a 柱 状 结 构 螺 旋 BFP CFP 折 叠 EGFP YFP 螺 旋 b N- 末 端 C- 末 端 Aequorea victoria GFP 突 变 图 图 20 (a) 荧 光 蛋 白 β- 柱 状 结 构 及 常 见 Aequorea 荧 光 蛋 白 衍 生 物 的 发 色 团 结

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1 表 4 肿 瘤 成 像 的 定 量 表 5 大 肠 中 GFP 标 记 的 肿 瘤 全 身 成 像 与 活 体 内 成 像 的 比 较 肿 瘤 部 位 像 素 mm 2 GFP 脑 部 RFP 脑 部 GFP 骨 GFP 大 肠 ( 全 身 成 像 ) GFP 大 肠 ( 活 体 内 成 像 ) GFP 胰 腺 RFP 肝 脏 RFP 胰 腺 成 像 类 型 肿 瘤 大 小 ( 像 素 ) 全 身 成 像 剖 开 后 成 像 资 料 来 源 :BioTechniques 荧 光 强 度 资 料 来 源 :BioTechniques 以 上 表 明, 在 动 物 体 内 用 GFP 或 RFP 等 标 记 的 肿 瘤 能 够 发 射 出 很 强 的 信 号, 获 得 的 图 像 可 以 很 容 易 定 量, 自 发 荧 光 的 干 扰 可 以 忽 略, 并 且 可 以 用 简 单 的 低 成 本 的 设 备 进 行 GFP 和 RFP 的 全 身 成 像 所 有 这 些 表 明, 荧 光 蛋 白 在 肿 瘤 研 究 及 体 内 高 通 量 药 物 筛 选 等 其 它 方 面 有 广 阔 的 应 用 前 景 参 考 文 献 1. Anna-Katerina Hadjantonakis, Andras Nagy. (2001) The color of mice: in the light of GFP-variant reporters, Histochem Cell Biol, 115: 刘 忠 华, 宋 军, 王 振 坤 等. (2008) 体 细 胞 核 移 植 生 产 绿 色 荧 光 蛋 白 转 基 因 猪, 科 学 通 报, 53(5): Meng Yang, George Luiken, Eugene Baranov, et al. (2005) Facile whole-body imaging of internal fluorescent tumors in mice with an LED flashlight, BioTechniques, 39: 三 荧 光 蛋 白 技 术 的 最 新 研 究 进 展 1. 新 增 荧 光 蛋 白 在 过 去 几 年 发 展 起 来 的 荧 光 蛋 白 变 体 的 荧 光 激 发 谱 几 乎 覆 盖 了 整 个 可 见 光 的 光 谱 范 围 发 色 团 周 围 环 境 的 变 化, 如 带 电 氨 基 酸 残 基 的 位 置 氢 键 网 络 及 蛋 白 间 疏 水 作 用 等 可 能 产 生 蓝 色 或 红 色 光 谱 漂 移, 经 吸 收 和 激 发 后 最 大 可 漂 移 40nm 更 大 的 光 谱 漂 移 会 产 生 新 的 光 谱 型 荧 光 蛋 白, 如 CFP GFP YFP 等, 这 是 由 于 发 色 团 共 价 结 构 和 外 部 轨 道 连 接 的 不 同 ( 图 20 21) 人 们 进 一 步 研 究 荧 光 蛋 白 发 色 团 的 复 杂 特 性, 找 到 了 关 于 多 肽 骨 架 结 构 与 功 能 关 系 的 线 索, 因 此 借 助 基 因 工 程 更 精 细 的 调 整 颜 色 变 体, 并 扩 大 有 用 蛋 白 的 光 谱 范 围 就 变 得 更 加 容 易 了 18

2 a 柱 状 结 构 螺 旋 BFP CFP 折 叠 EGFP YFP 螺 旋 b N- 末 端 C- 末 端 Aequorea victoria GFP 突 变 图 图 20 (a) 荧 光 蛋 白 β- 柱 状 结 构 及 常 见 Aequorea 荧 光 蛋 白 衍 生 物 的 发 色 团 结 构 (1)BFP;(2)CFP;(3) EGFP;(4)YFP (b)aequorea victoria GFP 突 变 图 β- 折 叠 ( 绿 色 带 有 箭 头 的 细 柱 状 结 构, 箭 头 指 向 C- 末 端, 已 编 号 为 β-1~11),α- 螺 旋 ( 灰 色 圆 柱 结 构 ) 肽 链 拓 扑 结 构 图 上 标 明 了 常 见 的 突 变 标 记 所 用 颜 色 代 表 相 应 颜 色 的 荧 光 蛋 白,BFP( 蓝 色 ) CFP( 蓝 绿 色 ) GFP( 绿 色 ) YFP( 黄 色 ) Sapphire( 紫 色 ) 折 叠 共 有 及 单 体 化 ( 灰 色 ) 图 中 可 以 看 出, 几 乎 75% 的 突 变 都 发 生 在 中 心 α- 螺 旋 以 及 β- 折 叠 处 图 片 来 源 :Journal of Cell Science 19

3 a 红 色 黄 色 及 橙 色 荧 光 蛋 白 的 发 色 团 结 构 变 化 反 式 发 色 团 (1) (2) 顺 式 发 色 团 eqfp611 (3) (4) 骨 架 被 劈 开 morange b N- 末 端 C- 末 端 DsRed 衍 生 的 突 变 图 残 基 图 21 (a) 黄 色 橙 色 及 红 色 荧 光 蛋 白 的 发 色 团 结 构 变 化 (1) 源 自 DsRed 和 其 它 造 礁 珊 瑚 的 荧 光 蛋 白 有 一 个 顺 式 发 色 团, 第 66 位 残 基 可 以 是 Met Gln Thr Cys 或 Glu;(2) 来 源 于 Entacmaea quadricolor 的 红 色 变 体 eqfp611, 它 是 已 知 的 唯 一 具 有 反 式 发 色 团 的 荧 光 蛋 白 ;(3) 来 源 于 纽 扣 型 珊 瑚 虫 Zoanthus 的 ZsYellow, 也 称 为 zfp538, 它 具 有 一 种 新 的 三 环 发 色 团, 由 66 位 赖 氨 酸 残 基 与 自 身 α- 碳 原 子 环 化 形 成 四 氢 吡 啶 环 再 连 接 到 发 色 团 形 成 ;(4)mOrange, 也 具 有 三 环 发 色 团, 是 由 66 位 苏 氨 酸 与 前 面 羧 基 碳 环 化 产 生 的 部 分 连 接 的 噁 唑 环 ; (b)dsred 突 变 图 β- 折 叠 ( 红 褐 色 带 有 箭 头 的 细 圆 柱 结 构, 箭 头 指 向 C- 末 端, 已 编 号 为 β-1~11) α- 螺 旋 ( 灰 色 圆 柱 结 构 ); 肽 链 拓 扑 结 构 图 上 标 明 了 突 变, 标 记 所 用 颜 色 代 表 相 应 颜 色 的 荧 光 蛋 白 mrfp1( 红 色 ) mcherry( 蓝 绿 色 ) mplum( 紫 色 ) dtomato( 黄 色 ) 共 有 突 变 ( 灰 色 ) 及 单 体 化 突 变 ( 绿 色 ) 与 围 绕 Aequorea GFP 发 生 基 团 的 突 变 簇 不 同 ( 图 20b), 红 色 荧 光 蛋 白 突 变 遍 布 整 个 序 列 图 片 来 源 :Journal of Cell Science 20

