282 曾 小 云, 等 肝 癌 病 例 中 XRCC 基 因 多 态 性 与 环 境 因 素 的 交 互 作 用 分 析 肝 细 胞 癌 (hepatocelularcarcinoma,hcc, 简 称 肝 癌 ), 是 世 界 上 最 常 见 的 恶 性 肿 瘤 之 一, 高 居 世 界 肿 [

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1 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 202 年 9 月 第 9 卷 第 7 期 CHINJCANCERPREV TREAT,September202,Vol.9 No.7 28 肝 癌 病 例 中 犡 犚 犆 犆 基 因 多 态 性 与 环 境 因 素 的 交 互 作 用 分 析 曾 小 云 黄 金 梅 许 杨 仇 小 强 2 余 红 平. 广 西 医 科 大 学 公 共 卫 生 学 院 流 行 病 学 教 研 室, 广 西 南 宁 桂 林 医 学 院 公 共 卫 生 学 院 流 行 病 学 教 研 室, 广 西 桂 林 前 沿 报 道 / 论 著 摘 要 目 的 : 研 究 某 些 环 境 因 素 与 X 射 线 修 复 交 叉 互 补 组 (XRCC) 基 因 多 态 性 间 交 互 作 用 对 肝 细 胞 癌 (HCC) 发 生 危 险 性 的 影 响 方 法 : 采 用 单 纯 病 例 研 究 方 法, 调 查 500 例 HCC 患 者 所 接 触 的 相 关 环 境 因 素, 用 荧 光 实 时 定 量 PCR 方 法 检 测 XRCC 280 XRCC 94 和 XRCC 399 单 核 苷 酸 多 态 性 结 果 :XRCC 280 与 乙 肝 e 抗 体 对 HCC 的 发 生 有 正 相 乘 交 互 作 用 ( 犘 =0.047,OR=.809,95%CI:.007~3.249);XRCC 94 与 饮 酒 对 HCC 的 发 生 有 正 相 乘 交 互 作 用 ( 犘 =0.04,OR=.496,95%CI:.06~2.204);XRCC 94 与 乙 肝 表 面 抗 体 阳 性 对 HCC 的 发 生 有 负 相 乘 交 互 作 用 ( 校 正 后, 犘 =0.045,OR=.737,95%CI:.03~2.979) 未 发 现 XRCC 399 基 因 多 态 性 与 相 关 环 境 因 素 之 间 存 在 交 互 作 用 结 论 : 携 带 XRCC 94 突 变 等 位 基 因 与 饮 酒 乙 肝 表 面 抗 体 阳 性 对 HCC 可 能 存 在 交 互 作 用 ; 携 带 XRCC 280 突 变 等 位 基 因 与 乙 肝 e 抗 体 对 HCC 可 能 存 在 交 互 作 用 关 键 词 癌, 肝 细 胞 ;DNA 修 复 ; 多 态 性, 单 核 苷 酸 ; 肝 肿 瘤 / 遗 传 学 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,202,9(7): 犐 狀 狋 犲 狉 犪 犮 狋 犻 狅 狀 狊 犫 犲 狋 狑 犲 狀 犡 犚 犆 犵 犲 狀 犲 狆 狅 犾 狔 犿 狅 狉 狆 犺 犻 狊 犿 犪 狀 犱 狊 狆 犲 犮 犻 犳 犮 犲 狀 狏 犻 狉 狅 狀 犿 犲 狀 狋 犪 犾 犳 犪 犮 狋 狅 狉 狊 犻 狀 犎 犆 犮 犪 狊 犲 狊 犣 犈 犖 犌 犡 犻 犪 狅 狔 狌 狀, 犎 犝 犃 犖 犌 犑 犻 狀 犿 犲 犻, 犡 犝 犢 犪 狀 犵, 犙 犐 犝 犡 犻 犪 狅 狇 犻 犪 狀 2 犵, 犢 犝 犎 狅 狀 犵 狆 犻 狀 犵. 犇 犲 狆 犪 狉 狋 犿 犲 狀 狋 狅 犳 犈 狆 犻 犱 犲 犿 犻 狅 犾 犵 狅 狔, 犛 犮 犺 狅 狅 犾 狅 犳 犘 狌 犫 犾 犻 犮 犎 犲 犪 犾 狋 犺, 犌 狌 犪 狀 犵 狓 犻 犕 犲 犱 犻 犮 犪 犾 犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔, 犖 犪 狀 犻 狀 犵 53002, 犘. 犚. 犆 犺 犻 狀 犪 2. 犇 犲 狆 犪 狉 狋 犿 犲 狀 狋 狅 犳 犈 狆 犻 犱 犲 犿 犻 狅 犾 犵 狅 狔, 犛 犮 犺 狅 狅 犾 狅 犳 犘 狌 犫 犾 犻 犮 犎 犲 犪 犾 狋 犺, 犌 狌 犻 犾 犻 狀 犕 犲 犱 犻 犮 犪 犾 犆 狅 犾 犲 犵 犲, 犌 狌 犻 犾 犻 狀 54004, 犘. 犚. 犆 犺 犻 狀 犪 [ 犃 犅 犛 犜 犚 犃 犆 犜 ] 犗 犅 犑 犈 犆 犜 犐 犞 犈 :Toexploretheinteractionsbetweenenvironmentalexposurefactorsandgeneticpolymor phisminxrccinhcc. 犕 犈 犜 犎 犗 犇 犛 :Theresearchwasdesignedbyacase onlystudybasedonhospitals.studiedcases werethe500new HCCcasesandtheirenvironmentalexposeddatawerecolected.TaqMan MGBReal timequantitative polymerasechainreaction(rt PCR)wasusedtodetectsinglenucleotidepolymorphismofXRCC 94,XRCC 280and XRCC 399. 犚 犈 犛 犝 犔 犜 犛 :XRCC 280and Anti Hbehadapositive multiplicativeinteractionon HCCoccurrence ( 犘 = 0.047,OR=.809,95%CI: ).XRCC 94andalcoholconsumptionhadmultiplicativeinteractiononHCC occurrence( 犘 =0.04,OR=.496,95%CI: ).XRCC 94andHBsAbhadanegativemultiplicativeinter actiononhccoccurrence( 犘 =0.045,OR=.737,95%CI: ). 犆 犗 犖 犆 犔 犝 犛 犐 犗 犖 犛 :CarryingtheXRCC 94 mutantaleleanddrinkingalcoholmayhaveaninteractionin HCC;carryingtheXRCC 94 mutantaleleand HbsAb tendtoaninteractionrelatedwithhcc.carryingthexrcc 280mutantaleleandHbeAbarealsolikelytohaveanin teractioninhcc. [ 犓 犈 犢 犠 犗 犚 犇 犛 ] carcinoma,hepatocelular;dnarepair;polymorphism,singlenucleotide;liverneoplasms/genetics 犆 犺 犻 狀 犑 犆 犪 狀 犮 犲 狉 犘 狉 犲 狏 犜 狉 犲 犪 狋,202,9(7): 中 图 分 类 号 R735.7 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 (202) 基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金 ( ); 广 西 自 然 科 学 基 金 (200GXNSFA0365) 第 一 作 者 简 介 曾 小 云, 女, 湖 南 邵 阳 人, 博 士, 教 授, 主 要 从 事 慢 性 病 流 行 病 学 的 研 究 工 作 Tel: E mail:zxyxjw@2cn.com 通 讯 作 者 简 介 余 红 平, 女, 河 南 桐 柏 人, 博 士, 教 授, 主 要 从 事 慢 性 病 流 行 病 学 的 研 究 工 作 Tel: E mail:yhp268@63.com

2 282 曾 小 云, 等 肝 癌 病 例 中 XRCC 基 因 多 态 性 与 环 境 因 素 的 交 互 作 用 分 析 肝 细 胞 癌 (hepatocelularcarcinoma,hcc, 简 称 肝 癌 ), 是 世 界 上 最 常 见 的 恶 性 肿 瘤 之 一, 高 居 世 界 肿 [] 瘤 死 因 谱 第 3 位, 严 重 威 胁 人 们 的 健 康 与 生 命 HCC 的 主 要 致 病 因 素 有 病 毒 性 肝 炎 感 染 食 物 中 黄 曲 [2] 霉 毒 素 污 染 饮 用 水 藻 类 毒 素 污 染 以 及 吸 烟 饮 酒 等 HCC 的 发 生 和 演 进 是 典 型 的 多 因 素 多 基 因 多 阶 段 和 多 途 径 的 复 杂 过 程, 是 遗 传 与 环 境 因 素 相 互 作 用 的 结 果 遗 传 因 素 与 特 定 的 环 境 因 素 相 结 合, 才 能 更 好 地 解 释 HCC 发 生 的 机 制 大 多 数 环 境 致 癌 物 通 过 外 源 和 内 源 性 DNA 损 伤 与 细 胞 基 因 组 DNA 共 价 结 合, 导 致 细 胞 遗 传 物 质 的 损 伤 如 果 DNA 损 伤 得 不 到 及 时 有 效 的 修 复, 可 能 最 终 导 致 基 因 突 变 和 细 胞 癌 变 碱 基 切 除 修 复 (base excisionrepair,ber) 是 主 要 的 DNA 损 伤 修 复 途 径,XRCC 基 因 在 BER 途 径 中 发 挥 着 重 要 作 用 本 研 究 应 用 单 纯 病 例 研 究 方 法 探 讨 饮 酒 吸 烟 等 环 境 暴 露 因 素 与 X 射 线 修 复 交 叉 互 补 组 (X rayrepaircross complementinggroup,xrcc) 基 因 交 互 作 用 对 HCC 发 生 危 险 性 的 影 响 材 料 与 方 法. 标 本 来 源 病 例 来 源 于 广 西 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 (382 例 ) 及 附 属 肿 瘤 医 院 (8 例 ), 经 综 合 临 床 表 现, 血 清 HCC 标 志 超 声 和 肝 组 织 病 理 学 等 检 查, 临 床 确 诊 的 原 发 性 HCC 患 者 共 500 例 男 426 例 (85.2%), 女 74 例 (4.8%) 年 龄 20~83 岁, 平 均 年 龄 (48.73±.08) 岁, 中 位 年 龄 48.8 岁 汉 族 377 例 (75.4%), 其 他 民 族 23 例 (24.6%); 有 384 例 乙 肝 病 毒 (hepatitisbvirus,hbv) 感 染, 占 76.8%.2 犇 犖 犃 提 取 每 例 研 究 对 象 抽 取 静 脉 血 2 ml, 置 于 含 0.2 ml 酸 性 枸 橼 酸 盐 (acidcitratedextrose,acd) 抗 凝 剂 的 真 空 抗 凝 管 中, 用 饱 和 酚 氯 仿 法 提 取 DNA.3 犡 犚 犆 基 因 多 态 性 的 检 测 应 用 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 的 7500Fast 实 时 定 量 PCR 仪, 按 照 7500Fast 用 户 操 作 手 册, 采 用 Taq Man MGB 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 对 XRCC 94 (rs799782) XRCC 280(rs25489) 和 XRCC 399 (rs25487) 进 行 基 因 多 态 性 检 测.4 资 料 收 集 采 用 统 一 的 调 查 表, 由 经 过 专 门 培 训 的 调 查 员 对 研 究 对 象 进 行 调 查 调 查 内 容 包 括 一 般 人 口 学 资 料 生 活 方 式 既 往 史 和 家 族 史 等 相 关 指 标 变 量 定 义 : ) 吸 烟 是 指 采 用 WHO 关 于 吸 烟 调 查 方 法 标 准 建 议 规 定, 一 生 中 连 续 或 累 积 吸 烟 6 个 月 视 为 有 吸 烟 史 2) 饮 酒 是 指 每 周 饮 酒 至 少 次, 持 续 6 个 月 即 视 为 有 饮 酒 史 3)HCC 家 族 史 是 指 被 调 查 对 象 的 一 级 亲 属 ( 父 母 子 女 和 同 胞 ) 或 二 级 亲 属 ( 祖 父 母 外 祖 父 母 叔 伯 舅 姨 和 姑 ) 中 有 HCC 病 史 4)HBV 感 染 是 指 乙 肝 表 面 抗 原 阳 性.5 统 计 学 方 法 采 用 单 纯 病 例 研 究 方 法 进 行 基 因 环 境 交 互 作 用 的 分 析 单 纯 病 例 研 究 的 基 本 原 理 为 拟 定 某 一 患 者 群 作 为 研 究 对 象 ( 无 需 正 常 对 照 组 ), 并 收 集 患 者 的 一 般 情 况 混 杂 变 量 及 环 境 暴 露 资 料, 同 时 采 集 患 者 的 生 物 标 本, 采 用 分 子 生 物 学 技 术 检 测 基 因 型 以 具 有 某 一 基 因 型 的 病 例 作 为 类 病 例 组, 以 无 该 基 因 型 的 病 例 作 为 类 对 照 组, 根 据 基 因 型 与 环 境 暴 露 情 况 采 用 非 条 件 Logistic 模 型 等 估 计 两 者 在 疾 病 发 生 中 的 相 乘 模 型 交 [3] 互 作 用 研 究 对 象 按 照 基 因 型 环 境 暴 露 因 素 的 有 无 或 者 等 级 分 组, 应 用 SPSS3.0 统 计 软 件 对 数 据 进 行 Logistic 回 归 分 析, 计 算 OR(oddratio) 值 及 其 95% 可 信 区 间 (confidenceinterval,ci) 所 有 的 统 计 检 验 均 为 双 侧 概 率 检 验, 检 验 水 准 α = 结 果 2. 犡 犚 犆 94 基 因 多 态 性 与 环 境 因 素 交 互 作 用 HCC 患 者 饮 酒 组 携 带 XRCC 94 至 少 个 突 变 等 位 基 因 的 基 因 型 (CT/TT) 的 比 例 高 于 非 饮 酒 组, 差 异 有 统 计 学 意 义, 校 正 年 龄 性 别 民 族 婚 姻 状 况 和 职 业 等 因 素 后 差 异 有 统 计 学 意 义, 犘 =0.04, 说 明 XRCC 94 位 点 的 多 态 与 饮 酒 存 在 交 互 作 用 ;HCC 患 者 乙 肝 表 面 抗 体 阳 性 组 携 带 XRCC 94 至 少 个 突 变 等 位 基 因 的 基 因 型 (CT/TT) 的 比 例 低 于 乙 肝 表 面 抗 体 阴 性 组, 差 异 有 统 计 学 意 义, 校 正 年 龄 性 别 民 族 婚 姻 状 况 和 职 业 等 因 素 后 差 异 有 统 计 学 意 义 ( 犘 = 0.045), 说 明 XRCC 94 位 点 的 多 态 与 乙 肝 表 面 抗 体 存 在 交 互 作 用, 未 见 其 他 因 素 与 所 研 究 基 因 存 在 交 互 作 用 ( 表 ) 2.2 犡 犚 犆 280 基 因 多 态 性 与 环 境 因 素 交 互 作 用 结 果 显 示, 乙 肝 e 抗 体 与 XRCC 280 基 因 有 交 互 作 用,HCC 患 者 乙 肝 e 抗 体 阳 性 组 携 带 XRCC 280 至 少 个 突 变 等 位 基 因 的 基 因 型 (GA/AA) 的 比 例 高 于 乙 肝 e 抗 体 阴 性 组, 差 异 有 统 计 学 意 义, 校 正 年 龄 性 别 民 族 婚 姻 状 况 和 职 业 等 因 素 有 统 计 学 意 义, 犘 =0.047, 提 示 XRCC 280 位 点 的 多 态 与 乙 肝 e 抗 体 存 在 交 互 作 用 未 见 其 他 因 素 与 所 研 究 基 因 存 在 交 互 作 用 ( 表 2) 2.3 犡 犚 犆 399 基 因 多 态 性 与 环 境 因 素 交 互 作 用 未 发 现 所 研 究 因 素 与 XRCC 399 基 因 存 在 交 互 作 用 ( 表 3)

3 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 202 年 9 月 第 9 卷 第 7 期 CHINJCANCERPREV TREAT,September202,Vol.9 No 表 XRCC 94 基 因 多 态 性 与 环 境 因 素 交 互 作 用 分 析 狀 (CC) 狀 (CT+TT) 95%CIforOR 因 素 犘 值 OR 值 是 否 是 否 下 限 上 限 饮 酒 吸 烟 家 族 史 食 鱼 生 史 肝 炎 病 史 HBV 感 染 乙 肝 表 面 抗 体 乙 肝 e 抗 原 乙 肝 e 抗 体 乙 肝 核 心 抗 体 校 正 因 素 为 年 龄 性 别 民 族 婚 姻 状 况 和 职 业 等 ; 犘 <0.05 表 2 XRCC 280 基 因 多 态 性 与 环 境 因 素 交 互 作 用 分 析 狀 (CC) 狀 (CT+TT) 95%CIforOR 因 素 犘 值 OR 值 是 否 是 否 下 限 上 限 饮 酒 吸 烟 家 族 史 食 鱼 生 史 肝 炎 病 史 HBV 感 染 乙 肝 表 面 抗 体 乙 肝 e 抗 原 乙 肝 e 抗 体 乙 肝 核 心 抗 体 校 正 因 素 为 年 龄 性 别 民 族 婚 姻 状 况 和 职 业 等 ; 犘 <0.05 表 3 XRCC 399 基 因 多 态 性 与 环 境 因 素 交 互 作 用 分 析 狀 (CC) 狀 (CT+TT) 95%CIforOR 因 素 犘 值 OR 值 是 否 是 否 下 限 上 限 饮 酒 吸 烟 家 族 史 食 鱼 生 史 肝 炎 病 史 HBV 感 染 乙 肝 表 面 抗 体 乙 肝 e 抗 原 乙 肝 e 抗 体 乙 肝 核 心 抗 体 校 正 因 素 为 年 龄 性 别 民 族 婚 姻 状 况 和 职 业 等 ; 犘 < 讨 论 [4] 大 多 数 常 见 肿 瘤 归 因 于 基 因 环 境 相 互 作 用 XRCC 是 一 种 重 要 的 DNA 修 复 基 因, 和 DNA 聚 合 酶 β DNA 连 接 酶 Ⅲ 相 互 作 用, 共 同 参 与 碱 基 切 除 修 [5] 复 对 XRCC 基 因 的 分 析 结 果 显 示, 有 3 个 会 导 致 氨 基 酸 发 生 变 化 的 基 因 多 态 性, 分 别 发 生 在 C263047T(Arg94Trp) G27466A (Arg280His) 和 G2852A(Arg399Gln) [6], 可 能 改 变 XRCC 的 功 能, 从 而 影 响 个 体 的 肿 瘤 易 感 性 研 究 显 示 饮 酒 与 HCC 的 发 生 发 展 有 着 一 定 的 [7] 关 联 裴 广 军 等 的 Meta 分 析 表 明, 饮 酒 是 原 发 性 HCC 发 生 的 危 险 因 素, 可 增 加 患 原 发 性 HCC 的 风 险 饮 酒 摄 入 机 体 后, 可 产 生 活 性 氧 分 子, 包 括 能 导 致 肝 细 胞 DNA 损 伤 的 氧 自 由 基 肝 细 胞 暴 露 于 乙 醇, 一 方 面 造 成 细 胞 对 DNA 修 复 能 力 下 降 ; 另 一 方 面, 乙 醇 和 乙 醛 造 成 对 叶 酸 代 谢 的 不 利 影 响, 可 能 会 导 致 [8] DNA 双 链 断 裂 本 研 究 结 果 显 示, 饮 酒 与 XRCC 94 基 因 多 态 性 对 HCC 的 发 生 可 能 有 交 互 作 用, 犘 <0.05, 校 正 年 龄 性 别 民 族 婚 姻 状 况 和 职 业

