陈松林 等% 铁皮石斛 & 种酸性多糖的分离纯化及体外抗氧化活性 于!$ _的 去 离 子 水 中 利 用 $ _ 的 =?溶 液 梯 - 试 管 收 集 洗 脱 液 度洗脱 流速 为! 每管 苯 酚> $ 型 紫 外 分 硫 酸 法 显 色 JM

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1 %&% $!# 年第 卷第 # 期 + 2 浙 江 农 业 科 学 $!# # # $ % 文献著录格式% 陈松林 吴志刚 姜武 等2铁皮石斛 & 种酸 性 多 糖 的 分 离 纯 化 及 体 外 抗 氧 化 活 性 C %&%> %2 df;!!$@!#!% -@$%> "$!@$!#$#!& 铁皮石斛 & 种酸性多糖的分离纯化及体外抗氧化活性 陈松林!!! 吴志刚!! 姜武! 陶正明!! $ #!@温州医科大学 药学院 浙江 温州&$& 亚热带作物研究所 浙江 温州&$$ $ 摘要# 为研究铁皮石斛酸性多糖的构成及 抗 氧 化 活 性 采 用 水 提 法 提 取 铁 皮 石 斛 粗 多 糖 # df?n$ 利 用 $ 和丙烯葡聚糖 凝 胶 柱 # < 8P <> $$ $ 分 离 纯 化 凝 胶 色 谱, 液 相 色 谱, 阴离子交换剂纤维素柱 # dbdb> U 和 dfdn&> & 种铁皮石斛酸 紫外光谱及红外光谱测定理化性质 结 果 表 明 分 离 纯 化 获 得 U 和 由 葡 萄 糖, 甘 露 糖, 半 乳 糖 和 阿 拉 伯 性多糖 分子量分别为 &$!&@% 及!&$@ /X 其中 另 包 含 鼠 李 糖 和 半 乳 糖 醛 酸 两 种 单 糖 红 外 分 析 显 示 U 含 有!> 糖构成 而 dfdn&> 呋 喃 型 糖 苷 和 dfdn&> 则含有!> 吡 喃 型 糖 苷 体 外 活 性 试 验 表 明 & 种 酸 性 多 糖 在 Deb<, 清 除 羟 基 自 由 基 和 dnn6自由基清除方面均比中性多糖表现出更强的活性 关键词# 铁皮石斛- 酸性多糖- 理化性质- 抗氧化活性 "$!#$!#$$#> $%&%> $# 中图分类号# <#@&"文献标志码# D文章编号# $%> 铁 皮 石 斛 # #$ %& +, %/ $H X L 2$ 为兰科 石 斛 属 # #$ %& +,$ 多 年 附 生 草 差异 以期为石斛多糖的药理药效及铁皮石斛药材 质量控制提供依据 本植物 具有润肺止咳, 滋阴养胃和清热明目以及!+ 抗肿 瘤 之 多 种 功 效 俗 称 铁 皮 兰 黑 节 草 是 2材料与方法 中国传统名贵中药材 多年药理学研究表明 多糖!@!试验材料 为铁皮石斛的 主 要 药 效 成 分 可 增 强 机 体 免 疫 力, + 抗氧化, 降血糖, 抗肿瘤以及抗白内障等 在铁皮石斛多糖研究中 有学者分离得到 & 种 多糖 # 黑 节 草 多 糖 $ 测 得 分 子 量 分 别 为! $$$ $$ 和!$ /X 并确定它们为一类 F> 乙酰葡萄甘露 &+ 聚糖 此外 也有研究者分离出 db db& 单一 组分多糖 分子量分别为 $ 和!&$ /X 主要由单 E I D 和 L - 构 成 摩 尔 比 分 别 糖 E "m!@ $m!@ $m $@ %m $@ " m!@ & m!@ $ m$@ m$@ + I 等 + 也从铁皮石斛中 分 离 出 个 单 一 组 分 多 糖 以 年 生 铁 皮 石 斛 新 鲜 茎 条 为 材 料 于 $! 年 月! 日采收于浙江省温州市乐清市!@铁皮石斛预处理及水溶性多糖提取 + 的 方 法 将 新 鲜 茎 条 烘 干, 参考文 献 #> 磨碎成 粉 末 先 后 用 #$ j"$ g 馏 程 的 石 油 醚 和 %$f乙 醇 加 热 回 流 脱 脂 脱 色 P 各 重 复 次 %$ g恒温下 用 $ 倍 # 体积比$ 的去离子水浸 提 P 离 心 取 上 清 液 重 复 & 次 浓 缩 上 清 液 %$f乙醇醇沉, 离心, 溶解 重复 & 次 收集多糖 法 除蛋 白 浓 缩 醇 沉 收 固体 #$ g干燥- < # dfn>! 