4 2. 各 种 荧 光 蛋 白 的 最 新 研 究 进 展 2.1 蓝 色 和 蓝 绿 色 荧 光 蛋 白 目 前, 虽 然 大 多 数 研 究 人 员 把 注 意 力 集 中 于 橙 色 到 远 红 外 光 谱 区 域, 但 最 近 BFP 和 CFP 变 体 在 成 像 中 的 应 用 潜 力 出 人 意 料 地 受 到 研 究 人 员 的 关 注 虽 然 EBFP 是 Aequorea GFP 来 源 的 最 早 的 光 谱 变 体 之 一, 但 其 亮 度 低 光 稳 定 性 差, 使 其 很 久 以 来 没 有 引 起 多 数 研 究 者 的 注 意 最 近, 有 三 个 研 究 小 组 报 道 指 出, 改 进 的 蓝 色 Aequorea 荧 光 蛋 白 变 体 与 EBFP 相 比, 亮 度 和 光 敏 感 性 有 明 显 增 强 这 些 新 的 变 体 被 命 名 为 Azurite ( 石 青 或 蓝 铜 矿 ) 强 力 增 强 型 蓝 色 荧 光 蛋 白 2(strongly enhanced blue fluorescent protein 2, SBFP2) 及 EBFP2( 图 22a), 它 们 第 一 次 使 得 活 细 胞 在 蓝 色 光 谱 区 域 成 功 地 长 时 间 成 像 成 为 可 能 即 使 这 三 种 荧 光 蛋 白 在 高 浓 度 的 微 环 境 中 表 现 出 很 弱 的 二 聚 体 特 性, 但 是 它 们 能 够 在 与 亚 细 胞 定 位 的 靶 蛋 白 融 合 中 有 效 地 发 挥 作 用, 并 且 它 们 能 够 很 容 易 地 通 过 滤 光 片 设 备 与 标 准 的 BFP 及 4', 6- 二 脒 基 -2- 苯 基 吲 哚 (4',6-diamidino-2- phenylindole, DAPI) 一 起 成 像 所 有 这 些 BFP 变 体 都 可 以 通 过 A206K 突 变 改 造 成 真 正 的 单 体, 而 且 这 种 突 变 不 会 影 响 它 们 的 特 性 更 重 要 的 是, 亮 度 最 强 光 稳 定 性 最 强 的 蓝 色 荧 光 蛋 白 EBFP2( 表 6), 是 EGFP 在 活 细 胞 中 FRET 的 很 好 的 供 体 a b c d e f g h i j k l m n o p q 图 22 (a-l) 单 体 荧 光 蛋 白 与 靶 蛋 白 融 合 蛋 白 的 亚 细 胞 定 位 (a)ebfp2-mito-n-7( 人 细 胞 色 素 C 氧 化 酶 VIII 亚 基 ; 线 粒 体 );(b)mcerulean-paxillin-n-22( 鸡 ; 粘 着 斑 );(c)mtfp1-actin-c-7( 人 β- 肌 动 蛋 白 ; 丝 状 肌 动 蛋 白 );(d)memerald-keratin-n-17( 人 细 胞 角 蛋 白 18; 中 间 丝 );(e) 超 折 叠 GFP-lamin B1-C-10 ( 人 核 纤 层 蛋 白 B1; 核 被 膜 );(f)mvenus-cx43-n-7( 大 鼠 α-1 间 隙 连 接 蛋 白 -43; 间 隙 连 接 );(g)ypet- EB3-N-7( 人 微 管 相 关 蛋 白 ;RP/EB 家 族 );(h)mko-golgi-n-7( 人 β-1, 4 半 乳 糖 基 转 移 酶 N- 末 端 81 个 氨 基 酸 ; 高 尔 基 复 合 体 );(i)tdtomato-zyxin-n-7( 人 斑 联 蛋 白 ; 粘 着 斑 );(j)tagrfp-tubulin-c-6( 人 α- 微 管 蛋 白 ; 微 管 );(k) mcherry-vimentin-n-7( 人 波 形 蛋 白 ; 中 间 丝 );(l)mplum-α-actinin-n-19( 人 非 肌 肉 ; 细 胞 骨 架 ); (m-q)megfp 与 人 组 蛋 白 H2B 融 合 (megfp-h2b-n-6) (m) 间 期 ;(n) 前 期 ;(o) 前 中 期 ;(p) 中 期 ;(q) 后 期 ( 图 片 来 源 :Journal of Cell Science) 21

5 蓝 绿 光 谱 区 域 ( 约 470nm~500nm) 一 直 是 原 始 的 Aequorea ECFP( 表 6) 衍 生 物 占 优 势, 直 到 一 个 单 体 的 水 鸭 色 ( 又 称 水 鸭 蓝, 是 蓝 色 与 绿 色 正 中 的 颜 色 ) 变 体 mtfp1( 图 22c) 出 现 这 种 荧 光 蛋 白 亮 度 更 强, 具 有 酸 不 敏 感 性, 而 且 光 稳 定 性 更 强 来 源 于 四 聚 体 软 珊 瑚 蛋 白 的 mtfp1 光 谱 特 性 与 大 多 数 CFP 相 比, 有 稍 微 的 红 移, 所 以 命 名 为 水 鸭 色 而 不 是 蓝 绿 色 与 其 它 CFP 不 同,mTFP1 在 发 色 团 的 第 66 位 氨 基 酸 是 酪 氨 酸 而 不 是 通 常 的 色 氨 酸 酪 氨 酸 代 替 色 氨 酸, 使 得 荧 光 激 发 光 谱 宽 度 从 大 约 60nm 降 低 到 更 容 易 操 作 的 30nm, 这 样 就 降 低 了 多 色 实 验 和 FRET 实 验 中 的 色 度 亮 度 干 扰 效 应 当 蓝 绿 色 荧 光 蛋 白 与 黄 色 或 橙 色 荧 光 蛋 白 组 合 使 用 时,mTFP1 ( 表 6) 作 为 一 个 FRET 的 供 体, 就 成 为 除 了 mecfp 和 mcerulean( 蔚 蓝 色 或 天 蓝 色 荧 光 蛋 白 )( 图 22b, 表 6) 之 外 的 一 个 极 好 的 选 择 虽 然 说 mtfp1 需 要 特 殊 的 滤 光 片 设 备 来 成 像, 但 是 用 标 准 的 ECFP 滤 光 片 设 备 也 能 产 生 合 适 的 信 号 水 平 最 近, 应 用 一 种 更 好 的 点 直 接 突 变 方 法 进 行 ECFP 和 EYFP 单 体 变 体 的 突 变 优 化, 以 增 强 亮 度 折 叠 效 率 可 溶 性 及 FRET 性 能 这 样 就 产 生 了 超 级 蓝 绿 色 和 黄 色 荧 光 衍 生 物, 它 们 分 别 被 命 名 为 SCFP 和 SYFP 在 细 菌 中 表 达 的 这 两 种 荧 光 蛋 白 明 显 要 比 原 荧 光 蛋 白 亮 度 更 强, 但 在 哺 乳 动 物 细 胞 中 表 达 的 亮 度 却 比 原 荧 光 蛋 白 弱 两 倍 不 过, 这 些 高 性 能 的 荧 光 蛋 白 应 该 有 利 于 融 合 标 签, 能 够 用 来 创 造 新 的 更 先 进 的 且 具 有 更 大 动 态 范 围 的 CFP- YFP FRET 生 物 传 感 器, 用 来 检 测 代 谢 ph 变 化 Ca 2+ 波 动 蛋 白 质 表 6 常 用 荧 光 蛋 白 的 物 理 属 性 蛋 白 光 谱 型 颜 色 激 发 峰 (nm) 发 射 峰 (nm) 亮 度 光 稳 定 性 pka 聚 集 状 态 发 色 团 滤 光 装 置 EBFP2 蓝 色 弱 二 聚 体 SHG DAPI/BFP ECFP 蓝 绿 色 433/ / 弱 二 聚 体 TWG CFP mcerulean 蓝 绿 色 433/ /503 27/ 单 体 TWG CFP mtfp1 蓝 绿 - 绿 色 单 体 AYG CFP megfp 绿 色 单 体 TYG FITC/GFP memerald 绿 色 单 体 TYG FITC/GFP sfgfp 绿 色 弱 二 聚 体 TYG FITC/GFP EYFP 黄 色 弱 二 聚 体 GYG FITF/YFP mvenus 黄 色 单 体 GYG FITC/YFP mcitrine 黄 色 单 体 GYG FITC/YFP YPet 黄 色 弱 二 聚 体 GYG FITC/YFP mko 橙 色 单 体 CYG TRITC/DsRed tdtomato 橙 色 T 二 聚 体 MYG TRITC/DsRed TagRFP 橙 色 <4.0 单 体 MYG TRITC/DsRed mrfp1 红 色 单 体 QYG TxRed mcherry 红 色 <4.5 单 体 MYG TxRed mkate 远 红 外 单 体 MYG TxRed mplum 远 红 外 <4.5 单 体 MYG TxRed 资 料 来 源 :Journal of Cell Science 和 酶 磷 酸 化 及 其 它 细 胞 内 的 生 物 活 动 22