4 284 曾 小 云, 等 肝 癌 病 例 中 XRCC 基 因 多 态 性 与 环 境 因 素 的 交 互 作 用 分 析 等 因 素 后 OR 值 为.496, 提 示 XRCC 94 位 点 突 变 纯 合 型 (TT) 或 者 杂 合 型 (CT) 可 能 随 饮 酒 因 素 共 同 作 用, 增 大 HCC 发 生 的 危 险 度 结 合 本 研 究 结 果, 在 社 会 中 提 倡 少 饮 酒, 特 别 是 携 带 XRCC 94 位 点 基 因 突 变 纯 合 型 (TT) 或 者 杂 合 型 (CT) 的 个 体 少 饮 酒, 将 有 益 于 降 低 原 发 性 HCC 的 风 险, 从 而 有 可 能 降 低 我 国 原 发 性 HCC 的 发 病 率 我 国 人 群 中 吸 烟 率 较 高, 吸 烟 与 肿 瘤 关 系 的 研 究 [9] 也 是 一 个 普 遍 被 关 注 的 问 题 刘 银 梅 等 关 于 吸 烟 与 HCC 的 Meta 分 析 表 明 吸 烟 是 HCC 发 病 的 危 险 因 素 且 随 每 日 吸 烟 量 增 加,HCC 发 病 风 险 也 在 增 加 这 些 研 究 表 明, 吸 烟 对 机 体 的 变 化 并 不 仅 仅 是 与 患 者 的 吸 烟 史 有 关, 还 与 患 者 吸 烟 量 和 吸 烟 时 间 长 短 有 密 切 关 系, 而 本 研 究 在 初 步 探 讨 吸 烟 与 否 和 XRCC 基 因 多 态 性 之 间 的 交 互 作 用 分 析 中, 未 能 发 现 吸 烟 与 XRCC 基 因 多 态 性 存 在 交 互 作 用, 未 能 全 面 深 入 探 讨 其 与 基 因 多 态 性 交 互 作 用 对 HCC 发 生 的 影 响 黄 德 [0] 生 等 对 吸 烟 同 XRCC 399 位 点 的 多 态 进 行 了 交 互 作 用 分 析, 在 重 度 吸 烟 肺 癌 患 者 中 发 现,Gln/Gln 同 Arg/Arg 比 较 合 并 后 的 OR 值 为 0.83(95% CI: 0.73~0.94), 差 异 具 有 统 计 学 意 义 但 是, 该 研 究 是 在 各 研 究 对 于 重 度 吸 烟 定 义 不 同 的 基 础 上 进 行 的 合 并, 同 时 考 虑 到 分 组 汇 总 中 的 假 阳 性 率 问 题, 这 种 在 重 度 吸 烟 患 者 中 OR 值 降 低 的 趋 势 值 得 进 一 步 检 验 国 内 外 的 研 究 发 现 慢 性 HBV 感 染 与 HCC 有 一 定 的 关 联, 已 证 实 慢 性 HBV 感 染 是 导 致 HCC 的 重 要 [] [2] 原 因, 可 以 解 释 约 80% 的 HCC 病 因 杨 金 龙 等 研 究 表 明, 人 类 XRCC 399 位 氨 基 酸 突 变 在 HBV 阳 性 人 群 的 HCC 的 发 生 中 可 能 具 有 一 定 的 作 用 曾 小 [3] 云 等 研 究 表 明,XRCC 常 见 3 个 位 点 的 单 核 苷 酸 多 态 性 可 能 不 是 广 西 人 群 中 HCC 的 易 感 因 素, 但 存 在 XRCC 基 因 多 态 性 与 吸 烟 饮 酒 HBsAg 慢 性 感 染 等 的 相 加 交 互 作 用 本 研 究 未 发 现 HBV 感 染 与 XRCC3 个 位 点 多 态 性 交 互 作 用 对 HCC 的 影 响 导 致 以 上 研 究 之 间 的 分 歧, 可 能 原 因 为 单 纯 病 例 研 究 探 讨 的 是 相 乘 交 互 作 用, 而 病 例 对 照 研 究 探 讨 的 是 相 加 交 互 作 用 乙 肝 表 面 抗 体 是 对 HBV 免 疫 的 保 护 性 抗 体 本 研 究 结 果 显 示, 乙 肝 表 面 抗 体 与 XRCC 94 基 因 对 HCC 有 交 互 作 用,OR<, 显 示 表 面 抗 体 阳 性 有 减 弱 XRCC 94 基 因 突 变 诱 发 的 HCC 发 生 危 险 性, 是 保 护 性 因 素 乙 肝 e 抗 体 是 患 者 感 染 了 乙 型 肝 炎 病 毒 以 后, 对 乙 型 肝 炎 表 面 抗 原 蛋 白 质 所 产 生 的 一 种 免 疫 反 应 性 抗 体 急 性 期 即 出 现 阳 性, 容 易 进 展 为 慢 性 乙 型 肝 炎 ; 慢 性 活 动 性 肝 炎 出 现 阳 性 者 可 进 展 为 肝 硬 化, 乙 型 肝 炎 和 肝 硬 化 是 导 致 HCC 的 重 要 危 险 因 素, e 抗 体 阳 性 对 HCC 的 发 生 发 展 可 能 有 影 响 本 研 究 结 果 显 示,e 抗 体 与 XRCC 280 基 因 多 态 性 存 在 交 互 作 用 ( 犘 =0.047,OR=.809), 提 示 e 抗 体 阳 性 增 加 XRCC 280 基 因 突 变 诱 发 HCC 的 可 能 性 总 的 来 说, 本 次 研 究 应 用 单 纯 病 例 研 究 方 法, 初 步 探 讨 了 XRCC 基 因 多 态 性 与 部 分 环 境 因 素 的 交 互 作 用 对 HCC 发 病 风 险 的 影 响, 结 果 显 示 单 个 基 因 与 环 境 暴 露 之 间 的 交 互 作 用 强 度 不 大, 这 一 方 面 可 能 是 由 于 单 纯 病 例 研 究 结 果 可 信 区 间 窄, 统 计 对 交 互 效 应 的 要 求 更 高, 另 一 方 面 可 能 是 由 于 HCC 是 在 多 种 环 境 因 素 影 响 下 使 多 个 基 因 发 生 改 变 所 致 的 多 基 因 病, 单 个 基 因 的 功 能 可 能 不 会 对 HCC 的 易 感 性 产 生 决 定 性 的 影 响 所 以, 今 后 的 研 究 应 充 分 考 虑 肿 瘤 多 影 响 因 素 的 复 杂 过 程, 为 全 面 了 解 HCC 病 因 提 供 科 学 依 据 参 考 文 献 [] 吴 孟 超, 沈 锋. 肝 癌 研 究 的 现 状 和 进 展 [J]. 国 外 医 学 肿 瘤 学 分 册,2000,27():7 9. [2] 叶 家 才, 崔 书 中, 巴 明 臣, 等. 原 发 性 肝 癌 的 流 行 病 学 特 征 及 其 危 险 因 素 [J]. 实 用 医 学 杂 志,2008,2(0): [3] 易 洪 刚, 陈 峰. 单 纯 病 例 研 究 [J]. 国 外 医 学 流 行 病 学 传 染 病 学 分 册,2004,3(): [4] 曾 益 新. 肿 瘤 学 [M].2 版. 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社,200:40. [5] TompsonLH,WestMG.XRCCkeepsDNAfromgetingstranded [J].MutatRes,2000,459(): 8. [6] Shen MR,JonesIM,MohrenweiserH,etal.Nonconservative aminoacidsubstitutionvariantsexistatpolymorphicfrequency indnarepairgenesinhealthyhumans[j].cancerres,998, 58(2): [7] 裴 广 军, 付 莉, 崔 亚 玲, 等. 中 国 人 群 饮 酒 与 原 发 性 肝 癌 关 系 的 Meta 分 析 [J]. 现 代 预 防 医 学,2008,35(4): [8] HoekJB,PastorinoJG.Ethanol,oxidativestress,andcyto kine inducedlivercelinjury[j].alcohol,2002,27(): [9] 刘 银 梅, 沈 月 平, 刘 娜, 等. 吸 烟 与 肝 癌 关 系 的 Meta 分 析 [J]. 现 代 预 防 医 学,200,37(20): [0] 黄 德 生, 何 苗, 周 宝 森.DNA 修 复 基 因 XRCC 的 399 位 点 多 态 性 同 肺 癌 易 感 性 关 系 的 Meta 分 析 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志, 2006,3(): [] TompsonLH,WestMG.XRCCkeepsDNAfromgetingstranded [J].MutatRes,2000,459(): 8. [2] 杨 金 龙, 韩 永 年, 郑 水 根, 等. 人 类 XRCC 399 单 核 苷 酸 多 态 性 对 原 发 性 肝 癌 的 影 响 [J]. 肿 瘤,2004,24(4): [3] 曾 小 云, 余 红 平, 仇 小 强, 等.XRCC 基 因 多 态 性 与 肝 细 胞 癌 的 病 例 对 照 研 究 [J]. 中 华 疾 病 控 制 杂 志,200,4(8): 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : ( 编 辑 : 刘 翠 玲 )

5 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 202 年 9 月 第 9 卷 第 7 期 CHINJCANCERPREV TREAT,September202,Vol.9 No 鼠 犕 犇 犕 2 犛 犖 犘 309 位 点 与 肝 细 胞 癌 发 病 年 龄 与 风 险 关 系 的 分 析 张 艳 艳 毛 良 勤 曾 小 云 谢 志 春 仇 小 强 2 余 红 平. 广 西 医 科 大 学 公 共 卫 生 学 院 流 行 病 学 教 研 室, 广 西 南 宁 桂 林 医 学 院 公 共 卫 生 学 院 流 行 病 学 教 研 室, 广 西 桂 林 流 行 病 学 研 究 / 论 著 摘 要 目 的 : 探 讨 广 西 地 区 人 群 鼠 双 微 粒 体 2 基 因 (MDM 2) 启 动 子 区 309 位 点 单 核 苷 酸 多 态 性 (SNP) 与 肝 细 胞 癌 (hepatocelularcarcinoma,hcc) 发 病 年 龄 和 发 病 风 险 的 关 系 方 法 : 运 用 聚 合 酶 链 反 应 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 方 法, 对 985 例 HCC 病 例 和 992 例 非 肿 瘤 对 照 者 的 MDM 2SNP309 位 点 (T>G,rs ) 基 因 型 进 行 检 测, 并 分 析 该 SNP 与 HCC 发 病 年 龄 和 发 病 风 险 的 关 系 结 果 : 经 年 龄 性 别 民 族 吸 烟 饮 酒 HBV 及 HCV 感 染 等 因 素 校 正 后,MDM 2 SNP309 位 点 与 HCC 发 病 风 险 之 间 无 统 计 学 关 联 (TG 狏 狊 TT:OR=.9,95%CI:0.86~.65;GG 狏 狊 TT:OR=.28,95%CI:0.89~.85;TG+GG 狏 狊 TT:OR=.22,95%CI:0.90~.66) 在 女 性 HCC 患 者 中, 与 携 带 MDM 2 SNP309 位 点 TG+GG 基 因 型 的 女 性 HCC 患 者 相 比 (44.8 岁 ), 携 带 TT 基 因 型 的 女 性 患 者 HCC 发 病 年 龄 提 前 4.6 岁 (49.4 岁 ),Log rank 检 验 : χ 2 =7.372, 犘 =0.007 在 男 性 患 者 中 未 发 现 此 类 似 结 果 结 论 :MDM 2SNP309 位 点 多 态 性 可 能 对 HCC 的 发 病 风 险 无 单 独 效 应 作 用, 但 其 TT 基 因 型 可 能 与 女 性 HCC 的 发 病 年 龄 提 前 有 关 联 本 研 究 结 果 需 要 大 样 本 量 的 研 究 进 一 步 验 证 关 键 词 癌, 肝 细 胞 ; 基 因,MDM 2; 多 态 性, 单 核 苷 酸 ; 发 病 年 龄 ; 肝 肿 瘤 / 流 行 病 学 犃 狊 狅 犮 犻 犪 狋 犻 狅 狀 狅 犳 犕 犇 犕 2 犛 犖 犘 309 狆 狅 犾 狔 犿 狅 狉 狆 犺 犻 狊 犿 犪 狀 犱 犪 犵 犲 犪 狋 狅 狀 狊 犲 狋 犪 狀 犱 狉 犻 狊 犽 狅 犳 犺 犲 狆 犪 狋 狅 犮 犲 犾 狌 犾 犪 狉 犮 犪 狉 犮 犻 狀 狅 犿 犪 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,202,9(7): 犣 犎 犃 犖 犌 犢 犪 狀 狔 犪 狀, 犕 犃 犗 犔 犻 犪 狀 犵 狇 犻 狀, 犣 犈 犖 犌 犡 犻 犪 狅 狔 狌 狀, 犡 犐 犈 犣 犺 犻 犮 犺 狌 狀, 犙 犐 犝 犡 犻 犪 狅 狇 犻 犪 狀 2 犵, 犢 犝 犎 狅 狀 犵 狆 犻 狀 犵. 犇 犲 狆 犪 狉 狋 犿 犲 狀 狋 狅 犳 犈 狆 犻 犱 犲 犿 犻 狅 犾 狅 犵 狔, 犛 犮 犺 狅 狅 犾 狅 犳 犘 狌 犫 犾 犻 犮 犎 犲 犪 犾 狋 犺, 犌 狌 犪 狀 犵 狓 犻 犕 犲 犱 犻 犮 犪 犾 犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔, 犖 犪 狀 狀 犻 狀 犵 53002, 犘. 犚. 犆 犺 犻 狀 犪 2. 犇 犲 狆 犪 狉 狋 犿 犲 狀 狋 狅 犳 犈 狆 犻 犱 犲 犿 犻 狅 犾 狅 犵 狔, 犛 犮 犺 狅 狅 犾 狅 犳 犘 狌 犫 犾 犻 犮 犎 犲 犪 犾 狋 犺, 犌 狌 犻 犾 犻 狀 犕 犲 犱 犻 犮 犪 犾 犆 狅 犾 犲 犵 犲, 犌 狌 犻 犾 犻 狀 54004, 犘. 犚. 犆 犺 犻 狀 犪 [ 犃 犅 犛 犜 犚 犃 犆 犜 ] 犗 犅 犑 犈 犆 犜 犐 犞 犈 :Toexploreassociationsbetween MDM 2singlenucleotidepolymorphism (SNP)309 (T> G,rs )andtheageatonsetandriskofhepatocelularcarcinoma (HCC)inGuangxipopulation. 犕 犈 犜 犎 犗 犇 犛 :A hospital basedcase controlstudywasconductedin985caseswithhccand992cancer freecontrols.snp309genotypes weredetectedusingapolymerasechainreaction(pcr) restrictionfragmentlengthpolymorphism (RFLP)assay,andas sociationsofmdm 2SNP309 withriskandageofonsetofhcc wereassessed. 犚 犈 犛 犝 犔 犜 犛 :Thevariantgenotypesof MDM 2SNP309werenotsignificantlyassociatedwithriskofHCC (TG 狏 狊 TT:OR=.9,95%CI: ;GG 狏 狊 TT:OR=.28,95%CI: ;TG+GG 狏 狊 TT:OR=.22,95%CI: ).Itwasfoundthatfemalepa tientscarryingthettgenotype(44.8year old)showeda4.6 yearearlierageatonset,comparedwiththosecarryingthe TG+GGgenotypes(49.4year old), χ 2 =7.372, 犘 =0.007.Similarobservationwasnotseenamong male. 犆 犗 犖 犆 犔 犝 犛 犐 犗 犖 犛 :ThefindingssuggestthatMDM 2SNP309maynothavetheindependentefectonthesusceptibilitytoHCC.The MDM 2SNP309TTgenotypemaybeassociated withanearlierageatonsetofhccin women.furtherstudieswith largesamplearewarrantedtovalidatetheseresults. [ 犓 犈 犢 犠 犗 犚 犇 犛 ] carcinoma,hepatocelular;genes,mdm 2;polymorphism,singlenucleotide;ageofonset;liverneo plasms/epidemiology 犆 犺 犻 狀 犑 犆 犪 狀 犮 犲 狉 犘 狉 犲 狏 犜 狉 犲 犪 狋,202,9(7): 基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金 ( ); 广 西 科 学 研 究 与 技 术 开 发 项 目 ( ); 广 西 科 学 基 金 (09926); 广 西 大 型 仪 器 协 作 网 测 试 补 助 ( ) 第 一 作 者 简 介 张 艳 艳, 女, 山 东 菏 泽 人, 硕 士, 主 要 从 事 分 子 流 行 病 学 和 慢 性 病 流 行 病 学 的 研 究 工 作 Tel: E mail:zhangyanyan226@63.com 通 讯 作 者 简 介 余 红 平, 女, 河 南 桐 柏 人, 博 士, 教 授, 主 要 从 事 分 子 流 行 病 学 和 慢 性 病 流 行 病 学 的 研 究 工 作 Tel: E mail:yhp268@63.com

