 家兔分别吸入高浓度 CO 2, 或 N 2 的空气后, 呼吸运动的有何变化? 2. 试比较吸入气中 CO 2 N 2 浓度增加, 家兔呼吸运动的频率和幅度变化的差异, 分别说明它们各通过何种途径发挥作用 3. 迷走神经是肺牵张反射的传入神经, 对照实验结果, 讨论切断迷走神经后及刺激迷走神经中枢端呼吸运动发生变化的机理 4. 注射 NaH 2 PO 4 为什么会引起动脉血血气酸碱度改变? 5. 为什么气道狭窄会引起呼吸运动和血气酸碱度改变? 6. 为什么气胸会引起呼吸运动和血气酸碱度改变? 7. 为什么气道狭窄和气胸会引起不同的呼吸运动和血气酸碱度的改变? ( 陆源夏强杨军 )

386 第九章 生理科学研究型实验 培养本科生科研能力 创新能力和实践动手能力是本科教学的一项基本任务 学校提倡实验教学与科研课题相结合, 将更多的实际问题引入教学实验, 开拓实验教学的新形式 新内容 生理科学实验课程是根据学校提出的教学要求开设的一门综合研究型课程, 研究型实验教学是本课程教学的核心内容, 其教学目的是为本科生提供科研训练的机会, 使学生了解生理科学实验科研领域, 接触学科前沿, 了解学科发展动态 ; 增强学生创新意识, 培养学生创新和实践动手能力 ; 加强合作交流, 培养团队协作精神, 提高学生综合素质 一 生理科学研究型实验教学程序 1. 校历春 秋学期第 1 周 : 课堂讲授实验研究 实验设计 文献检索等方面的基本知识, 学生通过课堂教学和自学方式, 学习和了解生理科学实验研究的基本程序及内容 2. 校历春或秋学期第 6 或第 7 周 : (1) 指导教师给学生开设研究型实验的专题讲座, 为学生提供研究型实验的方向和任务 ; 学生由教师指导在机能中心进行网上文献的初步检索和阅读 (2) 课后, 学生进一步进行文献检索和阅读, 以组为单位进行立题和实验设计 3. 校历春或秋学期第 7 或第 8 周 : (1) 举行研究型实验开题报告, 学生以组为单位进行立题及实验设计报告和答辩 (3) 课后, 学生对研究型实验和实验设计进行修改和完善 4. 校历夏或冬学期第 4~7 周 : (1) 课内时间进行实验预试和实验 必要时, 可利用晚上和假日进行实验 (2) 课外时间, 完成数据整理和统计, 论文撰写 5. 校历夏或冬学期第 8 周 : (1) 举行研究论文答辩, 学生以组为单位进行论文报告和答辩 (2) 课后, 完成论文的修改 6. 校历夏或冬学期第 9 周 : 提交研究论文 二 立题要求 1. 选择的研究项目要进行充分的文献调查, 项目科学, 方法可行, 有一定先进性或创新性 2. 根据机能中心的资源选择研究项目, 使研究项目切实可行 3. 研究项目要短小精悍, 观察指标不宜过多, 组数一般不超过 4 组, 每组例数家兔不超过 8 例, 其它每组例数一般不超过 10 例 4. 项目所用材料 ( 包括药品试剂 ) 费用不宜过高 5. 实验材料 ( 包括药品试剂 ) 用量要估算出一个上限

387 三 研究型实验教学内容 1. 研究型实验专题讲座一些研究领域的背景和动态, 有待解决或阐明的问题, 解决或阐明这些问题的意义 2. 文献检索和阅读文献数据库检索, 文献阅读要点 3. 立题研究型实验项目的科学性 可行性及项目的特色或创新性 3. 实验设计实验对象 观察指标 实验方法 实验分组 预期结果等 4. 开题报告报告立题和实验设计各项内容 5. 实验研究根据实验设计方案进行预实验并确定实验方案, 按正式方案进行实验和数据采集 要求对实验全过程进行规定项目的记录 6. 数据统计实验结果的整理和数据统计 7. 论文撰写按浙江大学学报 ( 医学版 ) 格式撰写论文, 达到生理科学实验研究论文的撰写要求 8. 论文答辩报告研究目的 方法 结果 讨论和结论 四 研究型实验教学要求 1. 采用研究导向式教学, 以学生为主角, 充分调动学生的积极性, 教师主要起引导作用 2. 培养学生严谨求实的科学态度和工作作风, 培养学生的创新精神和团队合作精神 3. 充分利用计算机多媒体技术和网络技术手段进行教学 研究型实验专题讲座 开题报告 论文答辩要求全部采用多媒体, 培养学生的组织资料能力 演讲能力和答辩能力 4. 营造浓厚的学术气氛 5. 开题报告前由学生选举 4 人, 加上教师 1 人组成答辩组, 答辩组组织开题报告 论文的答辩和评议, 答辩和评议须进行记录, 答辩结果作为评定成绩的一项参考内容 6. 教师要对每堂课的情况进行记录, 以作为设计 操作部分成绩评定的依据

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395 实验四免疫标记技术 免疫标记技术 (immunolabelling technic) 是指用放射性同位素 酶 荧光素 胶体金 化学发光物质或电子致密物质等标记抗体或抗原作为试剂, 检测标本中的相应抗原或抗体 本技术不仅特异 敏感和快速, 而且能定性 定量和定位, 是目前应用最广泛的免疫学检测技术 免疫标记技术一般分为两类 : 一类用于组织或其它标本中抗原或抗体的定位称为免疫组化技术 (immunohistochemical technique); 另一类用于体液标本中抗原或抗体的测定称为免疫测定 (immunoassay) 根据标记物质的不同, 免疫标记技术又可分为 : 酶免疫技术 荧光免疫技术 放射免疫分析技术 金免疫技术及化学发光免疫分析等 一 酶免疫技术 原理 酶免疫技术是一种把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用结合起来的方法 将酶与抗体或抗原用交联剂连接起来, 此种酶标记抗体或抗原可与组织内的或固相载体上的相应抗原或抗体发生特异性反应, 加入相应的酶底物时, 底物被酶催化生成有色产物, 根据成色深浅判定待测抗原或抗体的浓度与活性 酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两类, 前者用于组织切片上抗原的定性和定位 后者用于标本中抗原或抗体的测定, 最常用的方法是酶联免疫吸附试验 ( 一 ) 酶联免疫吸附试验 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) ELISA 双抗体夹心法测抗原 ( 检测人血清中乙型肝炎病毒表面抗原 HBsAg) 材料 1. 包被抗体 : 兔抗 HBsAg 抗体 2. 酶标抗体 : 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的小鼠抗 HBsAg 单克隆抗体 3. 待检标本 : 病人血清 4. 阳性对照 :HBsAg 阳性血清 5. 阴性对照 : 正常人血清 6. 其它试剂 : 包被缓冲液 ( 0.05molpH9.6 碳酸盐缓冲液 ); 封闭液 (1% 牛血清白蛋白 0.14mol NaCl 0.05mol ph8.0 Tris 缓冲液 ); 标本稀释液 (1% 牛血清白蛋白 0.05% 吐温 mol ph7.2 PBS); 洗涤液 (0.05% 吐温 mol ph7.2 PBS); 底物溶液邻苯二胺 (OPD 或四甲基联苯二胺 (TMB); 终止液 (2molH2SO4) 7. 聚苯乙烯酶标板, 塑料洗瓶或洗板机, 酶标仪, 微量移液器等 方法 1. 已知抗体包被酶标板 : 用包被缓冲液将兔抗 HBsAg 抗体稀释至工作浓度, 按每孔 100µl 包被酶标板,4 过夜 2. 洗板 : 弃去酶标板内的包被抗体, 在吸水纸上拍干, 孔内加满洗涤液, 静置 2~3min, 再在吸水纸上拍干, 如此洗涤 3 次 有条件此步骤也可用洗板机进行操作 3. 封闭 : 每孔加封闭液 200µl,37 湿盒 1 小时 4. 洗板 : 弃去封闭液, 按步骤 2 洗板三次 5. 加待检标本 : 取病人血清标本, 加于酶标板孔内, 每孔 100µl, 每份标本加 2 孔, 同时设阳性对照, 阴性对照和空白对照 置 37 湿盒 60min 6. 弃去酶标板内液体, 按步骤 2 洗板三次 7. 每孔加 100µl 酶标记抗 HBsAg 单克隆抗体, 置 37 湿盒 60min

396 8. 弃去酶标板内液体, 按步骤 2 洗板三次 9. 每孔加底物溶液 100µl,37 避光孵育 15min 10. 每孔加终止液一滴 ( 约 50µl), 终止反应 11. 观察显色反应或用酶标仪在 490nm 处用蒸馏水调零, 测定其 OD 值 结果 1.P/N 值 2.1 为阳性,2.1 P/N 值 1.5 为可疑,P/N<1.5 为阴性 P/N= 标本 OD 值 - 空白对照 OD 值阴性对照 OD- 空白对照 OD 值 2. 肉眼判断 : 反应孔呈棕黄色为阳性结果, 无色为阴性结果 注意事项 1. 包被缓冲液 洗涤液等, 可配成 10 倍浓缩的液体, 这样能减少配液次数, 方便平时使用, 同时也便于保存 2. 浓缩的试剂在使用前需用新鲜的蒸馏水或去离子水按要求稀释, 使用不合格的蒸馏水可 能使空白值增高 3. 存放在冰箱内的试剂, 在使用前应先恢复至室温 ( 一般在室温平衡 30min), 并检查试剂 各组分是否变质 ( 洗涤液 底物缓冲液等容易长霉菌 ) 4. 尽量避免标本溶血, 检测标本宜新鲜 若 5 天内检测, 可保存于 2-8, 超过一周时间 测定, 应于 -20 低温冻存 5. 反复冻溶会使抗体效价降低, 应尽量避免 6. 用封闭液封闭酶标板, 可降低本底 封闭是否必要, 取决于 ELISA 的模式及具体的实验 条件 并非所有的 ELISA 固相均需封闭, 封闭不当反而会使阴性本底增高 一般说来, 双抗体 夹心法, 只要酶标记物是高活性的, 操作时洗涤彻底, 不经封闭也可得到满意的结果 特别是 用单抗腹水直接包被时, 因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面, 实际已起到 了类似封闭剂的作用 但在间接法测定中, 封闭一般是不可少的 7. 每一洗板步骤一般为 3 次, 每次浸泡时间一般为 2~3min 洗板时需保证酶标板平放, 将洗涤液注满各孔, 但尽量避免洗涤液溢液现象, 洗板的液体残留量不宜过多, 洗完后, 应将 酶标板在吸水纸上轻轻拍干 8. 加样时避免样本溅出, 如有样本溅出孔外时, 应用吸水纸轻轻拭干, 并做相应记录 9. 空白对照不加样本, 其余步骤相同 10. 加样后酶标板应及时温育, 尽量缩短加样后温育前的等待时间 11. 保温容器最好是恒温水浴箱, 可使温度很快达到平衡 如使用孵箱或置室温, 为避免孔 内液体蒸发, 可用封板胶将 ELISA 板面密封后进行温育 温育时尽量少开启恒温箱门, 不能人 为缩短或延长温育时间 12. 底物溶液现配现用, 加底物应避光显色, 显色时间不要太长, 以免本底偏高 13. 加终止液后, 应在 2h 内比色测定 底物为邻苯二胺时用 490nm 波长比色 ; 底物为四甲 基联苯二胺时用 450nm 波长比色 14. 叠氮钠对辣根过氧化物酶的活性有明显的抑制作用, 在试验中应避免使用 ELISA 间接法测抗体 材料 1. 可溶性抗原 : 根据所测的蛋白浓度用 ph mol 碳酸盐缓冲液稀释至 1~10µg/ml 左右. 2. 酶标记抗人 IgG 3. 待检病人血清 4. 其它试剂 : 包被缓冲液 (0.01molpH9.6 碳酸盐缓冲液 ); 封闭液 (1% 牛血清白蛋白 ); 标

397 本稀释液 (1% 牛血清白蛋白 0.05% 吐温 molpH7.2 PBS); 洗涤液 (0.05% 吐温 molpH7.2 PBS); 底物溶液 ( 邻苯二胺或四甲基联苯二胺 ); 终止液 (2molH2SO4) 5. 酶标板 塑料洗瓶 微量移液器 吸水纸等 方法 1. 已知抗原包被酶标板 : 用包被缓冲液将已知可溶性抗原作适当稀释后, 用微量移液器每孔加入 100µl,4 过夜 2. 洗板 : 弃去酶标板内的包被抗原, 在吸水纸上拍干, 孔内加满洗涤液, 静置 2~3min, 再在吸水纸上拍干, 如此洗涤 3 次 3. 封闭 : 每孔加 1% 牛血清白蛋白 100µl,37 湿盒 1 小时 4. 洗板 : 同 2 5. 加待检病人血清 : 将待检病人血清用稀释液作不同倍数稀释, 如 1:20 1:40 1:80 每孔加入 100µl, 并设阳性血清对照 阴性血清对照和空白对照 置 37 湿盒孵育 2 小时 6. 洗板 : 同 2 7. 加酶标记抗人 IgG: 用稀释液将酶标记抗人 IgG 稀释至工作浓度, 每孔加 100µl, 置 37 湿盒孵育 2 小时 8. 洗板 : 同 2 9. 加底物溶液 : 每孔加临时配制的底物溶液 100µl, 置 37 湿盒孵育 20min 10. 终止反应 : 每孔加终止液 50µl 结果 肉眼观察判断, 滴度超过阴性血清对照的标本定为阳性 注意事项 1. 间接法成功的关键在于抗原的纯度 虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果, 但抗原纯度低, 不仅影响试验的特异性, 也大大降低试验的敏感性, 因此应尽可能予以纯化 2. 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性 IgG 病人血清中受检的特异性 IgG 只占总 IgG 中的一小部分 IgG 的吸附性很强, 非特异 IgG 可直接吸附到固相载体上, 有时也可吸附到包被抗原的表面 因此在间接法中, 抗原包被后一般用无关蛋白质 ( 例如牛血清蛋白 ) 再包被一次, 以封闭 (blocking) 固相上的空余间隙 3. 在检测过程中标本最好先行稀释 (1:40~1:200), 以避免过高的阴性本底影响结果的判断 4. 其余注意事项同双抗体夹心法 ELISA 竞争法测抗原 材料 1. 兔抗人白蛋白抗体 2. 酶标记人白蛋白 3. 人白蛋白标准参考品 4. 待检尿标本 : 收集晨尿, 离心取上清, 用 100g/L 磺柳酸作蛋白定性 若蛋白定性为阴性用原尿, 微量与 + 时作 1:10 稀释, ++ 时作 1:100 稀释 5. 其它试剂 : 包被缓冲液 ( 0.01mol ph9.6 碳酸盐缓冲液 ); 封闭液 (1% 牛血清白蛋白 ); 稀释液 (0.05% 吐温 molpH7.2 PBS); 洗涤液 (0.05% 吐温 molpH7.2 Tris-HCl 缓冲液 ); 底物溶液 (0.04% 邻苯二胺 ph5.0 柠檬酸缓冲液 ); 终止液 (2mol H2SO4) 6. 酶标板 塑料洗瓶 微量移液器 吸水纸等 方法 1. 已知抗体包被酶标板 : 用包被缓冲液将兔抗人白蛋白抗体稀释至工作浓度, 每孔加 100µl,4 过夜

398 2. 洗板 : 弃去酶标板内的包被液, 在吸水纸上拍干, 孔内加满洗涤液, 静置 2~3min, 再在吸水纸上拍干, 如此洗涤 3 次 3. 封闭 : 每孔加 1% 牛血清白蛋白 100µl,37 湿盒 1 小时 4. 洗板 : 同 2 5. 同时加待检尿液和酶标记人白蛋白各 50µl,37 湿盒孵育 2 小时 6. 洗板 : 同 2 7. 加底物溶液 : 每孔加新配制底物溶液 100µl,37 湿盒孵育 30min 8. 终止反应 : 每孔加终止液 50µl 10. 用酶标仪在 490nm 波长处测定光密度 11. 标准曲线的制作 : 将人白蛋白标准参考品自 20µg/ml 起作倍比稀释至 µg/ml, 同上法操作 以光密度值为纵坐标, 人白蛋白含量为横坐标, 绘制标准曲线 结果 由标准曲线将光密度值换算得人白蛋白含量, 并乘以相应的稀释倍数, 即为待检尿白蛋白含量 正常范围 :<0.3~26.0µg/ml 注意事项 1. 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点, 因此不能用双抗体夹心法进行测定, 可以采用竞争法模式 其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合 标本中抗原量含量愈多, 与固相抗体结合的酶标抗原愈少, 最后的显色也愈浅 本法常用于小分子激素 药物等测定 2. 其他注意事项同上 ( 二 ) 酶免疫组织化学技术 PAP 法 ( 可溶性酶抗酶法 ) 应用免疫学及组织化学原理, 对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性 定位或定量研究的免疫组织化学技术以其特异性强 灵敏度高等显著特点, 现今已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域 免疫组织化学技术按标记物质的种类可分为免疫荧光法 放射免疫法 酶标法和免疫金银法等 ; 按染色步骤可分为直接法 ( 又称一步法 ) 和间接法 ( 二步 三步或多步法 ), 与直接法相比, 间接法的灵敏度要高许多 ; 按结合方式可分为抗原 抗体结合法 ( 如过氧化物酶 - 抗过氧化物酶法 PAP 法 ) 和亲和连接法 ( 如卵白素 - 生物素 - 过氧化物酶复合物法 ABC 法 链霉菌抗生物素蛋白 - 过氧化物酶连结法 SP 法等 ) 免疫组织化学技术除了特异性强 敏感性高 定位准确外, 还同时能对组织或细胞进行形态与功能相结合的研究 免疫组织化学在生物学和医学领域主要用于确定细胞类型 辨认细胞产物 了解分化程度 鉴定病变性质 发现微小转移灶 探讨肿瘤起源或分化表型 确定肿瘤分期 指导治疗和预后 辅助疾病诊断和分类及寻找感染病因等研究 原理 先将过氧化物酶 (P) 免疫家兔, 制成抗过氧化物酶抗体 (AP), 然后将 P 与 AP 结合成 PAP 同时用家兔免疫制备抗已知组织抗原的相应抗体 ( 第一抗体,Ab 1 ) 用羊制备羊抗兔 Ig 的抗体 ( 第二抗体,Ab 2 ) 操作时按此程序进行: 组织切片 ( 含待检抗原 )+ Ab 1 + Ab 2 + PAP + 底物显色 即可检获组织切片中的抗原 材料 1. 组织切片 ( 冰冻切片或石蜡切片 ) 2. 第一抗体 3. 第二抗体 ( 羊抗兔 Ig 血清 )

399 4. PAP( 过氧化物酶 抗过氧化物酶复合物 ) 5. 其它试剂 : 正常羊血清,0.1mol ph 7.4 PBS,0.05 mol ph 7.6Tris-HCl 缓冲液,3%H 2 O 2, 0.1% 胰酶 ( 用 ph % 氧化钙溶液配制 ), 新鲜配制的 0.05% H 2 O 2 DAB(3.3- 二氨基联苯胺 )[ 称取 DAB 1.0~1.5mg, 加于 0.05mol ph 7.6Tris-HCl 缓冲液 5ml 中, 避光溶解, 用前加入 H 2 O 2 ], 苏木精, 丙酮, 乙醇, 二甲苯等 6. 孵箱, 湿盒 方法 1. 冰冻切片 ( 应贴附牢固 ), 吹干后固定 ( 冷丙酮固定 5min, 或 95% 乙醇固定 10min),PBS 洗三次 石蜡切片应先经二甲苯脱蜡 2 次, 无水乙醇洗 2 次, 每次 5min 逐级乙醇下至 PBS 2. 封闭内源性过氧化物酶用新配制的 3% H 2 O 2 处理标本 5~10min( 或 0.5% H 2 O 2 甲醇液处理 30min) 再经纯乙醇逐级下行至 PBS, 后法对冰冻切片欠佳 3. 用 PBS 充分清洗 2 次, 约 20min 4. 如系石蜡切片, 应用胰蛋白酶消化切片, 以消除甲醛固定所致的掩盖作用 方法为取 0.1% 胰酶溶液滴加于切片上, 置 37 15~60min 5. PBS 洗 3 次, 每次 5min 6. 滴加 1 10 稀释的正常羊血清, 置湿盒室温 10min 弃血清液, 紧接下步 7. 滴加稀释的第一抗体, 置湿盒 1 小时 8. PBS 洗 3 次, 每次 5min 9. 滴加稀释的第二抗体, 置湿盒 37 孵育 30min 10. PBS 洗 3 次, 每次 5min 11. 滴加合适滴度的 PAP, 置湿盒 37 孵育 30min 12. PBS 洗 10min, 再用 0.05 mol ph 7.6Tris-HCl 缓冲液洗 10min 13. 滴加 0.05% H 2 O 2 的 DAB, 室温下作用 5~10min, 镜下监测显色 14. Tris-HCl 缓冲液洗 3 次, 再用水洗 15. 苏木精复染 16. 则切片经过梯度酒精脱水干燥, 二甲苯透明, 中性树胶封固 结果 显微镜下观察, 抗原阳性部位呈棕黑色 注意事项 1. 及时取材和固定 组织标本及时取材和固定是有效防止组织自溶坏死, 抗原丢失, 做好免疫组化染色的关键步骤 因此, 离体组织应尽快的进行取材, 最好 2h 内, 取材时所用的刀应锐利, 要一刀下去切开组织, 不可反复切拉组织, 造成组织的挤压, 组织块大小要适中, 一般在 2.5cm 2.5cm 0.2cm, 切记取材时组织块宁可面积大, 千万不能厚的原则,( 也就是说组织块的面积可以大到 3cm 5cm, 但组织块的厚度千万不能超过 0.2cm, 否则将不利于组织的均匀固定 ), 以便固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白在尽可能短的时间内迅速凝固, 从而完好的保存抗原和组织细胞形态 2. 对于固定液的选择, 原则上应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液, 但除非是专项科研项目, 在病理常规工作很难做到这一点, 因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规 HE 病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化染色 HE 染色的常规组织固定液是 10% 的中性缓冲福尔马林或 4% 缓冲多聚甲醛, 它的特点是渗透性强, 对组织的作用均匀 组织固定时间最好在 12h 内, 一般固定时间不应超过 24 小时 随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低 3. 组织经固定后进行脱水 透明 浸蜡和包埋, 应掌握的原则是脱水透明要充分但不能过, 浸蜡时间要够, 温度不能高, 否则造成组织的硬脆使组织切片困难, 即使能切片, 由于组织的硬脆, 也使切片不能完好平整, 染色过程中极易脱片, 对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利, 所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长, 正常大小的组织无水酒精脱水 1h 3 次,