和 dfn> $ 对 其 结 构 的 分 析 表 明 dfn>! 的分子量分别为 &&@ 和!"@ /X 且都 和 dfn> 集多糖 用分 子截 留量 为 & $$ X 的 半 透 膜 于 去 离 子 水中 g透析 % P 收集多糖溶液 浓缩 醇沉 - E E D $ 含有相同单糖组成 # L 收集多糖 #$ g干燥 得多糖粉末!@&铁皮石斛酸性多糖的分离% 纯化 然而 上 述 多 糖 仅 是 铁 皮 石 斛 多 糖 的 中 性 组 分 对其酸性组分的研究甚少 本研究首次对铁皮 石斛的酸性多糖部分进行分离纯化 测定其理化性 质 并比较中性多糖和酸性多糖的体外抗氧化活性 参考文献 %+ 的方法 利用 l$$? X > 交 换 剂 柱 # ^P - 公司$ 的 dbdb> 分离中性多糖和酸性多糖 称取 $@ 多 糖 粉 末 溶 $&>! 收稿日期% $!> 基金项目% 浙江省农业科学院地方科技合作项目 # ^A$!&$$$# $ - 浙江省温州市科技计划项目 # =$!$$$!# $ % #"$&1]]@ 作者简介% 陈松林 #!""! &$ 男 硕士研究生 研究方向为天然化合物分离及纯化 B> % &!#&&#%1]]@ 通信作者% 陶正明 #!"$ &$ 男 副研究员 从事中药栽培技术, 品种选育与药材质量研究 B>

2 陈松林 等% 铁皮石斛 & 种酸性多糖的分离纯化及体外抗氧化活性 于!$ _的 去 离 子 水 中 利 用 $ $@$ $@!$ $@$ $@&$ $@$!@$$ _ 的 =?溶 液 梯 - 试 管 收 集 洗 脱 液 度洗脱 流速 为! 每管 苯 酚> $ 型 紫 外 分 硫 酸 法 显 色 JM> LDdAJ公司 $ 在 "$ - 处 监 测 洗 光光度计 # <6; 脱液吸光值 绘制洗脱曲线 根据曲线收集酸性组?溶液洗脱下的多糖组分 $ 浓缩 透 分多糖 # = 析滤过盐分 醇沉, 离心, 干燥 8P 酸性组分 多 糖 经 l$$ 的 < <> $$ 柱 # NP 公司$ 纯化 取 $@! 多糖 样 _ =?溶液 品溶于 _去离子水中 $@! - 试 管 收 集 洗 脱 液 洗脱 洗脱流 速! 每管 苯 酚> 硫 酸 法 显 色 紫 外 分 光 光 度 计 在 "$ -处监 测 洗 脱 液 吸 光 值 绘 制 洗 脱 曲 线 根 据洗脱曲线收集主峰多糖 反复上样 直至洗脱曲 线为单一对称峰 收集该峰多糖 浓缩, 醇沉, 离 心, 干燥!@多糖纯度鉴定与分子量测定 8P U E>!$$ #! l 利用 比 旋 光 度 法 和 < #$$ $ 柱 # NP 公司$ 凝胶层 析 测 定 多 糖 "+ 的均一 性 称 取 适 量 标 准 多 糖 # 分 子 量 分 别 为!$ $ $!$$ 和 $$ /X$ 配 制 _ 的 8P U E>!$$ 柱 中 上 样 洗 脱 上 样 溶 液 于 < $@! _ 去离子水洗脱 流 速 $@ _ - 收 集洗脱液 每管 _ 苯 酚> 硫 酸 法 显 色 紫 外 分 光光度计 "$ - 处 监 测 洗 脱 液 吸 光 值 待 出 现 最 大吸光值 时 则 该 洗 脱 体 积 为 标 准 多 糖 的 洗 脱 体 积 以标准多糖分子量的对数值为横坐标 洗脱体 积 为 纵 坐 标 绘 制 标 准 曲 线 得 标 准 曲 线 < p #@$% A i!!!@"! # F p$@""" & $ 按 上 述 条件 测出样品洗脱体积 根据标准曲线计算其分 子量!@多糖的单糖组成分析!$ + 参照! 中国药典 " # $!$ 版 $ 及 参 考 文 献 的方法 称取!$ 样 品 多 糖 置 $ _小 烧 杯 中 加入!$ _去离子水 溶 解 分 别 吸 取! _溶 液 于 & 只!