6 286 张 艳 艳, 等 鼠 MDM 2SNP309 位 点 与 肝 细 胞 癌 发 病 年 龄 与 风 险 关 系 的 分 析 中 图 分 类 号 R735.7 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 (202) 肝 细 胞 癌 (hepatocelularcarcinoma,hcc, 简 称 肝 癌 ) 是 最 严 重 的 恶 性 肿 瘤 之 一 其 发 生 是 多 基 因 参 与 多 因 素 作 用 的 复 杂 过 程, 是 基 因 与 环 境 共 同 作 用 导 [] 致 的 结 果 既 往 研 究 表 明,HCC 的 最 主 要 环 境 危 险 因 素 为 慢 性 乙 肝 病 毒 (hepatitisbvirus,hbv) 感 染 慢 性 丙 肝 病 毒 (hepatitiscvirus,hcv) 感 染 等 然 而, 只 有 少 数 一 部 分 人 慢 性 病 毒 感 染 者 最 终 发 展 为 HCC 提 示 个 体 对 HCC 的 易 感 性 存 在 差 异 MDM 2 是 p53 最 重 要 的 负 性 调 控 因 子 之 一 研 究 发 [2] 现 MDM 2 蛋 白 在 HCC 组 织 中 过 度 表 达 单 核 苷 酸 多 态 位 点 MDM 2SNP309 (T>G,rs ), 位 于 MDM 2 基 因 启 动 子 区, 研 究 表 明 该 位 点 G 等 位 基 因 可 提 高 与 转 录 活 化 因 子 Sp 的 亲 和 力, 增 加 MDM 2 基 因 RNA 和 蛋 白 质 的 表 达 水 平, 导 致 p53 介 导 的 抑 [3] 癌 作 用 减 弱, 从 而 加 速 肿 瘤 的 形 成 目 前 关 于 MDM 2SNP309 位 点 与 HCC 的 关 系 已 进 行 了 一 些 研 [4 6] 究, 但 是 研 究 结 果 不 一 致 亦 有 研 究 发 现 MDM 2 SNP309T G 突 变 可 提 前 肿 瘤 的 发 病 年 龄 为 此, 本 研 究 以 广 西 地 区 985 例 HCC 病 例 和 相 匹 配 的 992 例 非 肿 瘤 对 照 者 为 研 究 对 象, 分 析 MDM 2SNP309 位 点 多 态 性 与 HCC 发 病 年 龄 和 发 病 风 险 的 关 系 材 料 与 方 法. 研 究 对 象 本 病 例 对 照 研 究 包 括 985 例 HCC 病 例 和 992 例 非 肿 瘤 对 照 病 例 为 于 广 西 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 (500 例 ) 广 西 医 科 大 学 肿 瘤 医 院 (485 例 ) 住 院 治 疗 的 HCC 新 发 病 例, 均 经 组 织 病 理 学 确 诊, 无 其 他 肿 瘤 史, 未 经 过 放 疗 化 疗 等 治 疗 对 照 为 来 自 同 期 上 述 医 院 的 非 肿 瘤 患 者 对 照 无 肿 瘤 病 史, 无 长 期 慢 性 疾 病 史 对 照 在 性 别 民 族 年 龄 (±5 岁 ) 和 相 同 地 区 ( 居 住 >0 年 ) 等 方 面 与 病 例 频 数 匹 配, 采 用 流 行 病 学 调 查 问 卷, 经 研 究 对 象 知 情 同 意 后, 由 专 门 培 训 过 的 调 查 员 收 集 每 位 研 究 对 象 的 详 细 人 口 学 以 及 相 关 环 境 暴 露 因 素 资 料, 并 采 集 研 究 对 象 外 周 静 脉 血 3 ml, 运 用 常 规 酚 氯 仿 法 提 取 基 因 组 DNA.2 基 因 分 型 运 用 聚 合 酶 链 反 应 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 (pol ymerase chain reaction restriction fragmentlength polymorphismassay,pcr RFLP) 方 法 进 行 MDM 2 SNP309 位 点 基 因 型 分 析 PCR 引 物 上 游 为 5 CGG GAGTTCAGGGTAAAGGT 3, 下 游 为 5 AGCAA GTCGGTGCTTACCTG 3 PCR 反 应 总 体 系 为 25μL ( 上 下 游 引 物 各 μl, 模 板 DNA μl,~ 0ng/ μ L,Mix2.5μL, 双 蒸 水 9.5μL) 反 应 条 件 为 95,5min;35 个 循 环 (95,30s 55,45s 72, min);72,0 min PCR 产 物 长 度 为 352bp, 取 5μL 产 物 与 内 切 酶 MspAⅠ (Promege, USA) 在 0μL 体 系 于 37 水 浴 消 化 过 夜,3% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 酶 切 片 段, 凝 胶 成 像 系 统 观 察 条 带 野 生 纯 合 子 TT 基 因 型 出 现 和 3bp3 个 条 带 ; 杂 合 子 TG 型 产 生 和 3bp5 个 条 带 ; 突 变 纯 合 子 GG 型 有 和 3bp4 个 条 带 ( 图 ) 为 进 行 质 量 控 制, 实 验 者 对 样 本 的 病 例 或 对 照 状 态 未 知, 对 于 分 型 结 果, 随 机 抽 取 5% 的 样 本 进 行 盲 法 复 测, 结 果 一 致 率 为 00%.3 统 计 学 方 法 图 MDM 2SNP309 位 点 酶 切 结 果 采 用 狋 检 验 和 χ 2 检 验 分 析 计 量 资 料 和 计 数 资 料, 采 用 拟 合 优 度 χ 2 检 验 计 算 MDM 2SNP309 位 点 基 因 型 在 对 照 组 中 的 分 布 是 否 符 合 Hardy Weinberg 遗 传 平 衡 定 律 多 因 素 Logistic 回 归 分 析 MDM 2 SNP309 位 点 与 HCC 易 感 性 的 关 联, 关 联 强 度 用 比 值 比 (oddsratios,or) 和 95% 可 信 区 间 (confidencein tervals,ci) 表 示 在 病 例 组 中 用 Kaplan Meier 法 计 算 各 基 因 型 携 带 者 的 平 均 HCC 发 病 年 龄, 用 Log rank 方 法 检 验 MDM 2SNP309 位 点 与 HCC 发 病 年 龄 之 间 的 关 系 数 据 分 析 采 用 SPSS3.0 统 计 软 件 Meta 分 析 的 方 法 用 于 分 析 MDM 2SNP309 位 点 与 不 同 种 族 人 群 HCC 易 感 性 的 关 联 Stata. 统 计 软 件 用 于 Meta 分 析 所 有 统 计 检 验 均 为 双 侧 检 验, 检 验 水 准 α= 结 果 2. 一 般 人 口 学 特 征 和 环 境 暴 露 因 素 的 分 布 本 研 究 病 例 组 985 例, 年 龄 6~82 岁, 平 均 年 龄 (48.2±.2) 岁, 中 位 年 龄 47.0 岁 对 照 组 992 例,

7 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 202 年 9 月 第 9 卷 第 7 期 CHINJCANCERPREV TREAT,September202,Vol.9 No 年 龄 9~83 岁, 平 均 年 龄 (47.5±.5) 岁, 中 位 年 龄 46.0 岁 年 龄 性 别 民 族 和 HCV 感 染 在 病 例 组 和 对 照 组 之 间 分 布 无 统 计 学 意 义, 犘 >0.05, 吸 烟 史, 饮 酒 史 和 HBV 感 染 在 病 例 组 中 所 占 的 比 例 明 显 高 于 对 照 组, 差 异 有 统 计 学 意 义, 犘 <0.0( 表 ) 表 病 例 组 和 对 照 组 的 一 般 人 口 学 特 征 和 环 境 危 险 因 素 分 布 狀 (%) 变 量 病 例 组 (985 例 ) 对 照 组 (992 例 ) 2 χ 值 犘 值 年 龄 ( 岁 ) 48.2± ± 性 别 男 840(85.3) 834(84.) 女 45(4.7) 58(5.9) 民 族 汉 678(68.8) 647(65.2) 壮 307(3.2) 345(34.8) 吸 烟 是 360(36.5) 40(4.) 否 625(63.5) 852(85.9) <0.00 饮 酒 是 356(36.) 29(3.0) 否 629(63.9) 863(87.0) <0.00 HBV 感 染 + 796(80.8) 99(0.0) - 89(9.2) 893(90.0) <0.00 HCV 感 染 + 5(0.5) 7(0.7) - 980(99.5) 985(99.3) 为 狋 值 2.2 犕 犇 犕 2 犛 犖 犘 309 位 点 与 犎 犆 发 病 风 险 的 关 系 对 照 组 中 MDM 2SNP309 位 点 基 因 型 分 布 频 率 符 合 Hardy Weinberg 遗 传 平 衡 定 律, χ 2 =0.03, 犘 = MDM 2SNP309 位 点 TT TG GG3 种 基 因 型 在 两 组 间 分 布 差 异 无 统 计 学 意 义, χ 2 =2.23, 犘 = 0.33 多 因 素 Logistic 回 归 分 析 发 现, 校 正 年 龄 性 别 民 族 吸 烟 饮 酒 HBV 和 HCV 感 染 后,MDM 2 SNP309 位 点 G 等 位 基 因 可 能 增 加 HCC 的 风 险 (TG: OR=.9,95%CI=0.86~.65;GG:OR=.28, 95% CI= 0.89 ~.85;TG + GG: OR =.22, 95%CI=0.90~.66), 但 差 异 未 达 到 统 计 学 意 义, 犘 >0.05( 表 2) 2.3 分 层 分 析 按 年 龄 性 别 民 族 和 是 否 吸 烟 饮 酒 和 HBV 感 染 进 行 分 层 分 析, 均 未 发 现 MDM 2SNP309 位 点 多 态 性 与 HCC 之 间 有 统 计 学 关 联 ( 表 3) 2.4 犕 犇 犕 2 犛 犖 犘 309 位 点 与 犎 犆 犆 发 病 年 龄 的 关 系 在 985 例 HCC 患 者 中, 携 带 MDM 2SNP309 位 点 TT TG 或 者 GG 基 因 型 HCC 的 平 均 发 病 年 龄 分 别 为 (47.5±0.9) 岁 (48.8±.24) 岁 和 (47.7±.22) 岁, 三 组 间 发 病 年 龄 差 异 无 统 计 学 意 义 (Log rank 检 验 : χ 2 =2.207, 犘 =0.332) 进 一 步 按 性 别 分 层 分 析 发 现, 携 带 MDM 2SNP309TG+GG 基 因 型 的 女 性 HCC 平 均 发 病 年 龄 为 (49.4±.79) 岁, 而 携 带 TT 基 因 型 的 女 性 患 者 平 均 发 病 年 龄 为 (44.8±0.72) 岁 TT 基 因 型 可 使 女 性 HCC 患 者 的 发 病 年 龄 提 前 4.6 岁 ( χ 2 =7.372, 犘 =0.007), 见 表 4 和 图 2A TT 和 TG+GG 基 因 型 的 男 性 患 者 HCC 平 均 发 病 年 龄 分 别 为 (48.0±0.90) 岁 和 (48.2±.5) 岁, 未 发 现 该 SNP 位 点 基 因 型 与 男 性 HCC 患 者 的 发 病 年 龄 有 关 联, χ 2 =0.5, 犘 =0.734, 见 表 4 和 图 2B 按 民 族 进 行 分 层 分 析, 均 未 发 现 汉 族 和 壮 族 与 HCC 患 者 发 病 年 龄 之 间 有 关 联 ( 见 表 4) 2.5 犕 犲 狋 犪 分 析 结 果 截 止 , 通 过 检 索 中 英 文 数 据 库 ( 万 方 维 普 CNKI 和 Pubmed), 共 检 索 到 8 篇 相 关 文 献, 删 除 其 中 篇 无 基 因 型 分 布 频 率 和 篇 对 照 组 各 基 因 型 频 率 分 布 不 符 合 Hardy Weinberg 遗 传 平 衡 定 律 的 文 献, 加 之 本 研 究, 共 计 纳 入 7 篇 文 献 累 计 病 例 (2036 例 ), 对 照 (2832 例 ) 其 中, 亚 洲 人 群 纳 入 4 篇 文 献, 累 计 病 例 (769 例 ), 对 照 (2378 例 ); 非 亚 洲 人 群 纳 入 文 献 3 篇, 累 计 病 例 (267 例 ), 对 照 (454 例 ) Meta 分 析 结 果 发 现, 非 亚 洲 人 群 MDM 2SNP309TG+GG 基 因 型 增 加 个 体 患 HCC 的 风 险 (OR=.35,95%CI:.05~.73, 犘 =0.08), 而 亚 洲 人 群 则 未 发 现 MDM 2SNP309TG+GG 基 因 型 与 HCC 发 病 有 关 联 (OR=.07,95%CI:0.97~.7, 犘 =0.73) 表 2 MDM 2SNP309 等 位 基 因 和 基 因 型 在 病 例 组 和 对 照 组 中 的 分 布 狀 (%) 变 量 基 因 型 病 例 组 对 照 组 犘 值 校 正 OR(95% CI) TT 23(2.6) 239(24.) TG 492(49.9) 493(49.7).9(0.86~.65) GG 280(28.4) 260(26.2).28(0.89~.85) TG+GG 772(78.4) 753(75.9) (0.90~.66) G TT+TG 705(7.6) 732(73.8) GG 280(28.4) 260(26.2).4(0.85~.53) 校 正 了 年 龄 性 别 民 族 吸 烟 饮 酒 及 HBV HCV 感 染 的 多 因 素 Logistic 回 归

8 288 张 艳 艳, 等 鼠 MDM 2SNP309 位 点 与 肝 细 胞 癌 发 病 年 龄 与 风 险 关 系 的 分 析 表 3 分 层 分 析 MDM 2SNP309 位 点 基 因 型 与 HCC 发 病 风 险 的 关 系 变 量 病 例 组 (985 例 ) 对 照 组 (992 例 ) 校 正 OR(95% CI) TT TG+GG TT TG+GG TT TG+GG 年 龄 ( 岁 ) (0.85~.77) > (0.7~2.24) 性 别 男 (0.78~.55) 女 (0.96~4.08) 民 族 汉 (0.88~.86) 壮 (0.64~.93) 吸 烟 否 (0.89~.85) 是 (0.57~.88) 饮 酒 否 (0.93~.90) 是 (0.5~.77) HBV 感 染 否 (0.8~.8) 是 (0.77~2.04) 犘 值 校 正 了 年 龄 性 别 民 族 吸 烟 饮 酒 及 HBV HCV 感 染 的 多 因 素 Logistic 回 归 表 4 分 层 分 析 MDM 2SNP309 位 点 与 HCC 发 病 年 龄 的 关 系 变 量 病 例 组 (985 例 ) TT TG+GG TT 平 均 发 病 年 龄 ( 岁 ) TG+GG 中 位 发 病 年 龄 ( 岁 ) TT TG+GG χ 2 值 犘 值 性 别 男 ± ± 女 ± ± 民 族 汉 ± ± 壮 ± ± 从 MDM 2 作 为 一 种 癌 基 因, 是 p53 通 路 最 重 要 的 负 性 调 控 因 子 之 一, 二 者 可 形 成 负 性 调 节 反 馈 环 功 能 性 单 核 苷 酸 多 态 位 点 MDM 2SNP309 位 于 MDM 2 基 因 启 动 子 区 第 一 内 含 子, 该 位 点 T G 的 突 变 可 提 高 与 转 录 活 化 因 子 Sp 的 亲 和 力, 增 加 MDM 2 基 因 的 RNA 和 蛋 白 质 表 达 水 平, 减 弱 p53 介 导 的 下 游 生 物 学 事 件, 加 速 肿 瘤 的 形 成 以 往 已 有 一 些 研 究 报 道 关 于 MDM 2SNP309 位 [4] 点 与 HCC 易 感 性 的 关 系, 但 结 果 并 不 一 致 Leu 等 以 台 湾 人 群 为 研 究 对 象, 研 究 发 现 MDM 2SNP309 位 点 基 因 型 与 HCC 发 病 无 关, 与 本 研 究 结 果 一 致 [5] 然 而,Yoon 等 研 究 (287 例 HCC 患 者 /296 例 对 照 ) 发 现 MDM 2SNP309 位 点 G 等 位 基 因 可 增 加 HBV 感 染 者 患 HCC 的 风 险 在 北 非 摩 洛 哥 人 群 和 西 亚 土 A: 女 性 ;B: 男 性 图 2 MDM 2SNP309 位 点 基 因 型 与 HCC 发 病 年 龄 关 系 3 讨 论 p53 基 因 是 与 肿 瘤 关 系 最 为 密 切 的 一 种 抑 癌 基 因, 耳 其 人 群 中,MDM 2SNP309 位 点 GG 基 因 型 均 被 认 [6] 为 可 能 增 加 HCC 的 风 险 Meta 分 析 结 果 发 现, 亚 洲 人 群 MDM 2SNP309 与 HCC 发 病 无 关 联, 与 本 研 究 结 果 类 似 导 致 以 上 研 究 结 果 不 一 致 的 原 因 可 能 与 种 族 地 域 差 异 样 本 量 大 小 不 同 等 因 素 有 关 种 族 差 异 可 能 影 响 基 因 位 点 基 因 型 的 分 布,MDM 2SNP309