400 二甲苯透明 1h 2 次即可, 浸蜡及包埋石蜡温度不要超过 免疫组化所检测的抗原是多样性的, 染色操作程序复杂, 时间较长, 有些抗原还需进行各种修复处理, 如微波 高压 水溶酶等, 玻片如果得不到很好的处理, 将易造成脱片, 因此, 在免疫组化实验前应对清洗干净的载玻片作适当粘合剂处理以防脱片 (1)Poly-L-Lysine ( 多聚左旋赖氨酸 ) 一般采用分子量 左右的 0.5% 多聚左旋赖氨酸为最佳 方法是将玻片浸泡其中, 倾尽余液, 在 60 温箱中烤干备用, 此方法的优点是可以用于多种组织化学 免疫组化及分子学检测中的应用, 粘贴效果最好, 但价格稍贵 (2) 明胶硫酸铬钾法将 2.5g 明胶加热溶于 500ml 蒸馏水中, 完全溶解冷却后加入 0.25g 硫酸铬钾搅匀充分溶解, 然后将玻片浸泡其中 2 min, 取出倾尽液体, 置温箱中烤干备用 此法价格便宜 方法简单, 任何实验都可以使用, 特别适用于大批量的使用, 但应注意, 如果液体变蓝或粘稠状应停用 (3)APES (3- 氨丙基 - 乙氧基甲硅烷 ) 此法必须现用现配 将洗净玻片入 1:50 丙酮稀释的 APES 中, 浸泡 20s, 取出稍停再入丙酮或蒸馏水中刷去末结合的 APES 晾干即可 用此方法粘合的玻片应垂直烤片不能平拷, 否则组织片中易出现气泡 5. 在一些生物体组织中, 其自身含有一定量的内源性酶, 这些酶同样也能催化底物, 使其显色, 从而影响免疫组化的特异性, 因此在试验过程中要去除这些内源性酶, 以保证免疫组化染色在特异性情况下进行 6. 组织切片中高度荷电的胶原和结缔组织成分很容易吸附抗体, 而使背景出现着色, 为了防止这种现象, 最好用特异性抗体来源的同种动物灭活的非免疫血清预先处理组织切片, 以封闭荷电点, 不让一抗与之结合, 但这种方法一般实验室很难实现, 因而, 实际常见的是 2%~10% 羊血清或 2% 牛血清白蛋白在室温下作用 10~30min 即可, 但应注意此种结合是不牢固结合, 所以最好不要冲洗, 倾去余液直接加一抗, 对于多克隆抗体来讲, 易产生背景着色, 在稀释特异性抗体时可采用含 1% 非免疫血清的 ph7.4 的 PBS 液 7. 部分组织细胞在甲醛固定过程中, 形成醛键或保存的甲醛会形成羧甲基而封闭部分抗原决定簇, 从而使免疫组化敏感性明显降低, 因此, 在染色时, 有些抗原需先进行修复或暴露, 修复方法有化学法和物理法 化学法常用胰蛋白酶或胃蛋白酶消化的方式对抗原进行修复, 物理法常用单纯加热 微波处理和高压加热对抗原进行修复 8. 免疫组化最后的关键是显色, 一般辣根过氧化物酶 (HRP) 选用 DAB 或 AEC 显色系统进行显色 但要得到最佳的显色效果, 必须在镜下严格控制, 以检出物达到最强显色而背景无色为最终点, 尤其 DAB 显色时间短着色浅, 时间长背景又深, 这势必将影响结果判断 根据经验 DAB 在配制完后最长宜放置 30min 以内, 过时不能使用 DAB 加到组织切片时作用时间最长不宜超过 10min( 最好在 5min 内 ), 否则不管有无阳性都应终止反应 对一些含有内源性酶较高的组织用 DAB 显色时极易出现背景色, 因此, 更应尽早在镜下控制, 以达到最佳的分辨效果 ( 棕色 ) AEC 显色系统 ( 红色 ) 的弊端是易溶于有机溶剂, 所以封片时应以水性封片剂为主, 同时染色的切片也不能久存 如果是碱性磷酸酶 (AP) 最好选用 NBT/BCIP 作为显色系统 ( 结果染为蓝黑色 ) 二 荧光免疫技术 荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种 用荧光物质标记抗体而进行抗原定位的 技术称为荧光抗体技术 (fluorescent antibody technique), 利用荧光抗体可直接或间接检测抗原 与酶免疫技术和放射免疫分析一样, 荧光免疫技术在科研和临床检验中应用非常广泛

401 ( 一 ) 直接 ( 或间接 ) 荧光免疫法检测标本片中的抗原 原理 基本原理是将荧光素, 如异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) 或罗丹明 (lissamine rhodamlne B200, RB200) 与某些特异性抗体 ( 或抗原, 但少用 ) 以共价键结合, 但不影响该抗体的免疫特性 然后将此荧光素标记的抗体染色标本, 如标本中有相应抗原, 则荧光标记抗体与抗原结合形成复合物, 在紫外光或激光的照射下, 复合物中的荧光素发出荧光, 借助荧光显微镜就能观察到该抗原的定位情况 材料 1. 待检标本 : 如组织切片 细胞涂片 细菌涂片等 2. 特异性抗体 3. 荧光素标记的抗抗体 ( 直接法只需荧光素标记的特异性抗体 ) 4. ph 7.4 PBS. 方法 1. 标本片制备 (1) 载玻片的处理 : 取新载玻片依次用洗衣粉溶液浸泡流水冲洗清洁液浸泡流水冲洗蒸馏水冲洗 1 遍 95% 乙醇过一遍烘干 ( 晾干 ) (2) 根据实验目的不同制备各种标本片 (3) 标本固定 : 蛋白质抗原常用丙酮 无水乙醇或四氯化碳等室温固定 3~10min, 或 4 固定 30min; 多糖抗原用丙酮或甲醇固定, 室温 5~10min 或 4 30~60min; 类脂抗原用 10% 甲醛室温固定 3~10min 标本固定后需立即以冷 0.01mol ph 7.4PBS 浸洗 3 次, 每次 3min, 然后晾干待用 2. 染色方法 (1) 直接法将荧光抗体滴加于已固定的标本上, 置湿盒内,37 染色 30~60min 取出后先用 ph7.4 PBS 轻轻冲洗, 再连续通过 3 缸 PBS 浸洗, 每次 5min 取出后流水冲去 PBS 后吹干待检 (2) 间接法于固定的标本上先滴加已知抗体, 置 37 湿盒内 30min, 用 ph 7.4 PBS 轻轻冲洗后连续通过 3 缸 PBS 浸洗, 每次 5min 再于标本片上滴加荧光素标记的抗抗体, 置 37 湿盒内 30min, 同法浸洗后吹干待检 3. 封片于已染色的标本片上滴加缓冲甘油 ( 甘油 1 份 0.01mol ph 7.4 PBS 1 份 ) 一滴, 盖上盖玻片 封片后可降低荧光素的光致猝灭 结果 荧光显微镜下所观察到的荧光图象, 主要以两个指标判断结果, 一是形态学特征, 二是荧光强度, 必须将二者结合起来综合判断 根据特异性荧光强度用 表示, 无特异性荧光记 - 特异性荧光呈黄绿色 注意事项 1. 载玻片厚度应在 mm 之间. 太后的玻片, 一方面吸光太多, 另一方面不能使激发光在标本上聚焦 载玻片必须光洁, 厚度均匀, 无明显自发荧光, 在使用必须彻底清洗, 必要时还应作处理 2. 盖玻片厚度应选择 0.17mm 左右, 光洁 为加强激发光, 也可以用干涉盖玻片, 这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质 ( 如氟化镁 ) 的盖玻片, 它可以使荧光顺利透过, 而反射激发光, 这种反射的激发光又可以激发标本

402 3. 组织切片或其他标本不能太厚, 如太厚激发光大部分消耗在标本下部, 而物镜直接观察到的上部为充分激发 另外, 细胞组织重叠或杂质会掩盖荧光, 影响判断 4. 染色反应最好在湿盒内进行, 以免标本上试剂干燥 染色试剂的干燥是造成非特异性染色反应的原因之一 5. 染色反应的酸碱度以接近体液环境为宜 (ph7.4 左右 ), 因此, 切片冲洗液及抗体稀释液均应注意酸碱度的调整 6. 组织细胞要求新鲜, 最好使用冷冻切片, 固定存档标本要求组织结构完好 7. 切片经染色后, 应及时观察并照相, 不宜长期保存, 以免褪色 切片在 4 冰箱内过夜, 其荧光强度将减弱约 30% 8. 抗体稀释度以获得最佳染色效果, 背景非特异性染色最小为标准, 因此对每一批抗体必须试验摸索, 找出最佳稀释度 9. 为防止抗体效果下降, 所购抗体应及早试验, 并应尽量减少抗体溶液的冻融次数 10. 若非特异性染色过强时, 在染色反应前应先将荧光抗体离心, 去除沉淀物后再使用 11. 观察标本最好在暗室中进行, 尤其是荧光强度不高的标本 同时防止紫外线对眼睛的损伤, 在调整光源时应戴上防护眼镜 12. 观察时间以每次 1~2h 为宜, 超过 90min, 超高压汞灯发光强度逐渐下降, 荧光减弱, 标本受紫外光照射 15min 后, 荧光也明显减弱. 所以最多不得超过 2~3h. 13. 荧光显微镜光源寿命有限, 标本应集中检查, 以节省时间, 保护光源, 灯熄灭后欲再使用时, 须待灯泡充分冷却后才能点燃, 同一天中应避免数次点燃光源 14. 荧光显微镜所看到的荧光图像, 一是具有形态学特征, 二是具有荧光的颜色和亮度 在判断结果时, 必须将二者结合起来判断 结果记录根据效果指标, 即凭工作者目力观察, 作为一般定性观察, 基本上是可靠的, 随着科学技术的发展, 在不同程度上采用客观指标记录判断结果, 如用细胞分光光度计, 图像分析仪等仪器, 但这些仪器记录的结果, 也必须结合主观的判断 15. 保存荧光抗体一要防止抗体失活, 二是防止荧光素不脱落和不受激发猝灭 一般认为 0~4 可保存 1~2 年,-20 可保存 3~4 年 宜小量分装, 禁止反复冻融 保存前需加防腐剂 ( 一般加入浓度 1:5000~1:10000 的硫柳汞或 1:1000~1:5000 叠氮钠防腐 ) 真空干燥后更易长期保存 16. 荧光亮度的判断一般分四级 :"-" 无或可见微弱荧光,"+"----- 仅见明确可见的荧光, "++" 可见明亮的荧光,"+++" 可见耀眼的荧光 ( 二 ) 间接荧光免疫法检测人外周血中 T 淋巴细胞亚群 原理 人外周血中的 T 淋巴细胞, 根据表面 CD 分子可将其分为两大群 :CD4 + T 细胞和 CD8 + T 细胞 当小鼠抗人 CD4( 或 CD8) 单克隆抗体 ( 一抗 ) 加到淋巴细胞悬液中时, 表面有 CD4 抗原的淋巴细胞与一抗结合, 再加入荧光素标记的抗小鼠 IgG Fc 段抗体 ( 二抗 ) 后, 二抗就与一抗 Fc 段结合, 这样形成 CD4 + ( 或 CD8 + )T 细胞 +CD4 单克隆抗体 + 荧光抗体组成的免疫复合物, 在紫外光或激光的照射下, 复合物中的荧光素发出荧光, 借助荧光显微镜就能计数出 CD4 + ( 或 CD8 + )T 细胞的百分率 材料 /ml 淋巴细胞悬液 ( 人外周血淋巴细胞分离技术见实验七 ) 2. CD 4 及 CD 8 单克隆抗体 : 临用前按使用说明书将冻干粉溶解后立即分装成小剂量保存于 -20 以下备用 试验时按其效价用含 0.1% 牛血清白蛋白 ( 或 2% 小牛血清 ) 和 0.1%NaN 3 的 Hanks 液 ( 或 PBS, 或 RPMI1640) 稀释 如一次用不完, 可贮于 4 冰箱内 1~2 周 3. FITC 标记的抗鼠 IgG: 临用时取需要量按效价进行稀释, 稀释液为含 0.1% NaN 3 和 2%

403 小牛血清的无 Ca ++ Mg ++ Hanks 液 4. 小牛血清 无 Ca ++ Mg ++ Hanks 液 10% NaN 3 5. 水平离心机 荧光显微镜等 方法 1. 试验组 : 于小塑料离心管中加入淋巴细胞悬液及 CD 4 ( 或 CD 8 ) 单克隆抗体各 50µl, 混 匀, 置 4 冰箱内 30min 用含 2% 小牛血清 0.1% NaN 3 的无 Ca ++ Mg ++ Hanks 液洗离心 3 次, 每次 1000rpm 5min 再加 FITC 标记的抗鼠 IgG50µl, 置 4 冰箱内 30min, 同法洗涤 3 次, 弃上清, 用无 Ca ++ Mg ++ Hanks 液悬浮至原量, 取一滴于玻片上, 加盖玻片在荧光显微镜下镜 检 2. 阴性对照组 : 淋巴细胞悬液 50µl, 加无活性的单克隆抗体 3. 阳性对照组 : 淋巴细胞悬液 50µl, 加抗 HLA A B C 重链的单克隆抗体 4. 镜检 : 先用普通光计数视野中的淋巴细胞数, 然后挡住普通光, 改用紫外光计数同一视 野中有荧光的细胞数 结果 共计数 100~200 个淋巴细胞 ( 总数 ), 根据其中有荧光的细胞数目, 计算荧光阳性细胞的百 分数 细胞团块及死细胞不计数 阴性对照组应无荧光阳性细胞或只有 5% 以下非典型荧光阳性细胞 阳性对照组荧光阳性细胞应在 95% 以上, 常为 100%, 且荧光较强 正常人外周血中 CD4 + T 细胞和 CD8 + T 细胞占总淋巴细胞的百分率分别为 50~60% 和 20~25%, 在大多数组织中,CD4 + T 细胞与 CD8 + T 细胞的比值为 2 1 注意事项 1. 在离心洗涤过程中要防止淋巴细胞丢失 2. 其余事项见直接荧光免疫法 三 金免疫技术 胶体金是由金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液, 这种金颗粒呈红色, 并能与蛋白质等大分子物质结合, 因此, 可用胶体金作为标记物来检测标本中的抗原或抗体 典型的测定方法有斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等 胶体金技术具有简便 快速等优点, 目前广泛应用于临床实验室诊断 ( 一 ) 胶体金的制备 原理 在一定浓度的金溶液中加入一定量的还原剂, 使金离子被还原成一定大小的金原子 常用的还原剂有柠檬酸钠 鞣酸 抗坏血酸 白磷 硼氢化钠等 下面介绍最常用的柠檬酸三钠还原法 材料 1. 清洁玻璃容器 : 烧杯 量筒 吸管等 2. 双蒸水或三蒸水 3. 1% 氯金酸 (HauCl 4 ): 将 1g HauCl 4 一次性溶解于 100ml 双蒸水或三蒸水中 置 4 保存可稳定数月不变 4. 1% 柠檬酸三钠 : 将 1g 柠檬酸三钠溶解于 100ml 双蒸水或三蒸水中 现用现配 5. 电炉等 方法 1. 取 0.01%HauCl 4 水溶液 100ml 加热至沸

404 2. 根据所需胶体金颗粒的大小, 量取一定量的 1% 柠檬酸三钠水溶液 柠檬酸三钠用量与胶体金颗粒直径的关系见表 边煮沸, 边搅拌, 并一次性准确地加入所需 1% 柠檬酸三钠水溶液, 继续煮沸 15~30min ( 金黄色的氯金酸水溶液在 2 分钟内变为紫红色 ), 冷却后以蒸馏水恢复至原体积 4. 如需要防腐则加叠氮钠至 0.02%, 置 4 保存备用 注意事项 1. 所用的玻璃器皿必须清洁, 表面有少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成, 因此玻璃容器在用前必需认真清洗, 最好进行硅化 硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于 5% 二氯二甲硅烷的氯仿溶液中 1 分钟, 室温干燥后蒸馏水冲洗, 再干燥备用 专用的清洁器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面, 弃去后以双蒸馏水淋洗, 可代替硅化处理 2. 试剂 水质和环境 : 氯金酸极易吸潮, 对金属有强烈的腐蚀性, 不能使用金属药匙, 避免接触天平称盘 其 1% 水溶液在 4 可稳定数月不变 实验用水一般用双蒸馏水 实验室中的尘粒要尽量减少, 否则实验的结果将缺乏重复性 3. 金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞, 故不能用 ph 电极测定金溶液的 ph 值 表 4-1 柠檬酸三钠用量与胶体金颗粒直径的关系 0.01%HauCl 4 水溶液 (ml) 1% 柠檬酸三钠 胶体金直径 (nm) ( 二 ) 免疫金的制备 原理 当溶液的 ph 值等于或略高于蛋白质等电点时, 蛋白质呈电中性, 此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小, 但蛋白质分子的表面张力却最大, 处于一种微弱的水化状态, 易于吸附在金颗粒的表面, 由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面, 形成一个蛋白层, 阻止了胶体金颗粒的相互接触, 而使胶体金处于稳定状态 如果 ph 值低于蛋白质的等电点时, 蛋白质带正电荷, 胶体金带负电荷, 二者极易静电结合形成大的聚合物 如果 ph 值高于蛋白质的等电点, 蛋白质带负电荷, 与金颗粒的负电荷相互排斥而不能相互结合 材料与方法 1. 待标记蛋白的准备 (1) 透析除盐 : 盐类成分能影响金颗粒对蛋白质的吸附, 并可使溶胶聚沉, 因此, 在标记前应先对双蒸水或极低离子强度的盐水 (0.005mol/L NaCl,pH7.0) 作透析 (2) 去除蛋白质中的沉淀 : 长期低温保存的蛋白质或 4 较长时间保存的抗体, 特别是在浓度高于 2mg/ml 的情况下, 很容易形成聚合物, 聚合物对标记过程及免疫金的稳定性有一定影响, 因此, 在标记前须离心除去这些聚合物 一般以 rpm 低温离心 60min 取上清液, 调整蛋白浓度至 1mg/ml 即可用于标记 2. 蛋白质最适用量的选择 : 将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后, 分别取 0.1ml( 含蛋白质 5~40ug) 加到 1ml 胶体金溶液中, 另设一管不加蛋白质的对照管,5 分钟后加入 0.1ml 10 %NaCl 溶液, 混匀后静置 2 小时, 不稳定的胶体金将发生聚沉, 能使胶体金稳定的最适蛋白量

405 再加 10% 即为最佳标记蛋白量 3. 标记 : 在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是最合适的, 在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大 (1) 用 0.1mol/L K 2 CO 3 或 0.1mol/L HCl 调节胶体金至所需 ph (2) 在磁力搅拌下,100ml 胶体金中逐滴加入最佳标记量的蛋白质溶液 ( 体积为 2~3 ml),1mg 的蛋白质大约 5min 加完 (3) 在磁力搅拌下加入 5%BSA 使其终浓度为 1%, 或加入 3%PEG20000 溶液使其终浓度为 0.05% (4) 于 10000~100000g 离心 30~60 分钟 ( 根据粒径大小选择不同离心条件 ), 小心吸去上清液 ( 切忌倾倒 ) (5) 将沉淀悬浮于一定体积含 1%BSA 或 0.2~0.5mg/ml PEG20000 的缓冲液中, 离心沉淀后, 再用同一缓冲液恢复, 浓度以 A1cm/540nm=1.5 左右为宜, 以 0.02%~0.05% 叠氮钠防腐, 置 4 保存 (6) 标记后的的胶体金也可浓缩后于 Sephadex G-200 柱进行凝胶层析分离纯化, 以含 0.1 %BSA 的缓冲溶液洗脱 通常用 IgG 标记的胶体金洗脱液 ph 为 8.2, 以 A 蛋白标记的胶体金洗脱液为 ph7.0 注意事项 1. 以上操作中应注意, 一切溶液中不应含杂质微粒, 可用高速离心或微孔滤膜预处理 2. 标记后的胶体金溶液在 4~10 贮存数月有效, 不宜冰冻 3. 贮存中可能会发生程度不同的凝聚, 可低速离心除去 四 放射免疫技术 放射免疫分析技术 (radioimmunoassay, RIA) 是将放射性同位素标记物显示的高灵敏性和抗原抗体反应的高度特异性相结合的标记免疫分析技术, 用于定量测定受检标本中的抗原 最初建立的方法模式是以同位素标记的抗原与受检标本中的抗原竞争结合一定量的抗体 其后又发展了以同位素标记抗体直接检测抗原的测定模式, 为区别于前者, 称为免疫放射技术 (immunoradiometric assay) 两种方法均在医学检验中得到了广泛的应用 原理 本实验以竞争法测抗原 取定量的已知抗体, 与一定量的标记抗原和递增的未标记抗原共同孵育, 然后将标记的和未标记的抗原与抗体形成的免疫复合物 (B) 与游离的标记和未标记的抗原 (F) 分开, 测定 B 和 F 的放射活性, 绘制 B/F 对抗原量的标准曲线 未知样品中的抗原量同法操作计算, 即可从标准曲线查得含量 材料 HCG 放射免疫快速测定试剂盒 方法 1. 按表 4 2 顺序加样, 检测待检血清中 HCG 含量 表 4 2 HCG 放射免疫快速测定操作顺序 HCG 标准液 (ng/ml)

406 加样顺序 测定管 HCG 参考标准 (ml) 待测血清 (ml) 0.1 抗 HCG 血清 (ml) I HCG(ml) 混匀置 37 水浴 150min 第二抗体 (ml) 混匀, 置 37 水浴 30min,3000rpm 离心 15min, 测定各管总 CPM( 脉冲数 ) 和沉淀 CPM, 计算平均 B/F 值 结果 将 HCG 标准管的 B/F 值为纵坐标,HCG 含量为横坐标, 绘制标准曲线 根据待测样品 B/F 值查标准曲线, 即可得出 HCG 含量 注意事项 严防同位素污染, 操作人员必须穿工作衣, 戴口罩 帽子 手套 必须在严密的通风橱或 通风超净台中操作 操作前后对实验室环境进行监测 所用 I 和标记物应妥善保管 实验五免疫印迹 免疫印迹 (western blotting) 是将 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合的一项检测蛋白质的技术 免疫印迹包括 :1 蛋白质的电泳分离 ;2 将蛋白质从凝胶中转印至膜上以及封闭固相膜上未吸附蛋白质位点 ;3 免疫学检测 免疫印迹的高利用率 分辨率和灵敏度, 使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一 蛋白质的电泳分离 一 样本的制备 由于样本种类繁多, 处理的方法也有所不同, 可根据细胞的类型和待测抗原的性质, 选择理想的处理方法 ( 一 ) 细菌表达蛋白质和样本制备 材料 (1) 表达待检测蛋白质的细菌 (2)50mmol/L Tris-HCl(pH7.4) (3)2 SDS 凝胶加样缓冲液 100mmol/L Tris-HCl(pH6.8) 200mmol/L 二硫苏糖醇 (DTT) 4% SDS( 电泳级 ) 0.2% 溴酚蓝 20% 甘油

407 (4) 台式离心机 (5) 超声破碎仪 (6) 水浴箱 (7) 涡漩振荡器 (8) 加样器与吸头等 方法 (1) 表达靶蛋白大肠杆菌经诱导适当时间后, 用微量离心机以 g 离心 30s, 收集 1ml 培养的菌体 (2) 吸取培养液, 加入 0.5ml 用冰预冷的 50mmol/L Tris-HCl(pH7.4), 振荡沉淀的菌体, 使之复悬, 用微量离心机于 0 以 g 离心 30s 回收菌体 (3) 再次吸出上清液, 小心地吸净管壁上的液滴, 尽可能使沉淀物不带有残留液体 (4) 加入 25µl 水, 振荡使沉淀复悬, 一旦菌体分散开来, 立即加入 25µl 2 SDS 凝胶加样缓冲液, 继续振荡 20s (5) 样品在沸水浴中放置 5min (6) 采用带有浸入尖头或能在冷却怀中同时处理多个样品的超声处理仪对 DNA 进行剪切, 根据所用超声处理仪的输出功率及其设定状态, 以最大功率处理 0.5~2min 应能有效地将裂解液粘度降至可控水平 ; (7) 样品于室温以 g 离心 10min, 将上清液移至另一管中, 弃沉淀物 ; (8) 吸取经剪切或超声处理的样品 25µl 电泳, 剩余样品保存于 -20 备用 ( 二 ) 哺乳动物细胞和组织的样本制备哺乳动物细胞和组织有单层培养细胞 悬浮培养细胞和组织碎片, 虽然均可采用凝胶加样缓冲液裂解的方法来制备样本, 但制备方法有所差异 1. 对单层细胞的处理 材料 (1) 磷酸缓冲盐溶液 (PBS) (2)1 SDS 凝胶加样缓冲液 (3) 水浴箱 (4) 吸管 细胞刮棒等 方法 (1) 用磷酸缓冲盐溶液 (PBS) 漂洗细胞 2 次, 弃去洗液并吸净残余的 PBS 液体 (2) 如直径为 90mm 的平皿, 则加入 100~200µl 加热到 85 的 1 SDS 凝胶中样缓冲液溶解细胞, 用细胞刮棒把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中 2. 对悬浮培养细胞和组织碎片的处理 材料 (1) 悬浮缓冲液的配制 : 0.1mol/L NaCl 0.01mol/L Tris-HCl(pH7.6) 0.001mol/L EDTA(pH8.0) 1µg/ml Aprotinin 100µg/ml 苯甲基磺酰氟 (PMSF) (2)2 SDS 凝胶加样缓冲液 (3) 台式离心机 (4) 吸管或真空抽吸装置 (5) 加样器和吸头等 方法

