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1 环 球 中 医 药 2012 年 4 月 第 5 卷 第 4 期 摇 Global Traditional Chinese Medicine, April 2012,Vol 郾 5, No 郾 4 摇 255 疏 肝 补 肾 法 对 睡 眠 剥 夺 大 鼠 学 习 记 忆 及 前 额 叶 皮 质 BDNF 蛋 白 表 达 的 影 响 论 著 冯 婷 摇 李 峰 摇 宋 月 晗 摇 刘 晓 兰 摇 马 捷 摇 毛 萌 摇 吴 凤 芝 摇 刘 晶 揖 摘 要 铱 摇 目 的 摇 研 究 疏 肝 补 肾 法 对 睡 眠 剥 夺 大 鼠 学 习 记 忆 及 前 额 叶 皮 质 脑 源 性 神 经 营 养 因 子 (brain 鄄 derived neurotrophic factor,bdnf) 蛋 白 表 达 的 变 化 方 法 摇 以 成 年 雄 性 SD 大 鼠 36 只, 随 机 分 为 对 照 组 模 型 组 疏 肝 补 肾 治 疗 组 应 用 168 小 时 睡 眠 剥 夺 法 复 制 模 型,Y 迷 宫 成 绩 评 定 学 习 记 忆 能 力, 以 血 清 超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxide dismutase,sod) 水 平 反 映 脑 组 织 的 损 害 取 大 鼠 前 额 叶 皮 质 冰 冻 切 片, 以 免 疫 组 织 化 学 法 检 测 BDNF 的 蛋 白 表 达 结 果 摇 与 对 照 组 比 较, 模 型 组 的 Y 迷 宫 成 绩 显 著 下 降 (P<0. 01), 血 清 SOD 含 量 明 显 减 少 (P<0. 01), 前 额 叶 皮 质 BDNF 免 疫 阳 性 物 明 显 减 少 (P<0. 01); 与 模 型 组 比 较, 疏 肝 补 肾 治 疗 组 Y 迷 宫 成 绩 明 显 提 高 ( P<0. 01), 血 清 SOD 含 量 显 著 增 多 (P<0. 01),BDNF 蛋 白 表 达 也 显 著 提 高 ( P<0. 01) 结 论 摇 睡 眠 剥 夺 能 造 成 加 重 脑 损 伤 学 习 记 忆 能 力 减 退 以 及 BDNF 表 达 的 减 少, 而 疏 肝 补 肾 法 能 改 善 学 习 记 忆 和 脑 损 伤, 可 能 是 通 过 上 调 BDNF 蛋 白 的 表 达 以 及 相 关 通 路 蛋 白 所 致 揖 关 键 词 铱 摇 睡 眠 剥 夺 ; 摇 疏 肝 补 肾 法 ; 摇 脑 源 性 神 经 营 养 因 子 ; 摇 超 氧 化 物 歧 化 酶 ; 摇 Y 迷 宫 揖 中 图 分 类 号 铱 摇 R 摇 揖 文 献 标 识 码 铱 摇 A 摇 doi: / j. issn 鄄 Effects of learning and memory in rats with sleep deprivation and BDNF protein expression in the prefrontal cortex with soothing the liver and kidney method 摇 FENG Ting, LI Feng, SONG Yue 鄄 han, et al. Departmen of TCM Diagnostics,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing ,China Corresponding author: LI Feng, E 鄄 mail:lifeng95@ vip. sina. com 揖 Abstract 铱 摇 Objective 摇 To study changes of learning and memory and brain 鄄 derived neurotrophic factor expression in the prefrontal cortex on rats with sleep deprivation through the method of soothing the liver and tonifying the kidney. Methods 摇 36 adult male Spargue 鄄 Dawley rats are randomly divided into control group, model group, and treated group. Applying the model of 168 hours sleep deprivation to reflect brain damage with levels of serum SOD and evaluate learning and memory abilities with the results of Y 鄄 maze. Using frozen sections in the prefrontal cortex of rats to detect protein expression of BDNF with immuno 鄄 histochemical. Results 摇 Compared with the control group, Y 鄄 maze 爷 s results reduced remarkably ( P<0. 