9 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 202 年 9 月 第 9 卷 第 7 期 CHINJCANCERPREV TREAT,September202,Vol.9 No 位 点 TT TG 和 GG 基 因 型 在 本 研 究 人 群 中 分 别 占 22.9% 49.8% 和 27.3%, 而 有 研 究 发 现 该 3 种 基 因 型 在 韩 国 人 群 分 别 为 2.9% 44.% 和 34.0% [5], 在 高 加 索 人 中 为 44.8% 43.3% 和.9% [7] 研 究 提 示,MDM 2SNP309 位 点 T G 突 变 可 能 提 [5] 早 某 些 肿 瘤 的 发 生 年 龄 如 Yoon 等 发 现 与 MDM 2 SNP309 位 点 TT 基 因 型 相 比,GG 基 因 型 可 使 韩 国 人 群 [8] HCC 发 病 年 龄 提 前 4 岁 Sun 等 表 明 MDM 2 SNP309 位 点 GG 基 因 型 可 使 台 湾 女 性 乳 腺 癌 提 早 6 岁 [7] 发 病 Yu 等 研 究 发 现,MDM 2SNP309 位 点 TG 和 GG 基 因 型 在 高 加 索 女 性 头 颈 部 鳞 状 细 胞 癌 中 可 分 别 提 前 3 岁 和 9 岁 研 究 还 发 现 MDM 2SNP309 位 点 在 肿 瘤 进 展 中 表 现 出 性 别 差 异 在 女 性 中, 雌 激 素 信 号 能 够 作 用 于 MDM 2 基 因 的 转 录 过 程, 调 节 MDM 2 的 表 达, G 等 位 基 因 与 Sp 结 合, 也 能 与 雌 激 素 受 体 联 合 调 节 [9] MDM 2 Duong 等 发 现,MDM 2 能 够 负 性 调 节 雌 激 素 受 体 的 表 达 而 本 研 究 中 却 发 现 MDM 2SNP309 位 点 TT 基 因 型 使 女 性 HCC 的 发 病 年 龄 提 前 Lum [0] 等 以 中 国 人 群 为 研 究 对 象, 研 究 发 现 TT TG GG 基 因 型 散 发 乳 腺 癌 患 者 的 的 发 病 年 龄 分 别 为 (40.23± 2.32) 岁 (44.76±3.94) 岁 和 (45.33±3.73) 岁,TT 基 因 型 使 散 发 乳 腺 癌 提 前 5. 岁, 与 本 研 究 结 果 一 致 [] Sun 等 也 发 现 在 高 加 索 人 群,MDM 2 SNP309T 提 早 前 列 腺 癌 发 病 年 龄 ( 犘 =0.004) 产 生 这 种 结 果 差 异 的 可 能 原 因 是 MDM 2SNP309 位 点 TT 基 因 型 可 降 低 MDM 2 基 因 的 表 达, 可 能 导 致 雌 激 素 受 体 的 表 达 增 加 有 研 究 表 明 HCC 患 者 雌 激 素 受 体 表 达 不 同 于 非 HCC 患 者,HCC 患 者 雌 激 素 受 体 升 [2] 高 张 伟 等 研 究 亦 发 现, 雌 激 素 受 体 α 基 因 多 态 性 与 原 发 性 HCC 有 关 雌 激 素 受 体 是 雌 激 素 信 号 通 路 的 一 个 重 要 组 成 部 分, 参 与 雌 激 素 信 号 通 路 作 用 于 MDM 2 基 因 的 转 录 过 程, 调 节 MDM 2 基 因 RNA 和 蛋 白 的 表 达 水 平, 可 能 增 大 HCC 的 发 病 风 险 另 一 可 能 的 原 因 是 MDM 2 既 存 在 依 赖 p53 通 路 致 癌, 也 存 在 非 p53 依 赖 致 癌 机 制 TT 基 因 型 可 能 通 过 非 p53 依 赖 的 一 些 因 素 作 用 于 MDM 2 启 动 子, 影 响 其 转 录 活 性, 进 而 可 能 影 响 MDM 2 的 表 达 本 研 究 是 以 医 院 为 基 础 的 病 例 对 照 研 究, 病 例 和 对 照 均 来 自 医 院, 可 能 存 在 选 择 偏 倚 此 外, 本 研 究 分 层 分 析 的 样 本 量 相 对 偏 小, 比 如 病 例 组 HBV 非 感 染 者 仅 89 例, 按 性 别 分 层 后 女 性 HCC 患 者 仅 45 例, 因 此 分 层 分 析 的 统 计 学 检 验 效 能 受 到 一 定 程 度 的 限 制 因 此 对 本 研 究 的 结 果 诠 释 应 谨 慎, 本 研 究 结 果 仍 需 要 大 样 本 量 的 流 行 病 学 研 究 进 一 步 验 证 参 考 文 献 [] 范 雪 娇, 仇 小 强, 余 红 平, 等.COX 2 基 因 单 核 苷 酸 多 态 性 与 肝 细 胞 癌 关 联 的 研 究 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,20,8(6): [2] 潘 运 龙, 覃 莉, 李 文 生. 肝 细 胞 肝 癌 中 VEGF p53 mdm2 蛋 白 表 达 及 其 相 互 关 系 [J]. 实 用 肿 瘤 杂 志,2004,9(4): [3] MeissnerRdeV,BarbosaRN,FernandesJV,etal.Noassocia tionbetweensnp309promoterpolymorphisminthemdm2and cervicalcancerinastudyfrom northeasternbrazil[j].cancer DetectPrev,2007,3(5): [4] LeuJD,LinIF,Sun YF,etal.Associationbetween MDM2 SNP309andhepatocelularcarcinomain Taiwanesepopulation [J].WorldJGastroenterol,2009,5(44): [5] YoonYJ,ChangHY,AhnSH,etal.MDM2andp53polymor phismsareassociatedwiththedevelopmentofhepatocelularcar cinomainpatientswithchronichepatitisbvirusinfection[j]. Carcinogenesis,2008,29(6): [6] AkkizH,SumbulAT,BayramS,etal.MDM2promoterpoly morphismisassoci atedwithincreasedsusceptibilitytohepato celularcarcinomainturkishpopulation[j].cancerepidemiol, 200,34(4): [7] YuH,HuangYJ,LiuZ,etal.EfectsofMDM2promoterpoly morphismsandp53codon72polymorphismonriskandageaton setofsquamouscelcarcinomaoftheheadandneck[j].mol Carcinogenesis,20,50(9): [8] SunYF,LeuJD,ChenSM,etal.Resultsbasedon24casesof breastcancerand97controlsfrom Taiwansuggestthatthesin glenucleotidepolymorphism (SNP309)intheMDM2genepro moterisassociatedwithearlieronsetandincreasedriskofbreast cancer[j].bmccancer,2009,9():3 9. [9] DuongV,BouleN,DaujatS,etal.Diferentialregulationofestrogen receptoralphaturnoverandtransactivationby Mdm2andstress indu cingagents[j].cancerres,2007,67(): [0] LumSS,ChuaHW,LiH,etal.MDM2SNP309Galeleincrea sesriskbutthetaleleisassociated withearlieronsetageof sporadicbreastcancersinthechinesepopulation[j].carcino genesis,2008,29(4): [] SunT,LeeGS,OhWK,etal.Single nucleotidepolymorphisms inp53pathwayandaggressivenessofprostatecancerinacauca sianpopulation[j].clincancerres,200,6(2): [2] 张 伟, 时 德, 杜 成 友, 等. 雌 激 素 受 体 a 基 因 多 态 性 与 原 发 性 肝 癌 的 相 关 性 研 究 [J]. 生 物 技 术 通 报,2008,3: 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : ( 编 辑 : 杨 靖 )

10 290 刘 俊 玲, 等 PARP 抑 制 剂 对 顺 铂 抑 制 肺 癌 细 胞 增 殖 影 响 的 研 究 犘 犃 犚 犘 抑 制 剂 对 顺 铂 抑 制 肺 癌 细 胞 增 殖 影 响 的 研 究 刘 俊 玲 孙 蕊 李 万 湖 2 王 宇 蔡 修 宇 姜 文 奇 实 验 研 究 / 论 著. 华 南 肿 瘤 学 国 家 重 点 实 验 室 中 山 大 学 附 属 肿 瘤 防 治 中 心 ( 内 科 : 刘 俊 玲, 王 宇, 蔡 修 宇, 姜 文 奇 ; 鼻 咽 科 : 孙 蕊 ), 广 东 广 州 山 东 省 肿 瘤 防 治 研 究 院 磁 共 振 室, 山 东 济 南 2507 摘 要 目 的 : 以 顺 铂 (DDP) 敏 感 和 耐 药 肺 癌 细 胞 系 为 实 验 对 象, 探 讨 聚 腺 苷 二 磷 酸 核 糖 聚 合 酶 Poly(ADP ribose) polymerase,parp 抑 制 剂 对 DDP 抑 制 肺 癌 细 胞 增 殖 作 用 的 影 响 方 法 :MTT 法 检 测 DDP PARP 抑 制 剂 单 药 及 其 两 者 联 合 对 DDP 敏 感 和 耐 药 肺 癌 细 胞 系 增 殖 的 抑 制 作 用 应 用 蛋 白 免 疫 印 迹 方 法, 检 测 肺 癌 细 胞 系 中 PARP 和 PARP 2 的 表 达, 以 及 DDP 激 活 PARP 生 成 聚 腺 苷 二 磷 酸 核 糖 Poly(ADP ribose),par 与 PARP 抑 制 剂 对 PARP 的 抑 制 作 用 结 果 : 蛋 白 质 印 迹 法 结 果 显 示 PARP 在 PC9 PC4 SBC3 亲 代 DDP 敏 感 肺 癌 细 胞 系 及 其 子 代 DDP 耐 药 细 胞 系 之 间 的 表 达 差 异 有 统 计 学 意 义, 犘 值 分 别 为 和 DDP 作 用 于 肺 癌 细 胞 系 激 活 PARP 生 成 PAR 在 40 min 达 到 高 峰, 但 在 60min 即 迅 速 降 低, 且 DPQ 可 抑 制 PAR 的 生 成 而 MTT 结 果 显 示,DPQ 联 合 DDP 抑 制 肺 癌 敏 感 和 耐 药 细 胞 系 的 抗 增 殖 作 用 与 DDP 单 药 作 用 比 较 差 异 均 无 统 计 学 意 义 ( 犘 >0.05, 狋 <0), 表 明 DPQ 没 有 增 效 DDP 的 作 用 结 论 : 在 敏 感 和 耐 药 肺 癌 细 胞 系 中,PARP 抑 制 剂 与 DDP 联 合 无 明 显 的 协 同 增 效 作 用, 提 示 PARP 表 达 差 异 与 肺 癌 细 胞 对 DDP 敏 感 或 者 耐 药 无 关, 说 明 尚 需 进 一 步 探 讨 PARP 抑 制 剂 与 DNA 损 伤 药 物 联 合 使 用 对 肺 癌 的 影 响 关 键 词 肺 肿 瘤 ; 聚 ADP 核 糖 聚 合 酶 类 ; 顺 铂 ; 细 胞 培 养 犈 犳 犲 犮 狋 狅 犳 犘 犃 犚 犘 犻 狀 犺 犻 犫 犻 狋 狅 狉 狊 狅 狀 狋 犺 犲 狆 狉 狅 犾 犻 犳 犲 狉 犪 狋 犻 狅 狀 犻 狀 犺 犻 犫 犻 狋 狅 狀 犫 狔 犮 犻 狊 狆 犾 犪 狋 犻 狀 犻 狀 犾 狌 狀 犵 犮 犪 狀 犮 犲 狉 犮 犲 犾 犻 狀 犲 狊 犔 犐 犝 犑 狌 狀 犾 犻 狀 犵, 犛 犝 犖 犚 狌 犻, 犔 犐 犠 犪 狀 犺 狌 2, 犠 犃 犖 犌 犢 狌, 犆 犃 犐 犡 犻 狌 狔 狌, 犑 犐 犃 犖 犌 犠 犲 狀 狇 犻 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,202,9(7): 犛 狋 犪 狋 犲 犓 犲 狔 犔 犪 犫 狅 狉 犪 狋 狅 狉 狔 狅 犳 犗 狀 犮 狅 犾 狅 犵 狔 犻 狀 犛 狅 狌 狋 犺 犆 犺 犻 狀 犪, 犆 犪 狀 犮 犲 狉 犆 犲 狀 狋 犲 狉, 犛 狌 狀 犢 犪 狋 狊 犲 狀 犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔, 犌 狌 犪 狀 犵 狕 犺 狅 狌 50060, 犘. 犚. 犆 犺 犻 狀 犪 2. 犇 犲 狆 犪 狉 狋 犿 犲 狀 狋 狅 犳 犕 犚, 犛 犺 犪 狀 犱 狅 狀 犵 犆 犪 狀 犮 犲 狉 犎 狅 狊 狆 犻 狋 犪 犾, 犑 犻 狀 犪 狀 2507, 犘. 犚. 犆 犺 犻 狀 犪 [ 犃 犅 犛 犜 犚 犃 犆 犜 ] 犗 犅 犑 犈 犆 犜 犐 犞 犈 :Toobservetheefectofpoly (ADP ribose)polymerase(parp)inhibitorsonthegrowth inhibitionbycisplatininthecis sensitiveandcis resistantlungcancercellines. 犕 犈 犜 犎 犗 犇 犛 :Theefectofproliferation inhibitionofthecombinationofparpinhibitorswithcispaltinandthatofthesingledrugsweredetectedbymttassay. ThediferenceofexpressionofPARP andparp 2betweentheCis sensitiveandcis resistantcellines,togetherwith theformationofpoly(adp ribose)(par)folowingtheexposureofcisplatinandtheinhibitionofparbyparpinhibi torswereanalyzedbywesternblotanalysis. 犚 犈 犛 犝 犔 犜 犛 :TheexpressionofPARP betweentheparentcisplatinsensitive cellinespc9,pc4,sbc3andtheirsubcisplatinresistantcellines wassignificantlydiferent( 犘 =0.028,0.03, 0.008).Afterexposureof60minutestocisplatin,PARPwasactivatedrapidlyandtheformationofPARwasthehighest at40minutesandcouldbeinhibitedbydpqinthelungcancercellines( 犘 >0.05, 狋 <0).PARPinhibitorsdidnotpoten tiatetheefectofgrowthinhibitionofcisplatininallungcancercellines. 犆 犗 犖 犆 犔 犝 犛 犐 犗 犖 犛 :PARPinhibitorsbrings efectsofnopotentiationofgrowthinhibitionofcisplatininalthecis sensitiveandcis resistantlungcancercellines, whichsuggeststhatthediferentexpressionofparp isnotrelatedwithcellineswhethersensitivetocisplatinornot. FurtherinvestigationsarestilneededtoobservetheefectofPARPinhibitorsonproliferationinhibitionbyotherDNA damagechemotherapyagentsinlungcancercellines. [ 犓 犈 犢 犠 犗 犚 犇 犛 ] lungneoplasms;poly(adp ribose)polymerases;cisplatin;celculture 基 金 项 目 广 东 省 医 学 科 学 技 术 研 究 基 金 (A2099;A20088); 中 山 大 学 肿 瘤 防 治 中 心 出 国 留 学 人 员 科 研 启 动 基 金 ( ) 第 一 作 者 简 介 刘 俊 玲, 女, 河 南 商 丘 人, 博 士, 主 治 医 师, 主 要 从 事 肺 癌 临 床 和 应 用 基 础 研 究 工 作 Tel: E mail:liujl@sysucc.org.cn 通 讯 作 者 简 介 姜 文 奇, 男, 江 西 余 干 人, 教 授, 博 士 生 导 师, 主 要 从 事 肿 瘤 化 疗 的 临 床 和 应 用 基 础 研 究 工 作 Tel: E mail:jiangwq@sysucc.org.cn