6 2.2 绿 色 荧 光 蛋 白 在 光 谱 的 绿 光 区 (500nm-525nm) 已 经 发 现 了 多 种 荧 光 蛋 白, 而 且 来 源 广 泛, 包 括 不 同 种 属 的 Aequorea 桡 足 类 动 物 文 昌 鱼 以 及 珊 瑚 然 而 多 数 有 齐 聚 反 应, 即 使 最 好 的 荧 光 蛋 白 与 EGFP 相 比, 也 没 有 明 显 的 优 点 ( 表 6; 图 22 m-q) 或 许 目 前 活 细 胞 成 像 最 好 的 选 择 是 GFP 衍 生 的 Emerald( 祖 母 绿 )( 图 22d), 它 与 EGFP 的 特 性 相 似 Emerald 包 含 F64L 和 S65T 突 变, 另 外 还 有 四 个 点 突 变 从 而 改 进 了 折 叠 37 时 的 突 变 率 以 及 亮 度 虽 然 Emerald 比 EGFP 更 有 效, 但 含 有 快 速 光 漂 白 成 分, 可 能 在 某 些 环 境 下 其 定 量 成 像 会 受 到 影 响 过 去 几 年, 关 于 GFP 最 重 大 的 进 展 是 超 折 叠 GFP( 图 22e) 的 发 现, 即 使 与 不 溶 性 蛋 白 质 融 合 表 达 仍 然 可 以 高 效 地 折 叠 而 且 比 EGFP 和 Emerald 的 亮 度 更 强 耐 酸 性 更 好 ( 表 6) 然 而, 需 要 注 意 的 是, 超 折 叠 GFP 可 能 会 产 生 较 高 的 背 景 干 扰, 不 过 它 仍 能 产 生 亮 度 较 强 的 荧 光 2.3 黄 色 荧 光 蛋 白 作 为 一 种 光 谱 型, 黄 色 荧 光 蛋 白 已 经 被 开 发 成 亮 度 最 亮 及 最 通 用 的 遗 传 编 码 探 针 然 而 最 早 的 变 体 EYFP( 表 6) 虽 然 仍 被 广 泛 应 用, 但 由 于 其 pk a 值 高 对 卤 化 物 敏 感, 导 致 EYFP 的 应 用 还 很 不 理 想 单 体 形 式 的 变 体 柠 檬 黄 (mcitrine) 和 维 纳 斯 (mvenus)( 图 22f) 是 目 前 应 用 最 多 的 黄 色 荧 光 蛋 白 探 针 ( 表 6), 但 二 者 都 还 没 有 商 业 化 然 而 与 之 相 似 的, 来 源 于 Aequorea 被 命 名 为 诞 生 石 Topaz( 黄 玉 ) 的 变 体 可 从 Invitrogen 公 司 买 到 另 外, 一 旦 新 开 发 的 SYFP 在 哺 乳 动 物 细 胞 中 能 够 融 合 表 达 并 得 到 证 实, 一 定 会 成 为 一 种 有 用 的 黄 色 荧 光 蛋 白 另 一 种 很 有 应 用 潜 力 的 黄 色 荧 光 蛋 白 是 能 量 转 移 黄 色 荧 光 蛋 白 (yellow fluorescent protein for energy transfer, YPet), 它 经 合 成 的 DNA 重 排 获 得, 与 荧 光 激 活 的 细 胞 分 选 术 结 合 能 够 增 强 FRET 中 蓝 绿 色 荧 光 蛋 白 和 黄 色 荧 光 蛋 白 的 配 对 YPet 是 已 经 开 发 的 亮 度 最 强 的 黄 色 荧 光 蛋 白, 并 且 有 很 好 的 光 稳 定 性 ( 图 22g, 表 6) YPet 对 酸 性 环 境 的 耐 受 性 要 比 mvenus 及 其 它 黄 色 荧 光 蛋 白 变 体 强, 这 将 拓 宽 这 种 探 针 在 研 究 酸 性 细 胞 器 的 生 物 传 感 器 中 的 应 用 虽 然 YPet 对 FRET 是 最 优 化 的, 但 仍 存 在 一 个 很 大 的 疑 问, 就 是 YPet 具 有 如 此 好 的 特 性 的 原 因, 或 许 仅 是 由 于 YPet 与 CyPet 的 二 聚 化 作 用 得 到 增 强 2.4 橙 色 荧 光 蛋 白 与 数 以 百 计 的 蓝 绿 色 绿 色 及 黄 色 光 谱 型 荧 光 蛋 白 相 比, 在 橙 色 和 红 色 波 长 ( 约 560nm 到 650nm) 光 谱 区 仅 仅 开 发 了 几 种 探 针 尽 管 如 此, 现 有 的 这 几 种 光 谱 型 的 蛋 白 ( 图 21, 表 6) 都 是 从 珊 瑚 中 分 离 得 到 的, 并 且 在 多 种 成 像 情 景 中 显 现 出 应 用 潜 力, 但 在 对 橙 色 区 域 荧 光 蛋 白 的 命 名 中 存 在 混 乱 通 常 被 命 名 为 红 色 荧 光 蛋 白 RFP 的 探 针 如 DsRed TagRFP 及 tdtomato, 实 际 上 具 有 明 显 的 橙 色 多 于 红 色 的 发 射 谱 不 考 虑 颜 色 的 指 示, 用 标 准 的 四 甲 基 罗 丹 明 异 硫 氰 酸 脂 (tetramethyl-rhodamine isothiocyanate, TRITC) 滤 光 片 设 备, 橙 色 光 谱 型 的 蛋 白 在 多 种 颜 色, 如 蓝 绿 色 绿 色 和 红 色 情 景 中 更 易 于 成 像 Kusabira Orange 是 来 源 于 香 菇 珊 瑚 Fungia concinna 的 四 聚 体, 它 通 过 cdna 克 隆 的 点 特 异 性 突 变 在 蛋 白 质 的 N 末 端 添 加 了 10 个 残 基 得 到 的 荧 光 蛋 白 在 548nm 有 最 大 吸 收, 发 射 光 谱 以 559nm 为 中 心 发 出 亮 的 黄 - 橙 色 荧 光 随 后 再 另 外 引 入 20 个 突 变, 得 到 单 体 形 式 的 mko( 图 22h, 表 6) mko 表 现 出 与 EGFP 相 似 的 亮 度, 并 且 在 更 广 泛 的 荧 光 发 射 范 围 都 具 有 光 稳 定 性, 是 所 有 荧 光 蛋 白 中 最 好 的, 所 以 它 是 长 期 成 像 实 验 中 的 最 佳 选 择 更 重 要 的 是,mKO 消 光 系 数 高, 使 它 成 为 FRET 中 蓝 绿 色 和 水 鸭 绿 色 荧 光 蛋 白 的 极 好 受 体 现 在 Kusabira Orange 的 四 聚 体 和 单 体 变 体 都 已 经 商 业 化 最 近, 研 究 人 员 引 进 了 一 种 新 的 高 亮 度 的 单 体 橙 色 蛋 白 TagRFP, 在 定 位 研 究 和 FRET 研 究 中 是 很 有 希 望 的 候 选 物 人 们 最 早 是 从 海 葵 Entacmaea quadricolor 中 克 隆 到 其 二 聚 体 形 式, 随 后 的 随 机 突 变 产 生 一 种 快 速 成 熟 变 体 TurboRFP, 其 特 点 是 光 稳 定 性 高 亮 度 强 ph 耐 受 性 高 等 在 来 自 相 同 种 属 的 相 近 蛋 白 (eqfp611, 图 21) 的 晶 体 结 构 基 础 上,Merzlyak 等 在 二 聚 体 中 替 换 了 几 个 关 键 的 氨 基 酸 残 基, 同 时 进 行 随 机 突 变 以 保 留 蛋 白 的 折 叠 特 性 最 终 得 到 的 变 体 TagRFP 具 有 很 好 的 光 物 理 学 特 性 ( 表 6), 并 且 能 在 哺 乳 动 23