01), serum SOD declined (P<0. 01), and the immune reactive BDNF in prefrontal cortex declined (P<0. 01) in the model group; compared with the model group, treated groups improved the Y 鄄 maze result (P<0 郾 01), significantly increased serum SOD content (P<0 郾 01), the expression of BDNF protein is also significantly enhanced (P<0. 01). Conclusion 摇 Sleep deprivation can result in learning and memory loss and brain damage, reduction in the expression of BDNF; the method of soothing the liver and kidney can recover learning and memory and brain injury, possibly through increasing BDNF protein expression and relative pathways of protein. 揖 Key words 铱 摇 Sleep deprivation; 摇 Soothing the liver and tonifying the kidney; 摇 Brain 鄄 derived neu 鄄 rotrophic factor(bdnf); 摇 Superoxide dismutase(sod); 摇 Y 鄄 maze 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目 ( ) 作 者 单 位 : 北 京 中 医 药 大 学 中 医 诊 断 系 [ 冯 婷 ( 博 士 研 究 生 ) 李 峰 宋 月 晗 马 捷 ( 博 士 研 究 生 ) 毛 萌 ( 博 士 研 究 生 ) 吴 凤 芝 ( 博 士 研 究 生 ) 刘 晶 ( 博 士 研 究 生 )], 科 研 中 心 ( 刘 晓 兰 ) 作 者 简 介 : 冯 婷 (1982- ), 女,2009 级 在 读 博 士 研 究 生 研 究 方 向 : 病 证 结 合 的 辨 证 规 律 研 究 E 鄄 mail:07fting@ 163. com 通 讯 作 者 : 李 峰 (1966- ), 博 士, 教 授, 博 士 生 导 师 研 究 方 向 : 病 证 结 合 的 辨 证 规 律 研 究 E 鄄 mail:lifeng95@ vip. sina. com
2 摇 256 环 球 中 医 药 2012 年 4 月 第 5 卷 第 4 期 摇 Global Traditional Chinese Medicine, April 2012,Vol 郾 5, No 郾 4 摇 摇 睡 眠 的 作 用 是 调 节 丘 脑 皮 层 以 及 海 马 新 皮 质 网 络 神 经 元 之 间 同 步 化 作 用, 可 以 根 据 神 经 元 的 活 动 性 来 促 进 不 同 程 度 的 突 触 效 应, 将 短 时 记 忆 碎 片 再 次 激 活 分 析, 并 逐 渐 组 合, 融 合 成 长 时 程 记 忆 不 同 时 间 的 睡 眠 剥 夺 对 学 习 记 忆 有 不 同 程 度 的 影 响, 对 动 物 进 行 中 长 期 睡 眠 剥 夺 能 显 著 造 成 学 习 记 忆 障 碍, 脑 源 性 神 经 营 养 因 子 ( brain 鄄 derived neurotrophic factor,bdnf) 作 为 第 二 个 被 发 现 的 神 经 营 养 因 子 也 参 与 长 时 程 增 强 的 产 生 和 维 持 本 实 验 通 过 疏 肝 补 肾 方 药 干 预 睡 眠 剥 夺 造 成 学 习 记 忆 障 碍, 观 察 BDNF 的 蛋 白 表 达, 研 究 疏 肝 补 肾 法 的 作 用 机 理 1 摇 材 料 与 方 法 1. 