11 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 202 年 9 月 第 9 卷 第 7 期 CHINJCANCERPREV TREAT,September202,Vol.9 No.7 29 犆 犺 犻 狀 犑 犆 犪 狀 犮 犲 狉 犘 狉 犲 狏 犜 狉 犲 犪 狋,202,9(7): 中 图 分 类 号 R734.2 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 (202) 对 于 晚 期 非 小 细 胞 肺 癌 和 小 细 胞 肺 癌, 含 铂 类 联 合 化 疗 及 化 疗 后 发 生 耐 药 仍 然 是 制 约 疗 效 的 主 要 因 [] 素 因 此, 提 高 化 疗 疗 效 和 在 铂 类 耐 药 后 找 到 有 效 治 疗 方 法, 一 直 是 肺 癌 治 疗 中 的 研 究 热 点 顺 铂 (DDP) 是 临 床 上 最 常 用 的 能 够 引 起 DNA 损 伤 的 肺 癌 化 疗 药 物, 而 聚 腺 苷 二 磷 酸 核 糖 聚 合 酶 Poly(ADP ri bose)polymerase,parp 在 DNA 损 伤 修 复 过 程 中 [2] 能 够 起 到 关 键 性 的 作 用 PARP 家 族 成 员 众 多, 目 前 研 究 发 现 只 有 PARP 和 PARP 2 与 DNA 损 伤 修 [3] 复 过 程 密 切 相 关 本 研 究 在 DDP 敏 感 和 耐 药 的 肺 癌 细 胞 系 中, 探 讨 PARP 抑 制 剂 与 DDP 联 合 应 用 后, PARP 抑 制 剂 对 DDP 抑 制 肺 癌 细 胞 增 殖 的 影 响 材 料 与 方 法. 试 剂 5 种 PARP 抑 制 剂 ( 均 购 自 EMD ChemicalsInc. San Diego,CA,USA):DPQ 3 AB NU 025, 5 isoquinolinedio 及 5 lodo 6 amino,2 benzopyrone 用 二 甲 亚 砜 (00%) 溶 解 (DMSO,Sigma,St.Louis, MO,USA), 使 用 时 均 用 RPMI640 培 养 基 进 行 稀 释 DDP(Nihon Kayaku,Tokyo,Japan) 使 用 时 用 0.9% 生 理 盐 水 进 行 稀 释.2 细 胞 培 养 3 个 DDP 敏 感 亲 代 细 胞 系 : 人 非 小 细 胞 肺 腺 癌 细 胞 系 PC9(EGFR9 外 显 子 5bp 缺 失 ) 非 小 细 胞 肺 癌 细 胞 系 PC4(EGFR 野 生 型 ) 和 小 细 胞 肺 癌 细 胞 系 SBC3(p53 野 生 型 ), 以 及 3 个 相 应 的 DDP 耐 药 子 代 细 胞 系 :PC9/DDP PC4/DDP 和 SBC3/DDP( 均 由 日 本 国 立 癌 中 心 Shien 实 验 室 赠 予 ) 应 用 RPMI640 (0% 热 灭 活 胎 牛 血 清,00 U/mL penicilin, 00μg/mLstreptomycin) 培 养 基,37 5% CO 2 孵 育 箱 培 养.3 犕 犜 法 检 测 取 对 数 生 长 期 肺 癌 细 胞 进 行 实 验, 将 细 胞 悬 液 适 当 稀 释 后 接 种 至 96 孔 板 中, 分 为 实 验 组 ( 加 药 组 ) 无 药 对 照 组 ( 只 加 入 细 胞 和 培 养 基 ) 和 空 白 对 照 组 ( 只 加 入 培 养 基, 无 细 胞 ) 每 组 设 6 个 平 行 孔 予 梯 度 浓 度 DDP 及 PARP 抑 制 剂 单 独 及 联 合 作 用 72h 后, 于 酶 标 仪 A 570 处 测 取 OD 值, 以 比 较 实 验 组 和 对 照 组 细 胞 生 长 情 况, 所 有 实 验 结 果 均 重 复 3 次.4 蛋 白 免 疫 印 迹 分 析 PARP 2( 兔 源 多 克 隆 抗 体 ) 购 自 ABR.Inc (USA),PARP ( 鼠 源 单 克 隆 抗 体 ) 和 Goatanti mouseigg(h L)HRPconjugate 二 抗 购 自 (AB NOVA Co.TAIWAN),PARP 鼠 源 一 抗 ( 由 日 本 国 立 癌 中 心 Shien 实 验 室 赠 予 ) anti β actinantibody( 鼠 源 单 克 隆 抗 体 ) 购 自 (Sigma,St.Louis,MO,USA), PAR( 兔 源 多 克 隆 抗 体 ) 购 自 BD Bioscience (USA), anti rabbithorseradishperoxidase conjugated 抗 体 购 自 CelSignaling Technology(UK) 待 测 样 品 负 荷 20μg 蛋 白, 一 抗 (PARP 鼠 源 一 抗 000, β actin 鼠 源 一 抗 2000) 孵 育,4 振 荡 过 夜 TBST 清 洗, 常 温 下 二 抗 (PAR 兔 源 二 抗 2000,PARP 鼠 源 二 抗 2500,PARP 2 兔 源 二 抗 5000, β ac tin 鼠 源 二 抗 2000), 实 验 独 立 重 复 3 次.5 统 计 学 方 法 采 用 SPSS3.0 进 行 配 对 狋 检 验, 实 验 数 据 以 狓 - ± 狊 表 示, 检 验 水 准 α = 结 果 2. 犘 犃 犚 犘 抑 制 剂 和 犇 犘 单 药 对 肺 癌 细 胞 系 的 增 殖 抑 制 作 用 PARP 抑 制 剂 和 DDP 单 药 对 肺 癌 细 胞 系 的 增 殖 抑 制 作 用 (MTT 法 IC 50 ), 通 过 MTT 法 检 测 DDP 及 5 种 PARP 抑 制 剂 单 药 分 别 对 DDP 敏 感 和 耐 药 肺 癌 细 胞 系 细 胞 的 增 殖 抑 制 作 用, 得 出 相 应 IC 50 值, 实 验 独 立 重 复 3 次, 结 果 取 平 均 值 结 果 显 示,5 种 PARP 抑 制 剂 单 药 中 DPQ 抑 制 各 肺 癌 细 胞 系 增 殖 的 IC 50 最 低, 其 余 依 次 为 5 lodo 6 amino 2 benzopyrone,5 iso quinolinediol NU 025 和 3 AB DPQ 和 DDP 单 药 对 各 细 胞 系 增 殖 抑 制 作 用 的 IC 50 值 见 表 表 DPQ 和 DDP 单 药 对 各 肺 癌 细 胞 系 增 殖 抑 制 的 IC50 值 ( 狓 - ± 狊, μ mol/l,72h) 项 目 PC9 PC9/DDP PC4 PC4/DDP SBC3 SBC3/DDP DDP 2.02± ± ± ± ± ±4.8 DPQ 2.52± ± ± ± ± ±.92

12 刘俊玲 等 ＰＡＲＰ 抑制剂对顺铂抑制肺癌细胞增殖影响的研究 １２９２ ２ ２ 犇犇犘 敏 感 和 耐 药 肺 癌 细 胞 系 中 犘犃犚犘 １和 ＰＡＲ 生成 犘犃犚犘 ２ 的蛋白表达 Ｗｅ ｓ ｅ ｒｎｂ ｌ ｏ 分 析 结 果 显 示 ＰＡＲＰ １蛋白在 ＤＤＰ 耐 药 细 胞 系 和 敏 感 细 胞 系 之 间 表 达 差 异 有 统 计 学意义 相对灰度值 分 别 为 ０ ９２±０ ０６ １ １６±０ ０９ ０ ８６±０ ０８ １ １２±１ １１ １ ３３±０ １３ ０ ８８±０ ０７ 犘 值分 别 为 ０ ０２８ ０ ０１３ 和 ０ ００８ 而 ＰＡＲＰ ２在 ＤＤＰ 敏 感 和 耐 药 细 胞 系 之 间 表 达 差 别 不 明 显 ＰＡＲＰ １ 和 ＰＡＲＰ ２ 在 ＤＤＰ 敏 感 和 耐 药 肺 癌 细 胞 系 中的蛋白表达情况见图 １ 图 １ ＤＤＰ 敏感和耐药细胞系中 ＰＡＲＰ １ 和 ＰＡＲＰ ２的 蛋白表达差异 Ａ ＰＣ９ ＤＤＰ 敏感肺癌细胞系 Ｂ ＰＣ９ ＤＤＰ 耐药肺癌细胞系 ２ ３ 犘犃犚犘 抑制 剂 联 合 犇犇犘 对 敏 感 和 耐 药 肺 癌 细 图 ２ ＤＰＱ 对 ＤＤＰ 抑制肺癌细胞系增殖作用的影响 胞系增殖抑制作用的影响 在全部 ＤＤＰ 敏感和耐药肺癌细胞系 中 ＰＡＲＰ 抑 制剂取 ３ 个固定浓度与 ＤＤＰ 终浓度 ５０μｍｏ Ｌ ｌ ２倍 稀释成 １０ 个 浓 度 梯 度 并 设 ＤＤＰ 单 药 对 照 联 合 给 药 ＭＴＴ 法 ７２ｈ 检测 ＰＡＲＰ 抑 制 剂对 ＤＤＰ 抑 制肺 癌细胞增殖作用的影响 结 果 观 察 到 ＰＡＲＰ 抑 制 剂 联 合 ＤＤＰ 无 协 同 抑 制 各 肺 癌 细 胞 系 增 殖 的 作 用 以 ＰＡＲＰ 抑制剂 ＤＰＱ 及 ＰＣ９ ＰＣ９ ＤＤＰ 细 胞 系 为 例 Ｌ 联合 ＤＤＰ 对 ＰＣ９ ＤＤＰ ＤＰＱ ２ ５ １０ 和 ２０μｍｏ ｌ 敏感肺癌细胞系的 抗 增 殖 作 用 与 ＤＤＰ 单 药 作 用 比 较 差异无统计 学 意 义 犘 值分别为０ １２ ０ ０９ 和 ０ ２３ 狋 值分别为 ０ ９７ ２ １２ 和 １ ５２ 见图 ２Ａ ＤＰＱ Ｌ 联合 ＤＤＰ 对 ＰＣ９ ＤＤＰ 耐 药 ２ ５ １０ 和 ２０μｍｏ ｌ 肺癌细胞系的抗增 殖 作 用 与 ＤＤＰ 单 药 作 用 比 较 差 异 无统计学意 义 犘 值分别为０ ２２９ ０ １７９ 和 ０ ７ 狋值 分别为 １ ４６ １ ０３ 和 ０ ３９ 见图 ２Ｂ 图 ３ ＰＡＲＰ 在 ＳＢＣ３ ＤＤＰ 细胞系中被 ＤＤＰ 激活并被 ＤＰＱ 抑制 ３ 讨论 本研究 ＰＣ９ 肺癌细 胞 系 本 身 具 有 肺 癌 中 常 见 的 ＥＧＦＲ 基因 １９ 外显子 １５ｂｐ 缺 失 ＰＡＲＰ 抑 制 剂 单 药 抑 制 肿 瘤 细 胞 ＤＮＡ 的 ＳＳＢＲ ＢＥＲ ｓ ｎｇ ｌ ｅｓ ｒ ａｎｄ ｂ ｒ ｅ ａｋｒ ｅｐａ ｒ ＳＳＢＲ ｂａ ｓ ｅｅｘｃ ｓ ｏｎｒ ｅｐａ ｒ ＢＥＲ 修 复 ２ 通路 ＰＡＲＰ 抑制剂单药未引起 ＰＣ９ 肺癌细胞发生 ２ ４ 犇犇犘 激活 犘犃犚犘 及 犇犘犙 抑制 犘犃犚 的生成 在各肺癌细 胞 系 中 分 别 设 空 白 对 照 组 ＤＰＱ 单 因突变之间没有协同致死肿瘤细胞的作用 文献指出 药对照组 给药时间 ２ｈ ＤＤＰ 单 药 组 按 给 药 时 间 分 肿瘤细胞 如 ＢＲＣＡ １ 阳 性 乳 腺 癌 细 胞 系 具 有 同 源 为 ２０ ４０ 和 ６０ ｍ ｎ 组 ＤＰＱ 和 ＤＤＰ 联 合 组 ＤＰＱ 在 重组修复通路 ｈｏｍｏ ｌ ｏｇｏｕｓｒ ｅ ｃｏｍｂ ｎａ ｏｎ ＨＲ 缺 陷 时 在 ＰＡＲＰ 抑制 剂 单 药 作 用 下 肿 瘤 细 胞 就 会 发 生 ＤＤＰ 给药前 １ｈ 与细胞一起孵育 给 药 时 间 ２ｈ ＤＤＰ 给药时间 ６０ ｍ ｎ 结 果 在 全 部 肺 癌 细 胞 系 中 均 观 察 到 ＤＤＰ 迅 速 激 活 ＰＡＲＰ 酶 合 成 ＰＡＲ ＰＡＲＰ 抑 制 剂 合成性 致 死 提 示 ＳＳＢＲ ＢＥＲ 通 路 抑 制 与 ＥＧＦＲ 基 合成性致死 ３ ＰＡＲＰ 抑制剂的增效作用不依赖于某种基因 的突 变 如 ＰＡＲＰ 抑制 剂 ＮＵ１０２５ 对 ＤＮＡ 损 伤 药 物 拓 扑 可抑制 ＰＡＲ 生 成 图 ３ 以 ＳＢＣ３ ＤＤＰ 细 胞 系 为 例 观察到 ＤＤＰ 给 药 ４０ ｍ ｎ 后 ＰＡＲ 的 生 成 达 到 高 峰 替康抑制 ｐ５３ 野生型 Ｄ５４ 及 ｐ５３ 突变型 Ｕ２５１ 胶质母 Ｌ 抑 制 ６０ｍ ｎ 时 ＰＡＲ 的 生 成 下 降 ＤＰＱ １０μｍｏ ｌ 细胞瘤细胞系的增殖 均 有 协 同 增 效 作 用 这 种 增 效 作

13 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 202 年 9 月 第 9 卷 第 7 期 CHINJCANCERPREV TREAT,September202,Vol.9 No [4] 用 明 显 不 依 赖 于 细 胞 p53 基 因 是 否 有 突 变 本 研 究 在 PC9 和 PC4 肺 癌 细 胞 系 中,PARP 抑 制 剂 与 DDP 联 合 不 增 效 DDP, 从 另 个 角 度 支 持 了 PARP 抑 制 剂 的 作 用 不 依 赖 于 肺 癌 细 胞 EGFR 基 因 是 否 有 突 变 在 本 研 究 的 肺 癌 细 胞 系 中, 可 以 观 察 到 与 DDP 单 药 作 用 相 比,PARP 抑 制 剂 DPQ 与 DDP 联 合 没 有 明 显 协 同 增 效 DDP 抑 制 肺 癌 细 胞 系 增 殖 的 作 用 在 PARP 抑 制 剂 与 DNA 损 伤 药 物 联 合 使 用 方 面, 有 研 究 指 出 PARP 抑 制 剂 对 DNA 损 伤 药 物 包 括 DDP 有 [5] 增 效 作 用 但 有 研 究 指 出 PARP 抑 制 剂 不 能 增 效 DDP [6] 上 述 研 究 观 点 的 对 立, 也 反 映 了 PARP 抑 制 剂 的 增 效 作 用 与 DNA 损 伤 药 物 的 种 类 和 细 胞 类 型 有 [7] 关 另 外,DDP 和 PARP 抑 制 剂 是 两 类 作 用 机 制 不 同 的 药 物, 前 者 引 起 DNA 损 伤, 后 者 作 用 靶 点 是 PARP,PARP 是 在 DNA 修 复 和 凋 亡 坏 死 中 发 挥 重 要 作 用 的 酶 由 于 个 体 肺 癌 细 胞 对 DDP 的 敏 感 性 不 同, DDP 作 用 后 肿 瘤 细 胞 可 以 同 时 发 生 凋 亡 和 坏 死 因 此, 推 测 本 研 究 中 在 DDP 作 用 下 肺 癌 细 胞 DNA 同 时 出 现 各 种 程 度 的 损 伤, 当 DNA 出 现 轻 度 损 伤 时, PARP 被 激 活, 肺 癌 细 胞 的 DNA 损 伤 被 修 复 ; 当 DNA 出 现 中 度 不 可 修 复 损 伤 时, 肺 癌 细 胞 发 生 凋 亡 ; 当 DNA 出 现 重 度 损 伤 时, 肺 癌 细 胞 发 生 坏 死 方 式 的 死 亡 PARP 抑 制 剂 DPQ 对 此 进 行 干 预 的 结 果 是, 轻 度 DNA 损 伤 的 肺 癌 细 胞 损 伤 被 修 复, 严 重 DNA 损 伤 [8] 肺 癌 细 胞 转 而 通 过 凋 亡 途 径 被 清 除 ; 这 样 一 方 面 轻 度 损 伤 肿 瘤 细 胞 得 以 修 复 损 伤, 另 一 方 面 本 应 因 以 坏 死 的 方 式 死 亡 的 肿 瘤 细 胞 减 少, 由 其 释 放 的 坏 死 内 容 物 减 少, 削 弱 了 对 邻 近 肿 瘤 细 胞 的 杀 伤 作 用 ; 这 也 可 能 是 本 研 究 中 DPQ 不 能 增 效 DDP 的 原 因 之 一 同 样, 在 本 研 究 中,PARP 抑 制 剂 不 能 使 DDP 耐 药 肺 癌 细 胞 系 重 新 恢 复 其 对 DDP 的 敏 感 性 尽 管 有 研 究 发 现,PARP 抑 制 剂 在 一 些 肿 瘤 模 型 中 能 使 耐 药 肿 瘤 细 胞 系 重 新 恢 复 起 对 该 类 DNA 损 伤 药 物 的 敏 感 [9] 性 本 研 究 还 观 察 到 在 敏 感 和 耐 药 细 胞 系 中, 观 察 到 PARP 的 表 达 在 DDP 敏 感 和 耐 药 肺 癌 细 胞 系 之 间 存 在 差 别, 但 PARP 抑 制 剂 对 DDP 抑 制 作 用 的 影 响 相 同, 故 推 测 这 种 表 达 差 异 与 肿 瘤 细 胞 对 DDP 敏 感 或 耐 药 无 关 DNA 损 伤 类 药 物 对 PARP 的 激 活 不 仅 与 其 给 药 浓 度 和 给 药 时 间 有 关, 而 且 与 肿 瘤 细 胞 类 型 有 关 在 本 研 究 中,PARP 抑 制 剂 与 DDP 联 合, 在 全 部 肺 癌 细 胞 系 中 可 观 察 到 PARP 酶 被 DDP 快 速 激 活,DDP 给 药 后 PAR 的 生 成 迅 速 达 到 高 峰, 随 后 很 快 下 降 DNA 损 伤 类 药 物 引 起 DNA 链 损 伤 时, 以 NAD+ (nicotinamideadeninedinucleotide, 烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 ) 为 前 体,PARP 和 PARP 2 酶 活 性 可 被 激 活, 并 在 细 胞 核 内 快 速 合 成 PAR 本 研 究 证 实 了 PARP 的 激 活 是 细 胞 对 DNA 损 伤 的 一 个 早 期 和 短 暂 的 反 应, 并 且 这 一 反 应 可 被 PARP 抑 制 剂 DPQ 所 抑 制 综 上 所 述,PARP 抑 制 剂 与 DDP 联 合 对 肺 癌 细 胞 无 明 显 的 协 同 增 效 作 用, 但 尚 需 进 一 步 探 讨 PARP 抑 制 剂 在 肺 癌 细 胞 系 中 的 最 佳 抑 制 浓 度 和 最 佳 给 药 时 间 [0] 近 年 来, 由 于 靶 向 药 物 的 研 发 与 应 用 受 到 广 泛 关 注, 并 且 很 多 旨 在 增 强 细 胞 毒 抗 癌 药 物 疗 效 的 策 略, 以 及 寻 找 靶 向 治 疗 生 物 标 志 如 PARP 是 否 是 PARP 抑 制 剂 [] 治 疗 的 生 物 标 志 等 也 受 到 重 视, 今 后 还 应 进 一 步 深 入 研 究 PARP 抑 制 剂 在 肿 瘤 领 域 的 治 疗 参 考 文 献 [] 张 志 培, 周 勇 安, 徐 鵵 等. 非 小 细 胞 肺 癌 组 织 ABCG4 表 达 与 耐 药 的 相 关 性 研 究 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,2009,6():3 35. [2] Yuan Y,Liao YM,HsuehCT,etal.Noveltargetedtherapeu tics:inhibitorsofmdm2,alkandparp[j].jhematolon col,20,20(4):6 29. [3] YelamosJ,FarresJ,LlacunaL,etal.PARP andparp 2: Newplayersintumourdevelopment[J].Am J Cancer Res, 20,(3): [4] CimminoG,PepeS,LausG,etal.Poly (ADPR)polymerase signalingofthednadamageinducedbydnatopoisomerasei poisonind54(p53wt)andu25(p53mut)glioblastomacellines [J].PharmacolRes,2007,55(): [5] ChengCL,JohnsonSP,KeirST,etal.Poly(ADP ribose)poly merase inhibitionreversestemozolomideresistanceinadna mismatchrepair deficient malignantgliomaxenograft[j].mol CancerTher,2005,4(9): [6] CurtinNJ,WangLZ,YiakouvakiA,etal.Novelpoly (ADP ri bose)polymerase inhibitor,ag436,restoressensitivityto temozolomideinmismatchrepair deficientcels[j].clincancer Res,2004,0(3): [7] DelaneyCA,WangLZ,KyleS,etal.Potentiationoftemozolo mideandtopotecangrowthinhibitionandcytotoxicitybynovel poly(adenosinediphosphoribose)polymeraseinhibitorsinapan elofhumantumorcellines[j].clincancerres,2000,6(7): [8] TentoriL,PortarenaI,VernoleP,etal.Efectsofsingleorsplit exposureofleukemiccelstotemozolomide,combinedwithpoly (ADP ribose)polymeraseinhibitorsoncelgrowth,chromosom alaberrationsandbaseexcisionrepaircomponents[j].cancer ChemotherPharmacol,200,47(4): [9] DonawhoCK,LuoY,LuoY,etal.ABT 888,anoralyactive poly (ADP ribose)polymeraseinhibitorthatpotentiatesdna damagingagentsinpreclinicaltumor models[j].clin Cancer Res,2007,3(9): [0] 甄 永 苏. 治 疗 肿 瘤 的 抗 体 靶 向 药 物 [J]. 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志, 2006,3(22): [] 李 绪 渊, 李 蔚 冰, 林 英 城. 多 聚 二 磷 酸 腺 苷 酸 核 糖 聚 合 酶 抑 制 剂 抗 肿 瘤 研 究 进 展 [J]. 国 际 肿 瘤 学 杂 志,20,38(3): 收 稿 日 期 : 修 回 日 期 : ( 编 辑 : 刘 翠 玲 )