7 物 细 胞 中 与 多 种 蛋 白 融 合 表 达 ( 图 22j) 然 而, 有 些 实 验 室 发 现 其 光 稳 定 性 不 如 原 来 描 述 的 那 样 高 Merzlyak 等 推 测, 当 GFP 和 YFP 作 为 供 体 时, TagRFP 将 成 为 极 好 的 FRET 受 体, 但 这 仍 需 要 进 一 步 验 证 通 过 点 特 异 性 和 随 机 突 变, 人 们 已 经 解 决 了 原 始 Discosoma DsRed 荧 光 蛋 白 的 主 要 问 题 但 是 要 从 其 它 种 属 的 珊 瑚 虫 蛋 白 构 建 真 正 的 单 体 DsRed 变 体, 却 是 一 项 困 难 的 任 务 要 得 到 第 一 代 单 体 红 色 荧 光 蛋 白 (mrfp1), 需 要 改 造 DsRed 序 列 的 33 个 残 基 mrfp1 在 584nm 吸 收 最 大, 发 射 谱 607nm 然 而, 与 天 然 蛋 白 相 比, 这 种 衍 生 物 表 现 出 明 显 的 荧 光 发 射 减 弱 以 及 很 快 的 光 漂 白, 这 导 致 其 比 类 似 的 单 体 GFP 和 YFP 用 处 要 小 得 多 研 究 人 员 利 用 突 变 技 术 来 寻 找 橙 色 红 色 和 远 红 外 的 荧 光 蛋 白 变 体, 进 一 步 降 低 这 些 生 物 探 针 的 自 缔 合 (self-association, 文 后 小 词 典 ) 的 倾 向, 同 时 将 发 射 峰 推 进 到 更 长 的 波 长 区 域 在 所 有 光 谱 型 中, 亮 度 最 强 的 荧 光 蛋 白 是 串 联 形 式 的 二 聚 体 Tomato(dimeric Tomato, dtomato) 它 是 一 种 原 始 的 水 果 蛋 白 的 橙 色 衍 生 物 dtomato 来 源 于 一 种 被 命 名 为 dimer2 的 中 间 体, 这 种 中 间 体 是 在 四 聚 体 DsRed 蛋 白 崩 解 过 程 中 产 生 的 这 种 变 体 包 含 GFP 的 N 末 端 和 C 末 端 的 前 后 各 七 个 氨 基 酸 残 基, 这 样 可 以 提 高 与 融 合 蛋 白 的 兼 容 性 并 降 低 潜 在 的 定 位 假 象 串 联 二 聚 体 包 含 dtomato 的 两 个 拷 贝, 由 12 个 氨 基 酸 残 基 的 接 头 链 接 由 于 有 一 对 发 色 团, 导 致 tdtomato( 图 22i) 亮 度 极 强 并 且 有 得 天 独 厚 的 光 稳 定 性 ( 表 6) tdtomato 最 大 的 缺 点 是 分 子 较 大, 在 某 些 情 况 下 可 能 会 干 扰 融 合 蛋 白 的 折 叠 2.5 红 色 荧 光 蛋 白 在 活 细 胞 及 动 物 全 身 成 像 中 需 要 表 现 较 好 的 红 色 荧 光 蛋 白, 主 要 是 由 于 在 多 种 颜 色 成 像 实 验 中 需 要 红 色 探 针, 另 外 基 于 较 长 的 激 发 波 长 产 生 的 光 毒 性 较 小, 可 以 用 来 探 测 较 深 的 生 物 组 织 最 新 研 究 进 展 是, 通 过 mrfp1( 表 6) 发 色 团 残 基 的 直 接 突 变 产 生 的 新 的 荧 光 蛋 白, 得 到 的 单 体 荧 光 蛋 白 发 射 峰 在 560nm~610nm, 并 以 相 应 的 水 果 名 字 来 命 名 这 其 中 mstrawberry 和 mcherry, 发 射 峰 分 别 为 596nm 和 610nm( 表 6, 图 22k), 亮 度 分 别 为 EGFP 的 75% 和 50% 左 右 mcherry 的 光 稳 定 性 要 远 强 于 mstrawberry, 所 以 长 期 成 为 成 像 实 验 中 mrfp1 最 好 的 替 代 品 这 些 以 水 果 命 名 的 荧 光 蛋 白 单 体 与 mko 和 TagRFP 共 同 填 补 了 水 母 红 移 荧 光 蛋 白 ( 如 YPet) 与 大 量 低 聚 红 色 珊 瑚 荧 光 蛋 白 间 的 空 白, 并 且 目 前 已 经 商 业 化 虽 然, 某 些 荧 光 蛋 白 缺 乏 许 多 成 像 实 验 所 需 要 的 亮 度 和 光 稳 定 性, 但 是 它 们 的 存 在 提 示 我 们, 最 终 可 以 找 到 跨 越 整 个 可 见 光 谱 的 亮 度 高 稳 定 性 强 的 单 体 探 针 研 究 人 员 借 助 一 种 新 技 术 迭 代 体 细 胞 超 突 变 (somatic hypermutation, SMH), 获 得 了 两 种 新 的 荧 光 蛋 白, 这 表 明 首 次 获 得 了 真 正 的 远 红 外 基 因 工 程 探 针 ( 发 射 波 长 为 625nm 及 649nm) 其 中 最 有 应 用 潜 力 的 是 mplum( 图 22l), 虽 然 其 亮 度 有 限 仅 为 EGFP 的 10%( 表 6), 但 它 有 极 好 的 光 稳 定 性 mplum 可 与 蓝 绿 色 绿 色 黄 色 及 橙 色 荧 光 蛋 白 一 起 应 用 于 多 色 成 像 实 验 中, 也 可 在 FRET 中 与 绿 色 和 黄 色 荧 光 蛋 白 如 memerald( 表 6) mcitrine 配 对 使 用 Chudakov 等 人 在 2007 年 组 合 应 用 点 特 异 性 突 变 和 随 机 突 变 得 到 了 编 码 TurboRFP 变 体 的 库, 它 包 含 了 发 色 团 周 围 关 键 位 点 的 突 变 经 过 筛 选 及 进 一 步 突 变, 人 们 最 后 获 得 了 一 种 二 聚 体 蛋 白, 并 将 其 命 名 为 Katushka( 发 射 峰 为 635nm) 虽 然 亮 度 仅 为 EGFP 的 三 分 之 二, 但 Katushka 是 nm 光 谱 区 亮 度 最 强 的 荧 光 蛋 白, 此 区 域 对 较 深 的 组 织 成 像 非 常 重 要 将 Katushka 的 四 个 主 要 突 变 引 入 TagRFP, 产 生 的 一 种 单 体 的 远 红 外 蛋 白 mkate ( 表 6) 具 有 相 似 的 光 谱 特 点 研 究 表 明,mKate 的 光 稳 定 性 是 个 例 外, 其 亮 度 与 mcherry 类 似, 这 使 得 它 成 为 在 远 红 外 光 谱 区 成 像 的 定 位 实 验 中 极 好 的 选 择 24

8 2.6 光 学 加 亮 荧 光 蛋 白 人 们 在 对 荧 光 蛋 白 变 体 复 杂 的 光 物 理 学 特 性 的 研 究, 找 到 了 可 被 两 种 方 式 激 活 的 发 色 团, 它 们 可 从 静 息 态 发 射 荧 光 ( 即 光 激 活 ) 或 者 发 生 荧 光 发 射 带 宽 的 转 变 ( 即 光 转 化 ) 这 些 蛋 白 出 现 后 被 作 为 一 种 新 型 的 探 针, 在 活 细 胞 成 像 中 及 对 蛋 白 质 动 力 学 的 研 究 中 最 为 理 想 如 表 7, 理 想 的 光 学 加 亮 荧 光 蛋 白 应 易 于 光 激 活 或 光 转 化 以 产 生 更 高 水 平 的 对 比, 以 单 体 形 式 作 为 融 合 标 签 这 些 为 相 对 苛 刻 的 光 漂 白 技 术 提 供 了 一 个 温 和 的 选 择, 如 光 脱 色 荧 光 恢 复 技 术 (fluorescence recovery after photobleaching, FRAP) 和 光 漂 白 过 程 中 的 荧 光 损 失 (fluorescence loss in photobleaching, FLIP), 它 们 需 要 强 的 激 光 并 反 复 照 射, 以 便 从 感 兴 趣 的 区 域 完 全 清 除 活 化 的 光 团 更 重 要 的 是 新 合 成 的 或 未 转 化 的 荧 光 蛋 白 并 未 对 它 们 产 生 消 极 的 影 响, 它 们 仍 然 是 不 可 见 的 或 继 续 发 射 原 有 的 波 长 第 一 个 可 光 活 化 的 (photoactivatable, PA) 光 学 加 亮 PA-GFP( 图 23a, 表 7), 就 是 通 过 将 wtgfp 的 203 位 苏 氨 酸 替 换 为 组 氨 酸 (T203H) 而 产 生 的 只 有 被 激 活 才 发 出 绿 色 荧 光 的 变 体 用 强 烈 的 紫 色 光 ( nm) 照 射, 这 个 变 体 产 生 的 绿 色 荧 光 ( 发 射 峰 在 504nm) 提 高 了 100 倍, 从 而 可 以 用 来 追 踪 分 子 亚 群 动 力 学 ( 图 24 a-c) PA-GFP 的 非 活 化 形 式 很 难 被 检 测 到, 这 或 许 是 它 最 大 的 缺 陷 然 而, 这 一 点 对 于 建 立 一 个 较 大 的 光 活 化 动 力 学 范 围 是 至 关 重 要 的 在 Emerald 和 超 折 叠 GFP 基 础 上 开 发 的 类 似 荧 光 蛋 白 动 力 学 范 围 被 降 低, 这 或 许 是 因 为 非 活 化 状 态 下 的 荧 光 强 度 明 显 要 比 PA- GFP 亮 来 源 于 水 母 Aequorea coerulescens 的 一 种 新 蛋 白 质 PS-CFP2, 就 是 在 405nm 照 射 下 发 生 光 转 化 从 蓝 绿 色 变 成 绿 色 荧 光 的 ( 表 7) 这 种 光 学 加 亮 的 荧 光 蛋 白 与 PA-GFP 有 相 同 的 发 色 团, 可 能 是 通 过 类 似 的 机 制 进 行 光 活 化 的 ( 图 23a) PS-CFP2 与 PA-GFP 相 比 有 一 优 势, 在 光 转 化 前 会 发 出 有 效 的 蓝 绿 色 荧 光, 这 就 更 容 易 追 踪 和 定 位 然 而 PS- CFP2 的 动 力 学 范 围 要 比 PA-GFP 低, 这 种 探 针 在 光 转 化 效 率 上 不 如 绿 色 到 红 色 光 学 加 亮 的 荧 光 蛋 白 所 有 已 经 报 道 的 绿 色 到 红 色 光 学 加 亮 的 荧 光 蛋 白 ( 包 括 Dendra2 Eos Kaede 和 KikGR, 表 7), 都 有 一 个 能 发 出 绿 色 荧 光 的 来 源 于 三 肽 HYG 的 发 色 团 用 短 波 长 的 可 见 光 或 长 波 长 的 紫 外 线 照 射, 就 会 引 起 酰 胺 氮 和 组 氨 酸 残 基 的 α 碳 原 子 断 开, 接 下 来 发 色 团 会 连 接 到 组 氨 酸 支 链 上 ( 图 23b) 这 一 过 程 需 要 完 整 蛋 白 的 催 化 作 用, 结 果 荧 光 发 射 向 着 长 波 长 ( 橙 色 - 红 色 ) 漂 移 这 种 包 括 发 色 团 转 变 的 非 常 规 的 化 学 反 应, 为 开 发 更 好 的 加 亮 荧 光 蛋 白 提 供 了 很 好 的 基 础 表 7 常 用 光 学 加 亮 荧 光 蛋 白 物 理 属 性 蛋 白 光 谱 型 颜 色 激 发 峰 (nm) 发 射 峰 (nm) 亮 度 pk a 聚 集 状 态 发 色 团 滤 光 装 置 PA-GFP(N) 绿 色 弱 二 聚 体 SYG DAPI/FITC PA-GFP(P) 绿 色 弱 二 聚 体 SYG FITC/GFP PS-CFP2(N) 蓝 绿 色 单 体 SYG CFP PS-CFP2(P) 绿 色 单 体 SYG FITC/GFP PA-mRFP1(P) 红 色 单 体 QYG TxRed tdeos(n) 绿 色 串 联 二 聚 体 HYG FITC/GFP tdeos(p) 红 色 串 联 二 聚 体 HYG TRITC Dendra2(N) 绿 色 单 体 HYG FITC/GFP Dendra2(P) 红 色 单 体 HYG TRITC KFP1(P) 红 色 NA 四 聚 体 MYG TRITC/DsRed Dronpa(P) 绿 色 单 体 CYG FITC/GFP N: 天 然 构 象 ;P: 光 活 化 或 光 转 化 后 构 象 资 料 来 源 :Journal of Cell Science 25