408 (1) 取 1g 组织或 10 9 细胞, 加 1ml 冰预冷的悬浮缓冲液分散细胞或组织碎片 (2) 于 4 以 3 000g 离心 5min, 估算离心管底部沉淀物的体积 (3) 吸出上清液, 用连接于抽真空装置的一次性使用吸头把管壁上的液滴吸净 (4) 尽快加入等体积的 2 SDS 凝胶加样缓冲液 注意事项 PMSF 严重损害呼吸道粘膜 眼睛及皮肤, 一旦眼睛或皮肤接触了 PMSF, 应立即用大量水冲洗之, 凡被 PMSF 污染的衣物应予丢弃 PMSF 在水溶液中不稳定, 应在临用前从储存液中现加于裂解缓冲液中 ( 三 ) 免疫沉淀蛋白的样本制备一般情况下, 粗提样品无需进一步纯化即可直接进行凝胶电泳 对含量极稀少蛋白的检测, 可采用标准的免疫沉淀技术纯化和浓缩待测蛋白 材料 (1) 样品缓冲液 Tris/Glycine SDS-PAGE 样品缓冲液是 :2% SDS,100mmol/L DTT( 取自 -20 存放的 1mol/L 贮存液, 临用前加入 ),60mmol/L Tris(pH 6.8),0.01% 溴酚蓝和 10% 甘油 (2) 水浴箱 (3) 加样器和吸头等 方法 (1) 将样品缓冲液加入吸附有抗原和抗体, 并经过洗涤的 A 蛋白或 G 蛋白微珠中 使样品缓冲液和微珠的体积比率至少为 2:1~5:1 左右更好, 但一般不超过 10:1 (2) 样品置 70 水浴加热至少 5min 除特殊情况外, 在凝胶内加样之前不必去除微珠 (3) 样品既可立即使用也可冻存 -20 存放的样品可稳定保存数月 注意事项 (1) 对照设置 : 实验对照的设置应包括能与免疫抗体共沉淀的样品和能与非免疫抗体共沉淀的样品 通过两者比较可以鉴别抗体所形成的特异性条带和非特异性条带 (2) 将免疫沉淀制备的蛋白用于免疫印迹时, 来自免疫沉淀的抗体会出现在印迹膜上 该抗体可被二抗试剂检出 有两种解决办法 : 一是可将免疫沉淀抗体共价结合在 A 蛋白或 G 蛋白微珠上 ; 其二是采用直接检测技术进行测定 二 蛋白质凝胶电泳 Tris/Glycine SDS- 聚丙烯酰胺凝胶是免疫印迹中最常用的分离蛋白质的方法 由于印迹技术需将蛋白质成功地从胶中转移至膜上, 因此, 选择合适的凝胶甚为重要 ( 表 5-1) 一般情况下, 丙烯酰胺和交联剂的比例越低, 转移就越易进行 超薄胶转移的速度快, 而且彻底 通常, 应根据目的选择厚度 大小均适合的凝胶 若想寻求蛋白质的最佳分辨力, 长胶的效果较好, 使较大分子量的蛋白质更好地分离 若想达到最大的灵敏度, 胶的厚度可增 加到 1.5mm, 并且在不发生变形的前提下, 尽量提高蛋白的上样量 若主要考虑的是分离速度, 则选用微型胶, 厚度为 0.5mm 表 5-1 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 丙烯酰胺 * 浓度 线性分离范围 (KD) 15 12~ ~ ~ ~212 * 丙烯酰胺与双丙烯酰胺的摩尔比为 29:l

409 ( 一 ) 凝胶的制备 材料 (1)30% 的丙烯酰胺 : 分别称取 29g 丙烯酰胺,1g N, N - 亚甲双丙烯酰胺加温热的去离子水 60ml, 加热至 37 溶解, 补加水至终体积为 100ml, 过滤, 即配成 30%(w/v) 丙烯酰胺贮存溶液 丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸, 这一脱氨基反应是光催化或碱催化, 故溶液的 ph 值不超过 7.0, 应置于棕色瓶中 4 保存 (2)10% 十二烷基硫酸钠 (SDS): 称取 10g SDS 加去离子水 90ml 加热至 68, 加几滴浓盐酸调节至 ph7.2 加水至 100ml, 即为 10%(w/v)SDS (3) 浓缩胶缓冲液 (1mol/L Tris-HCl ph6.8):12.12g Tris 溶解在 80ml 去离子水中, 用浓盐酸调节 ph 至 6.8, 再加去离子水至 100ml 4 保存 (4) 分离胶缓冲液 (1.5mol/L Tris-HCl ph8.8):18.16g Tris 溶解在 80ml 去离子水中, 用浓盐酸调节 ph 至 8.8, 再加去离子水至 100ml 4 保存 (5)10% 过硫酸胺 (AP): 过硫酸胺提供催化丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基, 可用去离子水配制小量 10%(W/V) 贮存液并 4 保存 由于过硫酸胺会缓慢分解, 故应隔周新鲜配制 (6)TEMED(N, N, N, N - 四甲基乙二胺 )TEMED 通过催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合, 由于 TEMED 只能以游离碱的形式发挥作用, 因此 ph 值较低时聚合反应受到抑制 (7)Tris- 甘氨酸电泳缓冲液 : 分别称取 15.1 g Tris 和 94g 甘氨酸, 溶解在 900 ml 去离子水中, 然后加入 50 ml 10%(w/v)SDS, 再加去离子水至 ml 则成 5 贮存液 使用时稀释 5 倍, 终浓度 Tris 为 25mmol/L 甘氨酸为 25mmol/L 0.1% SDS, 缓冲液 ph 为 8.3 (8) 聚丙烯酰胺凝胶电泳槽和电泳仪 (9) 加样器和吸头等 方法 (1) 根据垂直电泳槽说明书安装玻璃板, 确定需配制分离胶的浓度和体积 (2) 迅速将分离胶注入两玻璃板间隙中, 留出灌注积层胶所需空间 ( 梳子的齿长再加 1cm, 用滴管小心地在分离胶上覆盖一层 0.1% SDS 或水, 覆盖层可防止氧扩散进入凝胶而抑制聚合反应 将凝胶垂直置于室温下 (3) 分离胶聚合完全后, 倒出覆盖层液体, 用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺, 尽可能排除凝胶上的液体 (4) 确定需配制浓缩胶的体积, 按 配制 Tris- 甘氨酸 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶所用溶液 配制所需浓缩胶, 然后直接将浓缩胶灌注在分离胶上, 立即插入干净的配套梳子, 避免气泡, 然后加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙 待浓缩胶聚合后, 拔出梳子, 形成加样孔 (5) 用去离子水将 Tris- 甘氨酸电泳缓冲液贮存液稀释 5 倍, 倒入电泳槽, 将加样孔充满, 这时加样孔中的气泡可通过电泳缓冲液排除 ( 二 ) 电泳 材料 (1)2 SDS 凝胶加样缓冲液 (2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳槽和电泳仪 (3) 加样器和吸头等 (4) 水浴箱 方法 (1) 把上述处理的样品按 1:1(V/V) 与 2 SDS 凝胶加样缓冲液混合,100 加热 3min, 使蛋白质变性

410 (2) 取出变性蛋白质, 立即放于冰上 样品如粘稠可进行超声对 DNA 进行剪切, 以最大功率处理 0.5~2min 应能有效地将裂解液粘稠度降至可控水平 ( 注意 : 此步骤一定要在冰上进行 ) (3) 如有沉淀以 g 将样本 4 离心 10min, 将上清液移至另一管中, 弃去沉淀物 (4) 计算使用 Western 印迹法检测靶蛋白所需要的样本量, 一般 Western 印迹法技术检测中等大小蛋白的检出下限约为 1~5mg 在厚 0.75mm 的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶上, 每个泳道可加样 100µg 而不致过多 (5) 用玻璃微量进样器按顺序加样, 注意沿加样孔底上样, 否则样品容易漂走 加样量不宜过多或过少, 一般 15~20µl 为宜 没上样的加样孔中加 1 SDS 凝胶加样缓冲液 (6) 用注射器排除两玻璃板底部的气泡, 将电泳装置接通电源 ( 正极接下槽, 负极接上槽 ), 凝胶上所加电压为 8V/cm, 当溴酚蓝前沿进入分离胶后, 电压可提高到 15V/cm, 继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部 ( 约 4h), 关闭电源 (7) 从电泳装置上卸下玻璃板, 放入一瓷盘中, 用一注射器吸取若干毫升电泳缓冲液, 将针头插入一玻璃板与凝胶之间, 小心不要将凝胶刺破, 沿玻璃板从左至右注入电泳缓冲液, 将玻璃板与凝胶分开 靠近左边切去一角以标明凝胶的位置 (8) 如不需做免疫检测可直接用考马斯亮蓝染色, 做免疫检测可按以下步骤进行 注意事项 1. 注意安全, 一些试剂对人体有害, 如丙烯酰胺等 2. 避免样品污染 将蛋白质从凝胶中转印至膜上 可用于免疫印迹的固相载体有多种, 如硝酸纤维素膜 PVDF( 聚亚乙烯双氧化物 ) 膜等 硝酸纤维素膜最为常用, 具有结合能力强, 膜不需要活化, 背景浅, 能进行多次免疫检测并可用常规染色方法, 功能基团寿命长等优点, 但极易破碎不易操作 FVDF 膜在制备多肽供蛋白质化学分析中最为常用 在进行蛋白水解和序列分析时, 通常是先将蛋白质结合在 PVDFF 膜上 将凝胶中的蛋白质转印至膜上的方法很多 目前常用方法是电洗脱或电印迹 其主要优点是转印迅速 完全 电洗脱有两种方法 : 一种是湿转印法, 即将凝胶一膜夹层组合完全浸入转印缓冲液中 ; 另一种是半干转印法, 即将凝胶 - 膜夹层组合放在浸有转印缓冲液的吸水纸之间 前者是将夹层组合放入有铂丝电极的缓冲液槽中 而后者是将凝胶 - 膜夹层组合置于两个石墨平板电极之间 这两种转印的装置效果均较好, 可根据实验室条件来选择 以下主要介绍以 PVDF 膜为固相载体的半干转印法 一 以 PVDF 膜为固相载体的半干转印法 材料 (1) 转印缓冲液 : Tris 碱 48mmol/L 5.8g 甘氨酸 39mmol/L 2.9g SDS 0.037%(w/v) 0.37g 甲醇 20% 200ml 蒸馏水 加至 1 000ml (3)6 张吸水纸 (Whtaman 3 MM 或类似物 ) 和 1 张 PVDF 膜 (4) 电转移装置

411 方法 (1) 用蒸馏水淋洗装置的平板电极 (2) 将凝胶切成适当大小用于转印 除去无关的凝胶和未使用的泳道 作好凝胶标记以确 定第一条泳道的方向 在准备滤纸时, 将凝胶放入转印缓冲液中 (3) 剪取吸水纸和 PVDF 膜, 使其稍大于凝胶, 将 PVDF 膜浸泡在甲醇溶液中 5 分钟, 操 作时要戴手套 油污或其他蛋白质可阻碍蛋白质与 PVDF 膜结合 滤纸剪成适当大小 如果滤 纸与凝胶的边缘重叠, 电流将短路而绕过凝胶, 使转印不能有效进行 一个可行的办法是以封 口膜作为垫子绕在凝胶的周围将其与滤纸分开或膜的面积稍大于凝胶, 使凝胶通过膜与滤纸分 开 (4) 将吸水纸放入转印缓冲液中浸湿 (5) 将凝胶 PVDF 膜和滤纸放在平板装置的底部, 放置顺序如下 : - 底部平板阳极 a. 三层转印缓冲液浸湿的吸水纸 b. 一张转印缓冲液浸湿的 PVDF 膜 c. 用转印缓冲液稍微湿润的聚丙烯酰胺凝胶 d. 三层转印缓冲液浸湿的吸水纸 - 阴极 (6) 仔细检查有无气泡, 并用玻棒驱赶气泡, 吸干凝胶 - 滤纸夹层组合旁边的缓冲液 许 多装置在凝胶一滤纸夹层组合旁边有一个垫圈以防转印时发生短路 (7) 小心将电极插入装置顶部 接通电极 ( 正极或红色表示阳极 ) 并进行转印 以 0.8mA/cm 2 凝胶, 转印 45min 至 1.5h 转印时间不宜太长, 否则易引起干胶 (8) 转印结束后立即断开电源, 小心拆开装置, 将膜做上标记 电极用后要用蒸馏水清洗 二 转印后切取印迹膜 有时转印后需将印迹剪成较小的片状进行单独处理 单个泳道可以泳动同一样品, 待彼此 分开后, 可用不同的抗体并列检测 为了简便而精确地找到泳道, 电泳之后用丽春红 S 或印度 墨汁对印迹膜进行染色 ( 表 5-2), 便可很快确定待测蛋白质的位置并将其剪下 表 5-2 用于免疫印迹染色的染料 染料 优点 缺点 丽春红 S 便宜 不够灵敏 适合于所有的抗原检测方法 不持久 印度墨汁 便宜 酶检测需用吐温封闭 灵敏 先检测, 后染色 适合于放射性标记检测 不适合于化学发光和生色底物的酶检测方法 三 印迹膜蛋白染色 材料 (1)2% 丽春红 S 浓贮存液 (3- 羟基 -4-[2- 磺基 -4- 硫代 - 苯偶氮基 ]-2,7- 萘二磺酸 ): 溶于 30% 三氯醋酸和 30% 磺基水杨酸中 贮存液可在室温下稳定存放 1 年以上 (2)PBS 方法 (1) 在染色之前, 先配制丽春红 S 的应用液 即将 2% 的丽春红 S 浓贮存液用 1% 醋酸 1:10 稀释即成为应用液 ( 注意 : 如果使用硝酸纤维膜, 须将丽春红 S 应用液更换为用水 1:10 稀释 ) (2) 用丽春红 S 应用液将 PVDF 膜洗 1 次

412 (3) 加入新鲜稀释的丽春红 S 应用液, 并在室温下搅动 5~10min (4) 将 PVDF 膜放入 PBS 中漂洗数次, 每次 1~2min, 并更换 PBS (5) 根据需要将转印部位和分子量标准位置进行标记 至此 PVDF 膜可用于封闭和加入抗体 免疫检测 免疫检测主要取决于抗原抗体的特异性, 特别是能够识别膜上变性的和固定化抗原的抗体 因印迹膜上有非特异性吸附蛋白质的位点, 因此需进行封闭以防免疫试剂的非特异性吸附 将印迹膜与一定浓度的不参与特异性反应蛋白质或去污剂溶液孵育可实现封闭 然后通过抗体与膜上抗原的特异性结合来定位抗原 一 印迹膜上非特异性蛋白质结合位点的封闭 尽管这些封闭液在某些情况下使用较为满意, 但是仍需要仔细选择以确保其能适合于检测试剂 几乎适合于所有检测系统的两种封闭缓冲液是脱脂奶粉和牛血清白蛋白 若蛋白质封闭液造成本底过高或干扰检测, 则可试用吐温 20 封闭液 二 直接与间接检测方法 直接法是指用标记的第一抗体 ( 一抗 ) 来进行检测的方法, 用这种类型的抗体对膜上抗原进行免疫检测的本底较低, 并且在同一张印迹膜上可同时使用来源或特异性不同的多种抗体, 但灵敏度不如间接法 间接检测是指先使用非标记的一抗, 然后用可与一抗结合的标记第二抗体 ( 二抗 ) 进行检测的方法 由于二抗分子是多价的, 具有放大效应, 因而灵敏度较高 下面以间接检测法为例介绍免疫检测的方法 准备工作 在准备做抗原检测时, 须考虑所用 抗和二抗的最佳浓度, 对不同来源的抗体, 其特异性抗体的浓度都不相同 因此, 对 抗体进行滴定有助于确定最佳反应比例, 预先滴定二抗对实验也有帮助, 一旦确定最佳浓度, 则每次印迹即可用同一批一抗 二抗来完成 多数情况下可采用商家提供的浓度进行检测 材料 (1)PBS: 称取 8g NaCl;0.2g KCl;1.44g Na 2 HPO 4 和 0.24g KH 2 PO 4, 加蒸馏水 800ml, 用 HCl 调节溶液 ph 值至 7.4, 加水至 ll, 在 Pa 高压下蒸气灭菌 20min, 室温保存 (2) 封闭液 ( 见表 ) (3)1% BSA/PBS (4)- 抗试剂和碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的二抗试剂 ( 通常是用辣根过氧化物酶标记的抗免疫球蛋白抗体 ) (5) 碱性磷酸酶底物溶液 : 1)NBT( 氮蓝四唑 ) 溶液 : 在 10ml 70% 的二甲基甲酰胺中溶解 0.5g NBT 2)BCIP(5- 溴 -4- 氮 -3- 吲哚磷酸 ) 溶液 : 在 10ml 70% 的二甲基甲酰胺中溶解 0.5g BCIP 3) 碱性磷酸酶缓冲液 :100mmol/L NaCl:5mmol/L MgCl 2 ;100mmol/L Tris-HCl(pH9.5), 置密闭容器中保存, 此溶液稳定 4) 取 66µl NBT 溶液与 10ml 碱性磷酸酶缓冲液混匀, 加入 33µl BCIP 溶液 (6) 辣根过氧化物酶底物溶液 : 用 9ml 的 0.01 mol/l Tris-Cl(pH7.6) 溶液中溶解 6mg 3-3'

413 - 二氨基联苯胺, 加入 1 ml 0.3%(w/v)NiCl 2 或 CoCl 2 用 Whatmal 号滤纸过滤以除去沉淀, 加入 10µl 30% H 2 O 2 混匀后立即使用 此溶液须在临用时配制 方法 (1) 用 PBS 漂洗印迹膜数次 (2) 加入一种封闭液 注意 : 不同的抗原和实验方法需用不同的封闭缓冲液 例如,BSA (V 部分 ) 和牛奶都含有磷酸化的酪氨酸和生物素, 用特异性抗磷酸化酪氨酸抗体进行实验时, 这会给解释实验结果造成一定的混淆, 也给亲合素 / 链霉亲合素检测的应用带来一些问题 某些牛奶制品可抑制碱性磷酸酶的活性 若无信号或检测背景较高, 则需尝试不同的封闭缓冲液 (3) 室温下搅动孵育 一般孵育 20min~2h 或 4 过夜较好 (4) 从封闭缓冲液中取出印迹膜, 用 PBS 漂洗 3 次, 每次 5min (5) 加入工作浓度的一抗溶液 每张 15 15cm 的印迹膜用量为 10ml 所有的稀释液均用含有蛋白质的溶液, 例如 1% BSA/PBS 孵育可在浅盘或塑料袋中进行 在室温下将抗体和印迹膜搅动孵育至少 1h 有人认为 4 孵育过夜 (12~18h) 可提高灵敏度 (6) 用 PBS 漂洗印迹膜 4 次, 每次换液洗 5min (7) 此时, 印迹膜便可加入工作浓度的标记的二抗溶液 可在浅盘或塑料袋中室温孵育 1h 抗体用含有蛋白质的溶液进行稀释, 例如 1% BSA/PBS 商品化的酶标二抗应在 0.5~5µg/ml 浓度之间使用 ( 通常将商品试剂原液稀释成 1:200~1:20000 的应用液 ) 用辣根过氧化物酶标记的试剂须用不含叠氮钠的封闭液稀释 (8) 用 PBS 漂洗印迹膜 4 次 每次换液洗 5min (9) 将经漂洗的印迹膜移至另一干净浅盘中, 按印迹膜面积加入 0.1ml/cm 2 的底物溶液 ( 若使用碱性磷酸酶标记的二抗, 用碱性磷酸酶底物溶液, 若用辣根过氧化物酶标记的二抗则用辣根过氧化物酶底物溶液 ), 于室温轻轻摇动, 待蛋白条带的颜色深度达到要求 ( 约 2~20min), 用水略为漂洗, 放入 PBS 中 (10) 拍摄照片, 留作永久实验记录 ( 过氧化物酶染色的蛋白条带经日光照射数小时后颜色将退去 ) 注意事项 1. 一抗 二抗的稀释度 作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件 2. 显色液必须新鲜配置使用, 最后加入 H 2 O 2 实验七细胞免疫功能测定 三 NK 细胞活性的检测 自然杀伤细胞 (natural killer cell,nk 细胞 ) 是一类杀伤靶细胞时既不需要特异性抗体参与, 也不需抗原预先致敏的淋巴细胞 该细胞对多种肿瘤细胞有迅速杀伤和溶解作用, 在抗肿瘤免疫中发挥重要作用 检测机体 NK 细胞活性, 可以了解机体抗肿瘤免疫的功能, 同时为临床肿瘤病人的预后和转归提供依据 实验室中主要采用细胞毒试验来测定 NK 细胞的活性 实验方法可分为酶释放法 同位素法 荧光法 流式细胞仪分析等 测定人的 NK 细胞活性一般用 K562 细胞株作为靶细胞, 小鼠的 NK 细胞活性则以 YAC-1 细胞株作为靶细胞 ( 一 ) 乳酸脱氢酶 (LDH) 法检测人外周血 NK 细胞活性 原理

414 先从外周血中分离出淋巴细胞, 这些淋巴细胞包括 T 细胞 B 细胞和 NK 细胞, 然后将这些 淋巴细胞与对 NK 细胞敏感的靶细胞混合培养,NK 细胞与靶细胞接触后, 通过释放穿孔素和颗 粒酶等的作用, 引起靶细胞膜损伤和 DNA 节段化 由于靶细胞膜破裂, 细胞浆中的乳酸脱氢酶 释放到细胞外, 这种酶能使 LDH 底物变色, 其颜色的深浅与乳酸脱氢酶的含量成正比通过比色测 定, 可计算出 NK 细胞毒活性 应用 酶释放法具有操作简便, 无同位素污染, 测定仪器要求不高等优点, 现已在实验室中广泛 材料 1. 靶细胞 :K562 细胞 ( 细胞活性应在 95% 以上 ) 2.RPMI1640 完全培养液 淋巴细胞分离液 Hanks 液 3.LDH 底物液 : 取硝基氯化四氮唑蓝 (NBT)4.0 mg 氧化型辅酶 I(NAD + )10 mg 吩嗪二甲酯 硫酸盐 1.0 mg 加 0.1 mol/l PBS(pH7.4) 2.0 ml 溶解, 再加 1.0 mol/l 乳酸钠溶液 0.5 ml, 然后加 PBS 至 12.5ml 4.1%NP-40 裂解缓冲液 5. 终止液 : 取柠檬酸 4.2g 加蒸馏水 200ml 6. 细胞培养板 CO2 培养箱 显微镜 离心机 移液器 试管 吸管和酶标仪等 方法 1. 分离淋巴细胞 : 见实验十 2. 将淋巴细胞悬液用 Hanks 液离心洗涤 2 次, 每次 1000rpm 5min, 计数后, 用 1640 完 全培养液调整细胞浓度至 /ml 备用 3. 取生长旺盛的 K562 细胞, 用 Hanks 液离心洗涤二次, 每次 looorpm 5min, 计数, 用 1640 完全培养液调整细胞浓度至 1 lo 5 /ml 4. 按下表 7-2 将细胞加于细胞培养板内, 每个标本做一复孔 表 7-2 乳酸脱氢酶法测 NK 细胞活性各组成份 靶细胞 效应细胞 10%FCS- l640 培养液 NP-40 效应细胞酶自然释放组 100µl 100µl 靶细胞酶自然释放组 100µl 100µl 靶细胞酶最大释放组 100µl 100µl 杀伤检测组 100µl 100µl 空白对组 200µl 5. 轻轻混匀细胞, 置 37 二氧化碳培养箱 2 小时 6. 取出细胞培养板, 将细胞混匀后,1000rpm 离心 5min, 吸取 50µl 上清液置于酶标板内 7. 加新鲜配制的酶底物工作液 50µl/ 孔, 置 37 10min, 每孔加 50µl 终止液 8. 在酶标仪上测 OD490 数值, 计算每组 ( 复孔 ) 的平均值 结果与正常值 根据 OD 值按下列公式计算 NK 细胞杀伤活性百分率 E KS PS NK 细胞杀伤活性 (%)= 100% KM KS E 为杀伤检测孔 OD 值,KS 和 PS 分别为靶细胞 效应细胞自然释放孔 OD 值,KM 为靶细胞