14 294 郭 大 伟, 等 干 扰 BDNF 表 达 对 97 H 细 胞 侵 袭 影 响 及 其 机 制 的 探 讨 干 扰 犅 犇 犖 犉 表 达 对 97 犎 细 胞 侵 袭 影 响 及 其 机 制 的 探 讨 郭 大 伟 姜 晓 峰 孙 文 郁 朱 磊 张 弘 彬 侯 学 忠 2 梁 健. 中 国 医 科 大 学 附 属 第 四 医 院 肝 胆 外 科, 辽 宁 沈 阳 中 国 人 民 解 放 军 463 医 院 普 外 科, 辽 宁 沈 阳 0042 实 验 研 究 / 论 著 摘 要 目 的 : 应 用 特 异 性 小 干 扰 RNA(siRNA) 下 调 97 H 细 胞 中 脑 源 性 神 经 生 长 因 子 (BDNF) 表 达, 观 察 对 细 胞 凋 亡 和 侵 袭 的 影 响 并 探 讨 相 关 分 子 机 制 方 法 : 在 人 肝 细 胞 癌 (HCC) 细 胞 系 97 H 中, 采 用 蛋 白 质 印 迹 法 检 测 BDNF 的 表 达, 采 用 ELISA 方 法 检 测 培 养 上 清 上 BDNF 的 分 泌 水 平 特 异 性 BDNF sirna 转 染 细 胞, 采 用 FITC phaloidin 染 色 方 法 检 测 actin 细 胞 骨 架 的 变 化, 采 用 westernblot 方 法 检 测 细 胞 内 RhoA Rac Cdc42 的 活 化 情 况 同 时, 流 式 细 胞 术 检 测 细 胞 凋 亡,Transwel 小 室 测 定 细 胞 侵 袭 能 力 的 变 化 结 果 :97 H 细 胞 培 养 上 清 中 BDNF 含 量 为 (9.08± 6.2) ρ g/ml 在 97 H 细 胞 中, 特 异 性 BDNF sirna 显 著 抑 制 BDNF 的 表 达, 干 扰 细 胞 内 actin 细 胞 骨 架 聚 合,RhoA 或 Rac 活 性 受 到 抑 制, 同 时 与 对 照 组 相 比, 凋 亡 细 胞 百 分 比 增 加 至 (27.00±.7)%, 犘 =0.000, 侵 袭 细 胞 数 减 少 至 (26.9±.6)%, 犘 =0.000 结 论 : 干 扰 BDNF 的 表 达 能 显 著 降 低 HCC 细 胞 侵 袭 能 力, 其 机 制 可 能 与 阻 断 actin 细 胞 骨 架 聚 合 以 及 RhoA 或 Rac 活 化 相 关 BDNF 信 号 通 路 可 能 作 为 阻 断 HCC 发 展 演 进 的 新 靶 点, 有 待 于 进 一 步 深 入 研 究 关 键 词 癌, 肝 细 胞 ; 神 经 生 长 因 子 类 ; 细 胞 骨 架 ; 细 胞 培 养 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,202,9(7): 犐 狀 犺 犻 犫 犻 狋 狅 狀 犲 犳 犲 犮 狋 狅 犳 犻 狀 狋 犲 狉 狌 狆 狋 犻 狅 狀 犅 犇 犖 犉 犲 狓 狆 狉 犲 狊 犻 狅 狀 狅 狀 犻 狀 狏 犪 狊 犻 狅 狀 狅 犳 97 犎 犮 犲 犾 狊 犪 狀 犱 犻 狋 狊 犿 狅 犾 犲 犮 狌 犾 犪 狉 犿 犲 犮 犺 犪 狀 犻 狊 犿 狊 犌 犝 犗 犇 犪 狑 犲 犻, 犑 犐 犃 犖 犌 犡 犻 犪 狅 犳 犲 狀 犵, 犛 犝 犖 犠 犲 狀 狔 狌, 犣 犎 犝 犔 犲 犻, 犣 犎 犃 犖 犌 犎 狅 狀 犵 犫 犻 狀, 犎 犗 犝 犡 狌 犲 狕 犺 狅 狀 2 犵, 犔 犐 犃 犖 犌 犑 犻 犪 狀. 犇 犲 狆 犪 狉 狋 犿 犲 狀 狋 狅 犳 犎 犲 狆 犪 狋 狅 犫 犻 犾 犻 犪 狉 狔 犛 狌 狉 犵 犲 狉 狔, 犉 狅 狌 狉 狋 犺 犃 犳 犳 犻 犾 犻 犪 狋 犲 犱 犎 狅 狊 狆 犻 狋 犪 犾 狅 犳 犆 犺 犻 狀 犪 犕 犲 犱 犻 犮 犪 犾 犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔, 犛 犺 犲 狀 狔 犪 狀 犵 0032, 犘. 犚. 犆 犺 犻 狀 犪 2. 犇 犲 狆 犪 狉 狋 犿 犲 狀 狋 狅 犳 犌 犲 狀 狅 狉 犪 犾 犛 狌 狉 犵 犲 狉 狔, 犆 犺 犻 狀 犲 狊 犲 犘 犲 狅 狆 犾 犲 狊 犔 犻 犫 犲 狉 犪 狋 犻 狅 狀 犃 狉 犿 狔 463 狋 犺 犎 狅 狊 狆 犻 狋 犪 犾, 犛 犺 犲 狀 狔 犪 狀 犵 0042, 犘. 犚. 犆 犺 犻 狀 犪 [ 犃 犅 犛 犜 犚 犃 犆 犜 ] 犗 犅 犑 犈 犆 犜 犐 犞 犈 :ToinvestigatetheefectsofsiRNAspecificforBDNFonapoptosisandinvasionof97 H celsanditspotentialmolecularmechanism. 犕 犈 犜 犎 犗 犇 犛 :TheexpressionofBDNFincelswasexaminedbywesternblot andbdnfsecretionwasevaluatedbyelisainhumanhcccellinesof97 H.BDNFknockdownwasperformedbyspe cificbdnf sirnatransfectionin97 HcelsandactincytoskeletonwasshownbyFITC phaloidinstainingandtheactiva tionsofrhoa.racorcdc42weredeterminedbywesternblot.celapoptosisandinvasionwereexaminedbyflowcy tometryandtranswelassayrespectively. 犚 犈 犛 犝 犔 犜 犛 :TheexpressionofBDNFwasfoundin97 Hcels.BDNFconcentra tioninthesupernatantof97 H celswas (9.08±6.2) ρ g/ml.inhibitedexpressionofbdnfbyspecificsirna showedimpairedactinpolymerizationanddecreasedactivationsofrhoaorracin97 Hcels.BDNFknockdownalsoin ducedapoptosisandsuppressedinvasionof97 Hcels.Comparedwiththecontrolgrouptheapoptosisrateimcreasedto (27.00±.7)% ( 犘 =0.000)andtheinvasionratedecreasedto(26.9±.6)% ( 犘 =0.000). 犆 犗 犖 犆 犔 犝 犛 犐 犗 犖 犛 :Ourre sultsindicatedthatbdnfknockdowninhibitedcelinvasionprobablythroughtheblockedactinpolymerizationandthe correlatedinactivationofrhoaorrac.aimingatbdnf/trkbsignalinginterruption maybeanefectivestrategyto preventhccprogression. [ 犓 犈 犢 犠 犗 犚 犇 犛 ] carcinoma,hepatocelular;nervegrowthfactors;cytoskeleton;celculture 犆 犺 犻 狀 犑 犆 犪 狀 犮 犲 狉 犘 狉 犲 狏 犜 狉 犲 犪 狋,202,9(7): 中 图 分 类 号 R735.7 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 (202) 基 金 项 目 辽 宁 省 教 育 厅 2009 年 度 高 等 学 校 科 研 项 目 (2009A729) 第 一 作 者 简 介 郭 大 伟, 男, 辽 宁 沈 阳 人, 博 士, 主 治 医 师, 主 要 从 事 肝 细 胞 癌 发 生 发 展 分 子 机 制 的 研 究 工 作 Tel: E mail:gdw80@26.com 通 讯 作 者 简 介 梁 健, 男, 辽 宁 沈 阳 人, 博 士, 主 任 医 师, 博 士 生 导 师, 主 要 从 事 肝 细 胞 癌 发 生 发 展 分 子 机 制 的 研 究 工 作 Tel: E mail:liangjian_pro@yahoo.com

15 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 202 年 9 月 第 9 卷 第 7 期 CHINJCANCERPREV TREAT,September202,Vol.9 No 肝 细 胞 癌 (hepatocelularcarcinoma,hcc, 简 称 肝 癌 ) 是 死 亡 率 较 高 的 恶 性 肿 瘤 之 一 BDNF 是 神 经 营 养 因 子 家 族 成 员, 促 进 神 经 元 细 胞 的 存 活 和 生 长 已 经 在 神 经 母 细 胞 瘤 中 证 实, 通 过 与 其 高 亲 和 力 受 体 相 关 激 酶 B(tropomycinrelatedkinaseB) 结 合,BDNF [] 调 节 多 种 细 胞 生 物 学 活 动, 包 括 凋 亡 和 侵 袭 在 多 种 原 发 人 类 肿 瘤 中 均 发 现 BDNF 表 达 上 调, 特 别 是 发 [2] 生 转 移 的 胃 癌 对 HCC 的 研 究 发 现, 脱 壁 培 养 的 [3] BEL7402 细 胞 中 BDNF 和 TrkB 表 达 增 多, 与 其 耐 [4] 受 脱 壁 诱 导 的 细 胞 凋 亡 相 关 RhoGTPases 属 于 小 G 蛋 白 家 族, 目 前 对 其 中 3 个 成 员 研 究 较 为 深 入, 即 RhoA Rac 和 Cdc42, 具 有 调 节 细 胞 内 actin 细 胞 [5] 骨 架 动 力 学 和 细 胞 运 动 的 作 用 BDNF 能 通 过 抑 制 RhoA/Rho 相 关 激 酶 的 活 化, 保 护 神 经 元 细 胞 避 免 苯 [6] 丙 氨 酸 诱 导 的 细 胞 凋 亡 本 研 究 探 讨 HCC 细 胞 系 97 H 细 胞 中 BDNF 的 表 达 水 平 以 及 敲 除 BDNF 对 HCC 细 胞 actin 细 胞 骨 架 RhoGTPases 活 性 以 及 细 胞 凋 亡 和 侵 袭 的 影 响 材 料 与 方 法. 主 要 试 剂 BDNF 兔 多 抗 (SC546, ml) 购 自 美 国 Santa Cruz 公 司 ; 高 糖 DMEM 培 养 基 (SH B, 500mL) 和 胎 牛 血 清 (SV ,00 ml) 购 自 美 国 Hyclone 公 司 ;BDNF sirna( 冻 干 粉 ) 及 对 照 购 自 上 海 吉 凯 公 司 ; 脂 质 体 Lipofectamine TM 2000( ,0.75mL) 购 自 美 国 Invitrogen 公 司 ;Annexin Ⅴ FITC Kit(556420,00 test) 和 Matrigel(356234, 5mL) 基 质 胶 购 自 美 国 BD Biosciences 公 司 ;Tran swel 小 室 购 自 美 国 Costar 公 司 ; 人 BDNF Quan tikine(dbd00,plate)elisa kit 购 自 美 国 R&D Systems 公 司 ;FITC phaloidin(c033,0.2 ml) 购 自 碧 云 天 公 司 ;RhoA/Rac/Cdc42 activation assay combokit(sta 405,3 0assays) 购 自 美 国 CelBi olabs 公 司.2 方 法.2. 细 胞 培 养 和 转 染 人 HCC 细 胞 系 97 H( 购 自 南 京 凯 基 公 司 ) 细 胞 使 用 含 有 0% 胎 牛 血 清 的 高 糖 DMEM 培 养 基,37 5% CO 2 条 件 培 养 采 用 脂 质 体 Lipofectamine TM 2000 转 染 试 剂, 将 BDNF 和 non silencing sirna 分 别 瞬 时 转 染 97 H 细 胞, 转 染 按 试 剂 说 明 书 进 行 细 胞 实 验 至 少 重 复 3 次.2.2 Westernblot 培 养 细 胞 用 冰 冷 的 PBS 漂 洗 2 次, 置 于 冰 上 裂 解, 裂 解 液 成 分 包 括 20 mmol/l Tris HCl mmol/ledta 50mmol/LNaCl 50mmol/L NaF mmol/l Na 3VO 4 % Triton X 00 和 mmol/lpmsf 4 下,22000r/min, 离 心 30min ( 离 心 半 径 8.8cm), 取 上 清, 考 马 斯 亮 蓝 法 测 定 蛋 白 浓 度 80μg 总 蛋 白 采 用 2% SDS PAGE 电 泳 分 离, 并 转 移 至 PVDF 膜 5% 脱 脂 奶 粉 室 温 封 闭 2h 后, 兔 多 克 隆 抗 人 BDNF 和 β actin( 200) 一 抗 4 孵 育 过 夜, 然 后 山 羊 抗 兔 IgG 二 抗 ( 2000)37 孵 育 2h,ECL 发 光 成 像 采 用 ImageJ 软 件 测 定 每 个 蛋 白 条 带 的 光 密 度 值, 计 算 同 一 个 标 本 BDNF 和 β actin 光 密 度 之 间 的 比 值 作 为 BDNF 的 相 对 表 达 量.2.3 ELISA 细 胞 培 养 24 h 后, 收 集 上 清 液 500μL, 加 入 无 菌 Eppendorf 中, 离 心 机 预 冷 至 4, 2500r/min, 离 心 0min( 离 心 半 径 8.8cm), 取 上 清 分 装 -80 冻 存, 用 于 检 测 BDNF 的 分 泌 水 平 采 用 人 BDNFQuantikineELISA 试 剂 盒,50μL 待 测 样 品 或 标 准 品 用 00μLassaydiluent 稀 释 后, 加 到 孔 板 中 室 温 孵 育 2h, 再 加 入 00μLBDNF 偶 联 抗 体 室 温 孵 育 h 充 分 漂 洗 后 加 入 200μL 底 物 溶 液 显 色 多 功 能 酶 标 仪 校 正 波 长 设 定 570nm, 于 450nm 波 长 处 读 取 吸 光 度 值.2.4 actin 细 胞 骨 架 染 色 观 察 BDNF sirna 转 染 细 胞 后, 用 PBS 充 分 漂 洗 细 胞,4% 多 聚 甲 醛 固 定 %BSA 封 闭 后,FITC phaloidin 室 温 孵 育 h,dapi 复 染 细 胞 核 阴 性 对 照 用 PBS 代 替 FITC phaloidin 孵 育 细 胞 在 400 倒 置 荧 光 显 微 镜 下 观 察, 选 择 状 态 好 分 布 均 匀 荧 光 明 亮 的 细 胞, 采 集 图 像.2.5 RhoGTPase 活 性 测 定 RhoA/Rac/Cdc42 activationassaycombo 试 剂 盒, 用 于 测 定 RhoA Rac 和 Cdc42 的 活 性 BDNF sirna 转 染 后, 细 胞 用 PBS 充 分 漂 洗, 加 入 assay/lysisbufer, 冰 上 孵 育 20min 用 细 胞 刮 将 细 胞 刮 下, 使 细 胞 充 分 裂 解, 4,4000r/min, 离 心 0 min( 离 心 半 径 8.8cm) 根 据 说 明 书 进 行 pul down 实 验, 再 完 成 westernblot 检 测 有 活 性 的 RhoA Rac Cdc Annexin Ⅴ FITC 双 染 法 测 定 细 胞 凋 亡 细 胞 转 染 24h 后, 用 冰 冷 的 PBS 漂 洗 2 次, 重 悬 于 bindingbufer( 0 6 ml - ) 取 00μL 细 胞 悬 液 ( 0 5 细 胞 ) 与 5μLAnnexinV FITC 和 5μLPI 充 分 混 匀, 室 温 避 光 孵 育 5 min 再 加 入 400μL bindingbufer, 上 流 式 细 胞 仪 测 定 凋 亡 细 胞 百 分 比 实 验 重 复 3 次.2.7 Transwel 小 室 检 测 细 胞 侵 袭 能 力 转 染 24h 后 消 化 细 胞 ( 0 4 ) 并 接 种 在 含 有 8μm 孔 径 膜 的 Transwel 上 室, 膜 预 包 被 有 Matrigel 基 质 胶, 上 室 含 有 % FBS 的 DMEM 培 养 基, 下 室 含 有 0% FBS 的 DMEM 培 养 基, 继 续 培 养 24h 用 棉 签 小 心 擦 去 膜 上 表 面 未 发 生 迁 移 的 细 胞, 而 膜 下 表 面 细 胞 用 4% 多 聚 甲 醛 固 定, 结 晶 紫 染 色 随 机 选 取 5 个 200 镜 下 视 野 计 数 侵 袭 细 胞 数, 结 果 为 3 个 复 孔 的 平 均 值