9 a 光 活 化 中 性 型 天 然 类 ( 暗 的 ) 阴 离 子 型 光 活 化 类 ( 绿 色 ) b 去 碳 酸 基 光 活 化 天 然 类 ( 绿 色 ) 光 活 化 类 ( 红 色 ) 骨 架 被 劈 开 c 反 式 发 色 团 顺 式 发 色 团 光 控 开 关 顺 反 异 构 暗 态 荧 光 态 图 23 光 学 加 亮 荧 光 蛋 白 光 活 化 光 转 化 和 光 控 的 机 制 (a)pa-gfp 和 PS-CFP2 的 光 活 化 是 当 发 色 团 由 中 性 转 变 为 阴 离 子 态 而 导 致 222 位 谷 氨 酸 脱 羧 基 引 起 的 (b) 包 含 HYG 发 色 团 的 Kaede KikGR Dendra2 和 Eos, 它 们 的 绿 色 到 红 色 的 光 转 化, 紫 外 或 紫 色 光 照 射 后 引 起 62 位 组 氨 酸 残 基 的 酰 胺 氮 与 α- 碳 原 子 间 连 接 断 裂, 形 成 一 个 相 连 的 双 咪 唑 环 系 统 (c)dronpa 的 光 控 是 照 射 光 在 405nm 和 488nm 间 转 换 引 起 的 顺 - 反 式 光 异 构 化 mtfp0.7 和 KFP1 的 异 构 化 机 制 与 此 相 似 ( 图 片 来 源 :Journal of Cell Science) 遗 憾 的 是, 光 学 加 亮 的 荧 光 蛋 白 的 全 部 潜 能 还 远 远 没 有 被 认 识 到 在 现 有 的 几 种 光 活 化 探 针 中,PA- GFP 仍 然 是 绿 色 荧 光 区 最 好 的 选 择, 而 且 在 动 力 学 范 围 方 面 远 优 于 红 色 变 体 PA-mRFP1 PS-CFP2 是 蓝 绿 到 绿 色 光 转 化 的 唯 一 选 择,PS-CFP2 虽 然 以 单 体 形 式 存 在, 但 其 亮 度 低, 而 且 在 成 像 过 程 中 会 因 持 续 的 光 转 化 而 造 成 伪 像 在 绿 色 到 红 色 类 型 中, 在 亮 度 和 转 化 效 率 方 面 表 现 最 好 的 是 Kaede 和 KikGR 然 而 二 者 都 是 四 聚 体, 在 大 多 数 实 验 中 都 不 能 应 用 Dendra2 是 单 体 变 体, 或 许 在 感 光 融 合 及 FRET 研 究 中 是 最 好 的 选 择 ( 图 24 g-i) 但 是 由 于 在 激 光 扫 描 共 聚 焦 成 像 中, 快 速 光 漂 白 使 其 亮 度 不 到 四 聚 体 的 50% 绿 色 到 红 色 光 加 亮 荧 光 蛋 白 Eos 的 二 聚 体 在 亮 度 及 光 稳 定 性 方 面 比 Dendra2 要 好, 但 体 积 大 两 倍 ( 图 24 d-f) 很 明 显, 所 有 的 种 类 都 需 要 进 一 步 找 到 更 好 的 荧 光 蛋 白 来 源 于 Pectiniidae( 一 种 石 化 珊 瑚 虫 ) 的 单 体 荧 光 蛋 白 Dronpa 的 产 生, 宣 告 了 新 一 代 专 门 的 开 - 关 可 控 的 可 逆 光 学 加 亮 荧 光 蛋 白 的 产 生 Dronpa 是 经 过 定 向 和 随 机 突 变 的 基 因 工 程 改 构 获 得 的, 表 现 出 非 同 寻 常 的 光 致 变 色, 用 两 种 不 同 激 发 波 长 照 射 可 使 其 开 启 或 关 闭 荧 光 ( 图 23c 和 图 24j-l) Dronpa 在 503nm 有 一 个 最 大 26

10 吸 收 峰, 在 390nm 处 有 一 个 次 峰 主 峰 归 因 于 去 质 子 化 的 发 色 团 ( 阴 离 子 型 ), 而 次 峰 产 生 于 质 子 化 ( 中 性 ) 形 式 的 发 色 团 当 在 488nm 照 射 时, 阴 离 子 型 的 发 色 团 在 最 大 518nm 发 射, 此 时, 相 应 的 光 量 子 产 率 较 高 达 到 0.85( 表 7) 与 此 形 成 鲜 明 对 照 的 是, 中 性 形 态 的 发 色 团 几 乎 发 不 出 荧 光 Dronpa 的 光 控 开 关 就 是 去 质 子 化 与 质 子 化 形 态 的 相 互 转 换 一 旦 在 488nm 受 到 照 射,Dronpa 就 变 成 质 子 化 形 式, 荧 光 减 弱 变 暗 即 关 闭 状 态, 此 时 390nm 吸 收 峰 占 优 势 在 最 低 照 度 (405nm) 下, 能 很 容 易 地 令 其 从 暗 淡 状 态 转 换 回 原 来 的 去 质 子 化 状 态, 发 出 荧 光 ( 图 23c) 2007 年, 研 究 人 员 报 道 了 水 鸭 绿 荧 光 蛋 白 前 体 mtfp0.7 类 似 的 行 为, 从 结 晶 学 上 描 述 了 其 暗 状 态 和 荧 光 状 态 的 转 换 目 前, 人 们 已 经 从 Anemonia sulcata 分 离 到 一 种 非 荧 光 色 素 蛋 白, 开 发 出 另 一 种 光 可 控 加 亮 荧 光 蛋 白 Kindling 荧 光 蛋 白 ( 商 品 名 KFP1, 表 7) KFP1 只 有 在 525nm 和 580nm 间 的 绿 色 或 黄 色 光 照 射 下 才 发 出 荧 光 低 亮 度 的 光 导 致 瞬 时 红 色 荧 光, 其 最 大 激 发 和 发 射 谱 分 别 为 580nm 和 600nm, 随 着 照 射 的 停 止 而 慢 慢 地 衰 退, 重 新 恢 复 到 原 来 非 荧 光 状 态 用 强 烈 的 蓝 光 ( nm) 照 射, 会 立 即 完 全 地 淬 灭 红 色 荧 光, 这 使 得 荧 光 标 记 受 到 很 好 的 控 制 相 反, 高 强 度 的 绿 光 ( 约 550nm) 照 射 或 以 中 等 水 平 持 续 照 射, 结 果 导 致 不 可 逆 的 光 转 换, 产 生 强 度 比 非 活 化 蛋 白 强 30 倍 的 荧 光 KFP1 主 要 的 缺 点 是 其 强 制 性 的 四 聚 体, 这 严 重 地 影 响 其 作 为 融 合 标 签 及 其 FRET 中 的 应 用 荧 光 蛋 白 光 控 机 制 的 研 究 表 明, 发 色 团 顺 - 反 异 构 体 是 开 关 过 程 的 关 键 事 件 顺 式 构 象 代 表 荧 光 形 态, 而 反 式 异 构 体 为 发 色 团 的 非 荧 光 或 暗 状 态 ( 图 23c) 这 些 构 象 的 改 变 很 显 然 是 伴 随 着 发 色 团 各 种 各 样 的 质 子 化 作 用 更 重 要 的 是, 光 诱 导 的 光 控 可 能 是 发 色 团 平 面 性 及 其 内 部 氨 基 酸 支 链 结 构 重 排 的 表 现 这 可 能 是 各 种 光 活 化 和 光 控 荧 光 蛋 白 基 本 的 机 制 a d g b 靠 近 e 前 缘 伪 足 小 体 h c 物 质 交 换 f 板 状 伪 足 回 缩 伪 足 小 体 新 前 缘 i 图 24 光 学 加 亮 荧 光 蛋 白 在 激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 下 成 像 (a-c)mpa- GFP-actin-C-7 在 负 鼠 肾 上 皮 细 胞 (OK 细 胞 系 ) 中 的 光 活 化 (a) 用 Olympus FV1000 飓 风 扫 描 器 选 定 的 环 状 区 域, 在 405nm 照 射 5 秒 钟 (b) 光 活 化 的 肌 动 蛋 白 嵌 合 体, 时 间 为 5 分 钟 (c) 胞 浆 肌 动 蛋 白 池 和 丝 状 肌 动 蛋 白 网, 时 间 为 60 分 钟 (d-f) 跟 踪 兔 肾 上 皮 细 胞 (RK-13 细 胞 系 ) 中 tdeos-mito-n-7 标 记 的 线 粒 体 (d) 选 定 的 区 域 中, 单 个 线 粒 体 ( 红 色 ) 在 405nm 光 照 下 的 光 转 化 (e) 箭 头 所 示 为 未 转 化 的 线 粒 体 ( 绿 色 ) 向 光 转 化 的 线 粒 体 靠 近, 时 间 为 10 分 钟 (f) 线 粒 体 间 的 物 质 交 换, 时 间 为 20 分 钟 (g-i) 在 OK 细 胞 中 用 Dendra2-actin-C-7 检 测 板 状 伪 足 (g) 用 405nm 激 光 选 定 区 域 的 光 转 化 ( 红 色 ) (h) 光 转 化 肌 动 蛋 白 形 成 的 伪 足 小 体 及 其 前 缘 的 改 变, 时 间 为 20 分 钟 (i) 光 转 化 的 板 状 伪 足 回 缩, 从 而 促 进 新 伪 足 小 体 和 新 前 缘 的 形 成, 时 间 为 45 分 钟 (j-l) 大 鼠 胸 主 动 脉 成 肌 细 胞 (A7r5 细 胞 系 ) 中 Dronpa-actin-C-7 标 记 的 肌 动 蛋 白 细 胞 骨 架 的 光 控 开 关 (j) 肌 动 蛋 白 网 在 488nm 激 光 下 的 成 像 (k) 完 全 光 控 开 关 后, 标 记 的 肌 动 蛋 白 在 488nm 关 闭, 拼 写 有 FV10 的 区 域 在 405nm 激 光 下 被 激 活, 时 间 为 3 分 钟 (l) 肌 动 蛋 白 网 在 488nm 成 像 时 FV10 区 域 被 光 漂 白 j k l 图 片 来 源 :Journal of Cell Science 27