415 正常值 :25±5% 1. 被检血样必须新鲜, 采血后要求在 3h~4h 内进行试验, 否则会降低 NK 细胞的活性 2. 靶细胞 (K562) 应处于良好的生长状态, 以保证 LDH 酶自然释放在最低水平 细胞使用前需用 1640 培养液洗涤 如果 LDH 酶自然释放过高, 将明显影响实验结果, 一般要求靶细胞的自然释放率 <10~15% 3. 不同的效靶比,NK 细胞的杀伤率不尽相同, 一般最优效靶比为 50 1 最佳孵育时间为 2h 4. 在加底物显色过程中, 尽可能控制显色的准确时间, 以减少同批实验中杀伤率的差异 在夏季实验中要控制室温, 避免室内温度过高而引起显色过快, 尽可能将显色时间控制在 5~7 min 内, 尤其在同一批样品检测中, 控制显色温度及时间, 对减少实验误差很有效 5. 由于小牛血清中 LDH 酶的含量不同, 同一批实验最好采用同一批号小牛血清, 以减少 NK 细胞杀伤率的差异 6. 吸取培养上清时, 应尽可能不吸动沉淀的细胞 ( 二 ) 同位素法检测小鼠脾脏 NK 细胞活性 原理 3 H-TdR 与靶细胞 (YAC-1) 共孵育, 由于靶细胞增殖, 3 H-TdR 掺入到细胞的 DNA 中, 掺入 3 H-TdR 的靶细胞与一定比例的小鼠脾脏淋巴细胞共同孵育 4~6h 后, 靶细胞被杀伤, 用 DNA 酶及胰酶处理细胞使细胞碎片充分裂解, 用细胞收集器收集完整的活细胞, 检测其细胞的 cpm 值, 即通过活细胞内 3 H-TdR 在 DNA 中的掺入程度, 可计算出 NK 细胞杀伤活性 材料 1. CO2 培养箱,β- 液体闪烁仪, 离心机, 细胞收集器 2. 3 H-TdR (100 µci/m1),ph7.2 PBS,Tris NH4C1 缓冲液,RPMI1640 完全培养液 ( 同前 ), DNasel(16U/m1), 胰酶 (8mg/m1), 靶细胞 (YAC-1) 方法 1. 靶细胞标记将新传代 12~24h 的 YAC-1 细胞用 RPMI1640 完全培养液调成 /m1 浓度, 加入 20µCi 3 H-TdR, 经 37 5% CO2 培养 4h, 每半小时振荡 1 次, 标记终止后用 PBS 离心 洗涤 3 次, 去除游离的同位素, 用 1640 完全培养基将细胞调成浓度为 /ml 待用 2. 小鼠脾细胞悬液制备脱颈椎处死小鼠, 酒精浸泡消毒, 无菌取出脾脏, 用 PBS 冲洗一 次, 然后将其研碎, 并悬浮于 1640 培养液中, 静置 10min 使大块组织沉降后, 将上清过 120 目网,1500rpm 离心 10min 弃上清, 加入 Tris NH4C1 缓冲液 5m1, 混匀后室温置 5min, 加等量 l640 培养液, 离心弃上清, 再用 l640 培养液洗 3 次, 然后用 1640 完全培养液配成 /m1 浓度的细胞悬液待用 3. NK 细胞活性检测取 96 孔圆底细胞培养板, 每孔加 3 H-TdR 标记的 YAC l 细胞悬液 100µl, 待测组加脾细胞悬液 100µl, 对照组加完全 1640 培养液 100µl,37 5% CO2 培养 18 小时, 取出培养板, 吸弃上清液 100µl, 每孔加入胰酶和 DNA 酶各 100µl,37 温箱孵育 30min, 然后用多头细胞收集器将细胞收集于 49 型玻璃纤维滤膜上,80 干燥后以液闪测定 CPM 值 NK 细胞活性以特异性杀伤率表示 结果 根据 CPM 值按下述公式计算 NK 细胞杀伤活性 待测组 ( 效 + 靶 )cpm

416 NK 细胞杀伤活性 (%)=(1 - ) 100% 注意事项 1. 严格无菌操作, 以防标本污染 2. 睥细胞必须新鲜 在夏季及气温偏高情况下, 脾细胞悬液在处理过程中, 应置于冰浴以保证 NK 细胞活性 3. 含有同位素的废物 废水要妥善处理, 不要污染环境 ( 三 ) MTT 比色法检测小鼠脾脏 NK 细胞活性 原理 以 MTT[3-(4,5- 二甲基噻唑 2) 2,5 二苯基四氮唑溴盐 ] 为底物, 利用活细胞线粒体中具 有活性的琥珀酸脱氢酶使外源性黄色的 MTT 还原成蓝紫色的难溶性结晶物 (Formazan), 并沉积 在细胞内, 而死细胞无此功能 将靶细胞与效应细胞一起孵育受到杀伤, 琥珀酸脱氢酶失去活 性, 不能还原 MTT 经酶标仪比色后, 即可计算出 NK 细胞活性 材料 1. 酶标仪,CO2 培养箱, 离心机,96 孔平底培养板 2. YAC-1 细胞 ( 使用前用台盼蓝染色, 活细胞数在 95% 以上 ), RPMI1640 完全培养液 ( 同 前 ),Hanks 液,MTT(5mg/m1 无菌 ph7.2 PBS 溶液, 遮光保存 ), 二甲基亚砜 (DMSO) 等 方法 1. 靶细胞制备取新传代 12~24h 的 YAC-1 细胞, 用 Hanks 液离心洗涤二次, 每次 looorpm 5min, 计数, 用 1640 完全培养液调整细胞浓度至 2 lo 5 /ml 2. 效应细胞制备脱颈椎处死小鼠, 酒精浸泡消毒, 无菌取出脾脏, 用 PBS 冲洗一次, 然后将其研碎, 并悬浮于 1640 培养液中, 静置 10min 使大块组织沉降后, 将上清过 120 目滤网, 1500rpm 离心 10min 弃上清, 加入 Tris NH4C1 缓冲液 5m1, 混匀后室温置 5min, 加等量 l640 培养液, 离心弃上清, 再用 l640 培养液洗 3 次, 然后用 1640 完全培养液配成 /m1 浓度 的细胞悬液待用 3. 细胞毒试验按表 7-3 将各成分加入 96 孔平底细胞培养板中, 每一标本做三个复孔 效靶比例为 将培养板置于 37 5%C02 培养箱中孵育 4h 后, 每孔加入 10µl MTT, 继续培养 4h 5. 轻轻吸弃培养上清液, 加二甲基亚砜 150µl, 充分振荡 10min, 置酶标仪于波长 570nm 处测定 OD 值 表 7-3 MTT 法测 NK 细胞活性试验各组成份 实验组 靶细胞对照组 效应细胞对照组 空白对照 靶细胞 100µl 100µl 一 一 效应细胞 100µl 100µl 一 RPMll640 完全培养基 100µl 100µl 200µl 结果 按下述公式换算成 NK 细胞活性百分率 : 实验组 OD 值 效应细胞对照组 OD 值 NK 细胞活性 (%)=(1 - ) 100% 靶细胞对照组 OD 值 注意事项 1. 此法简便 快速 灵敏, 且避免了使用同位素所造成的不便 但如效靶比例不合适, 会 对实验结果影响较大 根据我们的实验结果, 效靶比以 10 1 为好

417 2.MTT 应用液配制后需 4 避光保存, 且不能超过一个月 3. 效应细胞和靶细胞在加样时力求准确, 减少各孔之间的差异 4. 吸弃培养上清时, 不能吸弃沉淀的细胞, 否则对实验结果有明显的影响 四 LAK 细胞的制备及其细胞毒活性检测 外周血淋巴细胞或脾细胞在体外用较高浓度的 IL-2 培养刺激后, 可使非特异性杀伤肿瘤细胞的活性大大增强, 这种具有杀伤活性的淋巴细胞称为淋巴因子激活的杀伤细胞 (lymphokine activated killer cells, LAK cells), 简称 LAK 细胞 与 NK 细胞相比,LAK 细胞的细胞毒活性较高, 杀伤肿瘤细胞的范围较广 LAK 细胞已在临床上试用于治疗肿瘤 原理 人的外周血淋巴细胞在体外用含 IL-2 等细胞因子刺激培养后, 细胞发生活化和增殖, 而成为 LAK 细胞 ( 效应细胞 ), 当与靶细胞 (Raji 细胞 ) 接触后,LAK 细胞产生细胞毒效应, 杀伤靶细胞 通过细胞毒试验可测定 LAK 细胞的活性 材料 正常人或肿瘤病人抗凝外周血, 肝素,PBS 洗液,RPMIl640 培养液, 小牛血清 (FCS), 淋巴细胞分离液, 靶细胞 (Raji 细胞 ), 倒置显微镜, 台盼蓝, 无菌注射器, 无菌试管,rIL-2,24 孔细胞培养板,C02 培养箱, 超净工作台 方法 1. 外周血单个核细胞分离参见实验六 2. LAK 细胞的体外诱导用含 10%FCS 500~1000U/ml ril-2 的 RPMll640 培养液将新鲜分离的单个核细胞配成 /m1 细胞悬液, 按每孔 1ml 加入 24 孔细胞培养板,37 5%C02 条件下培养 3 天, 吸出上清液, 更换 1m1 新鲜配制的含 500~1000U/ml rii-2 的细胞培养液继续培养 3 天后, 无菌收集细胞即为 LAK 细胞 它可以用于杀瘤活性 表型测定和过继免疫治疗等 3. LAK 细胞细胞毒活性检测用 Raji 细胞作为靶细胞, 其余方法和步骤与 NK 细胞毒活性检测相同 注意事项 1. 整个实验必须严格无菌操作 2.rIL-2 细胞培养液必须现配现用 3. 分离的淋巴细胞活力必须大于 90% 4. 换培养液时, 应尽可能不吸动沉淀的细胞 五 肿瘤浸润淋巴细胞的制备 除个别肿瘤外, 多数实体肿瘤组织内或肿瘤周围组织中均可见有单个核细胞的炎症性浸润 ; 这些实体肿瘤组织内或周围的浸润单个核细胞被称之为肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) TIL 中以 T 淋巴细胞为主, 亦含一定数量的 NK 等细胞 TIL 中大多数的 T 淋巴细胞表达 CD45RO 分子, 其比例显著高于外周血 T 淋巴细胞中 CD45RO + T 细胞的百分率, 表明上述细胞已被活化 TIL 中 CD8 + T 细胞的数量明显多于 CD4 + T 细胞, 这是可识别肿瘤细胞的 CD8 + T 细胞被活化增殖的结果, 活化的 CD8 + T

418 细胞表现出对肿瘤细胞的 CTL 的细胞毒活性 ; 其中的 CD4 + T 细胞及其分泌的各种细胞因子, 对于 CD8 + T 细胞的活化 增殖以及提高抗肿瘤免疫反应的强度也是十分重要的, 某些细胞因子也直接参与了对肿瘤细胞的杀伤 正是由于体外培养的 TIL 表现出高于 LAK 细胞近 100 倍的肿瘤杀伤活性, 使其得以应用于临床, 并成为继 LAK 细胞后又一种重要的肿瘤过继免疫治疗手段 TIL 的研究无论对肿瘤免疫理论及临床肿瘤免疫治疗均具有重要意义 下面对 TIL 分离及培养方法作以介绍 原理 采用机械破碎 酶消化处理肿瘤组织将其制成单细胞悬液, 再用密度梯度离心 免疫磁性分离或流式细胞仪分离获得所需要的 TIL, 在 IL-2 等细胞因子刺激下体外扩增后可以用于杀瘤活性测定 表型分析及过继免疫治疗 材料 实体肿瘤, 胰酶,Ⅴ 型透明质酸酶,Ⅰ 型 DNA 酶,Ⅳ 型胶原酶,RPMIl640 培养基,PBS 洗液, 淋巴细胞分离液,Percoll 液, 免疫磁珠 (Dyna M-450), 羊抗鼠 IgG 抗体,T 细胞特异性单克隆抗体 (Anti-CD3 Anti CD4), 荧光激活细胞分类器 (FACS), 荧光标记的 T 细胞特异性单克隆抗体, 正常人外周血, 小牛血清,IL-2,24 孔塑料培养板,C02 培养箱, 超净工作台, 温控搅拌器, 水平离心机 方法 ( 一 )TIL 的分离 机械及酶消化分离 1. 将切除的肿瘤组织在无菌条件下去除坏死组织和结缔组织后剪碎, 用 PBS 冲洗 3 次 2. 将碎块移入含 20mlRPMIl640 培养液的烧杯内, 其中含 0.25% 胰酶 0.01%Ⅴ 透明质酸酶 0.002%Ⅰ 型 DNA 酶 0.1%Ⅳ 型胶原酶, 室温下搅拌过夜 3. 用 200 目细胞筛过滤消化后的细胞悬液, 再用 RPMIl640 培养液离心洗涤 3 次, 每次 1000rpm 5min 4. 将其配成 l 10 7 /ml 细胞悬液, 轻缓地加到淋巴细胞分离液上,2000rpm 离心 20min 5. 轻轻吸出淋巴细胞分离液上层的细胞, 以 RPMIl640 培养液洗涤 3 次 这层细胞主要是淋巴细胞和肿瘤细胞 6. 将上述分离液上层细胞用 RPMIl640 培养液配成 /ml 细胞悬液, 缓慢地加到 10% ~12.5% 和 20%~22% 的双层 Perco11 密度梯度液上 500rpm 离心 10min 7. 轻轻吸出双层 Perco11 分界面之间的细胞, 以 RPMIl640 培养液洗涤 3 次, 然后用 10% FCS RPMIl640 培养液将其配成 /ml 8. 取出 0.1m1 细胞, 加入 0.04% 台盼蓝染色, 显微镜下计数死 活细胞数, 推算细胞活性 一般细胞活力应大于 90% 其余冻存或培养 免疫磁性分离 1. 步骤 1 2 同上 2. 用 200 目细胞筛过滤消化后的细胞悬液, 再用 RPMIl640 培养液洗涤 3 次, 将其配成 /ml 细胞悬液 3. 先用羊抗鼠 IgG 抗体包被 Dyna M-450 珠, 再以 T 细胞特异性抗体包被 Dyna M-450 珠, 这样装备的 Dyna M-450 珠可以作为免疫磁珠 4. 将制备的 Dyna M-450 珠与上述的细胞悬液按 1 2~10 的比例混合, 连续温和搅拌,0 下孵育 30min

419 5. 用磁棒吸附与免疫磁珠形成玫瑰花环的 T 细胞, 冲洗去除残存的肿瘤细胞, 然后再洗涤制成 TIL 6. 用含 10%FCS 的 RPMIl640 培养液将其配成 /m1 细胞悬液 取出 0.1m1 细胞, 加入 0.04% 台盼蓝染色, 显微镜下计数死 活细胞数, 推算细胞活性 其余样品冻存或培养 流式细胞仪分离 1. 步骤 1 2 同上 2. 用 200 目细胞筛过滤消化后的细胞悬液, 再用 RPMIl640 培养液洗涤 3 次, 将其配成 /ml 细胞悬液, 然后进行荧光染色 3. 取 1m1 细胞悬液加入 Epp 管内,1000rpm 5min 离心, 弃上清, 加入荧光标记的 T 细胞特异性单克隆抗体 ( 抗 CD3)100µl, 悬浮细胞,4 静置 30min 4. 用含 0.02%BSA,0.1% 叠氮钠的 PBS 洗液 1000rpm 5min 离心洗涤 2 次 5. 加入 0.5mlPBS 悬浮细胞, 上机进行 FACS 分离, 然后收集分离所得的细胞, 以无血清的 RPMIl640 培养液 min 离心洗涤 3 次 经 0.04% 台盼蓝染色后, 显微镜下计数死 活细胞数, 推算细胞活性 ( 二 )TIL 的体外培养 1. 完全 RPMIl640 培养液的配制 ( 略 ) 2. 条件培养液 (LAK 细胞培养上清 ) 的制备 1) 无菌抽取正常人外周血 100m1( 肝素抗凝 ), 以 PBS 缓冲液稀释 2~4 倍 2) 将稀释的外周血等体积轻缓地加到淋巴细胞分离液上,1500~2000rpm 离心 15~ 20min 3) 将淋巴细胞分离液上层的淋巴细胞轻轻吸出, 用无血清的 RPMIl640 培养液 1500~ 2000rpm 10min 离心洗涤 3 次 4) 用含 10%FCS 1000U/m1IL-2 的 RPMIl640 培养液将细胞配成 /m1 5) 用 100m1 无菌培养瓶分瓶培养, 置 37 5% CO2 的培养箱连续培养 72~96h,2000rpm 离心 10min, 去沉淀收集上清 6) 上述上清液即为条件培养液 (LAK 细胞培养上清 ), 置 4 备用或分装贮存于 -20 有报道亦可将外周血单个核细胞在 lµg/ml PHA 存在下 37 体外培养 48h, 收集其上清 在 TIL 分离扩增培养时, 加入该上清 20% 于培养液中 3. 分离扩增 TIL 1) 将完全 RPMIl640 培养液与条件培养液按 4 1 的比例混合, 即为 TIL 培养液 2) 加入 IL-2 于 TIL 培养液至终浓度为 1000U/ml, 用这种培养液将分离获得的 TIL 配成 0.5~l 10 6 /m1, 按每孔 1m1 加入 24 孔培养板内, 置 37 5% CO2 的培养箱内培养 3) 4~6 天传代一次, 细胞数维持在 /ml 左右, 同时补加 IL-2(1000U/m1) 细胞数增加到一定量后, 可移入 75cm 2 175cm 2 的塑料培养瓶中继续培养 注意事项 1. 所用器皿均需要无菌处理, 所有操作必须严格遵守无菌观念 2. 分离 TIL 时尽可能多冲洗肿瘤组织, 一定要去除其中的坏死组织尤其是化脓的坏死部分, 因为这些组织最容易造成污染 3.TIL 的培养时间尽可能延长, 这样残存的肿瘤细胞会逐渐消失, 一般需要 2 3 周 4. 分离 TIL 应该低温操作, 酶消化步骤除外

420 六 CTL 细胞毒活性检测 被肿瘤细胞或同种异体细胞致敏的细胞毒性 T 淋巴细胞, 在与带有相应抗原的细胞 ( 靶细胞 ) 共同培养时表现出对靶细胞的杀伤作用 这种作用有如下特点 :1 有抗原特异性 ;2 效应细胞 需经抗原致敏 ;3 效应细胞与靶细胞共同孵育一定时间才表现出杀伤活性 检测 CTL 细胞毒活性 的方法有 51 Cr 释放法 MTT 法 3 H-TdR 参入法及形态学检查法 这里只介绍形态学检查法, 其它 方法参见上述各段 原理 体外贴壁生长的靶细胞在受到细胞毒性 T 细胞的作用后发生损伤, 丧失贴壁能力 因此可根 据贴壁细胞细胞数减少的程度判断待测 CTL 的杀伤能力 材料 1. 倒置显微镜,CO2 培养箱 2. 靶细胞 ( 选用在对数生长期的人或动物的能贴壁生长的肿瘤细胞 ),0.125% 胰酶溶液 ( 用 无钙镁的 Hanks 液配制 ),RPMI1640 完全细胞培养液 ( 同前 ) 瑞氏染液 细胞 (3) 效应细胞 : 肿瘤病人或荷瘤小鼠的 CD8 + T 细胞 方法 1. 靶细胞在 30m1 培养瓶内生长成单层后, 吸出培养液, 用 3m1 的胰酶溶液洗 2 次, 以去除死 2. 向培养瓶内加 0.125% 的胰酶溶液消化细胞数分钟, 在消化过程中把培养瓶放在倒置显微 镜台上观察, 待细胞胞质回缩, 细胞间隙增大后立即停止消化 3. 吸去消化液, 加入完全细胞培养液, 用吸管伸入培养瓶内吸取培养液, 反复轻轻吹打瓶 壁细胞, 使其脱离, 形成单细胞悬液 4. 用培养液把靶细胞浓度调到 /m1, 在平底细胞培养板内每孔加 100µl 细胞悬液, 加 盖,37 5%CO2 培养箱培养 8~24h, 使细胞贴壁 5. 弃去孔内培养液, 实验孔加 /ml 效应细胞 200µl, 对照孔加培养液 200µl, 培养 48h 6. 用 Hanks 液洗去孔中的淋巴细胞及脱落的靶细胞, 甩干 用瑞氏染液染色, 干燥 7. 镜检残留的贴壁细胞, 进行结果计算 杀伤百分率 (%)= 对照孔细胞数 实验孔细胞数 100% 对照孔细胞数 注意事项 1. 在消化过程中应掌握好时间, 消化过头很容易使细胞脱落, 这是必须通过离心收集细胞, 然后用 Hanks 液洗涤, 再用完全细胞培养液调整细胞浓度至所需范围 2. 用 Hanks 液洗去孔中淋巴细胞及脱落的靶细胞时, 不能用力过猛, 以免将正常生长的靶细胞洗落 3. 在操作时应注意无菌操作, 避免细菌污染, 导致实验失败 七 抗体介导的淋巴细胞毒试验 原理 K 细胞借助 ADCC 作用能杀伤靶细胞, 故体外用 ADCC 试验可检测 K 细胞数目, 作为反映机体细胞免疫功能的一个指标 本实验采用溶血空斑形成法测定 K 细胞数目 将鸡红细胞在多聚 -L- 赖氨酸 (Po1y-L-Lysine) 处理过的玻片上形成单层细胞, 加入抗鸡红细胞抗体和淋巴细胞, 经

421 一定时间作用后,K 细胞周围的鸡红细胞被溶解只剩下细胞核, 在低倍镜下计数有空斑和无空斑的淋巴细胞数, 即可算出 K 细胞数量的百分率 材料 1. 淋巴细胞悬液,2.5% 鸡红细胞, 兔抗鸡红细胞血清 ( 稀释 ),Tris-Hanks 液, 多聚 -L- 赖氨酸 (20µg/ml) 2.CO2 培养箱, 显微镜, 平皿, 盖玻片, 吸管等 方法 1. 单层鸡红细胞平板的制备 : 取酒精浸泡过的盖玻片放在平皿内 滴加多聚 -L- 赖氨酸溶液 0.5ml, 均匀铺于盖玻片上 室温放置 45min, 吸去玻片上的液体 用 Tris-Hanks 液 0.5ml 洗玻片 2 次 ( 注意不要将平皿底弄湿 ) 将 2.5% 鸡红细胞悬液 0.5ml 均匀铺于盖玻片上, 室温放置 45min, 向平皿内缓慢加入 Tris-Hanks 液, 再用吸管吸去, 如此反复洗涤几次, 以去除未吸附于盖玻片上的鸡红细胞 最后在平皿内留少许液体 若当时不用可置于 4 保存 3~4 天 2. 在低倍镜下检查单层红细胞的盖片, 分布不均匀者弃去 将平皿内多余的液体吸净 取 0.5ml 淋巴细胞悬液 ( /ml) 与 0.5ml 灭活的兔抗鸡红细胞血清混匀平铺于平皿中 另取一平皿用于正常兔血清作对照 将上述平皿放于 5%CO2 37 培养 20 小时 1. 取出平皿, 滴加 2.5% 戊二醛 1ml,30 秒后吸去全部液体, 再沿平皿壁缓缓加入 2.5% 戊二醛 2ml, 固定 5~8min 后, 用蒸馏水漂洗 2 次, 姬姆萨染色后显微镜观察 结果 凡有 5 个以上被溶去细胞膜只剩胞核的鸡血球集中在一起为一个空斑, 即一个 K 细胞 计数 1cm 2 红细胞单层上的空斑数 (a), 量出平皿的总面积 (b), 加入平皿的淋巴细胞总数 (c) a b K 细胞的百分率 = 100% c 本法测定正常人外周血淋巴细胞中的 K 细胞为 2.5~3.5% 注意事项 1. 从外周血分离单个核细胞, 并用吸附的方法除去大单个核细胞, 得到较纯的淋巴细胞, 用 10% 小牛血清 1640 培养液配成 /ml 的细胞悬液 2. 兔抗鸡红细胞血清 56 30min 灭活补体, 并用 1640 培养液作 稀释 3.Tris-Hanks 液配制 :Tris-HCl 2.02g, Tris 2.65g 溶于 100ml 双蒸水中与 Hanks 液等量混合即成 4. 多聚 -L- 赖氨酸溶液配制 : 用 Tris-Hanks 液将多聚 -L- 赖氨酸配成 10mg/ml 的母液, 冷冻保存, 临用前取母液 0.1ml, 加 Tris-Hanks 液 49.9ml, 使成 20µg/ml 的浓度 八 混合淋巴细胞培养试验 原理 两个遗传不同个体的淋巴细胞在体外共同培养时, 由于它们表面的组织相容性抗原不同, 从而互相刺激, 导致对方淋巴细胞分裂增殖和转化 根据淋巴细胞反应的强度, 可评价同种组织相容性抗原的差异程度, 这种试验称为混合淋巴细胞培养 (mixed lymphocyte culture, 简称 MLC) MLC 现已用作组织器官移植配型的一种检测方法 常用的方法有同位素法和 MTT 法 同位素法 材料 1. 培养液 :RPMIl640 完全培养液 ( 含青霉素 100~200U/m1, 链霉素 100~200U/ml,2mmol