16 296 郭 大 伟, 等 干 扰 BDNF 表 达 对 97 H 细 胞 侵 袭 影 响 及 其 机 制 的 探 讨.3 统 计 学 方 法 采 用 SPSS3.0 软 件 处 理 数 据 单 向 方 差 分 析 用 于 比 较 不 同 处 理 组 细 胞 之 间 的 差 异 结 果 用 狓 - ± 狊 表 示 检 验 水 准 α= 结 果 犎 细 胞 上 清 犅 犇 犖 犉 水 平 采 用 ELISA 方 法 检 测 97 H 细 胞 培 养 上 清 中 BD 改 变 BDNF sirna 特 异 性 敲 除 97 H 细 胞 中 BDNF 的 表 达, 减 少 了 actin 微 丝 的 形 成 与 未 转 染 细 胞 相 比, 转 染 细 胞 胞 质 中 大 多 数 微 丝 结 构 消 失,FITC 荧 光 呈 散 在 分 布 ( 图 4) 本 研 究 结 果 表 明,BDNF sirna 转 染 细 胞 中 actin 细 胞 骨 架 发 生 解 聚, 微 丝 数 量 显 著 减 少, 可 能 造 成 侵 袭 细 胞 数 下 降 NF 的 分 泌 水 平 97 H 细 胞 正 常 培 养 上 清 中 BDNF 的 浓 度 为 (9.08±6.2) ρ g/ml, 提 示 BDNF 可 能 对 细 胞 本 身 具 有 一 定 的 生 物 学 功 能 转 染 BDNF sir NA 后,97 H 细 胞 培 养 上 清 中 BDNF 的 浓 度 为 (02.40±4.0) ρ g/ml, 表 明 特 异 性 sirna 减 少 BD NF 的 表 达 2.2 转 染 犅 犇 犖 犉 狊 犻 犚 犖 犃 下 调 97 犎 细 胞 犅 犇 犖 犉 的 表 达 未 转 染 sirna 之 前,BDNF 在 97 H 细 胞 中 检 测 到 有 表 达 转 染 non silencingsirna 对 BDNF 的 表 达 没 有 影 响, 但 BDNF sirna 转 染 的 细 胞 中 BDNF 表 达 水 平 显 著 降 低 ( 图 ), 表 明 特 异 性 sirna 有 效 抑 制 BDNF 的 表 达 2.3 犅 犇 犖 犉 狊 犻 犚 犖 犃 诱 导 97 犎 细 胞 凋 亡 对 照 组 non silencing 和 BDNF sirna 转 染 的 97 H 细 胞 的 凋 亡 率 分 别 为 (.63 ± 0.84)% (4.3±.6)% 和 (27.00±.7)%, 犘 =0.000 ( 图 2) 结 果 表 明,BDNF sirna 能 诱 导 97 H 细 胞 发 生 凋 亡 2.4 犅 犇 犖 犉 狊 犻 犚 犖 犃 抑 制 97 犎 细 胞 侵 袭 为 了 检 测 干 扰 BDNF 表 达 对 97 H 细 胞 侵 袭 能 力 的 影 响, 用 特 异 性 BDNF sirna 转 染 97 H 细 胞,Tr answel 小 室 测 定 侵 袭 细 胞 数 的 变 化 对 照 组 non si lencing 和 BDNF sirna 转 染 的 97 H 细 胞 的 侵 袭 细 胞 数 分 别 为 44.0± ±.5 和 26.9±.6, 犘 = 0.000( 图 3) 结 果 表 明,BDNF sirna 可 以 阻 断 97 H 细 胞 的 侵 袭 2.5 犅 犇 犖 犉 狊 犻 犚 犖 犃 诱 导 的 97 犎 细 胞 犪 犮 狋 犻 狀 细 胞 骨 架 的 与 对 照 组 和 non silencingsirna 转 染 细 胞 相 比, 特 异 性 sirna 有 效 抑 制 97 H 细 胞 中 BDNF 的 表 达 ; 与 对 照 组 和 non silencingsirna 转 染 细 胞 相 比,RhoA 和 Rac 活 性 在 BDNF sirna 转 染 的 97 H 细 胞 中 显 著 下 调, 而 Cdc42 活 性 未 受 影 响 c: 对 照 组 ;n:non silencingsirna 转 染 组 ;si:bdnf sirna 转 染 组 图 转 染 BDNF sirna 对 97 H 细 胞 表 达 BDNF 水 平 及 RhoA Rac Cdc42 活 性 的 的 影 响 2.6 犅 犇 犖 犉 狊 犻 犚 犖 犃 对 犚 犺 狅 犃 犚 犪 犮 和 犆 犱 犮 42 活 性 的 影 响 RhoGTPases(RhoA Rac Cdc42)pul donw 和 westernblot 实 验 用 于 测 定 敲 除 BDNF 对 转 染 细 胞 中 RhoA Rac Cdc42 活 性 的 影 响 转 染 BDNF sirna 的 97 H 细 胞 中,RhoA 和 Rac 的 活 性 显 著 降 低, 但 Cdc42 的 活 性 没 有 变 化 ( 见 图 ) 这 些 结 果 表 明, 内 源 性 BDNF 可 能 通 过 抑 制 RhoA 或 Rac 活 性, 阻 断 actin 聚 合, 进 而 抑 制 细 胞 侵 袭 图 2 BDNF sirna 转 染 对 97 H 细 胞 凋 亡 的 影 响

17 中华肿瘤防治杂志 ２０１２ 年 ９ 月第 １９ 卷第 １７ 期 ＣＨＩＮＪＣＡＮＣＥＲＰＲＥＶ ＴＲＥＡＴ Ｓｅｐ ｅｍｂｅ ｒ２０１２ Ｖｏ ｌ １９ Ｎｏ １７ １２９７ Ａ 对照组 Ｂ 随机乱序组 Ｃ ＢＤＮＦ ｓ ＲＮＡ 转染组 图 ３ ＢＤＮＦ ｓ ＲＮＡ 转染对 ９７ Ｈ 侵袭力的影响 结晶紫染色 ２００ 与未转染细胞相比 转染细胞胞质中大多数微丝荧光变弱或消失 ＦＩＴＣ 荧光呈散在分布 ＤＡＰＩ复染细胞核 图 ４ ＢＤＮＦ ｓ ＲＮＡ 转染对 ９７ Ｈ 对 ａｃ ｎ细胞骨架的影响 ３ 讨论 ＨＣＣ 是 全 世 界 常 见 的 恶 性 肿 瘤 之 一 多 发 性 ＲｈｏＡ 能刺激 ａ ｃ ｎ 收缩 而 Ｒａ ｃ １ 具有阻断 ａ ｃ ｎ解聚 的作用 因此我们又对转染 ＢＤＮＦ ｓ ＲＮＡ 的细胞进 行 了ａ ｃ ｎ 细胞骨架 染 色 发 现 转 染 细 胞 中 ＦＩＴＣ ｌ ｐｈａ 瘤细胞存活和侵袭能力决定了是否能发生转移 本研 ｌ ｏ ｄ ｎ 染色的 ａ ｃ ｎ 微丝数 目 变 少 或 消 失 取 而 代 之 的 是胞质内散在的荧光 这可能与 ＲｈｏＡ 和 Ｒａ ｃ １ 活性下 究探 讨 了 ＢＤＮＦ 对 ＨＣＣ 细 胞 凋 亡 和 侵 袭 的 调 节 作 降有关 也与 ＢＤＮＦ ｓ ＲＮＡ 对细胞侵袭能力的抑制作 用 在 ９７ Ｈ 细 胞 中 检 测 了 ＢＤＮＦ 的 表 达 情 况 发 现 用相关 因此 我们认为 内 源 性 ＢＤＮＦ 可 能 通 过 活 化 细胞及培养上清 中 均 含 有 ＢＤＮＦ 提 示 ＢＤＮＦ 可 能 是 ＨｅｐＧ２ 细 胞 本 身 生 长 和 存 活 所 必 需 的 由 于 干 扰 ＲｈｏＡ 和 Ｒａ ｃ １影响ａ ｃ ｎ 细 胞 骨 架 重 组 进 而 影 响 ９７ Ｈ细胞的侵袭活性 ＢＤＮＦ 的 表 达 可 能 成 为 抗 肿 瘤 治 疗 的 新 的 研 究 方 综上 所 述 本 研 究 结 果 表 明 内 源 性 ＢＤＮＦ 在 促 向 ７ 本研 究 结 果 显 示 ＢＤＮＦ ｓ ＲＮＡ 能 促 进 ９７ Ｈ 进 ９７ Ｈ 细胞存 活 和 侵 袭 方 面 具 有 重 要 作 用 其 分 子 ＨＣＣ 患者往往由于发生了肝内转移而预 后不良 而肿 细胞凋亡并 抑 制 细 胞 侵 袭 内 源 性 ＢＤＮＦ 具 有 促 进 ＨＣＣ 细胞存活和侵袭的作用 活化的 ＲｈｏＧＴＰａ ｓ ｅ ｓ可以抑制肿瘤细 胞凋 亡 肿 机制可能与 ＲｈｏＡ 和 Ｒａ ｃ １ 的活化以及ａ ｃ ｎ 细胞骨架 重 组 相 关 但 ＨＣＣ 细 胞 中 ＢＤＮＦ ＴｒｋＢ 活 化 Ｒｈｏ ＧＴＰａ ｓ ｅ ｓ的分子机制还有待于进一步研究 瘤细胞还能通过 Ｒｈｏ 蛋白调节黏附 蛋 白 的 改 变 使 其 易于转移 和 播 散 ８ 本 研 究 发 现 ＢＤＮＦ ｓ ＲＮＡ 转 染 后细胞中 ＲｈｏＡ 和 Ｒａ ｃ １ 活性下降 提示内源性 ＢＤＮＦ 可能通 过 活 化 ＲｈｏＡ 和 Ｒａ ｃ １ 影 响 ９７ Ｈ 细 胞 侵 袭 参考文献 １ 董海蓉 丁海霞 华烨 等 脑源性神经营养因子促进人脑胶质 瘤细胞株生 长 的 研 究 Ｊ 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 ２００９ １６ ２０ １５２１ １５２５ 下转第 １３０７ 页

18 298 严 文 辉, 等 CN 对 大 鼠 移 植 性 肝 癌 磁 靶 向 热 疗 效 果 的 观 察 犉 犆 犖 犆 犖 对 大 鼠 移 植 性 肝 癌 磁 靶 向 热 疗 效 果 的 观 察 严 文 辉 郭 跃 华 周 汉 新 李 富 荣 梁 文 龙 2 张 琳. 暨 南 大 学 第 二 临 床 医 学 院 深 圳 市 人 民 医 院 ( 甲 乳 外 科 : 严 文 辉 ; 肝 胆 外 科 : 郭 跃 华, 周 汉 新 ; 妇 科 : 张 琳 ; 临 床 医 学 研 究 中 心 : 李 富 荣 ), 广 东 深 圳 广 州 市 第 一 人 民 医 院 胃 肠 外 科, 广 东 广 州 5080 实 验 研 究 / 论 著 摘 要 目 的 : 研 究 碳 包 铁 纳 米 笼 壳 聚 糖 微 球 (Fe@CN CN) 在 交 变 磁 场 中 感 应 产 热 规 律, 观 察 其 对 大 鼠 移 植 性 肝 癌 (HCC) 的 磁 靶 向 热 疗 效 果 方 法 : 在 体 外, 观 察 Fe@CN CN 在 高 频 交 变 磁 场 中 感 应 产 热 规 律, 确 定 体 内 实 验 条 件 36 只 移 植 性 HCC 大 鼠 随 机 分 为 3 组 ( 狀 =2),A 组 生 理 盐 水 组,B 组 微 球 组,C 组 微 球 热 疗 组 C 组 治 疗 中 记 录 肿 瘤 区 及 周 围 器 官 温 度,7d 后, 测 量 肿 瘤 体 积 质 量, 计 算 瘤 质 量 抑 制 率, 病 理 切 片 观 察 肿 瘤 病 理 变 化 和 微 球 沉 积 情 况, 比 较 各 组 治 疗 效 果 结 果 : 不 同 浓 度 不 同 电 流 强 度 条 件 下 磁 流 体 均 能 在 20 min 内 达 到 最 高 温 度, 产 热 效 应 随 着 两 者 升 高 而 增 强 肿 瘤 区 组 织 温 度 0min 内 可 达 到 (42.6±0.20), 可 恒 温 维 持 30 min, 并 显 著 性 高 于 右 肝 叶 和 直 肠 温 度 ( 犉 =0.925, 犘 =0.000) C 组 的 瘤 质 量 显 著 小 于 其 他 两 组 ( 犉 =98.830, 犘 =0.000) C 组 的 瘤 质 量 抑 制 率 为 48.5%, 是 B 组 的.5 倍 ;C 组 的 肿 瘤 体 积 最 小, 显 著 小 于 其 他 两 组 ( 犉 =89.086, 犘 =0.000), 仅 是 A 组 的 42.5%; 病 理 切 片 显 示 C 组 和 B 组 肿 瘤 组 织 中 均 见 Fe@CN CN 沉 积,C 组 肿 瘤 组 织 呈 重 度 坏 死,B 组 呈 中 度 坏 死,A 组 呈 轻 度 坏 死 结 论 :Fe@CN CN 具 有 良 好 的 感 应 产 热 性 能, 能 靶 向 定 位 于 大 鼠 移 植 性 HCC, 在 交 变 磁 场 作 用 下 能 有 效 升 高 肿 瘤 组 织 温 度, 从 而 产 生 显 著 的 治 疗 效 果 关 键 词 肝 肿 瘤, 实 验 性 ; 肿 瘤 移 植 ; 磁 力 学 ; 电 磁 场 ; 高 温, 诱 发 ; 肿 瘤 / 治 疗 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志,202,9(7): 犗 犫 狊 犲 狉 狏 犪 狋 犻 狅 狀 狋 犺 犲 犿 犪 犵 狀 犲 狋 犻 犮 狋 犪 狉 犵 犲 狋 犻 狀 犵 犲 犳 犲 犮 狋 狅 犳 犺 狔 狆 犲 狉 狋 犺 犲 狉 犿 犻 犪 狅 犳 犉 犆 狀 犪 狀 狅 犮 犪 犵 犲 犾 狅 犪 犱 犲 犱 犮 犺 犻 狋 狅 狊 犪 狀 狀 犪 狀 狅 狆 犪 狉 狋 犻 犮 犾 犲 狊 狅 狀 狋 狉 犪 狀 狊 狆 犾 犪 狀 狋 犲 犱 狉 犪 狋 犾 犻 狏 犲 狉 犮 犪 狀 犮 犲 狉 犢 犃 犖 犠 犲 狀 犺 狌 犻, 犌 犝 犗 犢 狌 犲 犺 狌 犪, 犣 犎 犗 犝 犎 犪 狀 狓 犻 狀, 犔 犐 犉 狌 狉 狅 狀 犵, 犔 犐 犃 犖 犌 犠 犲 狀 犾 狅 狀 2 犵, 犣 犎 犃 犖 犌 犔 犻 狀. 犛 犲 犮 狅 狀 犱 犃 犳 犳 犻 犾 犻 犪 狋 犲 犱 犎 狅 狊 狆 犻 狋 犪 犾 狅 犳 犑 犻 狀 犪 狀 犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔, 犛 犺 犲 狀 狕 犺 犲 狀 犘 犲 狅 狆 犾 犲 狊 犎 狅 狊 狆 犻 狋 犪 犾, 犛 犺 犲 狀 狕 犺 犲 狀 58020, 犘. 犚. 犆 犺 犻 狀 犪 2. 犇 犲 狆 犪 狉 狋 犿 犲 狀 狋 狅 犳 犌 犪 狊 狋 狉 狅 犻 狀 狋 犲 狊 狋 犻 狀 犪 犾 犛 狌 狉 犵 犲 狉 狔, 犉 犻 狉 狊 狋 犘 犲 狅 狆 犾 犲 狊 犎 狅 狊 狆 犻 狋 犪 犾 狅 犳 犌 狌 犪 狀 犵 狕 犺 狅 狌, 犌 狌 犪 狀 犵 狕 犺 狅 狌 5080, 犘. 犚. 犆 犺 犻 狀 犪 [ 犃 犅 犛 犜 犚 犃 犆 犜 ] 犗 犅 犑 犈 犆 犜 犐 犞 犈 :TostudytheheatefectoftheFe@C nanocage loadedchitosannanoparticles (Fe@ CN CN)underanalternatingmagneticfieldandtoobservethetherapeuticefectoftransplantedlivercancerbythemag netictargethyperthermia. 犕 犈 犜 犎 犗 犇 犛 :ToobservedFe@CN CNinthehigh frequencyalternatingmagneticfieldinduced heatproduction 犻 狀 狏 犻 狋 狉 狅 and 犻 狀 狏 犻 狏 狅 36livertransplantedratswererandomlydividedinto3groups ( 狀 =2),Asaline group,bmicrospheregroup,cmicrosphereshyperthermiagroup.tumorareaandsurroundingorganstemperaturewere recordedduringtreatmentincgroup.after7daystumorsize,weight,tumorweightinhibitionratewerecalculatedand pathologicalchangesandmicrospheresdepositionconditionswerecomparedintreatmentgroups. 犚 犈 犛 犝 犔 犜 犛 :Indiferent concentrationsofmagneticfluidanddiferentcurrentintensitythefe@cn CNfluidscanachievemaximumtemperature within20minutes.itsheatefectincreasedwiththeriseoftheboth.thetemperatureoftumorareawithin0 minutes couldreach(42.6±0.20) andconstanttemperaturecouldmaintainfor30minutes.itwassignificantlyhigherthanthe temperatureoftherighthepaticlobeandthetemperatureofrectum ( 犉 =0.925, 犘 =0.000).TumorweightinCGroup wassignificantlylessthanthatintheothertwogroups ( 犉 =98.830, 犘 =0.000).TumorweightinhibitionofCgroup was48.5%,thatwas.5timesthebgroup;thesmalesttumorvolumeincgroupwassignificantlylessthanthatinthe othertwogroups( 犉 =89.086, 犘 =0.000)anditwasonly42.5% ofagroup.pathologyshowedthatfe@cn CNdepo sitionwereseenintumortissueofgroupbandc,cgroupshowedseverenecrosisoftumortissueandbgroupshowed 基 金 项 目 广 东 省 自 然 科 学 基 金 ( ); 广 东 省 名 医 工 程 研 究 项 目 (20043); 深 圳 市 科 技 计 划 (2002 K3 2) 通 讯 作 者 简 介 严 文 辉, 男, 广 东 紫 金 人, 硕 士, 主 治 医 师, 主 要 从 事 甲 状 腺 乳 腺 外 科 基 础 与 临 床 研 究 工 作 Tel: E mail:uolor@tom.com