$ _具塞试管中 加入 &@$ _ 6?溶 液 $@ _ 封 口!!$ g 烘 箱 中 水 解! P 冷 却 _ = F6 溶 液 调 中 性 吸 取 $$ "_ 用 &@$ _ 的 于干净 的!$ _具 塞 试 管 中 加 $@ NLN甲 醇 溶 液 和 $@& _ 的 = F6 溶 液 各 $$ "_ 混匀 $ g水浴!$$ - 后加 $@ & _ 6?溶液 $$ "_ 混 匀 三 氯 甲 烷 洗 涤 & 次 每次 _ 离心 取上清液 进 6N_?!$ "_进样 %&" -!$$ 系 统 # D -公 司 $ 色谱条 件 D AFOeDI<e>!% 柱 l$ $ 柱 温 为 g 流速 为! _ - $ - 检 测 流 动 _ 乙 酸 铵 溶 液 以 $ m%$ 体 相由乙腈 与 $@$ 积比构成!@#光谱分析 称取多糖样品 配 成 _ 的 溶 液 以 蒸 馏水为 空 白 对 照 于!"$ j$$ - 波 长 区 域 扫 描 称取!$ 多糖样品 与 He研磨混合 压成透明 薄片 红外 光 谱 仪 扫 描 分 析 He空 白 片 作 参 比 扫描范围 $$$ j$$!@deb< 法测定总抗氧化能力 参考文 献!! + 的 方 法 在!$ _试 管 中 加 _ Deb< 溶 液 # D UU - 公司$ 入 _ %% _!$ _ 和 " 过硫酸钾溶液 摇匀混合 $ 的体积比 避光静置过夜 在 $$ _烧杯中按!m 加 $ _蒸馏水制成工作液 样品组% 在!$ _试 管 中 加 入 $$ "_不 同 浓 # $@ $@ _ $ 的 多 糖 溶 液 和 & _的 Deb< 溶 液 每个浓度设 & 个重复- 空白组用蒸馏水代替 多 糖溶液- 对照组 用 蒸 馏 水 代 替 Deb< 溶 液- 以 上 & 组在室 温 避 光 放 置! P 于 & - 处 测 定 其 吸 光 值 按照上述方法 抗坏血酸 # M?$ 作阳 性 对 照 按以下公式计算多糖对 Deb< 自由基的清除率% Deb< 清除率 9 f p G空 白 # G样 品 G对 G空白 l!$$ 照$ + 9!@%dNN6自由基清除能力的测定 参考文献!+ 的方法 样品组%!$ _试管 中加 _$@$$f 的 dnn6 溶 液 # 溶 于 "f 乙 醇 $ 与 $@ _ 不 同 浓 度 # $@ $@ _ $ 的 多 糖 溶 液 每个处理 设 & 个 重 复- 对 照 组 用 "f 乙 醇 代 替 dnn6溶液- 空白组用蒸馏水代替多糖 溶 液 以 - 离 心 取 上 清 液 上 & 组 置 于 % g 水 浴 &$ 用 $@ _蒸 馏 水 _"f 的 乙 醇 调 零 于! -处测 定 吸 光 值 按 照 上 述 方 法 抗 坏 血 酸 # M?$ 作阳性对照 用 以 下 公 式 计 算 多 糖 对 dnn6 的清除率% dnn6清除率 9 f p G空白 # G样品 G对 G空白 l!$$ 照$ + 9!@"羟基自由基 # &F6$ 清除能力的测定 参考文献!&+ 的方法 样品组%!$ _试管 _ a <F, $@ _! 中加入! _#

3 %$ $!# 年第 卷第 # 期 _ 水 杨 酸, $@ _不 同 浓 度 的 多 糖 溶 液 # $@ $@ $@#!@ $ _ $,! _# _ 6 F 和 $@ _蒸馏水 设 & 个 以认定其为均一组分 # 图 &$ U dfdn&> & 种酸性多糖 洗脱体积 分 别 为!% 和 % _ 根 据 标 准 曲 线 平行样- 空白组用蒸馏水代替多糖溶液 对照组用 蒸馏水代替水杨酸- 以 上 & 组 试 管 于 水 浴 锅 & g # <p #@%$ A i!!!@"! $ 计 算 其 分 子 量 分 别 为 &$!&@% 和!&$@ /X 恒温水浴! P 取 出 冷 却 于!$ - 处 测 定 吸 光 值 按照 上 述 方 法 以 抗 坏 血 酸 # M?