422 谷氨酰胺,25mmol Hepes,20% 混合人血清或小牛血清 ) 检测仪 2. 淋巴细胞分离液, 闪烁液, 3 H-TdR,1%AET( 溴化 2 氨基乙基异硫脲 ) 3. 肝素, 丝裂霉素 C, 姬姆萨 - 瑞氏染料 4. 水平离心机,CO2 培养箱, 平底细胞培养板, 玻璃纤维滤纸, 多头细胞收集器, 液体闪烁 5. 微量移液器, 试管, 吸管等 方法 MLC 有两种方法 :(1) 双向反应 : 将 A 和 B 二个个体淋巴细胞混合培养,A 个体淋巴细胞与 B 个 体淋巴细胞膜表面的组织相容性抗原互相刺激, 使双方淋巴细胞均产生增殖反应 (2) 单向反应 : 先用丝裂霉素 C 或 X 线照射处理细胞, 使 A 或 B 个体细胞的 DNA 合成中断, 不能进行增殖分裂, 但仍 保留抗原刺激能力, 引起对方细胞增殖分裂 1. 分离单个核细胞 : 在无菌条件下分别抽取供者和受者静脉血各 l0ml 左右, 立即置于含肝 素 (40U/ml) 的容器中充分混匀 如为严重贫血患者, 可酌情抽取 10~20ml 血液 ( 主要依据配型 所需组别多少来决定取血量 ) 用淋巴细胞分离液分离单个核细胞, 用含 20% 人混合血清的 RPMIl640 溶液配制成 /ml 浓度的细胞悬液 2. 细胞处理 : 先将丝裂霉素 C 配制成 25µg/0.1m1 溶液, 然后按 10 6 单个核细胞加 25µg 丝裂霉 素 C, 分别处理供者和受者的淋巴细胞, 放置 37 水浴温育 30min 后,500g 离心 10min, 再用 RPMIl640 溶液洗涤 1 次, 倾去上层液, 用培养液调节为 10 6 /m1 细胞数 如用 X 线处理细胞, 则每 10m1 含 单个核细胞用 2.000rad 剂量照射 3. 实验分组 : 按表 7-4 组合进行分组 供者 受者双方以 1 1 细胞比例配组, 在 96 孔细胞培 养板内进行培养 4. 细胞培养 : 将细胞置 37 5% CO2 培养箱培养 6 天, 终止前 18~20 小时加 3 H-TdR0.1µci/ 孔, 培养物用多头细胞收集器, 将细胞收集在玻璃纤维滤纸上, 用液体闪烁器测定 CPM 值 表 7-4 混合淋巴细胞培养试验分组 组 别 孔 数 A + B 4 A + Bm 4 A + Am 4 B + Bm 4 注 :1.A 为受者淋巴细胞,B 为供者淋巴细胞 2.Am Bm 为经丝裂霉素 C 处理的相应淋巴 细胞 3. 4 孔中 3 个复孔测同位素 ; 一个孔用于形态观察 结果 1. 形态学计数 : 终止培养时, 经 300g 离心 10min, 弃去上清液, 将沉淀细胞打匀, 取样 涂片, 用姬姆萨 - 瑞氏染料染色, 在油镜下计数 500~1000 个淋巴细胞中淋巴母细胞 ( 包括过渡 型细胞 ) 数目, 求出转化细胞的百分率 如肾移植, 一般认为活体供肾, 转化率小于 10% 即可 采用 2. 同位素计数 : 根据所得数值 (CPM), 可以在同一批实验组别中比较不同供者对同一受者 反应的大小, 以选择刺激程度小的供者 目前有人主张采用相对反应 (relative response 简称 RR) 来表示, 可按下列公式表示 T-C RR= r-c 100 式中 T 为实验组 CPM,C 为自身对照组 CPM r 为参考值, 代表某一反应者与无关刺激者的 反应, 通常以 10 名以上随机供者的有效的混合细胞所组成, 因此在 RR 中 r 是作为比较稳定的 对照组, 因此利用 r 值, 可使 RR 成为最可靠的指标 由于无关供者血源较难得到, 一般多用 CPM 值作为指标

423 MTT 法 材料 丝裂霉素 C,Hanks 液, 二甲基亚砜,MTT(5mg/ml), 酒精, 细胞培养板, 离心机, 小鼠, 尖刀, 镊子, 滤网, 移液器, 酶标仪及培养箱等 方法 1. 制备反应 T 细胞 拉颈处死 A 小鼠, 用酒精浸泡消毒, 在无菌条件下, 取出脾脏, 用针芯将其研碎, 过滤网, 用 Hanks 液离心洗涤 2 次, 制成 /ml 的单个脾细胞悬液 2. 制备刺激细胞 用同样的方法制备 B 小鼠的单个脾细胞悬液, 加丝裂霉素 C 至终浓度为 25µg/ml,37 孵育 30min, 用培养液离心洗涤 3 次去除丝裂霉素 C 3. 铺板培养 将细胞培养板分成三组, 每组三孔 第一组每孔加 100µl 反应 T 细胞和 100µl 培养液, 为反应细胞对照组 ; 第二组每孔加 100µl 刺激细胞和 100µl 培养液, 为刺激细胞对照组 ; 第三组每孔加 100µl 反应 T 细胞和 100µl 刺激细胞, 为试验组 37 培养 5~7 天, 在培养结束前 6 小时, 加入 10µlMTT 4. 显色 轻轻吸去上清液, 加入 150µl 二甲基亚砜, 充分混匀,37 放置 20min 用酶标仪于波长 570nm 处测定 OD 值 结果 根据各组 OD 值, 按下列公式计算结果 试验组 OD 值 - 刺激细胞对照组 OD 值增殖指数 = 反应细胞对照组 OD 值通常情况下, 增殖指数大于或等于 1.3, 则表明反应 T 细胞与刺激细胞之间组织相容性抗原差异程度较大 ; 反之, 增殖指数小于 1.3, 则表明反应 T 细胞与刺激细胞之间组织相容性抗原差异程度较低 注意事项 1. 注意无菌操作 2. 刺激细胞接受处理的剂量要准确, 使细胞暂时存活, 但失去增殖的能力 3. 吸弃培养上清时, 不能吸弃沉淀的细胞, 否则对实验结果有很大的影响 实验九细胞因子及其受体的检测 细胞因子 (cytokine, CK) 是由活化的免疫细胞以及某些基质细胞分泌的一类生物活性物质, 多属分子量为 6~60KD 的多肽或糖蛋白 通常包括白细胞介素 (interleukin, IL) 干扰素 (interferon, IFN) 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF) 造血因子 趋化因子 各种细胞生长因子等 细胞因子在体内广泛参与免疫应答及调节 促进组织修复 刺激造血功能 刺激细胞的增殖与分化 参与细胞凋亡等重要生理活动 ; 某些因素可导致一些细胞因子的异常表达或功能异常, 从而参与炎症反应 免疫性疾病 肿瘤性疾病等病理过程的发生与发展 细胞因子必须通过与靶细胞膜表面特异性受体 ( 即细胞因子受体,cytokine receptor, CKR) 相结合才能发挥其广泛的生物学效应 因此, 细胞因子及其受体的检测, 无论是对基础免疫学研究, 还是对阐明某些疾病的发病机制 疾病诊断 疗效监测及预后判断等临床研究都具有重要意义 细胞因子及其受体的检测一般可分为生物活性检测法 免疫学检测法 分子生物学检测法三大类

424 细胞因子的生物活性检测法 不同的细胞因子有其特有的生物学活性 细胞因子的生物活性检测法是利用细胞因子对特定细胞株 ( 靶细胞或反应细胞 ) 的生物学效应来评估样本中相应细胞因子的含量和 / 或活性 其测定方法可分为促进细胞增殖和增殖抑制法 抗病毒活性测定法 集落形成法 趋化作用测定法及细胞因子诱导产物测定法等 生物活性检测法敏感性往往高于细胞因子的免疫学检测法, 且不需要各种标记的特异性抗体, 可直接反映待测细胞因子的活性水平 但本法易受多种因素的干扰 ( 如某些细胞因子抑制物 其他细胞因子 反应条件等 ), 且不能区分样本中某些具有相似或相反生物学效应的细胞因子 ; 同时, 因大多数细胞因子在体液中含量甚少, 难以直接测定, 一般均需要先进行体外诱导细胞因子产生, 才能进行上述细胞因子活性检测 一 IL-1 的生物活性检测法 IL-1 主要由活化的单核 / 巨噬细胞产生, 具有广泛的生物学活性 IL-1 包括 IL-1α 和 IL- 1β, 两者分子量相近, 且均能与 IL-1R 结合, 故具有相似的生物学活性 常用的 IL-1 生物活性检测法对两者均适用, 主要有 : 小鼠胸腺细胞增殖法 L929 细胞增殖法等 由于体液中 IL-1 含量极少, 难以直接测定, 故通常是通过检测体外诱生的 IL-1 来反映体内 IL-1 活性水平 ( 一 )IL-1 的体外诱生 原理 脂多糖 (LPS) 是 IL-1α 与 IL-1β 的诱生物, 能在体外诱导单核 / 巨噬细胞产生 IL-1α 与 IL-1β 材料 1.BALR/c 或 C57BL/6 小鼠 :6~10 周龄, 雌雄均可 2.75% 酒精 3.LPS: 用 10% FCS-RPMI-1640 培养液配制成 10µg/ml 4.5% FCS-Hanks 液,10% FCS-RPMI-1640 培养液 5. 带 9 号针头的无菌注射器 (5ml 以上 ), 刻度吸管, 毛细吸管, 刻度离心管, 加样器, 24 孔细胞培养板, 温浴箱, 细胞计数板, 倒置显微镜, 离心机, 超净工作台,CO 2 培养箱等, 0.22µm 滤膜及滤器 方法与结果 1. 将 BALB/C 或 C57BL/6 小鼠拉颈处死后, 浸泡入 75% 酒精中 3~5min, 消毒处理 2. 用带 9 号针头的无菌注射器向小鼠腹腔内注入 5ml 冷的 5% FCS-Hanks 液, 用消毒镊子柄轻揉腹部数次后, 吸回腹腔液体 ( 内含腹腔细胞及巨噬细胞 ), 反复抽吸几次 3. 置刻度离心管中, 以 1500rpm/min 离心,8min, 并用 5% FCS-Hanks 液洗涤细胞 2 次 4. 将腹腔细胞用 10% FCS-RPMI-1640 培养液调细胞浓度为 /ml 5. 将上述细胞悬液加至 24 孔平底培养板中,1ml/ 孔, 置 37,5% CO 2 培养箱中孵育 2h 6. 用 5% FCS-Hanks 液洗板 3 次, 弃去未粘附细胞, 贴壁细胞为巨噬细胞单层 7. 将 LPS(10µg/ml) 加入巨噬细胞单层,lml/ 孔, 置 37,5% CO 2 培养箱中培养 4h 8. 再加入 10% FCS-RPMI-1640 培养液,lml/ 孔,37,5% CO 2 培养箱中培养至 48h 9. 收集细胞培养上清液, 即为含 IL-1 的待测样品, 用 0.22µm 滤膜过滤除菌后, 分装后置 -20 或 -70 冰箱中, 待测 IL-1 活性 注意事项 1. 一般一只小鼠腹腔液可获腹腔细胞 ~5 10 6, 能满足诱生 IL-1 所需细胞数, 所

425 获细胞存活率应 >95% 2. 若要测定人 IL-1 的生物活性, 则分离出外周血单核巨噬细胞, 用 LPS 刺激即可 3.IL-1 诱生剂的浓度 细胞浓度和培养条件对结果有明显影响, 应进行预试验, 以确定最佳诱生条件 操作时接触细胞的试剂或器皿应无致热原, 例如使用的耐热器皿可以通过 160 干烤 2h 以上 4. 操作过程均应无菌, 否则会影响 IL-1 诱生及活性测定 5. 所获细胞培养上清液在分装冻存前宜过滤除菌及杂质 6. 培养材料 :24 孔培养板培养细胞存活率高, 但生长稍慢 ; 玻璃瓶培养有时会因玻璃质量和清洗不净而导致培养细胞死亡, 故应采取相应措施 大容量培养时用大容量瓶比较方便, 可减少操作过程中的污染 ( 二 )IL-1 的生物活性检测 1.L929 细胞增殖 MTT 比色法 原理 利用成纤维细胞在 IL-1 的刺激下发生增殖作用来检测 IL-1 的生物活性 实验通常用 L929 细胞株 ( 小鼠成纤维细胞瘤细胞 ) 作为检测 IL-1 生物活性的靶细胞或反应细胞 MTT 比色法的原理是利用四甲基偶氮唑盐 [3-(4.5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT] 在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下, 由淡黄色被还原成蓝紫色或蓝黑色的 MTT- 甲臢 (Formazan), 形成的量与活细胞代谢率及细胞增殖程度成正相关 故通过反应细胞形成的 MTT- 甲臢量, 即可测定 IL-1 对 L929 细胞促增殖作用程度, 从而间接测定 IL-1 的生物活性 材料 1. 已诱生的 IL-1 待检样品 : 倍比稀释成不同浓度 2.IL-1 标准品 : 倍比稀释成不同浓度 3.L929 细胞 : 作为靶细胞或反应细胞, 存活率应 >95% % 胰蛋白酶 5.10% FCS-RPMI-1640 完全培养液 6.MTT: 用 PBS 稀释成 5mg/ml, 用 0.22µm 膜过滤除菌及杂质,4 避光保存 7. 酸化异丙醇 ( 含 0.04mol.L HCl 的异丙醇 ):100ml 异丙醇中加入 0.4ml 的 36% HCl 即可 8.96 孔细胞培养板, 刻度吸管, 毛细吸管, 加样器, 刻度离心管, 离心机, 细胞计数板, 倒置显微镜,5% CO 2 培养箱, 超净工作台, 酶标测定仪,570nm 与 630nm 滤光片 方法 1. 将生长状况良好的 L929 细胞用 0.25% 胰蛋白酶消化 2~3min 2. 将 L929 细胞用 10% FCS-RPMI-1640 培养液洗涤 2 次, 以去除消化液及原生长培养液 3. 用 10% FCS-RPMI-1640 培养液调整 L929 细胞浓度至 /ml 4. 将 L929 细胞悬液加至 96 孔细胞培养板,100µl/ 孔 5. 分别加入不同倍比稀释度的 IL-1 标准品和待测样品于 96 孔细胞培养板中,100µl/ 孔, 各设 3 个复孔, 同时设立培养液空白对照 6. 置 37,5% CO 2 培养箱中培养 56h 7. 将 96 孔培养板取出, 各孔加入 MTT,10µl/ 孔 8. 置 37,5% CO 2 培养箱中继续培养 4h 9. 取出培养板, 先从各孔中轻轻吸出 100µl 上清液弃去, 再加入酸化异丙醇或 DMSO,100µl/ 孔, 置室温 10~20min, 吹打振荡, 充分混匀, 使 MTT- 甲臢产物充分溶解 10. 用酶标仪以 570nm 波长, 参考波长 630nm, 分别测定各孔 OD 值 ( 测定应在酸化异丙醇加入后 1h 内完成 ) 结果

426 1. 每孔 OD 值应为 OD 570nm -OD 630nm, 再减去培养液对照 OD 值, 最终每孔 OD 值应取 3 复孔的平均值 2. 以 log 2 [ 稀释度 ] 为 X 轴 ( 横坐标 ), 各稀释度对应的 OD 值为 Y 轴 ( 纵坐标 ), 在普通坐标纸上, 分别绘制出 IL-1 标准品与待测样品两条回归曲线 ( 如图 22) 3. 经标准品最大 OD 值一半处 ( 即标准品 50% 最大 OD 值处 ) 的 A 点画一条平行于 X 轴的横线, 由此产生相关于待测样品回归曲线的 B 点 4.A 点与 B 点所对应的横轴上的值为 X, 因 X=log 2 [ 稀释度 ], 则 A 点与 B 点对应的稀释度值为 : 稀释度 =2 X, 求得稀释度 待测样品 IL-1 活性单位计算公式 : B点对应的样品稀释度待测样品 IL-1 活性 (U/ml)= 标准品 IL-1 活性 (U/ml) A点对应的标准品稀释度或者采用下列公式计算 : 达标准品 5% 最大 OD值对应的样品稀释度待测样品 IL-1 活性 (U/ml)= 标准品 IL-1 达标准品 50% 最大 OD值对应的标准品稀释度活性 (U/ml) 图 22 IL-1 标准品与待测样品两条回归曲线 注意事项 1.L929 细胞存活率应 >95%,L929 细胞在培养条件不良时, 可呈圆形漂浮状, 此时更换培养液可使其恢复为正常的梭形贴壁细胞 2. 应充分洗涤后加入培养板中, 且应均匀分散于各孔中, 否则可能造成某个部位细胞过密而某个部位细胞过稀, 影响细胞单层形成 3. 标准品及待测样品应从 1:2 开始至少 6 个倍比稀释度 4. 加样时, 应从低浓度到高浓度顺序加入, 不可共用加样头 5. 加入酸化异丙醇后, 应在 1h 内进行 OD 值测定 6. 还可按正态概率纸法或概率单位法计算 IL-1 的活性单位 2. 小鼠胸腺细胞增殖 3H-TdR 掺入法 原理 IL-1 可协同有丝分裂原 ( 如 ConA 或 PHA) 刺激的 T 细胞或胸腺细胞发生增殖反应, 通过 3 H-TdR DNA 掺入法, 即可测定 IL-1 生物活性 此法是目前测定 IL-1 活性常用而简便的方法, 其敏感度达 10~50pg/ml 但本法缺乏特异性, 因为 IL-1 亦可刺激 T 细胞或胸腺细胞产生一些

427 细胞因子 ( 如 IL-2 等 ), 同样可协同有丝分裂原刺激细胞增殖, 且在细胞增殖过程中还可受到样品中 T 细胞增殖抑制因子的干扰 材料 1. 小鼠 :BALB/C 或 C57BL/6 小鼠,6~10 周龄, 雌雄均可 2.75% 酒精 3.5% FCS-RPMI-1640 完全培养液与 RPMI-1640 完全培养液 4.ConA 或 PHA 5.IL-1 标准品 : 倍比稀释成至少 6 个不同浓度值 6.IL-1 待测样品 : 倍比稀释成至少 6 个不同浓度值 7. 3 H-TdR β- 液闪汁数仪, 微量细胞收集仪 8. 解剖刀 剪 单皿 研磨工具 ( 玻璃匀浆器, 不锈钢细胞筛 ) 9.96 孔细胞培养板 10. 刻度吸管, 毛细吸管, 刻度离心管 离心机 细胞计数板, 倒置显微镜, 加样器,5% CO 2 培养箱, 超净工作台 ConA 或 PHA 亚适剂量的确定 测定样品前必须作 ConA 或 PHA 的剂量曲线, 观察其对小鼠胸腺细胞增殖的影响, 选择一个既能够激活胸腺细胞, 但又不引起其明显增殖的合适剂量, 即亚适剂量 1. 在 96 孔培养板各孔中加入小鼠胸腺细胞,100µl/ 孔 2. 加人不同浓度的 ConA( 或 PHA),100µl/ 孔, 使其终浓度分别为 0.5µg/ml,1µg/ml,2µg/ml, 5µg/ml,10µg/ml, 各设三复孔, 以不加 ConA 的培养液作对照 3. 置 37,5% CO 2 培养箱中培养 72h, 收获前 12h 加入 3 H-TdR,0.5µci/50µl/ 孔 4. 用微量细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维纸上, 用 β- 液闪计数仪测定各孔 cpm 值 ; 数据 (cpm) 以三个复孔平均值 ± 标准差表示 5. 数据 (cpm) 以三个复孔平均值 ± 标准差表示, 绘制 ConA 剂量曲线, 据此选择亚适剂量, 通常为 0.2~2.0µg/ml( 终浓度 ) 方法 1. 拉颈处死小鼠, 浸泡于 75% 酒精中 3~5min, 消毒处理 2. 无菌操作取出小鼠胸腺, 放人含有 RPMI-1640 完全培养液的平皿中 3. 将胸腺剪碎 ( 或研磨 ), 无菌过滤网, 制成单个胸腺细胞悬液 4. 用 RPMI-1640 完全培养液 1500rpm 10min 离心洗涤上述细胞 2 次, 然后用 5% FCS-RPMI 完全培养液调细胞浓度至 /ml 5. 在 96 孔培养板每孔加入小鼠胸腺细胞 100µl 6. 将倍比稀释后的标准品与待测样品加到上述各孔中,100µl/ 孔, 各设 3 个复孔, 及培养液对照和有丝分裂原对照 7. 将预先确定的亚适剂量的 ConA( 终浓度约 0.2~2.0µg/ml) 或 PHA( 终浓度为约 0.5~ 4.0µg/ml) 加入 96 孔培养板中,100µl/ 孔 8. 置 37,5% CO 2 培养箱中培养 72h, 收集前 10~12h 加入 3 H-TdR 0.5uci/50µl/ 孔 9. 用微量细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维纸上, 用 β 液闪计数仪测定各孔 3 H-TdR 掺入量 (cpm 值 ) 结果 1. 各孔 cpm 值为 3 复孔平均值减去培养液对照与 ConA 对照 ( 或 PHA 对照 )3 复孔平均值 2. 待测样品 IL-1 活性单位计算方法参见前述 L929 细胞增殖 MTT 比色法检测待测样品 IL-1 生物活性部分 注意事项