11 除 了 选 择 性 地 标 记 融 合 蛋 白 亚 群 用 来 研 究 动 力 学 外, 光 学 加 亮 荧 光 蛋 白 在 超 分 辨 率 显 微 镜 技 术 中 也 是 有 价 值 的 工 具, 它 打 破 了 传 统 的 Abbe 衍 射 屏 障 最 新 建 立 的 方 法, 如 光 敏 定 位 显 微 技 术 (photoactivated localization microscopy, PALM; 图 25) 和 随 机 光 学 重 建 显 微 法 (stochastic optical reconstruction microscopy, STORM) 就 是 很 好 的 例 子 这 些 技 术 使 得 研 究 者 能 够 在 更 高 的 分 辨 率 下 更 快 地 进 行 活 细 胞 成 像 这 些 独 特 的 光 激 活 探 针 绿 色 到 红 色 光 学 加 亮 荧 光 蛋 白 及 来 源 于 GFP 衍 生 物 和 造 礁 珊 瑚 蛋 白 的 光 控 变 体, 都 对 解 决 与 聚 合 及 微 调 光 激 活 及 发 射 谱 的 问 题 有 积 极 的 作 用 将 来, 随 着 更 先 进 的 光 学 加 亮 蛋 白 工 程 的 发 展, 其 光 转 化 波 长 将 漂 移 到 蓝 色 和 绿 色 光 谱 区 域, 比 现 在 常 用 的 紫 外 波 长 对 活 细 胞 毒 性 更 小, 发 射 波 长 漂 移 到 穿 过 远 红 外 区 域 的 黄 色 区 域, 这 些 都 将 极 大 地 扩 展 这 类 探 针 的 应 用 潜 力 a b c b 图 25 多 聚 甲 醛 固 定 的 灰 狐 肺 成 纤 维 细 胞 粘 着 斑 在 光 敏 定 位 显 微 镜 (PALM) 下 成 像 (a)tdeos 标 记 的 多 个 粘 着 斑 与 人 纽 蛋 白 (human vinculin, VCL) 融 合 后 在 广 视 野 下 荧 光 成 像 (b) 图 a 中 框 出 区 域 的 粘 着 斑 全 内 反 射 荧 光 (TIRF) 成 像 (c) 对 图 B 所 示 的 粘 着 斑 结 构 进 行 光 敏 定 位 显 微 成 像 ( 粘 着 斑 结 构 上 有 明 显 的 纽 蛋 白 装 配, 已 用 白 色 箭 头 标 出 ) ( 图 片 来 源 :Journal of Cell Science) 小 词 典 小 词 典 Abbe 衍 射 屏 障 早 在 1873 年,Abbe 就 发 现 了 一 个 规 律, 现 在 基 本 已 成 为 一 个 定 律 这 个 规 律 认 为, 根 据 透 镜 原 理 制 造 的 光 学 显 微 镜, 其 分 辨 能 力 不 可 能 超 过 光 波 波 长 的 一 半, 这 个 限 制 被 称 为 衍 射 屏 障 (diffraction barrier) 自 缔 合 (self association) 自 缔 合 指 借 分 子 间 作 用 力 氢 键 弱 的 离 子 间 引 力 而 缔 合 如 在 一 定 距 离 内 羧 基 和 氨 基 间 的 引 力 : 距 离 近, 发 生 缩 合 反 应 ; 距 离 远, 引 力 太 弱, 则 发 生 自 缔 合 28

12 2.7 越 来 越 多 的 荧 光 蛋 白 发 生 斯 托 克 斯 位 移 除 了 采 用 工 程 设 计 来 调 整 发 射 谱 外, 荧 光 蛋 白 突 变 技 术 也 靶 向 吸 收 峰 与 发 射 峰 间 的 分 离, 即 斯 托 克 斯 位 移, 来 产 生 更 好 的 探 针 以 用 于 FRET FCCS 及 多 色 成 像 将 wtgfp 的 第 203 位 氨 基 酸 由 T 苏 氨 酸 突 变 为 异 亮 氨 酸 I 而 产 生 的 变 体 Sapphire 在 475nm 就 没 有 次 激 发 峰 Sapphire 表 现 出 引 人 注 目 的 112nm 的 斯 托 克 斯 位 移, 其 激 发 峰 和 发 射 峰 分 别 为 399nm 和 511nm 在 此 基 础 上 再 进 行 四 个 额 外 的 突 变 产 生 的 衍 生 物 T-Sapphire, 其 折 叠 功 能 得 以 改 进 并 产 生 更 亮 的 荧 光 由 于 这 些 变 体 在 紫 外 区 能 够 被 激 发, 在 FRET 中 可 作 为 极 好 的 供 体 与 橙 色 和 红 色 蛋 白 一 起 应 用 Miyawaki 等 人 在 来 源 于 一 种 叫 做 Montipora 的 蔷 薇 珊 瑚 色 素 蛋 白 的 基 础 上, 采 用 更 严 格 的 方 法 构 建 了 最 长 达 180nm 的 斯 托 克 斯 位 移 荧 光 蛋 白 变 体 将 发 色 团 周 围 的 五 个 残 基 进 行 半 随 机 突 变 得 到 一 种 具 有 双 峰 激 发 谱 的 红 色 荧 光 蛋 白, 双 峰 分 别 在 452nm 和 580nm, 其 发 射 峰 在 606nm 另 外, 他 们 又 进 行 了 另 外 四 个 突 变, 结 果 完 全 减 少 了 580nm 峰, 并 且 将 另 一 个 吸 收 峰 蓝 移 到 440nm 这 种 衍 生 物 被 命 名 为 Keima, 发 射 峰 在 616nm, 为 四 聚 体 在 进 行 多 轮 突 变 后 得 到 了 具 有 与 Keima 类 似 光 谱 特 性 的 二 聚 体 dkeima, 以 及 发 射 峰 为 620nm 的 单 体 mkeima mkeima 的 亮 度 有 限 与 mplum 相 似, 它 需 要 特 殊 的 滤 光 片 才 能 成 像, 但 可 在 FCCS 和 多 色 成 像 实 验 中 应 用 目 前, 每 个 光 谱 型 中 都 有 一 些 具 有 潜 力 的 荧 光 蛋 白 ( 如 图 22 及 表 6 所 示 ), 但 多 数 还 没 有 与 EGFP 在 光 稳 定 性 及 其 它 至 关 紧 要 的 性 能 ( 除 ph 稳 定 性 外 ) 方 面 相 当 的 荧 光 蛋 白 蓝 色 和 蓝 绿 色 区 域 新 成 员 充 分 地 改 进 了 亮 度 和 光 稳 定 性, 所 有 的 橙 色 荧 光 蛋 白 都 是 长 期 多 色 成 像 的 极 好 选 择 另 外,YFP 虽 然 亮 度 比 EGFP 强, 但 其 光 稳 定 性 还 没 有 达 到 最 佳 水 平, 而 红 色 和 远 红 外 荧 光 蛋 白 是 所 有 光 谱 型 中 亮 度 最 暗 的 不 考 虑 光 谱 型 和 单 体 特 性, 更 复 杂 的 问 题 是 潜 在 的 难 折 叠 蛋 白 的 聚 集 假 象 即 便 如 此, 表 6 所 列 的 荧 光 蛋 白 也 能 够 两 种 或 三 种 颜 色 成 像 获 得 极 好 的 结 果 大 多 数 荧 光 蛋 白 都 是 过 去 数 年 发 现 并 引 入 研 究 领 域 的, 它 们 的 亮 度 和 光 稳 定 性 仍 需 要 将 来 进 一 步 优 化 小 词 典 小 词 典 斯 托 克 斯 位 移 1852 年,G.G.Stokes 在 研 究 光 致 发 光 的 光 谱 时, 提 出 了 一 个 论 断 : 发 光 的 波 长 总 是 大 于 激 发 光 的 波 长 后 来, 在 大 量 的 实 验 中, 出 现 了 很 多 例 外 于 是 他 们 把 发 光 谱 线 分 为 两 类, 符 合 上 述 关 系 的 叫 做 斯 托 克 斯 线, 它 的 波 长 和 激 发 光 的 波 长 之 差, 称 为 斯 托 克 斯 位 移 反 之, 称 为 反 斯 托 克 斯 线, 相 应 的 波 长 差, 则 称 为 反 斯 托 克 斯 位 移 由 于 存 在 很 多 例 外, 上 述 斯 托 克 斯 提 出 的 论 断 就 不 是 规 律, 而 只 能 称 为 定 则 1879 年,E. 洛 梅 尔 概 括 了 大 量 实 验 结 果, 把 斯 托 克 斯 定 则 修 改 为 : 发 光 光 谱 的 峰 值 及 重 心 的 波 长 总 是 大 于 激 发 光 光 谱 的 峰 值 及 重 心 的 波 长, 称 为 斯 托 克 斯 - 洛 梅 尔 定 律 1927 年,C. 瓦 维 洛 夫 定 律 揭 示 了 发 光 效 率 随 着 激 发 光 的 波 长 而 变 化 的 规 律 : 在 斯 托 克 斯 区 ( 即 发 光 波 长 大 于 激 发 光 波 长 的 频 段 ) 发 光 的 能 量 效 率 随 着 激 发 光 波 长 的 增 大 而 上 升, 而 发 光 的 量 子 效 率 不 因 激 发 光 波 长 的 增 大 而 改 变 ; 但 是, 进 入 反 斯 托 克 斯 区 以 后, 发 光 效 率 就 急 剧 下 降, 从 而 进 一 步 揭 示 了 斯 托 克 斯 规 则 的 物 理 内 容 近 代 关 于 发 光 光 谱 的 研 究 又 深 入 一 步 阐 明 了 产 生 斯 托 克 斯 位 移 的 物 理 过 程 它 反 映 了 发 光 中 心 所 受 周 围 环 境 的 影 响, 是 发 光 中 心 与 振 动 中 的 点 阵 相 互 作 用 的 结 果 对 宽 频 带 发 光 过 程 来 说, 斯 托 克 斯 位 移 是 很 有 益 的, 因 为 它 可 以 避 免 光 被 材 料 再 吸 收 近 年 来, 人 们 发 现 了 将 长 波 光 转 换 为 短 波 光 的 材 料, 它 吸 收 两 个 以 上 的 光 子 后, 发 射 出 一 个 能 量 较 大 的 光 子, 一 般 只 是 在 高 激 发 密 度 下 才 比 较 显 著 29