$ 作 阳 性 照 用以下公式计算多糖对F6的清除率% F6清除率 9 f p G空 白 # G样 品 G对 G空白 l!$$ 照$ + 9 U 和 共 水 解 得 到 种 单 糖 分别是 葡 萄 糖, 甘 露 糖, 半 乳 糖 和 阿 拉 伯 糖 # 图 $ - dfdn&> 则 水 解 多 得 到 种 单 糖 分 别 是 半 乳糖醛酸, 鼠李糖 # 表!$ 表!酸性多糖的单糖组成及摩尔分数 多糖组分? X > 柱分离 共得到 粗多糖经 dbdb> 组分的多 糖 # 图! $ 前 个 峰 为 主 峰 收 集 前 U 组分多糖 其中去离子水洗脱部分为中性多糖 后 & 组 分 为 酸 性 多 糖 酸 性 多 糖 # dfdn! dfdn dfdn&$ 在 < 8P <> $$ 柱中上样洗脱纯化 发 现 & 组洗脱图中 都 存 在 一 个 主 峰 分 别 是 U dfdn&> - 收 集 主 峰 多 糖 反 复 上 样洗脱 直至洗脱曲线中有且只有一个单一对称峰 # 图 $ - 收 集 得 U dfdn&> 多糖粉末 %$$ # 白 色$ & # 白 色 $ # 淡 黄色$ $@%f 单糖摩尔分数 葡萄糖 甘露糖 半乳糖 半乳糖醛酸 鼠李糖 阿拉伯糖 $@#% $@#!& $@$#% $@$! $@! $@$ $@$" $@! dfdn&> $@!" $@#" $@!!& $@$ $@$& $@&# 注% 多糖溶液在波长在!"$ j$$ -进行紫外扫描 发现 在 $ j"$ -均无吸收峰 表明均不存在 蛋白质和核酸分子 红外光谱检测结果如图 所示% & 种多糖的红外 的峰 # 光谱较相似 在 & #$$ j& $$ & $!@ %! % & &""@ "& dfdn&> $ 是由&F&6的伸缩振动和变 % & &""@"& 的 峰 # 角振动引起 "$ j %$$ "@& % ""@&%" %"$@ %!" dfdn &> % ""@ &%" 和 %"$@ %!" $ 是&?&6 键 伸 缩 振 动 引 起 的 特 征 峰! #$ j! #$$ 出现的 峰 #! #%@%## %! #!@! dfdn&> %! #!@! $ 附近的 是羰基的伸缩振动峰 另外 在! & 峰 #! &&@$ % 图!粗多糖在 dbdb> 纤维素柱上的洗脱曲线! &&@$ dfdn&> %! &&@$ $ & 种 酸 性 多 糖 的 纯 度 鉴 定 与 多 糖 分 子 量 的 %! "@ ## dfdn&> %! &@ $ 测定 & 种 酸 性 多 糖 的 比 旋 光 度 U 为!+ p!!@r#?p$@$& 6 F$ 为!+ 分别是糖醛酸基团和磷酸基团的特征吸收峰 表明 d $ p"$@$r#?p$@$& 6 F$ dfdn&> U 为!+ U 出 现 了 个 强 吸 收 峰 #! $##@#$ 和 d $! % 附近的峰 #! "@## 而! $$ j! $$$ F>?伸 缩 振 动 所 引 起 所产生 的 峰 是 由 糖 环 的?> 这 & 种多糖为酸 性 多 糖! + p"@&r#?p$@$& 6 F$ 其 中!+ 代 表 比旋光 度 d为 d钠 光 测 定 $ 指 $ g 测 定? 8P U E>!$$ 柱 上 样 洗 为浓度 #!$$_ $ <! $&!@ $ 表 明 U 多糖存在呋喃糖 脱显示 & 种多糖洗脱曲线 均 为 单 一 对 称 峰 型 可 #!!!@&%! $%@#& 和! $@%"$ $ 说 明 d $ 产 生 了 & 个 峰 #!!"@ &%! $#@ #$& 苷 $ dfdn&> 也出现 & 个吸收峰 和! $"@%!%

4 陈松林 等% 铁皮石斛 & 种酸性多糖的分离纯化及体外抗氧化活性 D为 dfdn! e为 dfdn?为 dfdn& d为 U B为 a为 dfdn&> 8P <> $$ 色谱柱上的洗脱曲线 图 酸性多糖在 < D为 U e为?为 dfdn&> 8P U E>!$$ 色谱柱上的洗脱曲线 图 &酸性多糖在 < %!