428 1. 所制备的小鼠胸腺细胞存活率应 >95% 2. 标准品及待测样品应以 1:2 开始至少 6 个倍比稀释度 3. 加样时, 应以低浓度到高浓度顺序加入, 且不可共用加样头 4. 由于受其他细胞因子的影响, 本法特异性受到一定限制 二 IL-2 的生物活性检测法 IL-2 主要由活化的 CD4 + T 细胞产生, 主要是促进 T 淋巴细胞的增殖与分化 IL-2 是机体免疫网络中最重要的细胞因子, 因此 IL-2 的检测已成为评价机体免疫功能状态的重要指标之一 但由于 IL-2 是通过自分泌或旁分泌方式发挥其生物学效应的, 在生理性免疫应答过程中,IL-2 不出现于血液等体液中, 故体液中 IL-2 含量极少, 难以直接测定, 通常是通过检测体外诱生的 IL-2 来反映体内 IL-2 活性水平 IL-2 可用免疫学方法来检测其含量, 但更多是用生物活性检测法来检测其活性单位 ( 一 )IL-2 的体外诱生 原理 PHA 或 ConA 是 IL-2 的诱生物, 能在体外诱导人外周血单个核细胞和组织细胞 ( 如人脾脏 淋巴结 ) 小鼠和大鼠脾脏细胞等产生 IL-2, 由此可用于检测 IL-2 的生物活性 1. 人外周血单个核细胞诱生 IL-2 材料 (1) 常规分离的外周血单个核细胞 (PBMC) (2)RPMI-1640 培养液, 含 10% FCS 的 RPMI-1640 完全培养液 (3)PHA( 初浓度为 2mg/ml) (4) 刻度吸管, 毛细吸管, 加样器, 刻度离心血管, 离心机, 细胞计数板, 倒置显微镜, 24 孔细胞培养板, 超净工作台,CO 2 培养箱,0.22µm 滤膜及滤器 方法 (1) 常规分离 PBMC( 见实验六 ) (2) 用 RPMI-1640 培养液将 PBMC 洗涤 2 次,1000rpm/min 离心 10min, 然后用 10% FCS-RPMI-1640 完全培养液调细胞浓度为 /ml (3) 将上述细胞悬液加入 24 孔培养板中,1ml/ 孔, 同时加入 PHA, 使 PHA 的终浓度为 100µg/ml (4) 置 37,5% CO 2 培养箱中培养 48h (5) 将培养的细胞充分混匀后, 转移至离心管中,2000rpm/min 离心 20min (6) 收集细胞培养上清液, 即获得 IL-2 待测样品, 用 0.22µm 或 0.45µm 滤膜滤除杂质, 分装保存于 -20 或 -70 冰箱待测 IL-2 活性 2. 小鼠脾脏细胞诱生 IL-2 材料 (1)BALB/c 或 C57BL/6 小鼠 :6~10 周龄, 雌雄均可 (2)75% 酒精 (3) 蒸馏水或 0.83% 氯化铵溶液 ( 破红细胞用 ) (4)ConA

429 (5)2% FCS-Hanks 液,10% FCS-RPMI-1640 完全培养液 (6) 解剖刀 剪, 无菌平皿,100 目钢网, 研磨工具 ( 玻璃匀浆器 不诱钢网等 ), 刻度吸管, 毛细吸管, 刻度离心管, 离心机, 细胞计数板, 倒置显微镜, 加样器,24 孔培养板, 超净工作台,CO 2 培养箱,0.22µm 滤膜及滤器等 方法 (1) 拉颈处死小鼠, 浸泡于 75% 酒精中 3~5min, 消毒处理 (2) 无菌操作取出脾脏, 仔细剪碎或研磨, 加适量 2% FCS-Hanks 液混悬细胞, 经 100 目钢网过滤, 即获得单个脾细胞悬液 (3) 将获得的单个脾细胞用蒸馏水或 0.83% 氯化铵裂解红细胞 (4) 用 2% FCS-Hanks 液洗涤细胞 2 次,1000rpm/min 离心 10min, 然后用含 10% FCS-RPMI-1640 完全培养液调细胞浓度为 /ml (5) 将上述脾细胞悬液加入 24 孔培养板,1ml/ 孔, 再加入 ConA, 使其终浓度为 5~10µg/ml (6) 置 37 5% CO 2 培养箱中培养 24~48h( 视细胞转化情况而定 ) (7) 将培养的细胞充分振荡混匀后, 移至离心管中,2000rpm/min 离心 20min; (8) 收集上清液, 即获 IL-2 待测样品 用 0.22µm 或 0.45µm 滤膜滤除杂质, 分装保存于 -20 或 -70 冰箱, 待测 IL-2 的生物活性 注意事项 (1)IL-2 诱生剂浓度 细胞浓度 培养条件和诱生时间对 IL-2 诱生结果均有明显影响, 应进行预试验确定最佳实验条件 (2) 细胞悬液的均匀程度及细胞存活率对结果亦有影响 (3) 研磨条件 : 可用玻璃匀浆器 不锈钢网等研磨脾脏 (4) 培养器皿 :24 孔培养板培养细胞存活率较高, 但生长稍慢 玻璃瓶培养有时会因玻璃质量和清洗不净引起细胞死亡 (5) 本试验系统均应无菌操作, 防止可能出现的污染 ( 二 )IL-2 的生物活性检测法 原理 IL-2 的生物活性检测法是检测 IL-2 对靶细胞 ( 反应细胞 ) 的促增殖作用的能力 靶细胞 ( 反应细胞 ) 增殖程度可以通过测定 3 H-TdR DNA 掺入量或 MTT 比色法 OD 值, 并与标准品对照, 间接测定 IL-2 的生物活性单位 以下三类细胞可作为 IL-2 检测的靶细胞 ( 或反应细胞 ):1IL-2 依赖细胞株, 如 CTLL-2;2 有丝分裂原活化的 T 淋巴母细胞 ;3 小鼠胸腺细胞 下面主要介绍以 CTLL-2 细胞作为靶细胞 ( 反应细胞 ) 检测 IL-2 的生物学活性 1.MTT 比色法 材料 (1)CTLL-2 细胞株 : 靶细胞 ( 反应细胞 ) (2) 待测样品 : 从 1:2 开始作倍比稀释, 至少 6 个稀释度 (3)IL-2 标准品 : 同上作倍比稀释, 至少 6 个不同稀释度 (4)10% FCS-RPMI-1640 完全培养液 (5)MTT: 用 PBS 配成浓度为 5mg/ml 的 MTT 溶液, 用 0.22µm 滤膜过滤除菌及杂质,4 避光保存 (6) 酸化异丙醇 :100ml 异丙醇中加入 0.4ml 36% HCl 即可成为 0.04mol/L HCl 的异丙醇 (7)96 孔细胞培养板, 刻度吸管 毛细吸管, 加样器, 刻度离心管, 离心机, 细胞计数板,

430 倒置显微镜, 超净工作台,CO 2 培养箱, 酶标测定仪,570nm 和 630nm 滤光片 方法 (1) 用 10% FCS-RPMI-1640 完全培养液洗涤 CTLL-2 细胞 2 次,1000rpm/min 离心 5min, 以去除原生长培养液 ( 含有 IL-2) (2) 用 10% FCS-RPMI-RPMI-1640 培养液调细胞浓度为 /ml (3) 将不同倍比稀释度的 IL-2 的标准品及待测样品分别加入 96 孔培养板中,100µl/ 孔, 各设 3 复孔, 并同时设培养液对照 (4) 各孔内均加入 CTLL-2 细胞悬液,100µl/ 孔 (5) 置 37,5% CO 2 培养箱中培养 24h(18~24h 均可 ) (6) 细胞培养至 18~24h 时, 各孔加 MTT 溶液,10µl/ 孔, 继续培养 4h (7) 取出培养板, 先从各孔中轻轻吸出 100µl 上清液弃去 再加入酶化异丙醇或 DMSO, 100µl/ 孔, 置室温 10~20min, 吹打振荡, 充分混匀, 使 MTT- 甲臢产物充分溶解 (8) 用酶标仪的检测波长 570nm, 参考波长 630nm, 分别测定各孔 OD 值, 测定应在加入酸化异丙醇后 1h 内完成 结果 (1) 每一稀释度的 OD 值应取 3 复孔的平均值, 最终 OD 值应为 OD 570nm -OD 630nm, 再减去培养液对照孔 OD 值 (2) 按概率单位分析法计算 IL-2 活性单位 ( 参见 IL-1 的生物活性检测法部分 ): 样品 IL-2 活性单位采用下列公式计算 : 达标准品最大 OD值 50% 的样品稀释度样品 IL-2 活性单位 (U/ml)= 标准品 1L-2 活性达最大 OD值 50% 对应的标准品稀释度单位 (U/ml) 注意事项 (1)CTLL-2 细胞存活率应 >95%( 细胞折光性好, 形态饱满 ), 洗涤时操作不要太猛烈, 因 CTLL-2 细胞膜极脆, 容易破碎而影响检测结果 (2)CTLL-2 细胞要充分洗涤, 因原生长培养液中含有 IL-2 (3)CTLL-2 细胞对鼠 IL-4 亦有增殖反应, 若样品中含有鼠 IL-4, 将影响检测结果准确性, 此时可用抗鼠 IL-4 McAb 处理待测样品后再进行检测 但 IL-2 细胞对人 IL-4 无增殖反应 (4)CTLL-2 细胞的最佳终浓度宜为 / 孔, 且应均匀分布 (5)CTLL-2 细胞冻存后复苏较为困难, 而长期培养又易产生变异而干扰 IL-2 活性测定, 应加以注意 (6)IL-2 标准品及待测样品从 1:2 开始至少 6 个倍比稀释度, 加样时应从低浓度到高浓度顺序加入, 且不可共用加样头 (7) 加入 MTT 的最佳时间应为培养液对照 ( 无 IL-2) 孔细胞全部死亡时, 一般时间是细胞培养至 18~24h 时 (8) 加入酶化异丙醇后, 应在 1h 内进行 OD 测定 如果 1h 内无法测定, 可将未加酸化异丙醇的 96 孔培养板暂时放入 4 冰箱保存 测定前, 取出置室温下数分钟, 再加人酶化异丙醇进行 OD 值测定 (9) 因 RPMI-1640 培养液中含有的酚红可干扰 OD 值测定, 而加入酸化后的异丙醇, 可使培养液中的酚红在酸性条件下由红色变成黄色, 从而可排除红色对 OD 值测定的干扰 ; 此外, 设立培养液对照, 可进一步排除培养液对 OD 值测定的影响 (10)IL-2 活性单位计算方法有多种, 除在 IL-1 活性单位计算法中所述的方法外, 还可通过正态概率法 概率单位法计算 IL-2 活性单位, 亦可对结果进行计算机处理, 得出 IL-2 的活性单位

431 2. 3 H-TdR 掺入法 材料 (1)CTLL-2 细胞株 : 靶细胞 ( 反应细胞 ), 存活率应 >95% (2)IL-2 标准品 : 倍比稀释为不同浓度 (3) 待测样品 : 倍比稀释为不同浓度 (4)10% FCS-RPMI-1640 完全培养液 (5) 3 H-TdR (6)96 孔培养板, 刻度吸管, 毛细吸管, 刻度离心管, 离心机, 加样器, 细胞计数板, 倒置显微镜, 超净工作台,CO 2 培养箱, 微量细胞收集仪, 玻璃纤维滤纸,β 液闪计数仪 方法 (1) 用 10% FCS-RPMI-1640 培养液洗涤 CTLL-2 细胞 2 次,1000rpm/min 离心 5min, 以去除原生长培养液 ( 含 IL-2) (2) 用 10% FCS-RPMI-1640 培养液调细胞浓度为 /ml (3) 将不同倍比稀释度的 IL-2 的标准品和待测样品分别加入 96 孔细胞培养板,100µl/ 孔, 各设 3 复孔, 同时设培养液对照 (4) 各孔均加人 CTLL-2 细胞悬液,1ml/ 孔 (5) 置 37,5% CO2 培养箱中培养 24h (6) 每孔均加入 3 H-TdR,0.5µci/ 孔, 继续培养 4~6h (7) 用微量细胞收集仪收集细胞手玻璃纤维纸上, 用 β 液闪计数仪测定各孔 cpm 值 测定 cpm 值的最佳时间应是培养液对照 ( 无 IL-2) 细胞全部或大部分死亡而加有 IL-2 孔细胞生长旺盛时 结果 (1) 每一稀释度 cpm 值为复孔的平均值减去培养液对照, 即为最终 cpm 值 (2) 计算 IL-2 活性单位 ( 参见 IL-1 IL-2 的 MTT 比色检测法 ) 可按下式计算 : 达 50% 最大增殖 H TdR掺入值的样品稀释度样品 IL-2 活性单位 (U/ml)= 标准品 IL-2 3 达 50% 最大增殖 H TdR掺入值的标准品稀释度 活性单位 (U/ml) 注意事项 (1) 可用 125 I-UdR 代替 3 H-TdR 进行 IL-2 活性检测 其优点是不需 β 液体闪烁测定所需的试剂和设备, 只需一台小型 γ 计数仪即可, 并可节省时间和减少 β 液体闪烁操作中出现的误差 其缺点是 125 I-UdR 半衰期较短, 需要定期供应 基本方法同 3 H-TdR 掺入法, 只是用 125 I-UdR 代替 3 H-TdR,0.2µci/ 孔, 然后再加入 1mmol/L 的 5- 氟尿嘧啶 5µl, 继续培养 24h, 收集细胞用 γ 计数仪测定 cpm 值 (2) 其余注意事项可参见 MTT 法检测 IL-2 活性部分 3 三 TNF 的生物活性检测法 TNF 包括 TNFα 与 TNFβ 两型, 它们具有极其相似的生物学活性, 在体内外可对一些肿瘤细胞或细胞系起杀伤作用, 而对正常细胞则无细胞毒效应 根据这一特点, 可利用 TNF 对敏感靶细胞的细胞毒效应, 在体外检测 TNF 的活性水平, 既可检测分泌型 TNF(sTNF), 也可检测膜结合型 TNF(mTNF) 最常用的方法是体外检测 TNF 对小鼠成纤维瘤细胞 (L929 细胞 ) 的细胞毒效应 原理

432 TNF 对 L929 细胞有细胞毒作用, 如同时加用转录抑制剂放线菌素 D, 则可提高 L929 细胞对 TNF 的敏感性 10~100 倍 利用染料结晶紫或 MTT 可使活细胞染色, 再用脱色液将染料脱出, 测定其 OD 值, 即可反应细胞的存活状态或 TNF 对 L929 细胞的杀伤率, 通过计算细胞死亡率, 并与 stnf 标准品对照, 即可检测待测样品 stnf 活性单位 材料 1. L929 细胞株 ( 存活率应 >95%) 2. TNF 标准品 : 作倍比稀释 (100~0.1U/ml) 3. 待测样品 : 作倍比稀释至少 6 个不同稀释度 % 胰蛋白酶 5. RPMI-1640 培养液及 PBS % 结晶紫 ( 溶于 20% 甲醇中 ), 或者 5mg/ml MTT( 溶于 PBS 中 ) 7. 放线菌素 D( 贮存液浓度为 100µg/ml) 8. 柠檬酸钠缓冲液 (0.9% 柠檬酸钠,0.02mol/L 盐酸,47.5% 乙醇, 为脱色液 ); 酸化异丙醇 (0.04mol/L HCl 异丙醇 ) 孔细胞培养板, 刻度吸管, 毛细吸管, 加样器, 刻度离心管, 离心机, 细胞计数板, 倒置显微镜, 超净工作台,CO 2 培养箱 10. 酶标测定仪,570nm 滤光片,630nm 滤光片 方法 1. 结晶紫法 (1) 取对数生长期的 L929 细胞, 用 0.25% 胰蛋白酶消化 2~3min, 然后洗涤细胞 2 次, 以去除消化液及原生长培养液 (2) 用 RPMI-1640 培养液调 L929 细胞浓度为 /ml (3) 将上述细胞悬液加至 96 孔培养板,100µl/ 孔 (4) 置 37,5% CO 2 培养箱中培养 24h (5) 吸去细胞培养上清液后, 各孔分别加入倍比稀释的标准品和待测样品,100µl/ 孔, 各设双复孔, 并设培养液阴性对照及空白对照 ( 即 L929 细胞 标准品及待测样品均不加入, 仅加培养液 ) (6) 同时向各孔均加入 10µl 放线菌素 D(0.5~1µg/ 孔 ) (7) 置 37,5% CO 2 培养箱中培养 12~14h (8) 甩弃上清, 并用 RPMI-1640 培养液洗细胞 1 次 ; (9) 每孔均加入 0.25% 结晶紫,100µl/ 孔, 室温下染色 10min (10) 甩弃上清, 再用 PBS 洗板 3 次 (11) 室温下晾干, 加入柠檬酸钠缓冲液脱色,100µl/ 孔 (12) 充分混匀后, 用酶标仪以波长 570nm, 参考波长 630nm 测各孔 OD 值 2.MTT 比色法 (1)~(7) 同上述结晶紫法 (8) 直接于每孔中加入 MTT 溶液,10µl/ 孔,37 孵育 4h (9) 从每孔中轻轻吸出培养上清液 100µl/ 孔, 弃去, 再于每孔中加入酸化异丙醇或 DMSO, 100µl/ 孔, 混匀, 置室温 10min (10) 用酶标仪以检测波长 570nm, 参考波长 630nm 分别测各孔 OD 值 结果 1. 取双复孔平均值, 各孔 OD 值为 OD 570nm -OD 630nm, 再减去空白对照 OD 值 2. 根据各孔 OD 值, 分别计算出各稀释度的标准品和待测样品对应的 L929 细胞死亡率 可按下式计算 :

433 阴性对照孔 OD 含 TNF孔 OD 各孔细胞死亡率 = 100% 阴性对照孔 OD 3. 以 log 2 [ 稀释度 ] 为横坐标 (X), 以细胞死亡率 (%) 为纵坐标 (Y), 分别绘制标准曲线和待测样品曲线, 根据导致 50% 细胞死亡的标准品和待测样品曲线, 根据导致 50% 细胞死亡的标准品和待测样品稀释度, 按下式计算样本 TNF 的活性单位 : 标准品导致 50% 细胞死亡的待测样品稀释度 TNF 的活性单位 (U/ml)= 标准品活性单位导致 50% 细胞死亡的标准品稀释度 (U/ml) 4. 亦可根据正态概率纸法和概率单位法求得待测样品 TNF 活性单位 注意事项 1. L929 细胞要充分洗涤, 以去除原培养液, 同时应均匀分布于各孔中, 以免影响检测结果 2. L929 细胞不宜生长过密, 只要孔内长成单层即可使用 3. L929 细胞存活率应 >95% 4. L929 细胞随着传代或受其他因素影响, 对放线菌素 D 的敏感性会有差异, 应先作预试验确定其使用浓度 5. 倍比稀释 TNF 标准品和待测样品时, 应以 1:2 开始至少 6 个稀释度 6. MTT 染色, 其着色深浅不但与细胞数有关, 还与细胞激活有关 如某种因素激活细胞后, 其代谢率将增强, 线粒体琥珀酸脱氢酶活性亦增强, 着色也将加深 因此 MTT 染色时, 应考虑待测样品中是否含有能激活靶细胞的因素存在 7. 加入酸化异丙醇后, 应在 1h 内测定各孔 OD 值 8. 本法亦可适用于待测细胞 mtnf 的检测 细胞因子及其受体的免疫学检测法 细胞因子及其受体的免疫学检测法的基本原理是以细胞因子或细胞因子受体作为抗原, 应用标记的特异性抗体, 利用抗原抗体特异性反应对待测样品中的细胞因子或细胞因子受体进行特异性检测 可检测体液或细胞培养上清液 细胞膜表面的细胞因子或细胞因子受体, 也可检测细胞内 ( 胞浆 ) 的细胞因子 常用的检测方法有 EIA 法 ( 如 ELISA) RIA 法 FIA 法 FCM 术 ( 如 FACS) 等 其中以 ELISA 法最为常用, 它具有特异 敏感 简便 快速 且干扰因素影响较小等特点 但免疫学检测法需要获得标记的特异性抗体, 且所获结果与细胞因子或细胞因子受体的生物学活性并不一定平行, 其灵敏度也往往低于生物活性检测法 由于细胞因子众多, 本节仅以 TNF 和 IL-2R 的免疫学检测为例, 介绍其主要检测方法 一 TNF 的免疫学检测法 肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor, TNF) 是一类能直接导致某些肿瘤细胞坏死的细胞因子, 有 TNF-α 与 TNF-β 两种类型 TNF-α 主要来源于活化的单核 / 巨噬细胞,TNF-β 主要来源于活化的 T 淋巴细胞 虽然两型 TNF 的细胞来源不同, 结构也不同, 但均能与不同的受体结合, 故具有极其相似的生物学活性 TNF 可进入体液成为分泌型 ( 或可溶性 )TNF(sTNF), 也可与细胞膜结合成为跨膜型 ( 或膜结合型 )TNF(mTNF) 应用标记的抗 TNF 特异性抗体, 利用抗原抗体反应检测 TNF 即为 TNF 的免疫学检测法 可检测待测样品中 stnf 的精确定量, 也可检测 mtnf, 还可区分 TNF-α 与 TNF-β 两种类型 主要方法有 ELISA 法 RIA 法 FIA FCM

434 或 FACS 法等 ( 一 ) 双抗体夹心 ELISA 法检测待测样品 stnf-a 含量 原理 选用两株针对 TNF-α 分子不同表位的单克隆抗体, 即 McAb 1 ( 包被抗体 ) 与 McAb 2 ( 酶标 抗体 ) 先用 McAb 1 包被固相载体, 使待测 stnf-α 与之特异性结合, 然后再加入辣根过氧化物 酶 (HRP) 标记的 McAb 2, 则形成 McAb 1 -stnf-α-hrp 标记 McAb 2 复合物, 再加入 HRP 底物, 则酶催化底物显色, 测定样品与标准品光密度值 ( 即 OD 值 ), 绘制标准曲线, 即可从标准曲线 中查得待测样品中 stnf-α 含量 材料 1. 包被抗体 McAb 1 : 使用时用包被液作适当稀释 ( 如 1:100) 2. 酶标抗体 McAb 2 : 以辣根过氧化物酶 (HRP) 标记 使用时用稀释液作适当稀释, 其稀 释度根据预试验结果而定 3. rhutnf-α 标准品 : 已知含量的 rhutnf-α(10ng/ml), 使用时用稀释液作倍比稀释成 7 个 浓度 :5ng/ml,2.5ng/ml,1.25ng/ml,625pg/ml,312pg/ml,156pg/ml,78pg/ml 释 4. 待测样品 : 如血清 血浆 尿液 细胞培养上清液等均可用于 stnf-α, 后者应作适当稀 5. 阴性对照品 : 未免疫小鼠 IgG 6. PBS(0.01mol/L,pH7.4 的磷酸盐缓冲液 ) 7. 包被液 (0.05mol/L,pH9.6 碳酶盐缓冲液 ) 8. 洗涤液 (0.05%Tween-20-PBS) 9. 稀释液 ( 含 2%PEG 的洗涤液或含 10%BSA 的 PBS): 稀释液主要用来稀释酶标 McAb 2 和标准品 rhatnfα 2% PEG 洗涤液的配制 :2.9g NaCl,2.0g PEG(MW6000),0.6ml 鸡蛋清 溶于 100ml PBS 中 10. 底物缓冲液 (0.mol/L,pH5.0 的柠檬酸盐缓冲液 ): 称取 1.79g Na 2 HPO 4 12H 2 O 和 1.29g 柠檬酸, 溶解至 100ml 双蒸水 11. 底物液 ( 显色液 ): 将 10mg OPD 或 5mgTMB 溶于 10ml 底物缓冲液中, 加入 20µl 3%H 2 O 2 ( 临用前配制 ) 12. 终止液 (2mol/L 的 H 2 SO 4 ): 量取 20ml 98% H 2 SO 4, 缓缓加至 80ml 双蒸水中即可 孔酶标板, 酶标测定仪,490nm 滤光片 14. 其他 :4 冰箱, 水浴箱, 刻度吸管, 毛细吸管, 加样器等 方法 1. 包被 : 将用包被液稀释好的 McAb 1 加入 96 孔酶标板内,100µl/ 孔, 置 37 温育 2h 或 4 过夜 ; 2. 洗涤 : 将 96 孔酶标板倾去包被液, 用洗涤液加满各孔, 置室温 3min, 然后倾去 反复洗 涤 3 次 3. 加样 ( 均设双复孔 ) 1 将已知含量 rhutnf-α 标准品用稀释液作倍比稀释后, 分别加入 1~7 孔,100µl/ 孔, 按 浓度从低到高的顺序依次加样 ;2 第 8 孔加入待测样品,100µl;3 第 9 孔加阴性对照血清 ( 未 免疫小鼠 IgG),100µl;410 孔为空白对照 ( 稀释液 ),100µl/ 孔 孔 4. 加样后, 置 37 孵育 1~2h 洗涤 3 次, 方法同前 5. 各孔加入 HRP 标记的 McAb 2, 用稀释液作适当稀释, 其稀释度根据预试验结果而定,100µl/ 6. 置 37 孵育 1~2h