13 为 了 及 时 收 集 生 命 科 学 最 新 资 讯 提 高 生 命 奥 秘 办 刊 质 量, 现 面 向 从 事 生 命 科 学 或 对 这 学 科 有 浓 厚 兴 趣 的 科 研 人 员 学 生 诚 聘 特 约 编 辑 ( 兼 职 ) 职 位 职 责 : 独 立 完 成 生 命 奥 秘 专 题 的 策 划 : 对 基 因 组 学 蛋 白 组 学 生 物 信 息 学 和 细 胞 生 物 学 等 学 科 的 发 展 以 及 生 物 医 学 领 域 相 关 技 术 ( 例 如 基 因 诊 断 技 术 干 细 胞 和 克 隆 技 术 生 物 芯 片 技 术 等 ) 的 应 用 进 行 翻 译 及 深 入 评 述 选 题 要 求 内 容 新 颖 评 述 精 辟 注 重 时 效 和 深 入 浅 出 尤 其 欢 迎 以 自 身 系 统 研 究 为 基 础 的 高 水 平 译 述 与 评 论, 结 合 所 从 事 的 科 研 工 作 提 出 自 己 的 见 解 今 后 设 想 或 前 瞻 性 展 望 要 求 : 1. 具 备 基 因 组 学 蛋 白 组 学 生 物 信 息 学 细 胞 生 物 学 等 生 命 科 学 学 科 背 景 ; 2. 具 备 良 好 的 生 命 科 学 前 沿 触 觉 ; 3. 具 备 较 高 的 外 文 文 献 翻 译 编 译 水 平 ; 4. 具 备 较 强 的 选 题 策 划 资 料 搜 集 组 织 能 力, 以 及 专 业 稿 件 撰 写 能 力 ; 5. 具 有 高 级 职 称 ; 或 者 拥 有 ( 正 在 攻 读 ) 该 领 域 的 最 高 学 位 有 意 者 请 将 个 人 简 历 发 送 至 editor@lifeomics.com 联 系 人 : 蔡 小 姐 30

14 3. 荧 光 蛋 白 工 程 进 展 所 有 的 荧 光 蛋 白 都 是 相 似 的 三 维 圆 柱 形 结 构, 多 肽 骨 架 的 大 部 分 折 叠 成 11 条 氢 键 链 接 的 β 折 叠 片, 中 央 为 包 含 发 色 团 的 α 螺 旋, 短 的 螺 旋 片 段 保 护 着 圆 柱 的 两 端 ( 图 20) 这 些 β 折 叠 片 由 不 太 有 序 排 列 的 富 含 脯 氨 酸 的 环 链 接 在 一 起, 每 个 折 叠 片 的 氨 基 酸 支 链 或 者 凹 入 蛋 白 质 内 部 或 者 凸 向 表 面 与 多 数 可 溶 性 蛋 白 相 似, 蛋 白 表 面 的 残 基 常 常 带 有 电 荷 或 极 性, 也 包 含 部 分 疏 水 残 基 该 蛋 白 内 部 折 叠 很 紧 密, 即 使 水 分 子 也 被 疏 水 键 固 定 在 氨 基 酸 上, 而 且 离 子 或 其 它 小 分 子 的 扩 散 空 间 极 小 荧 光 蛋 白 内 部 的 刚 性 结 构 是 由 独 特 的 化 学 环 境 造 成 的, 这 有 利 于 中 央 的 α 螺 旋 中 由 三 个 氨 基 酸 形 成 自 催 化 的 发 色 团 这 种 环 境 的 改 变 会 产 生 一 些 变 体, 这 些 变 体 在 光 谱 特 点 光 稳 定 性 及 其 它 物 理 特 性 方 面 都 有 所 改 变 这 可 用 一 个 例 子 来 说 明, 普 通 的 三 肽 甲 硫 氨 酸 - 酪 氨 酸 - 甘 氨 酸 (MYG) 能 够 形 成 跨 越 175nm 发 射 区 域 的 发 色 团, 这 明 显 仅 是 依 靠 β 折 叠 柱 内 部 造 成 的 化 学 物 理 环 境 值 得 注 意 的 是, 具 有 MYG 发 色 团 的 荧 光 蛋 白 包 括 ZsGreen1( 发 射 峰 507nm) tdtomato TagRFP mcherry mkate 和 mplum 在 MYG 光 谱 区 域 末 端 的 荧 光 蛋 白 包 括 蓝 绿 色 荧 光 蛋 白 AmCyan1(Clontech, 发 射 峰 486nm) 及 远 红 外 荧 光 蛋 白 AQ14( 发 射 峰 663nm) 虽 然, 人 们 目 前 已 经 阐 明 报 道 的 多 数 荧 光 蛋 白 包 含 MYG 发 色 团, 但 是 很 可 能 还 存 在 很 大 的 差 异 理 论 上, 进 行 新 的 荧 光 蛋 白 工 程 首 先 要 改 造 发 色 团 残 基 及 其 邻 近 残 基 这 种 努 力 产 生 了 多 种 光 谱 变 体, 它 们 的 发 射 谱 改 变 了 数 十 纳 米 在 获 得 Aequorea 荧 光 蛋 白 晶 体 后, 蛋 白 质 工 程 师 就 能 在 更 大 的 范 围 设 计 新 的 变 体, 来 改 变 光 谱 特 性 光 稳 定 性 齐 聚 反 应 ph 敏 感 性 和 成 熟 效 率 珊 瑚 红 移 荧 光 蛋 白 的 发 现 同 样 产 生 了 新 的 变 体, 这 些 变 体 有 一 个 大 约 160nm 的 发 射 光 谱 范 围, 它 们 的 特 性 更 是 多 种 多 样 然 而 仅 从 晶 体 结 构 来 进 行 理 论 推 断 还 有 一 些 局 限, 许 多 通 过 随 机 突 变 产 生 的 变 体 会 出 现 亮 度 降 低 及 蛋 白 折 叠 问 题, 甚 至 根 本 不 能 发 出 荧 光 通 常 表 面 上 看 起 来 很 明 显 的 突 变, 都 必 须 经 过 一 轮 或 多 轮 随 机 突 变 才 能 保 留 其 它 必 要 的 特 性 正 是 由 于 这 一 原 因, 多 个 研 究 组 已 经 采 用 创 新 的 技 术 来 改 进 设 计 策 略 一 种 有 潜 力 的 方 法 应 该 有 助 于 荧 光 蛋 白 特 性 的 微 调, 就 是 将 靶 向 特 异 残 基 的 结 构 库 与 为 了 改 良 其 特 点 的 定 量 筛 选 结 合 起 来 研 究 者 应 用 这 一 方 法 成 功 地 增 强 了 BFP 的 亮 度 及 光 稳 定 性 最 好 的 突 变 体 被 命 名 为 Azurite, 其 亮 度 比 天 然 BFP 高 60% 下 一 步, 研 究 人 员 将 研 究 这 种 方 法 能 否 应 用 于 其 它 荧 光 蛋 白 Nguyen 和 Daugherty 等 人 采 用 类 似 的 被 称 为 进 化 优 化 的 方 法, 来 优 化 用 来 检 测 凋 亡 的 带 有 caspase-3( 半 胱 氨 酸 蛋 白 酶 3) 酶 切 位 点 的 FRET 生 物 传 感 器 中 配 对 的 CFP 和 YFP 结 论 是,YPet 和 一 种 蓝 绿 色 变 体 CyPet 表 现 出 比 ECFP 更 强 的 ph 稳 定 性 和 更 快 速 的 成 熟 性 然 而 CyPet 在 37 很 难 折 叠, 这 严 重 地 限 制 了 其 作 为 独 立 探 针 的 应 用 范 围 在 CyPet 和 YPet 中 的 氨 基 酸 替 换 分 布 在 整 个 蛋 白 中, 有 益 的 突 变 既 有 靠 近 发 色 团 的 也 有 离 发 色 团 比 较 远 的 CyPet-YPet FRET caspase-3 生 物 传 感 器 的 动 态 范 围 要 比 mcerulean-mvenus 配 对 的 FRET 提 高 20 倍 但 是 最 近 研 究 表 明,CyPet-YPet 生 物 传 感 器 易 于 使 二 聚 化 增 强, 这 可 能 是 其 超 强 表 现 的 原 因 所 在 因 此 有 人 对 此 提 出 了 疑 问, 所 以 在 设 计 实 验 时 要 认 真 考 虑 是 否 使 用 CyPet-YPet 组 合 此 外, 研 究 者 采 用 常 规 序 列 来 改 造 来 源 于 石 珊 瑚 Galaxeidae 的 荧 光 蛋 白, 获 得 了 单 体 的 绿 色 变 体 Azami Green(mAG) 采 用 同 样 的 工 程 方 法, 通 过 改 良 序 列 来 改 变 蛋 白 的 特 性, 结 果 得 到 的 常 规 绿 色 蛋 白 (consensus green protein, CGP) 与 mag 相 差 23 个 残 基, 与 来 自 于 珊 瑚 Agaricia fragilis 的 GFP2 相 差 76 个 残 基 CGP 在 细 菌 中 表 达 为 单 体 形 式, 并 且 表 现 出 高 水 平 的 荧 光, 但 是 表 达 量 却 比 mag 降 低 了 40% 左 右, 这 使 得 CGP 明 显 变 得 暗 淡 有 趣 的 是,mAG 与 CGP 不 同 的 残 基 有 超 过 85% 在 蛋 白 表 面, 这 或 许 说 明 表 面 残 基 要 比 内 部 残 基 进 化 的 快 虽 然, 首 次 荧 光 蛋 白 工 程 所 得 到 的 产 品 不 如 原 来 蛋 白 效 率 高, 但 是 随 着 已 知 荧 光 蛋 白 序 列 的 数 据 增 多, 这 种 方 法 毫 无 疑 问 会 发 挥 更 大 的 作 用 融 合 蛋 白 中 折 叠 效 率 得 到 提 高 的 GFP 变 体, 为 生 产 超 折 叠 GFP 奠 定 了 基 础 将 GFP 序 列 重 排 库 与 难 折 叠 的 多 肽 融 合, 这 些 难 折 叠 的 肽 作 为 诱 饵 蛋 31