5 % $!# 年第 卷第 # 期 D为 U e为?为 dfdn&> 图 酸性多糖水解衍生物的 6N_?色谱 D为 U e为?为 dfdn&> 图 酸性多糖的红外光谱 和 dfdn&> 存在吡喃糖环! + 清除率由 高 到 低 分 别 是 ""@$f %@#f #@&f 附 近 出 现 的 吸 收 峰 # 在 %$ %@ ## % %"@ &" dfdn&> % 同 时 在 %!$ - 各组分多糖的清除率同样随着多糖浓度的增加而增 # %$%@$$ 强 且增强程度逐渐减弱 中性多糖的清除率依旧 最低 在浓度为 _ 时 清 除 率 由 高 到 低 % %$"@ "#" dfdn&> % %$"@ "#" $ 附近出现的吸收峰表明 糖基中存在甘露糖 而在 %"$ 处无吸收峰也表明这 & 种多糖不存 在 " 构 型的糖基键结构! + dnn6自由基清 除 能 力 结 果 如 图 # 中 e所 示 %"@ &" $ 表明这 & 种多糖具有!> 型糖苷键!#+ $@%f和 &@#f 种酸性多糖体外抗氧化活性 Deb< 法测定结果 如 图 # 中 D所 示 & 种 酸 性 分别是 #@#f 羟基自由基 #F6$ 清除能力结果如图 # 中? 所示 活性最强为 M? 最弱的为中性多糖 和 $@ 活性最强 值得注意的是 低浓度 #$@ _ $ 时 U 的清除率甚至高于 M? 达到了 "f和 #!@ $f 在浓度为 _ 时 明显增强 当增加到一定程度 其增强程度慢慢减 &f 与 M?的 ""@ $f接近 的清除率为 "@ 弱 比较发现 & 种酸性多糖 的 总 抗 氧 化 能 力 非 常 接近 均高 于 中 性 多 糖 略 低 于 M? 以 活性最强 在浓 度 为 _ 时 各 组 分 多 糖 2讨论 本试验通过阴离子交换剂纤维素柱和丙烯葡聚

6 陈松林 等% 铁皮石斛 & 种酸性多糖的分离纯化及体外抗氧化活性 %& 图 #不同组分多糖的总抗氧化能力 # D$ % 对 dnn6自由基的清除能力 # e$ 和对羟基自由基 # &F6$ 的清除能力 #?$ 糖凝胶柱分离纯化得到铁皮石斛 & 种主要酸性多糖 U 和 dfdn&> 通 过 凝 胶 色 谱, 液相色谱, 紫外光谱和红外光谱分析发现 这 & 种 酸性多糖的分子量大小, 单糖构成, 比旋光度均不 同于以往所分离的石斛多糖 Deb< 总抗 氧 化, 清 除 dnn6 自 由 基, 清 除 羟 基自由基等试验发现 & 种 酸性 多 糖 抗 氧 化 活 性 大 大强于中性多糖 在高浓度时 其活性甚至接近于 M?活性 大 量 研 究 显 示 多 糖 的 生 物 活 性 与 其 组 &#!@ 食品科学 $! && #& $ % &#> + 吕圭源 颜美秋 陈 素 红2铁 皮 石 斛 功 效 相 关 药 理 作 用 研 + 2中国中药杂志 $!& &% #$ % %"> "&@ 究进展 C & + 王世林 郑光植 何静波 等2黑节草多糖的研究 C + 2云 &"@ 南植物研究!"%%!$ #$ % &%"> + 杨虹 王顺春 王峥涛 等2铁皮石斛多糖研究 C + 2中 国 #@ 药学杂志 $$ &" #$ % > + I; D_C _; J I a EJF 6 G 2N P + -U X- UX 8 P U P #$ %& +, %/ $# b 8 P PX$ % : C + 2C X - ax- - a U $! #!$ % "> &$!