435 7. 洗涤 3 次, 方法同前 8. 显色 : 各孔加新鲜配制的 OPD-H 2 O 2 显色液 ( 或 TMB-H 2 O 2 显色液 ),100µl/ 孔, 置室温或 37 下避光反应 15~30min 9. 终止反应 : 各孔加入终止液 2mol/L H 2 SO 4,50µl/ 孔 10. 测定 OD 值 : 用酶标测定仪, 以波长 490(TMB 为底物时用波长 450nm 比色 ), 测定各孔 OD 值 结果 1. 空白对照及阴性对照孔应无色, 各阳性孔呈现棕黄色, 且 rhutnf-α 标准品各孔呈明显颜色由浅到深梯度 2. 绘制标准曲线 : 以标准品各稀释度 rhutnf-α 含量为横坐标 (X), 相应的 OD 值为纵坐标 (Y), 在普通坐标纸上绘制标准曲线 3. 根据待测样品孔所测得的 OD 值, 在标准曲线上查得样品中 stnf-α 含量 注意事项 1. 血清或血浆中残存的凝块或红细胞须经离心去除, 勿用溶血或血脂过多的血清检测 TNF-α 含量 2. 待测样品在 2~8 可放置 3 天, 超过 3 天应放入 -20 或 -70 冰箱, 且应避免反复冻融, 宜分装保存 3. TNF-α 标准品的质量直接影响待测样品结果的准确性, 应注意商品试剂盒中的标准品可随时间延长而效价降低 4. 分别用加样头吸取各份标本, 避免相互交叉使用 5. 叠氮钠 (NaN3) 对辣根过氧化物酶有灭活作用, 在本实验系统中应避免使用 6. 底物显色液应在临用前配制, 置 4 避光保存,H 2 O 2 应置 2~8, 保存 6 个月以内 加入底物显色 15~30min 后应立即测定 OD 值 7. 应避免反应孔中有气泡, 以免影响所测 OD 值的准确性 8. 用不同来源的样品 不同实验室所测得的 TNF-α 含量不同, 正常值标准也难于统一 可进行大样本测定, 以 X±2SD 确定自己实验室各种来源检测样品的 TNT-α 正常值范围 一般 ELISA 法测定血清标本时,TNF-α 参考值范围为 4.3±2.8µg/L( 或 4.3±2.8ng/ml) ( 二 ) 间接放射免疫法检测待测样品 mtnf 原理 选用两种抗体, 一抗为抗 TNF 抗体, 可与细胞膜表面的 mtnf 特异性结合 ; 二抗为抗一抗抗体, 且标记放射性同位数 125 I, 可与一抗特异性结合, 通过测定其放射活性, 并与标准品对照, 即可间接测定细胞膜表面的 TNF 材料 1. 1% 多聚甲醛 2. 含 3% 牛血清白蛋白的 PBS(3%BSA-PBS) 及 PBS 3. 一抗 : 兔抗 TNF 的抗体 4. 二抗 : 125 I 标记的羊抗兔 IgG 5. 未免疫兔血清 6. 制备好的巨噬细胞悬液 ( 细胞浓度为 ml) 孔 PVC 板 ( 聚苯乙烯板 ) 8. γ- 计数仪, 温浴箱, 刻度吸管, 毛细吸管, 加样器 方法 1. 将准备好的巨噬细胞悬液加入 PVC 板各孔中,0.1ml/ 孔, 再用 1% 多聚甲醛固定于 PVC

436 板中, 然后用 PBS 洗去多余的多聚甲醛 2. 设立不同倍比稀释度的 TNF 标准品 3. 加入 3% BSA-PBS, 每孔 0.1ml,37 孵育 1h, 以封闭抗体非特异性结合位点 4. 弃上清, 每孔加入 1:50 稀释度的兔抗 TNF 血清 ( 一抗 ) 以未免疫兔血清作为阴性对照, 37 孵育 45min 5. 用 PBS 洗 3 次, 以去除未结合的一抗 6. 加入 125 I 标记的羊抗兔 IgG( 二抗,2000cpm/ 孔 ),37 孵育 45min 7. 用 PBS 充分洗板后, 用 γ- 计数仪测量放射活性 8. 从标准曲线中即可求得待测细胞 mtnf 含量 ( 三 )FACS 法检测样品 mtnf 原理 利用荧光标记的抗 TNF McAb 的免疫荧光技术, 并通过 FACS( 荧光激活流式细胞分离术 ), 即可对膜表面结合有 TNF 的单核 / 巨噬细胞进行定性或定量分析与分离 材料 1. 制备好的单核 / 巨噬细胞悬液 2. 含 2% 人血清 0.1% 叠氮钠的 PBS 及 PBS 3. FITC( 异硫氰酸荧光素 ) 标记的抗 TNF McAb 4. 兔抗 TNF 多克隆抗体 5. FITC 标记的羊抗兔 IgG 6. 圆底 96 孔细胞培养板, 离心机, 温浴箱, 刻度吸管, 毛细吸管, 加样器,CO 2 培养箱, 流式细胞液, 细胞计数板 方法 1. 将单核 / 巨噬细胞加或不加激活剂,37,5% CO 2 培养箱中培养一定时间 2. 将单核 / 巨噬细胞悬液以 2000rpm/min 离心 10min, 弃上清 3. 用含 2% 人血清 0.1% 叠氦钠的 PBS 重新悬液细胞, ml 4. 将细胞悬液加入圆底 96 孔细胞培养板中,100µl/ 孔或者 / 孔 5. 再加入 FITC 标记的抗 TNF McAb, 置冰上 20min 6. 用 PBS 洗板 4 次后, 用流式细胞仪分析荧光阳性细胞 ( 即 mtnf 阳性细胞 ) 的百分率及平均荧光强度, 并可进行分离 注意事项 上述介绍的为直接法, 要求具备 FITC 标记的抗 TNF McAb, 如无 FITC 标记的抗 TNF McAb, 则可采用间接法, 操作步骤如下 : 1~4 步同上 5. 加入 1:500 稀释度的兔抗 TNF 多克隆抗体, 置冰上 20min 6. 用 PBS 洗板 1 次, 以去除未结合的抗体 7. 再加入 1:500 稀释度的 FITC 标记的羊抗兔 IgG, 置冰上 20min 8. 用 PBS 洗板 4 次后, 用流式细胞仪分析荧光阳性细胞 ( 即 mtnf 阳性细胞 ) 的百分率及平均荧光强度, 并可进行分离 二 IL-2R 的免疫学检测法 白介素 2 受体 (interleukin 2 receptor, IL-2R) 是能与 IL-2 特异性结合的细胞受体 IL-2R 由

437 α β γ 链组成 IL-2R 存在形成包括膜结合型 IL-2R(membrane-bound IL-2R, mil-2r) 与可溶性 IL-2R(solubble IL-2R, sil-2r) sil-2r 是由于某种因素 ( 如位点特异性蛋白酶裂解作用 ) 使 mil-2r α 链 (P55,CD25,Tac 抗原 ) 脱落进入体液而形成,( 是 mil-2r 的清除形式之一 ) 体液中 sil-2rα 升高是抗原强烈刺激的标志以及 T 淋巴细胞活化的标志 sil-2r 由 mil-2r+ T 细胞释放, 可存在于血清 尿液及淋巴细胞培养上清液中 应用标记的抗 IL-2R 特异性抗体和抗原抗体反应可检测待测样品中 sil-2r 含量, 也可检测 mil-2r 目前多以双抗体夹心 ELISA 法或 ELISA 抗原竞争法检测 sil-2r 含量, 以间接免疫荧光法或放射免疫法检测 mil-2r ( 一 ) 双抗体夹心 ELISA 法检测待测样品 sil-2r 含量 原理 选用两株针对 sil-2r 分子不同表位的单克隆抗体, 即 McAb 1 ( 包被抗体 ) 与 McAb 2 ( 酶标抗体 ) 先用 McAb 1 包被固相载体, 使待测 sil-2r 与之特异性结合, 然后再加入辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的 McAb 2, 则形成 McAb 1 -sil-2r-hrp 标记 McAb 2 复合物, 再加入 HRP 底物 ( 邻苯二胺或四甲基联苯胺 ), 则酶催化底物而显色, 测定样品与标准品 OD 值, 绘制标准曲线, 即可从标准曲线中查得待测样品中 sil-2r 含量 该法敏感性高, 且特异 简便 快速 取材容易, 故较为常用 材料 1. 包被抗体 (McAb 1 ): 使用时用包被液作适当稀释 ( 如 1:100) 2. 酶标抗体 (McAb 2 ): 以辣根过氧化物酶 (HRP) 标记 使用时用稀释液做适当稀释, 其稀释度根据预试验结果而定 3. sil-2r 标准品 : 已知含量的 sil-2r, 使用时用稀释液作倍比稀释成 7 个浓度 :1600U/ml, 800U/ml,400U/ml,200U/ml,100U/ml,50U/ml,25U/m1 4. 待测样品 : 如血清 血浆 尿液 细胞培养上清液等均可用于检测 sil-2 5. 阴性对照品 : 未免疫小鼠 IgG 6. PBS(0.01mol/L,pH7.4 的磷酸盐缓冲液 ) 7. 包被液 (0.05mol/L,pH9.6 的磷酸盐缓冲液 ) 8. 稀释液 ( 含 10% BSA 的 PBS) 9. 洗涤液 (0.05% Tween20-PBS) 10 底物缓冲液 (0.1mol/L,pH5.0 的柠檬酸 - 磷酸氢二钠缓冲液 ) 11. HRP 底物 : 邻苯二胺 (OPD) 12. 3% H 2 O 底物显色液 (OPD-H 2 O 2 ): 临用前配制,4 避光保存 14. 终止液 (2mol/L H 2 SO 4 ) 孔酶标板, 酶标测定仪,495nm 滤光片 16. 其他 :4 冰箱, 水浴箱, 刻度吸管, 毛细吸管, 加样器及吸头 方法 1. 包被 : 将用包被液稀释好的 McAb1(5~10µg/ml) 加入 96 孔酶标板,100µl/ 孔, 置 37 2h 后移置 4 过夜 (16~72h) 2. 洗涤 : 将 96 孔酶标板包被液倾去, 用洗涤液加满各孔, 置 3min, 然后弃去, 反复洗涤 3 次 3. 加样 ( 均设双复孔 ): 1 将已知含量的 sil-2r 标准品用稀释液作倍比稀释后, 分别加入 1~7 孔,100µl/ 孔, 按浓度从低到高的顺序依次加样 ;2 第 8 孔加入待测样品,100Vl;3 第 9 孔加阴性对照血清 ( 未免疫小鼠 IgG),100µl;4 第 10 孔为空白对照 ( 稀释液 ),100µl

438 4. 加样后, 置室温孵育 1~2h 5. 洗涤 3 次, 方法同前 6. 各孔加入 HRP 标记的 McAb 2 ( 根据预试验结果确定其适当稀释度 ),100µl/ 孔 7. 置 37 孵育 1~2h 8. 洗涤 3 次, 方法同前 9. 显色 : 各孔加新鲜配制的 OPD-H 2 O 2 显色液,100µl/ 孔, 置室温或 37 下避光反应 15~ 30min 10. 终止反应 : 各孔加 2mol/L H 2 SO 4,50µl/ 孔 11. 测定 OD 值 : 用酶标测定仪以波长 495nm 测定各孔 OD 值 结果 1. 空白对照及阴性对照孔应无色, 各阳性孔呈现棕黄色, 且 sil-2r 标准品各孔呈明显颜色 由浅到深梯度改变 2. 绘制标准曲线 : 以标准品各稀释度 sil-2r 含量为横坐标 (X), 相应的 OD 值为纵坐标 (Y), 在普通坐标纸上绘制标准曲线 3. 根据待测样品孔的 OD 值, 在标准曲线上查得待测样品 sil-2r 含量 注意事项 1. 血清或血浆中残存的凝块或红细胞须离心去除, 勿用溶血或血脂过高的血清检测 sil-2r 2. 待测样品在 4 可放置一周, 如不立即检测应置于 -20 或 -70 冰箱中, 且应避免反复冻 融, 宜分装保存 3. sil-2r 标准品质量直接影响检测结果的准确性, 应注意商品试剂盒中的 sil-2r 标准品可 随时间延长而降低效价 4. 叠氮钠 (NaN 3 ) 对辣根过氧化物酶有灭活作用, 在本实验系统中应避免使用 5. 底物显色液应在临用前配制,4 避光保存,H 2 O 2 应置 2~8, 保存 6 个月以内 加入 底物显色 15~30min 后应立即测定 OD 值 6. 分别用加样器头吸取各份标本, 避免相互交叉使用 7. 避免孔中有气泡, 以免影响所测 OD 值的准确性 8. 因不同来源的样品, 不同实验室所测得的 sil-2r 含量不同, 故 sil-2r 正常标准难以统一 可进行大样本测定, 以 X ±2SD 确定自己实验室各种来源检测样品的参考值范围 在临床观察 中, 一般以 sil-2r 水平升高有意义, 故可设立 X ±2SD 为正常值上限 一般用 ELISA 法测定血清时,sIL-2R 水平 <200~300U/ml ( 二 )ELISA 抗原竞争法检测样品中 sil-2r 含量 原理 本法是用纯化或重组的 IL-2R(α 链,P55,CD25,Tac 抗原 ) 蛋白包被 96 孔酶标反应板, 同时加入已知量的抗 IL-2R McAb, 再分别加入 sil-2r 标准品与待测样品 则待测 sil-2r 或者 sil-2r 标准品与包被的纯化或重组的 IL-2R 蛋白竞争与抗 IL-2R McAb 结合 通过与标准品对照, 从抗 IL-2R McAb 与包被的纯化或重组的 IL-2R 蛋白结合受抑制程度来求得待测样品中 sil-2r 含量 材料 1. 纯化或重组的 IL-2R 蛋白 (α 链,P55,CD25,Tae 抗原 )( 40.00U/ml) 2. FITC 标记的抗 IL-2R McAb(0.2µg/ml):FITC 为异硫氰酸荧光素, 这里仅作为半抗原使用, 而不作为荧光素标记 3. 碱性磷酸酶标记的兔抗 FITC 抗体 ( 酶标抗体 ) 4. 对硝基苯磷酶盐底物液 ; 用 ph9.8 的二乙醇胺缓冲液溶解, 配成浓度为 1mg/ml

439 5. 1% 牛血清白蛋白 -PBS(1%BSA-PBS): 为封闭液点稀释液 6. 不同倍比稀释度的 sil-2r 标准品 : 以 1%BSA-PBS 稀释 7. 洗涤液 (0.05% Tween20-PBS) 8. 待测 sil-2r 样品 孔酶标板 ( 聚苯乙烯板 ), 酶标仪, 波长 465nm 滤光片 10 刻度吸管, 毛细吸管, 加样器 ),4 冰箱 方法 1. 以一定浓度的纯化或重组的 IL-2R(P55) 蛋白包被 96 孔酶标板,100µl/ 孔,4 过夜 (16~ 72h) 2. 弃包被液, 用 1%BSA-PBS 封闭非特异性结合位点,200µl/ 孔, 置室温 2h 3. 用洗涤液加满各孔置 3min, 然后倾去, 反复洗涤 3 次 4. 分别加入不同稀释度的 sil-2r 标准品及待测样品,50µl/ 孔 5. 各孔均加入 FITC 标记的 IL-2R McAb,50µl/ 孔, 充分混匀后置室温 2h 6. 同上洗涤 3 次 7. 各孔均加入碱性磷酶酶标记的兔抗 FITC 抗体,100µl/ 孔, 置室温 1h 8. 同上洗涤 3 次 9. 各孔均加入底物液,100µl/ 孔, 置室温 15~30min 10. 用酶标仪以波长 405nm 测各孔 OD 值 结果 1. 以 sil-2r 标准品各稀释度对应的浓度值为横坐标 (X), 相应的 OD 值为纵坐标 (Y), 在普通坐标纸上绘制竞争抑制标准曲线,OD 值随标准品 sil-2r 浓度升高而降低 2. 根据待测样品所测得的 OD 值, 在标准曲线上查得样品 sil-2r 含量 3. 本方法测定 sil-2r 含量时, 不需要计算抑制百分率 注意事项 1. 本方法的敏感度低, 大约为 5,000U/ml, 大大低于双抗体夹心 ELISA 法 (10U/ml) 因此不适合检测正常人标本中 sil-2r 含量, 仅适用于检测 sil-2r 含量极度增高的样品, 如接受抗 IL-2R 抗体治疗等患者标本, 或作为监测移植排斥反应的一个指标 2. 若无纯化或重组的 IL-2R 蛋白, 可用 PHA 刺激的外周血单个核细胞包被 96 孔酶标板, 吹干, 固定, 再用 1% H 2 O 2 处理以抑制内源性过氧化物酶后即可使用 3. 其余多见双抗夹心 ELISA 法测定 sil-2r 含量部分 4. 试剂配制多参见 TNF-α 的免疫学检测部分 ( 三 ) 间接免疫荧光法检测样品中 mil-2ra + 阳性细胞 原理 利用抗 IL-2Rα McAb( 一抗 ) 与细胞膜表面的 mil-2r 特异性结合, 再选用 FITC 标记的 ( 羊或兔 ) 抗小鼠 IgG( 二抗 ) 与一抗特异性结合, 即可借助荧光显微镜直接观察或利用流式细胞术 ( 如 FACS) 分检细胞群体中 mil-2rα + 细胞比例 下面检测人 PBMC 表面的 mil-2rα 为例 材料 1. 一抗 : 任意一株抗 IL-2Rα McAb, 例如测定人源细胞 mil-2rα 时, 多选用抗 TacMcAb (Tac 即为 IL-2Rα 链,P55,CD25) 2. 二抗 :FITC 标记的羊 ( 或兔 ) 抗小鼠 IgG, 使用时作适当稀释 ( 如 1:8 或 1:16), 稀释液为 1% BSA-PBS 3. 待测细胞 ( 如 PHA 刺激的人外周血淋巴细胞 ): 用 5% FCS-Hanks 液调浓度为 /ml, 细胞存活率应 >95%

440 4. 人 Ig( 封闭非特异性结合位点 ) 5. 5% FCS-Hanks 液,1% BSA-PBS 液 6. 1% 多聚甲醛 7. 小试管 (10 75mm), 刻度吸管, 毛细吸管, 加样器, 细胞计数板, 倒置显微镜,4 冰箱, 载玻片, 盖玻片, 离心机 8. 荧光显微镜或流式细胞仪 方法 1. 将待测细胞 (PHA 刺激的人 PBMC) 加入小试管中,100µl/ 管, 即 / 管 2. 向试管内加入人 Ig,100µl/ 管, 孵育 15min 以去除抗体的 Fc 段非特异性结合 ( 此步可省去 ) 3. 加入抗 Tac McAb( 一抗 ),100µg/100µl/ 管,4 孵育 30~60min 4. 加入 2ml 冷的 5% FCS-Hanks 洗涤 2~3 次,1500rpm/min 离心 5min 5. 加入适量稀释的 FITC 标记的羊 ( 或兔 ) 抗小鼠 IgG( 二抗 ),100µl/ 管,4 孵育 30min 6. 加入 2ml 的 5% FCS-Hanks 洗涤 2~3 次,1500rpm/min 离心 5min 7. 进行 FACS 分析, 分析荧光阳性细胞百分比及平均荧光强度 8. 或者 : 用 1% 多聚甲醛固定细胞后, 用毛细吸管吸取固定后的细胞滴加于载玻片上, 用荧光显微镜计数荧光阳性细胞, 计数荧光阳性细胞百分比 结果 1. FACS 不仅可以分析荧光阳性细胞的 (mil-2rα + 细胞 ) 百分比, 还可进行细胞分离 2. 用荧光显微镜计数时, 先在普通光源下计数视野中淋巴细胞总数, 每份标本应至少计数 200 个淋巴细胞, 然后再在荧光光源下计数荧光阳性细胞 (mll-2rα + 细胞 ) 数, 最后计算出 mil-2rα + 细胞数百分比 3. 荧光阳性细胞特点是 : 在细胞膜上可见明亮的黄绿色斑点状或半月形 ( 帽状 ) 荧光, 有时亦可到整个细胞膜周围呈环状荧光, 均为荧光阳性细胞 ( 即 mil-2rα + 细胞 ) 注意事项 1. 待测细胞活性应 >95% 2. 应去除样品中的红细胞, 以免影响结果 3. 混杂的多形核细胞亦可呈现片状或均匀的荧光染色, 应在普通光源下加以区分与排除 4. 计数细胞时应使用高倍镜头观察 5. 还可用放射性同位数 ( 125 I) 标记的抗 IL-2Rα McAb 进行放射免疫分析检测待测细胞膜表面的 mil-2rα 三 细胞内细胞因子的免疫学检测法 原理 基本原理是应用荧光素标记的特异性抗细胞因子单克隆抗体, 借助 FCM 免疫荧光技术 ( 如 FACS) 即可从单细胞水平检测不同细胞内的细胞因子, 并由此可判断产生特定细胞因子的细胞种类 细胞定位, 分布密度及细胞因子与组织病变的关系等 也可将细胞裂解后, 应用 ELISA RIA 等技术检测细胞与细胞因子水平 现以 FCM 免疫荧光法检测人 PBMC 内的细胞因子为例加以简单介绍 方法与结果 1. 人 PMBC: 常规分离人 PBMC, 用含 10% 小牛血清,50µmol/L 2- 巯基乙醇 1mmol/L 丙酮酸钠的 RPMI-1640 完全培养液将 PBMC 调浓度为 /ml 2. 细胞培养与收集 : 取 6 孔细胞培养板, 加上述细胞悬液,2ml/ 孔, 并加入 2µmol/L 莫能菌

441 素 (monensin, 抑制细胞分泌细胞因子 ) 1µmol/L 艾罗雯素 (ionomycin) 和 20ng/ml PMA 刺激细胞产生细胞因子 在 37,5% CO 2 培养箱中培养适当时间, 根据实验需要, 可用不同方法刺激细胞诱导细胞产生细胞因子 用 4 PBS 洗涤细胞 1 次, 留下少许液体用于悬浮细胞, 使细胞完全分散于离心管中 3. 细胞固定 ( 可固定细胞内的细胞因子 ): 于每管中加入 4% 多聚甲醛 ( 用 PBS 配制, 置 37 预温 )3ml, 充分混悬细胞, 固定 5min 再加入 0.1% BSA-PBS 12ml, 混匀以终止反应 1500rpm/min 离心 10min, 去上清液后进行封闭和染色 ; 亦可用 1ml 含 10% DMSO( 二甲亚砜 ) 的 PBS 悬浮细胞, 分装保存于 -80 冰箱备用 4. 封闭非特异性结合位点 : 取上述固定的细胞 ( 或复苏冻存的细胞, 用 0.1% BSA-PBS 洗涤细胞 2 次 ), 用悬浮液 ( 含 5% 脱脂奶粉的 PBS-Ca-Mg:1mmol/L Ca 2+ 1mmol/L Mg % 皂角苷和 0.1% BSA 的 PBS) 悬浮细胞至 10 6 /100µl 室温下作用 1h, 封闭非特异性结合位点, 并增加细胞膜的通透性, 以利于荧光素标记的抗细胞因子单克隆抗体能进入细胞内与胞浆中的细胞因子特异性结合 取 96 孔塑料软板或 V 型底离心管, 每孔 ( 管 ) 加入上述细胞悬液 20µl, 离心去上清 用悬浮液稀释不含特异性抗体的同种抗体 0.1mg/ml 以封闭非特异性结合位点 ; 同样将未标记的荧光素的抗细胞因子单克隆抗体稀释至 0.1mg/ml 分别于每孔( 管 ) 中加入 50µl 同种抗体 ( 为染色试验管 ) 未标记荧光素的单抗或含 100~1000 倍量细胞因子的悬浮液 ( 未标记荧光素的单抗或过量的细胞因子可以封闭特异性结合位点, 作为阴性对照 ) 置室温 1h 5. 染色与分析 : 再加入荧光素标记的抗细胞因子单抗于各管中,4 下作用 30min, 用 PBS-Ca-Mg 洗涤细胞 3 次 ( 增加细胞通透性 ), 将细胞悬浮于 0.1% BSA-PBS 中, 即可进行 FCM 分析, 从单细胞水平检测不同细胞内的细胞因子种类和含量 细胞因子的分子生物学检测法 细胞因子基因的检测包括对其 DNA 的检测和 mrna 表达水平的检测 特定细胞因子 mrna 表达水平的检测有助于判断细胞表达该细胞因子的水平 ; 而细胞因子 DNA 的检测可以判断该细胞因子基因存在与否及其变异情况 常用的方法有 Southern 印迹 斑点印迹 PCR, 原位杂交及原位 PCR 等,Northern 印迹及 RT-PCR 这里简要介绍常见细胞因子 mrna 表达水平的检测 一 斑点杂交法测定培养细胞 IL-2 mrna 的含量 本法可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析 该法先将 RNA 变性后直接点样于硝酸纤维膜上, 可用手工操作点样, 也可用斑点式点样器点样, 再与特异性探针进行杂交 由于其操作比 Northern 印迹简单 迅速 所需样品量少, 且可在同一张膜上同时进行多个样品的检测, 故很适合于临床应用 亦可用于 DNA 的检测 但其缺点是不能鉴定所测基因的分子量 下面以检测培养细胞的 IL-2 mrna 含量的检测, 说明斑点杂交法的操作过程 ( 一 ) IL-2 质粒 DNA 探针的制备 材料 1. 含 IL-2 DNA 探针的质粒以及宿主菌