15 白 在 细 菌 中 干 扰 GFP 的 正 确 折 叠 经 过 四 轮 DNA 重 排, 研 究 人 员 分 离 得 到 包 含 六 个 新 的 突 变 的 荧 光 亮 度 强 的 克 隆 这 一 工 作 至 关 重 要 的 一 点 就 是 : 即 使 在 高 度 优 化 的 GFP 变 体 中 也 还 有 很 大 的 工 程 改 进 空 间 将 这 种 方 法 应 用 在 其 它 颜 色 的 蛋 白 中 可 能 会 得 到 相 似 的 结 果 钱 永 健 等 发 明 了 一 种 真 正 独 特 的 方 法 进 行 基 因 工 程 改 造 荧 光 蛋 白, 包 括 采 用 从 免 疫 系 统 借 鉴 来 的 技 术 迭 代 体 细 胞 超 突 变 (somatic hypermutation, SHM) 来 直 接 优 化 他 们 要 产 生 发 射 波 长 在 远 红 外 区 (>625nm) 的 红 色 荧 光 蛋 白 变 体 人 们 已 经 知 道,B 淋 巴 细 胞 能 够 通 过 SHM 将 点 突 变 引 入 抗 体 的 可 变 区 研 究 人 员 证 实, 能 够 在 超 突 变 表 达 免 疫 球 蛋 白 的 B 细 胞 系 Ramos 中 采 用 这 一 技 术 来 产 生 新 的 荧 光 蛋 白 在 Ramos 细 胞 系 中 表 达 mrfp1 的 一 种 变 体, 启 动 子 为 四 环 素 诱 导 启 动 子, 载 体 为 逆 转 录 病 毒, 其 转 录 在 强 力 霉 素 调 控 下 来 控 制 SHM 的 水 平 用 FACS 富 集 来 选 择 最 长 发 射 波 长 的 克 隆, 此 过 程 需 要 多 次 重 复 23 轮 后 分 离 得 到 一 种 单 体, 发 射 波 长 在 远 红 外 区, 并 命 名 为 mplum( 表 6), 同 时 对 它 的 特 性 加 以 鉴 定 mplum 的 最 大 发 射 谱 为 649nm, 比 原 来 位 移 了 37nm, 并 且 这 种 荧 光 蛋 白 也 表 现 出 非 常 大 的 斯 托 克 司 频 移, 达 到 59nm 早 期 得 到 的 克 隆 mraspberry 发 射 谱 波 长 更 短, 为 625nm 虽 然 mraspberry 的 光 稳 定 性 不 足 以 在 活 细 胞 成 像 中 应 用, 但 mplum 的 光 稳 定 性 与 黄 色 光 谱 型 的 许 多 蛋 白 相 当 采 用 以 上 描 述 的 方 法 对 已 有 的 蛋 白 进 行 微 调, 来 改 进 它 们 的 折 叠 特 性 亮 度 齐 聚 效 应 及 光 稳 定 性, 毫 无 疑 问 最 终 能 够 得 到 比 简 单 地 从 海 洋 中 寻 找 到 的 荧 光 蛋 白 更 好 的 探 针 最 近, 荧 光 蛋 白 工 程 技 术 的 突 破 已 经 得 到 了 几 种 新 的 变 体, 这 些 都 是 传 统 方 法 无 法 做 到 的 这 些 技 术 已 经 用 来 产 生 新 的 颜 色 的 荧 光 蛋 白 建 立 更 稳 定 的 结 构 增 强 折 叠 效 率 及 优 化 FRET 效 率 或 许 新 的 方 法 将 能 够 使 得 ph 敏 感 性 及 光 稳 定 性 得 到 改 善, 这 两 点 对 其 在 酸 性 的 细 胞 器 官 及 长 期 成 像 实 验 中 的 应 用 是 至 关 重 要 的 已 知 许 多 氨 基 酸 三 联 体 能 使 发 射 颜 色 发 生 巨 大 变 化 ( 如 MYG,177nm;QYG,137nm;TYG,91nm; CYG,80nm), 这 表 明 在 荧 光 蛋 白 序 列 中 有 足 够 的 空 间 添 加 额 外 的 突 变, 从 而 能 够 优 化 颜 色 及 多 种 其 它 荧 光 蛋 白 的 性 质 参 考 文 献 1. Nathan C. Shaner, George H. Patterson & Michael W. Davidson. (2007) Advances in fluorescent protein technology, Journal of Cell Science, 120: 四 更 多 阅 读 1.GFP 的 科 学 影 响 随 着 GFP 类 蛋 白 作 为 细 胞 内 遗 传 标 签 的 应 用 以 及 成 像 技 术 数 据 分 析 的 快 速 发 展,GFP 在 生 物 科 学 中 的 应 用 得 到 极 大 的 推 进 早 期 发 展 起 来 的 生 物 物 理 荧 光 方 法, 如 FRET 荧 光 相 关 谱 (fluorescence correlation spectroscopy, FCS) 荧 光 交 叉 相 关 光 谱 (fluorescence cross-correlation spectroscopy, FCCS) 光 脱 色 荧 光 恢 复 技 术 (fluorescence recovery after photo-bleaching, FRAP) 和 全 内 反 射 显 微 术 等, 都 是 借 助 GFP 类 蛋 白 发 出 的 荧 光 信 号 来 监 测 细 胞 内 发 生 的 事 件, 而 且 已 经 得 到 广 泛 应 用 此 外, 荧 光 寿 命 成 像 术 (fluorescence life-time imaging, FLIM) 高 分 辨 率 光 敏 定 位 显 微 技 术 (photo-activation localization microscopy, PALM) 及 其 它 建 立 在 GFP 基 础 上 的 高 分 辨 率 方 法 也 已 经 出 现 实 际 上 自 1992 年 以 来, 各 类 期 刊 有 超 过 20,000 篇 关 于 GFP 的 文 章, 这 对 生 物 科 学 实 验 的 如 何 实 施 如 何 解 释 都 有 巨 大 的 影 响 32