19 中 华 肿 瘤 防 治 杂 志 202 年 9 月 第 9 卷 第 7 期 CHINJCANCERPREV TREAT,September202,Vol.9 No moderatenecrosiswhileagroupshowedmildnecrosis. 犆 犗 犖 犆 犔 犝 犛 犐 犗 犖 :Fe@CN CNhasagoodresultofheatperform ance,cantargetthetransplantedlivercancerdirectlyinratsandinthealternatingmagneticfieldcanefectivelyincrease thetemperatureoftumortissue,resultinginasignificanttherapeuticefect. [ 犓 犈 犢 犠 犗 犚 犇 犛 ] liverneoplasms,experimental;neoplasmstransplantation;magnetics;electromagneticfields;hyper thermia,induced;neoplasms/therapy 犆 犺 犻 狀 犑 犆 犪 狀 犮 犲 狉 犘 狉 犲 狏 犜 狉 犲 犪 狋,202,9(7): 中 图 分 类 号 R735.7 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 (202) 磁 性 靶 向 热 疗 (magnetictargetinghyperthermia, MTH) 是 指 将 磁 性 材 料 导 入 肿 瘤 区 域 后, 置 于 交 变 磁 [] 场 下 使 靶 区 温 度 升 高 到 >4 的 热 疗 方 法 与 传 统 的 热 疗 方 法 比 较,MTH 具 有 微 创 靶 向 效 应 等 优 点 本 研 究 以 碳 包 铁 纳 米 笼 为 磁 性 内 核, 壳 聚 糖 为 微 球 基 质, 制 备 新 型 磁 性 纳 米 微 球 微 球 是 一 种 良 好 的 [2 3] 化 疗 药 物 载 体, 在 体 内 具 有 优 良 的 磁 靶 向 性 本 研 究 将 之 置 于 交 变 磁 场 中, 体 外 测 定 其 感 应 发 热 情 况 ; 将 之 应 用 于 移 植 性 肝 癌 (hepatocelular carcinoma, HCC) 大 鼠 体 内, 观 察 其 对 肝 肿 瘤 的 热 疗 效 果 材 料 与 方 法. 材 料 与 仪 器 ) 碳 包 铁 纳 米 笼 壳 聚 糖 微 球 (Fe@CN CN) 的 制 备 : 由 本 实 验 室 采 用 反 相 微 乳 法 制 备 : 取 磁 粉 500mg, 浸 入 50 ml 稀 盐 酸 溶 液 (0. mol/l), 室 温 下 反 应 2h, 用 蒸 馏 水 反 复 清 洗 至 洗 涤 液 ph=7.0, 磁 分 离 后 冻 干 保 存 壳 聚 糖 45 mg 加 入 到 5% 乙 酸 水 溶 液 0mL 中, 充 分 溶 解 2h, 再 加 入 30mgFe@C 纳 米 笼, 混 匀 超 声 分 散 形 成 水 相, 油 相 取 00 ml 溶 解 20g AOT 的 正 庚 烷 在 超 声 和 搅 拌 下, 将 水 相 逐 滴 加 入 油 相, 形 成 微 乳 液,0.5h 后 向 微 乳 液 中 加 入 2 ml 交 联 剂 (50% 戊 二 醛 溶 液 ), 维 持 超 声 和 搅 拌, 交 联 固 化 h, 用 丙 酮 无 水 乙 醇 和 蒸 馏 水 各 反 复 清 洗 5 遍, 冷 冻 干 燥 后 得 Fe@C 纳 米 笼 壳 聚 糖 微 球 Fe@C 纳 米 笼 壳 聚 糖 微 球 球 形 光 滑 圆 整, 粒 径 分 布 均 匀, 平 均 粒 经 (207± 2)nm, 粒 径 在 00~300nm 的 微 球 >90% 将 Fe@ CN CN 按 5 mg/ 支 进 行 分 装, 分 装 后 送 广 州 辐 照 中 心, 采 用 60 Co 辐 射 灭 菌, 辐 射 剂 量 为 5kGy 2) 动 物 和 瘤 株 : 雄 性 SD 大 鼠, 体 质 量 250~270g, 雄 性 SD 幼 鼠, 体 质 量 80~00g, 均 购 自 广 东 省 医 学 实 验 动 物 中 心 ( 实 验 动 物 合 格 证 号 :SCXK ) 大 鼠 Walker 256 瘤 株 购 自 武 汉 大 学 典 型 培 养 物 保 藏 中 心 3) 主 要 仪 器 :YZ2074 型 手 术 显 微 镜 ( 苏 州 医 疗 器 械 总 厂 ), 手 术 器 械 和 显 微 手 术 器 械 ( 上 海 医 疗 器 械 有 限 公 司 ), 电 子 数 显 游 标 卡 尺 ( 成 都 量 具 刃 具 总 厂 ), 分 析 天 平 ( 德 国 Sartorius 公 司 ),2cm 2cm 大 小 钕 铁 硼 稀 土 永 久 磁 铁 ( 表 面 磁 场 强 度 5000Gs, 深 圳 福 永 磁 材 料 厂 ), 德 国 testo 公 司 testo925 型 单 通 道 温 度 仪 及 插 入 式 探 头, 深 圳 市 双 平 电 源 技 术 公 司 中 高 频 感 应 加 热 设 备 sp 600 型.2 犉 犆 犖 犆 犖 的 磁 感 应 产 热 规 律 用 生 理 盐 水 将 Fe@CN CN 稀 释 成 6 8 和 0g/L 的 磁 流 体, 分 别 取 2mL 于 试 管 中, 在 20 室 温 置 于 频 率 80kHz 输 出 电 流 27A 的 交 变 磁 场 ( 线 圈 4 匝, 内 径 4cm) 中 加 热 50 min 后, 将 插 入 式 探 头 置 入 溶 液 水 平 下 约 5 mm 处, 使 用 testo925 型 单 通 道 温 度 仪 每 5min 测 量 磁 流 体 温 度, 每 一 浓 度 重 复 3 次, 取 平 均 值 绘 制 浓 度 温 度 曲 线 称 取 Fe@CN CN20 mg 用 2 ml 生 理 盐 水 配 制 成 0g/L 的 磁 流 体, 在 80kHz 频 率, 输 出 电 流 分 别 为 和 20A 的 交 变 磁 场 下 进 行 产 热 实 验, 实 验 时 间 为 50 min, 每 5 min 测 量 磁 流 体 温 度, 每 一 电 流 强 度 重 复 3 次, 取 平 均 值 绘 制 电 流 强 度 - 温 度 曲 线.3 建 立 大 鼠 移 植 性 犎 犆 模 型 将 Walker 256 瘤 株 常 规 复 苏 培 养 扩 增, 注 入 SD 幼 鼠 腹 腔 0.5 ml 周 后 幼 鼠 出 现 腹 水, 托 颈 处 死, 无 菌 条 件 下 抽 取 腹 水 约 0mL 将 含 肿 瘤 细 胞 的 腹 腔 液 注 射 到 皮 下 种 植 幼 鼠 的 双 侧 腹 股 沟 区 皮 下, 每 个 注 射 点 0.5mL 7d 后 托 颈 处 死 皮 下 种 植 幼 鼠, 无 菌 条 件 下 切 取 皮 下 种 植 瘤 块, 挑 选 出 鱼 肉 状 组 织, 并 切 成 若 干 块 置 于 生 理 盐 水 中 以 备 肝 脏 种 植, 须 在 2~3h 内 移 植 完 SD 大 鼠 常 规 麻 醉 消 毒 后, 显 露 左 肝 叶, 将 备 好 的 瘤 组 织 块 用 眼 科 镊 植 入 肝 包 膜 下, 确 认 瘤 组 织 未 退 出 无 出 血 即 关 腹 4d 再 次 开 腹 探 查 肿 瘤 生 长 情 [3] 况, 造 模 成 功 鼠 进 行 下 一 步 实 验.4 动 物 分 组 36 只 移 植 性 HCC 大 鼠, 体 质 量 250~270g, 随 机 分 为 3 组 ( 狀 =2):A 组 生 理 盐 水 组,B 组 微 球 组,C 组 微 球 热 疗 组.5 方 法.5. 给 药 方 法 大 鼠 实 验 前 禁 食 禁 水 2h, 常 规 麻 醉 消 毒 和 备 皮 后, 开 腹 探 查 左 肝 叶 肿 瘤 生 长 情 况, 在 手 术 显 微 镜 下 解 剖 肝 十 二 指 肠 韧 带, 游 离 出 胃 十 二 指 肠 动 脉, 远 端 结 扎 在 胃 十 二 指 肠 动 脉 结 扎 线 上 方 纵 行 剪 开 动 脉 壁, 用 肝 素 生 理 盐 水 冲 洗 动 脉 腔, 将 自 制

20 300 严 文 辉, 等 CN 对 大 鼠 移 植 性 肝 癌 磁 靶 向 热 疗 效 果 的 观 察 外 径 0.2mm 的 导 管 自 胃 十 二 指 肠 动 脉 插 入 肝 固 有 动 脉, 结 扎 固 定 导 管 ( 图 ), 以 备 肝 动 脉 注 射 给 药 3 组 的 注 药 时 间 均 为 5min,B 和 C 组 的 注 药 剂 量 为 ml 微 球 生 理 盐 水 分 散 液 ( 微 球 浓 度 5g/L),A 组 注 射 ml 生 理 盐 水 A B 和 C 组 以 肝 肿 瘤 部 位 为 靶 区, 在 其 上 方 放 置 5000Gs 磁 场, 注 药 后 维 持 30 min 后 移 走 各 组 动 物 注 药 完 毕 后 取 出 肝 动 脉 导 管, 结 扎 胃 十 二 指 肠 动 脉 创 口 远 端, 松 开 肝 总 动 脉 夹, 分 腹 壁 肌 肉 和 皮 肤 两 层 缝 合 切 口.5.2 磁 感 应 热 疗 方 法 靶 向 给 药 后,C 组 移 植 性 HCC 大 鼠 继 续 给 予 磁 感 应 加 热 治 疗 在 20 室 温 下, 将 大 鼠 肝 区 置 于 频 率 80kHz 输 出 电 流 27A 的 交 变 磁 场 ( 线 圈 4 匝, 内 径 4cm) 中 加 热 40min 当 肿 瘤 区 温 度 达 到 42 时, 调 整 交 变 磁 场 强 度 即 输 出 电 流 为 22A, 维 持 肿 瘤 区 温 度 42 左 右 不 变 治 疗 时 用 插 入 式 温 度 计 测 量 肿 瘤 区 和 其 周 围 区 域 的 温 度 变 化 情 况 计 算 肿 瘤 体 积 体 积 = ( 最 长 径 垂 直 径 2 ) 肿 瘤 病 理 变 化 和 微 球 沉 积 情 况 将 完 整 切 出 的 瘤 块 置 于 4% 甲 醛 溶 液 中 固 定, 取 瘤 体 最 大 剖 面 作 2 ~3 处 病 理 切 片,HE 染 色, 显 微 镜 下 观 察 肿 瘤 组 织 坏 死 情 况 和 微 球 沉 积 情 况, 根 据 坏 死 组 织 所 占 比 例 分 为 轻 度 (0~30%) 中 度 (3% ~70%) 和 重 度 (7% ~ 00%).7 统 计 学 方 法 统 计 分 析 采 用 SPSS0.0 软 件 包 计 量 资 料 用 狓 - ± 狊 表 示 多 个 样 本 均 数 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析, 两 两 比 较 采 用 SNK 狇 检 验 检 验 水 准 α= 结 果 2. 犉 犆 犖 犆 犖 纳 米 球 的 形 貌 单 个 微 球 透 射 电 镜 照 片 示 内 核 为 Fe@C 纳 米 笼, 外 层 包 裹 壳 聚 糖, 见 图 2 Fe@CN CN 球 形 光 滑 圆 整, 粒 径 分 布 均 匀, 平 均 粒 径 (207±2)nm, 见 图 3 图 外 径 0.2mm 的 导 管 置 入 大 鼠 胃 十 二 指 肠 动 脉 图 2 单 个 微 球 TEM 照 片.6 观 测 指 标.6. 温 度 指 标 微 球 热 疗 组 进 行 磁 感 应 加 热 治 疗 时, 每 5 min 测 量 左 HCC 右 肝 叶 和 直 肠 的 温 度 左 HCC 及 右 肝 叶 的 温 度 测 定, 均 测 定 肝 叶 表 面 温 度,HCC 测 量 位 点 分 别 位 于 肿 瘤 中 央 肿 瘤 边 缘 3 点 和 9 点 位 ( 按 时 钟 分 布 ), 右 肝 叶 测 量 位 点 分 布 位 于 右 肝 叶 中 央 其 边 缘 3 点 和 9 点 位 ( 按 时 钟 分 布 ), 然 后 取 3 个 位 点 温 度 的 平 均 值 直 肠 的 温 度 是 指 肠 腔 的 温 度, 探 头 插 入 大 鼠 肛 门 深 度 约 5mm, 重 复 测 量 3 次, 取 其 平 均 值.6.2 瘤 质 量 抑 制 率 和 肿 瘤 体 积 给 药 后 第 7 天, 各 组 大 鼠 再 次 麻 醉 开 腹, 完 整 切 除 肿 瘤, 用 分 析 天 平 测 定 [3] 瘤 质 量, 计 算 瘤 质 量 抑 制 率 试 验 组 平 均 瘤 重 瘤 质 量 抑 制 率 (%)=(- 对 照 组 平 均 瘤 重 ) 00% 用 游 标 卡 尺 测 量 肿 瘤 最 长 径 及 其 垂 直 径, 按 公 式 图 3 Fe@CN CN 纳 米 球 TEM 照 片 2.2 犉 犆 犖 犆 犖 的 产 热 效 果 在 环 境 温 度 20 条 件 下, 不 同 浓 度 的 Fe@CN CN 磁 流 体 在 高 频 交 变 磁 场 中 感 应 20min 后 能 迅 速 达 到 最 高 温 度, 并 恒 定 在 此 水 平, 形 成 产 热 和 散 热 平 衡 磁 流