442 2. STE 溶液 :0.1mol/L NaCl 3. Tris HCl(pH8.0):10mmol/L 1mmol/L 4. 溶液 Ⅰ: 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris HCl(pH 8.0) 10mmol/L EDTA(pH 8.0) 可配 100ml, 高压灭菌 15min, 贮存于 4 5. 溶液 Ⅱ: 0.2mol/L NaOH( 临用前用 10mol/L 贮存液稀释 ) 1%SDS( 配 20% 贮存液 ) 盖紧瓶盖, 颠倒离心瓶数次, 以充分混匀内容物, 于室温放置 5~10min 6. 溶液 Ⅲ: 5mol/L 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 所配成的溶液对钾是 3mol/L, 对乙酸根是 5mol/L 7. 含相应抗生素的 LB 增养基 8. 氯霉素 (0.25g/2ml) 终浓度 170µg/ml 9. 溶菌酶 (10mg/ml, 溶于 10mmol/L Tris HCl ph8.0)1ml 10. 无水乙醇 ( 部分 -20 预冷 ), 异丙醇,75% 乙醇 ( 部分 4 预冷 ) 11. TE 缓冲液 (ph8.0) 12. 5mol/L LiCl 1.5ml 13. RNA 酶 14. 3mol/L NaAC 15. 饱和酚 16. 氯仿 : 异戊醇 (24:1) 17. 质粒提取试剂盒 (Promega: Wizard Minipreps DNA,NO117) 18. 低温高速离心机 19. 恒温摇床 方法 1. 含 IL-2 质粒 DNA 探针的提取 : 取含 IL-2 质粒 DNA 的单个菌落置两个 25ml LB 培养基 ( 含 100µg/ml Amp) rpm/min 振摇过夜 ( 约 16h) 取 10ml 菌液加 200ml LB 培养液 ( 含 100µg/ml Amp) rpm/min 振摇 4h 加氯霉素 ( 终浓度 170µg/ml) rpm/min 振摇 3h 菌液倒入 300ml 离心管中离心 rpm/min 10min 离心弃上清除去残液 ( 吸水纸无菌 ) 每管加 40ml STE 溶液 ( 冰预冷 ) 悬浮细菌后, 用移液管转入到 50ml 离心管中 rpm 15min 离心弃上清, 加 5ml 溶液 Ⅰ( 冰预冷 ) 悬浮细菌, 加 1ml 新配制 (ph8.0) 的溶菌酶 (10g/ml) 轻摇, 室温静置 5min 加 10ml 溶液 Ⅱ, 盖上盖子, 将离心管小心颠倒数次混合液体, 不要用旋涡振荡器 冰浴 10min, 且勿摇动

443 加 7.5ml 溶液 Ⅲ( 冰预冷 ) 摇振荡离心管数次使之混合 冰浴 20~30min, 使沉淀完全, rpm/min 20min 离心取上清到另 -50ml 离心管中, 加 0.6 体积异丙醇, 混匀 室温静置 15min 室温 5000rpm/min 15min 离心弃上清用 75% 乙醇洗涤沉淀一次 ( 不将沉淀悬浮 ), 将乙醇倒置吸水纸上, 使乙醇挥发 用 1.5ml TE(pH8.0) 将沉淀溶解加等体积冰预冷的 5M LiCl, 混匀后置冰溶 10min rpm/min 10min 离心取上清至新 EP 管, 加等体积的异丙醇 ( 约 3ml) 充分混合 室温静置 15min 室温 12000rpm/min 10min 离心 ( 回收沉淀的核酸 ) 小心去上清, 将管倒置以使最后残留的液滴流尽, 用 75% 乙醇洗涤沉淀, 流尽乙醇, 用吸低吸去附于管壁的液滴, 将管倒置在纸巾上数分钟, 以使最后残余的痕量乙醇蒸发 加入 RNA 酶 ( 终浓度 100µg/ml) 用 500µl 溶解沉淀 DNA, 移至新 EP 管中 37 水浴 30min 加等体积 (500µl) 含 13%(W/V)PEG(800) 的 1.6mol/L NaCl, 充分混合 rpm/min 5min 离心吸去上清用 400µl TE(pH8.0) 溶解质粒 DNA 沉淀 加等体积饱和酚 (400µl) 混合 12000rpm/min 10min 离心吸上层水相移至另一职管加入等体积酚 : 氯仿 : 异戊醇 (25:24:1) 剧烈混匀至乳白状 12000rpm/min 10min 离心吸上层水相移至另一 EP 管, 加等体积氯仿 : 异戊醇 (24:1) 混匀 12000rpm/min 10min 离心吸上层水相移至新 EP 管 ( 硅化 ) 加入 0.1 体积的 3mol/L NaAC(pH5.2) 和 2 体积的 -20, 预冷的无水乙醇 混匀 ( 可见沉淀出现 ), 置 -20 2h 或 0 20min rpm/min 15min 离心弃上清, 加 75% 乙醇 (4 预冷 )200µl, 稍加振荡, 离心洗涤 2 次 rpm/min 5min 离心去上清敞开管口, 将管置于实验桌上直到最后可见的痕量与乙醇挥发 溶沉淀于 11µl TE 溶液中 取 1µl 电泳其余进行酶切 2. 经 0.7% 琼脂凝胶电泳, 确定有质粒 DNA 后, 用 XhoI 进行酶切 : 酶切反应体系 :10µl 质粒 DNA,6µl 内切酶 XhoI,6µl 10 X 酶切缓冲液,38µl 蒸馏水, 总体积为 60µl;37 消化过夜 3. IL-2 DNA 片段的回收和纯化 : 可以使用任何一种回收与纯化 DNA 片段的方法, 下面介绍的是用 WizardTNPCR 纯化试剂盒回收 IL-2 DNA 片段 (1) 将 60µl 酶切反应体系经 1% 琼脂糖凝胶电泳 (2) 紫外灯下切下 IL-2 DNA 片段, 挑出凝胶到 EP 管中, 加 1ml Resin, 使凝胶深化 (3) 用 5ml 一次性注射器将 Resm/DNAmix 转移到 Wizard Minicolumn 中 (4) 用 2ml 80% 异丙醇洗涤 Minicolum 5)12000g 离心 20min

444 6) 将 Minicolumn 转移至新 EP 管中, 加 50µl 三蒸水到 Minicolumn 中,12000g 离心 20S, 收集 DNA ( 二 ) IL-2 DNA 探针的标记 地高辛是一种仅存在于洋地黄类物质花叶中的类固醇半抗原, 又称异羟基洋地黄毒甙配基, 地高辛精可以通过一个 11 个碳原子的连接臂与尿嘧啶核甘酸嘧啶环上的第 5 组碳原子相连接形成地高辛精标记的尿嘧啶甘酸 :Boehringer Mannheim 公司出售的地高辛精标记核苷酸有 dig-utp,dig-dutp 和 dig-ddutp, 它们分别适用于 RNA 探针 DNA 探针和寡核苷酸探针的标记 地高辛精标记核甘酸主要通过酶反应标记核酸探针, 用标记探针做原位杂交, 杂交体用特异性抗地高辛精抗体通过免疫组化技术检测 在适宜的标记反应条件下, 一般在 20~25 个核苷酸中带有一个标记的核苷酸 这一标记密度最利于半抗原与碱性磷酸酶标记的抗地高辛精之间的反应 因为一个标记抗体大约覆盖 20 个核苷酸 Boehringer Mannheim 公司生产的地高辛精 DNA 标记试剂盒和地高辛检测试剂盒在分子杂交中的应用愈来愈广泛 材料 1. 地高辛标记和检测试剂盒 (Boerhinger Mannheim,No: ): 其中包括六聚核苷混合物,dNTP 混合物,Klenow 聚合酶等 2. 乙醇,LiCl,TE 缓冲液等 3. 台式高速离心机, 水浴箱 方法 1. 将 DNA(1~3µg) 加热 95 ( 或 100 )10min, 随即在冰浴中骤冷,DNA 充分变性对探针标记十分重要 5µl DNA 作为对照 2. 将离心管置于冰上, 按顺序加入下列试剂 :1l~3µg 新鲜变性 DNA;22µl 六聚核苷混合物 ;32µl dntp 混合物, 加人蒸馏水使总体积达到 19µl, 再加入 1µl Klenow 聚合酶 3. 离心片刻后, 将离心管置 37 恒温箱内孵育 60min 延长孵育时间可长达 20h, 可使标记量增加 4. 加入 2µl 0.2mol/L,EDTA(pH8.0), 终止酶反应 5. 加入 2.5µl 4mol/L LiCl 和 75µl 乙醇 (-20 预冷 ), 混匀置 min 或 -20 2h 使标记探针沉淀 6. 离心 (16500rpm/min), 弃上清液, 用 50µl 70% 冷乙醇轻洗沉淀物 6. 将沉淀物置于真空干燥仪内干燥后, 溶解于 50µl TE 缓冲液 -20 冰箱保存 注意事项 1. 随机引物标记前必须将探针变性 :100 沸水浴 10min 后, 迅速插入冰中, 缺口平移则不需变性 2. DNA 片段必须小于 10kb 大于 10kb 的 DNA 序列则需要酶切 最小能为随机法标记的片段是 52bp, 一般探针长度以大于 100bp 为好 3. 随机法标记过夜能够获得较高的标记产量 ( 三 ) 培养细胞 RNA 的提取 ( 采用 Trizol 试剂盒提取 RNA) 材料 1. RNA 提取试剂 :TRIZOL 试剂 (Gibcol No: ) 2. DEPC 处理的双蒸水, 乙醇 3. RPMI-1640, 胎牛血清 (FCS),ConA( 刀豆蛋白 A) 4. CO 2 培养箱

445 5. 无菌操作台和离心机等 方法 1. 收集培养细胞, 用 RPMI-1600 培养液离心洗涤 3 次, 第二次离心洗涤时用 RPMI-1640 培养液调整细胞数至 ~ 细胞 2. 最后一次洗涤时吸 1ml 细胞悬液至 1.5ml EP 管中, 在台式离心机离心, 弃上清加入 1ml TRIZOL 试剂, 用移液器轻轻吹打细胞数次, 充分混匀, 室温 (15~30 ) 静置 5min 后加入 0.2ml 氯仿, 快速摇动 15S, 室温静置 2~3min 3. 于 2~8 离心 14600rpm/min 15min, 上层无色水相 (RNA 溶于此层中 ) 约占整个细胞匀浆液的 60% 4. 小心吸取其中 400µl 移至另一 Eppendorf 管中, 加入 0.5ml 异丙醇轻柔混匀, 室温静置 5~ 10min 5. 于 2~8 离心 14600rpm/min 10min, 在管壁下底处可见一乳白色小沉淀块, 即为 RNA 弃上清 6. 用冰冷 75% 乙醇 1ml 洗 RNA 沉淀 ( 不用吹打沉淀 ), 然后于 2~ rpm/min 离心 5min, 去除上层乙醇后于无菌环境 ( 或真空 ) 风干 RNA 沉淀, 但不要使沉淀过于干燥, 以免影响 RNA 的溶解, 用 20µl DEPC 处理的双蒸水溶解 RNA 沉淀, 置 -80 冰箱备用 ( 四 )RNA 的斑点杂交 1. 将样本 RNA 点膜 材料 (1)20 SSC( 标准柠檬酸盐缓冲液 )( ph7.0) NaCl 175.3g 柠檬酸钠 88.2g 加 H 2 O 至 1000ml 用 10N NaOH 或 10N HCl 调 ph 至 7.0, 高压灭菌 (2)37% 甲醛 (3) 甲酰胺 (4)2 Denhardt 液 (5) 硝酸纤维素膜 (6) 多孔过滤加样器和真空泵 (7) 恒温水浴摇床 (8) 加样器和吸头等 方法 (1) 样本 RNA 变性 : 20µl RNA 溶液 (2µgRNA) 4µl 20 SSC 14µl 37% 甲醛 40µl 100% 甲酰胺将上述溶液混匀, 置 60 温育 30min, 冰浴冷却样品, 使样本 RNA 变性 在上述 RNA 液体中每 100µl 液中加 210µl 20 SSC( 共 31µl), 作为点样溶液, 点样时每孔加 150µl (2) 纤维素膜处理 : 硝酸纤维素膜 (0.45µm) 水中浸泡 5min, 再用 20 SSC 室温浸泡 1h (3) 滤器的处理及点样 : 用 0.1N NaOH 浸泡 ( 洗 ) 多孔过滤加样器, 再用灭菌水彻底冲洗 将纤维素膜压在多孔加样器的上层板的上面, 再压在下层板上, 赶去气泡, 然后两部分夹紧, 点样前, 先用 20 SSC(200µl) 洗一遍每个孔, 真空抽吸干净后, 再分别点样 如有未点样孔

446 须用 150µl 的 20 SSC 封住其孔, 然后用真空泵抽吸干净, 再用 20 SSC 清洗一次, 待液体滤 过纤维膜后, 继续抽吸 5min 以干燥滤膜 (4) 取出膜,80 烤 2~3h, 膜保存于 杂交 材料 (1) 预杂交液 :5 SSC,2 Denhardt 液 ( 或采用试剂盒的相应试剂 ),0.02%(W/V)SDS (2) 杂交液 DIG Easy Hyb (3) 杂交袋 (4) 含 0.1% SDS 2 SSC 和含 0.% SDS 0.1 SSC 方法 (1) 预杂交 : 1) 先将预杂交液热至 60 2) 将带有目的 RNA 的硝酸纤维素膜放入稍宽于滤膜的杂交袋, 加入预杂交液, 按每 100cm 2 滤膜加 20ml 3) 尽可能除净袋中的空气, 用热封口器封住袋口, 将其置 60 水浴过夜, 其间不断翻动 塑料袋 (2) 杂交 : 1) 杂交液 DIG Easy Hyb(20ml/100cm 2 ) 预温轻振荡 30min; 将标记探针 DNA(5~25ng/ml) 煮沸变性 5min, 迅速置冰水中冷却 2) 加入到预温的 DIG Easy Hyb(2.5ml/100cm 2 ) 中混合, 避免形成气泡 3) 探针 /DIG Easy Hyb 注入杂交袋中, 封好杂交袋 4)68 振荡孵育至少 6h, 在微量 DNA 时建议 16h, 使其杂交 5)2 SSC,0.1%SDS 清洗 2 次, 每次 5min 室温 6)68 振荡条件下,0.1 SSC,0.1% SDS 清洗 2 次, 每次 15min 注意事项 (1) 中和 : 尤其是计划使用硝纤膜时, 凝胶中和后需查一下 ph 值,pH 值应小于 9.0, 否 则会导致膜变黄和破坏 尼龙膜可以承受更高的 ph 值 (2) 转移 : 最好选用尼龙膜 ( 带正电荷 ) 处理膜时绝对小心, 不能将指痕印在膜上, 只能 用无齿镊夹边角位置 (3) 固定 : 转膜后的 DNA 必须固定才能用于杂交 一般采用紫外光照射即可 (4) 标记和杂交的各种溶液应高压灭菌 ; 含 SDS,Tween20 的溶液应经滤膜除菌后加入其 他溶液 ; 使用灭菌吸头, 干净器皿, 每次用前必须严格清洗 操作膜时戴无尘手套 ; 只用无齿 镊操作膜的边缘 (5) 探针浓度 : 探针浓度是非常重要的因素, 应予高度重视 浓度过高会增加背景, 浓度 过低又会导致敏感性下降 应通过模拟杂交试验来确定最佳浓度 (6) 可用 β-actin 作为内参考对照 ( 五 ) 免疫测定 材料 地高辛标记和检测试剂盒 (Boerhinger Mannheim,No: ) 方法 (1) 杂交后彻底清洗, 将膜置入清洗缓冲液中 1~5min (2)100ml 封闭缓冲液 (1 ) 中封闭 30min (3) 抗地高辛 -AP 复合物 (75mU/ml) 用封闭缓冲液 (1 )1:10000 稀释 (4) 稀释的抗体溶液 20ml 与膜孵育 30min

447 (5)100ml 清洗缓冲液中 2 次, 每次 15min (6)20ml 测定缓冲液中平衡 2~5min (7) 将膜置入新鲜制备的 20ml 显色液中孵育 5min( 暗处, 即避光 ), 显色过程中避免振动 (8) 数分钟显色沉淀开始形成,16h 后反应完全, 可短期在亮处观察显色情况 (9) 如果可见期望的斑点, 加 TE 缓冲液 50ml 作用 5min 终止显色 ( 六 ) 图像分析结果采用 MPIAS-500 多媒体彩色图文分析系统, 以 0.758µm 波长取样 在 µm 2 测量 窗下测得各斑点的积分光密度值, 以标准品的相应参数作图, 查得各样本的数值, 或将各组织 分光密度值进行比较, 得出样本相应 mrna 含量 也可以用其他型号的光密度扫描仪进行扫描, 检测每点的光密度, 与标准品光密度曲线比 较, 得出样本相应 mrna 含量 二 原位杂交法测定 TNF 的 mrna RNA-DNA 原位杂交的原理与分子杂交其他方法的原理相同 但是其他方法都是将 RNA 提取出来后进行分子杂交, 而原位杂交则是在细胞内 mrna 原有位置上进行杂交, 细胞则尽可能保持原有形态 将细胞以适当方法固定后, 除去脂类并适当消化细胞内的蛋白质, 增大细胞对大分子物质的通透性, 使 DNA 探针便于出入细胞 与免疫组化相结合, 原位杂交可以将显微镜下的组织形态学资料与 DNA,mRNA, 蛋白质水平的基因活动联系起来 进行分子杂交之后, 将玻片上细胞置与显微镜下观察, 可确定不同细胞内的基因表达定位情况 ( 一 ) 细胞样本的制备 固定及增加其通透性 材料 1. 培养基 : 不含酚红的 DMEM 培养基 2. 处理玻片 : 将多聚赖氨酸溶液 ( 溶于 1moL/L ph7.0 Tris-HCl 缓冲液中 ), 涂布于玻片上, 干燥后即可使用 或者 APES 2ml 溶于 100ml 丙酮中, 将玻片浸泡入内, 取出晾干,180 干燥备用 2. 洗涤液 :0.1M,pH7.2~7.4PBS 3. 细胞固定液 :4% 多聚甲醛 0.1MPBS(pH7.2~7.4) 含有 1/1000 DEPC 4. 乙醇 :70% 90% 100% 5. 胃蛋白酶溶液 : 用 0.1N HCl 将其稀释为 100µg/ml 6. 设备 : 烤箱,CO 2 培养箱, 倒置显微镜, 玻璃载玻片 ( 经洗涤,180 干烤或 15 磅高压灭菌 20min), 原位杂交专用盖玻片, 温箱, 加样器和吸头等 方法 1. 用培养液将细胞加在处理的载玻片上, 37 5% CO 2 条件下培养, 时间通过预试验确定 2. 细胞长好后, 用洗涤液洗 2min 3 次, 室温下将其放人细胞固定液中固定 30~60min, 蒸馏水洗涤 3. 室温下用洗涤液充分洗涤固定细胞,( 干燥后 -20 冰冻可保存 2 周以上 ) 4. 杂交前将固定的细胞进行如下处理 : 依次在 70%,90%,100% 的乙醇中浸泡, 脱水每次 5min, 用二甲苯洗涤, 除去残留脂质依次在 100%,90%,70% 乙醇中浸泡, 进行再水化, 每次 5min, 最后浸泡于洗涤液中 5. 在 37 用胃蛋白酶溶液 10min 处理固定的细胞, 以增加细胞对大分子试剂的通透性, 再用洗涤液洗 5min

448 6. 用 1% 甲醛固定 10min, 用洗涤液洗净 注意事项 1. 所有溶液都必须用 RNA 酶抑制剂处理 2. 操作中最重要的是及时固定, 并在固定液中加入 0.1% 的 DFPC 处理, 以抑制 RNA 酶对 mrna 的分解作用 此外, 过度固定对原位杂交有明显的不利影响 ( 二 ) 原位杂交 材料 1. TNF-DNA 探针 2. 地高辛标记液试剂盒 3. 杂交液 :60% 去离子甲酰胺,300mmol/L NaCl 30mmol/L 柠檬酸钠 10mmol/L EDTA 25mmol/L NaH 2 PO 4 (ph7.4),5% 葡聚糖硫酸酯,250µg/µl 变性鲑精 DNA 4. 设备 : 温箱, 水浴锅, 加样器, 吸头, 染色缸等 方法 1. 用地高辛标记 DNA 探针, 参见上面介绍的 斑点杂交法测定培养细胞 IL-2 mrna 的含量 2. 准备杂交液 3. 临用前, 将 DIG 标记的 DNA 探针在 80 加热 10min, 迅速置冰浴中变性后, 将其加入杂交液中, 至终浓度 5µg/µl 4. 将 10~20µl 杂交混合液 ( 杂交液加变性探针 ) 加入到固定并增加了通透性的细胞上, 盖上专用原位杂交盖玻片, 放入盛有约 20ml 20% 甘油湿盒内 37 使其杂交过夜 ( 三 ) 洗涤 材料 1. 2 SSC:1000ml 蒸馏水中加氯化钠 17.6g, 柠檬酸三钠 (C 6 H 5 O 7 Na 3 2H 2 O, 分子量 294) 8.8g SSC:300ml 蒸馏水加 100ml 2 SSC 即可 SSC:270ml 蒸馏水加 30ml 2 SSC 即可 方法 揭掉盖玻片,30~37 左右水温的 2 SSC 洗涤 5min 2 次,0.5 SSC 洗涤 15min 1 次, 0.2 SSC 洗涤 15min 1 次 ( 四 ) 荧光抗体检测 材料 1. 封闭液 :Tris-HCl 100mmol/L ph7.5,nacl 150mmol/L,0.5% 羊血清 2. 抗 DIG- 荧光素抗体 3. 洗涤液 :0.1M,pH7.2~7.4PBS 4. 20% 甘油 :20ml 甘油加 80ml 蒸馏水即可 5. 乙醇 :70% 90% 100% 6. 防退色溶液 :9 份甘油与 1 份染液 (1mmool/L Tris-HCl ph7.5,2% 1.4-diaza-bicyelo [2,2,2]- Octane,500ng/ml propidiumiodide) 7. 地高辛标记和检测试剂盒

449 8. 设备 : 加样器, 吸头, 染色缸等 方法 1. 每块载玻中上加 100µl 封闭液, 封闭非特异性结合位点 2. 用封闭液将抗 DIG- 荧光素抗体按 1:500 稀释加在载玻片上, 置湿盒内 37 温育 45min, 用洗涤液洗 5min 4 次 3. 用 100mol/L Tris-HCl(pH7.5),150mmol/L NaCl,0.05%T ween 20 洗载玻片 4. 将细胞样品依次在 70%,90%,100% 乙醇浸泡 5min, 脱水 5. 将玻片在空气中干燥 6. 将细胞样品放在防退色溶液中, 取出封片 结果 表达 TNF mrna 的细胞胞浆着色, 在荧光显微镜荧光的分布与强度