@ 成结构 存 在 紧 密 联 系 其 中 包 括 分 子 量, 单 糖 组 # + <BMDE L E2 D - : 8P U > P U 成, 官能团以及构型 本试验中 中性多糖与酸性 X - > - 多糖的巨大活性差异可能与酸性多糖所特有的糖醛 酸与磷酸基团有关 对比 & 种酸性多糖的活性与 分 e P PA P!"& & %!"> "@ 在 Deb< 子量的关系发现 分子 量 最低的 总抗氧化活性试验和清除羟基自由基试验中活性最 U 和 之 间 的 强 分 子 量 介 于 P U - P / -> 8 - -U 8- X C+ 2 + 陈晓梅 王春兰 王爱荣 等2铁皮石斛原球茎多糖的研究 C + 2中国药学杂志 $!! # #$ $ %!>!#@ % + ^D=E C6 _JF CN A6D I c 2? X U -8 P U - P dfdn&> 的 dnn6清除自由基活性最强 表明抗氧 #$ %& +, % $_ -U C + 2? P U N 化活性与分子量存在密切关系 且分子量越小活性 U 具 有 的 呋 喃 糖 环, 相 对 越 强 另 外 $!$ " #!$ %!!>!!%@ 和 dfdn&> 具有的吡喃糖环也可能是影 响多糖活性的因素 目前 多糖含量和甘露糖与葡萄糖的比值是评 价铁皮石斛品质的重要指标 虽然该指标测定方便 快捷 但是根据上述结果分析 酸性多糖相比中性 多糖具更强的活性 是铁皮石斛抗氧化的主要物质 基础 因此 我们认为可以考虑将酸性多糖的含量 作为一个评价指标 本研究分离纯化得到的 & 种酸 性多糖的理化性质 与 体 外 抗 氧 化 活 性 的 相 互 关 系 将为铁皮石斛多糖药理药效研究和药材质量控制提 供一定依据 参考文献 %! + 聂少平 蔡 海 兰2铁 皮 石 斛 活 性 成 分 及 其 功 能 进 展 C +2 " + 封聚强 赵 骏2中 药 多 糖 的 分 子 量 及 结 构 研 究 进 展 C +2 #@ 时珍国医国药 $$%!" #&$ % #>!$ + 杨兴斌 赵燕 周四元 等2柱前衍生化高效液相色谱法分 + 2分 析 化 学 $$ && # " $ % 析当归 多 糖 的 单 糖 组 成 C!%>!"$@!! + OFeBOb O =;?F Bb N D==D N 2 D- U U Deb< U - U + C+ 2 a O U e -U L U -!""" # #!$ $ %!&!>!&@! + ^D=E I L <J= O E A6D=E C 2 < X X -U - U - 8 P U NFC > J! U X X-U ;6 2 6 % H /6 % / C + 2a 8 $! %& #%$ %!#>!%@!& + ^D=E C A6D=E c e A6D=E A < 2 D- U - X U 8 P U - U!/, %/ / H /6 % / C+ 2 ; C X - e L X $$% # $ %!>!&@! + _; JG6 ^D=E a<2< X X P + - -

第 期 王 兴 涛 等 猪 流 行 性 乙 型 脑 炎 病 毒 种 猪 精 液 分 离 株 的 鉴 定 及 进 化 分 析 病 料 毒 株 及 细 胞 试 剂 引 物 设 计 提 取 及 基 因 克 隆 及 测 序

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