1 摇 实 验 动 物 与 分 组 成 年 雄 性 SD 大 鼠 36 只, 清 洁 级, 体 重 (270 依 20)g, 购 自 北 京 维 通 利 华 实 验 动 物 技 术 有 限 公 司, 合 格 证 号 为 SCXK( 京 ) 2006 鄄 0009 饲 养 于 室 内 温 度 (22 依 2) 益 相 对 湿 度 在 30% ~ 40% 的 动 物 房, 光 照 节 律 12L 颐 12D(6 颐 00 ~ 18 颐 00), 适 应 性 饲 养 3 天, 期 间 自 由 饮 水 进 食, 同 时 进 行 站 平 台 训 练 随 机 将 大 鼠 分 为 3 组, 每 组 12 只, 分 别 为 对 照 组 ( 正 常 环 境 饲 养 ) 模 型 组 ( 睡 眠 剥 夺 ) 疏 肝 补 肾 治 疗 组 ( 模 型 组 基 础 上 给 予 四 逆 散 和 生 慧 汤 合 方 ) 1. 2 摇 动 物 模 型 制 备 [1] 采 用 改 良 的 多 平 台 ( MMPM) 睡 眠 剥 夺 法 复 制 模 型, 将 模 型 组 和 疏 肝 补 肾 治 疗 组 从 造 模 第 1 天 早 8 颐 00 开 始 放 入 睡 眠 剥 夺 箱, 连 续 7 天, 至 第 8 天 早 8 颐 00 结 束 使 用 自 制 睡 眠 剥 夺 箱, 规 格 110 cm ( 长 ) 伊 60 cm( 宽 ) 伊 40 cm( 高 ), 塑 料 箱 内 壁 为 灰 色, 其 底 面 均 匀 固 定 15 个 直 径 6. 5 cm 高 8 cm 的 有 机 玻 璃 平 台 造 模 开 始 前 在 箱 内 注 水, 水 平 面 应 在 平 台 下 1 cm 处, 水 温 保 持 在 28 ~ 30 益 箱 顶 置 铁 丝 网, 大 鼠 在 平 台 间 可 自 由 活 动 和 饮 食 1. 3 摇 药 物 制 备 与 给 药 方 法 疏 肝 补 肾 治 疗 组 采 用 四 逆 散 和 生 慧 汤 的 1 颐 1 合 方 四 逆 散 : 选 用 伤 寒 论 的 四 逆 散 ( 由 柴 胡 枳 实 赤 芍 炙 甘 草 各 6 g 组 成 ); 生 慧 汤 : 选 用 辨 证 录 健 忘 门 的 生 慧 汤 ( 由 熟 地 黄 30 g 远 志 6 g 山 茱 萸 12 g 柏 子 仁 15 g 菖 蒲 1. 5 g 炒 枣 仁 15 g 茯 苓 9 g 红 参 9 g 白 芥 子 6 g 组 成 ) 方 药 均 为 北 京 中 医 药 大 学 东 直 门 医 院 提 供 的 免 煎 颗 粒 ( 北 京 康 仁 堂 药 业 有 限 公 司 生 产 ), 按 人 体 用 药 量 换 成 大 鼠 等 效 剂 量 作 为 大 鼠 用 药 量, 每 天 给 予 生 药 量 为 g / kg, 灌 胃 容 积 1 ml / kg, 时 间 点 为 睡 眠 剥 夺 的 小 时 对 照 组 和 模 型 组 同 时 间 给 予 等 体 积 蒸 馏 水 1. 4 摇 试 剂 抗 原 修 复 液 ( 北 京 普 利 莱 基 因 技 术 有 限 公 司 ), ABC 试 剂 盒 (VECTOR 公 司, 美 国 ),BDNF 兔 来 源 多 克 隆 抗 体 (Abcam 公 司, 美 国 ),DAB 试 剂 盒 ( 北 京 普 利 莱 基 因 技 术 有 限 公 司 ), 超 氧 化 物 歧 化 酶 ( SOD) 试 剂 盒 ( 南 京 建 成 科 技 有 限 公 司 ) 1. 5 摇 学 习 记 忆 评 定 采 用 Y 迷 宫 评 定 大 鼠 的 记 忆 能 力 各 组 造 模 前 3 天 进 行 每 天 20 次 的 训 练, 取 第 3 天 成 绩, 造 模 最 后 一 天 再 进 行 测 试 设 备 由 三 等 分 迷 路 箱 和 控 制 仪 组 成 迷 路 箱 为 等 长 的 玉 域 芋 臂 和 三 者 的 交 界 区 ; 箱 底 铺 设 间 距 1 cm 的 电 栅, 每 臂 顶 端 各 装 一 盏 15 W 的 刺 激 信 号 灯 Y 迷 宫 的 控 制 仪 有 电 压 控 制 按 钮 延 时 控 制 按 钮 和 玉 域 芋 0 四 个 按 钮, 当 分 别 按 下 玉 域 芋 按 钮 时, 相 应 臂 的 信 号 灯 亮, 此 时 该 臂 不 通 电 为 安 全 区, 另 外 无 灯 光 的 两 臂 及 交 界 区 均 通 电 而 成 为 非 安 全 区 ; 按 下 0 按 钮, 则 三 臂 均 不 通 电, 但 交 界 区 通 电, 信 号 灯 亮 后, 稍 停 片 刻 电 栅 才 开 始 通 电 [2] 根 据 文 献 研 究, 本 实 验 采 用 固 定 次 数 随 机 不 休 息 法 冶 [3], 实 验 时 先 将 大 鼠 放 入 迷 宫 适 应 3 分 钟, 然 后 无 规 则 变 换 安 全 区 次 序, 大 鼠 受 电 击 后 逃 到 安 全 区, 灯 光 持 续 10 秒, 然 后 再 以 所 在 臂 作 为 下 次 测 试 的 起 始 位 置 进 行 下 一 次 测 试 每 个 实 验 日 连 续 测 试 20 次, 连 续 10 次 中 有 9 次 或 者 以 上 正 确 反 应, 则 为 达 标 本 实 验 每 组 筛 选 出 9 只 进 行 测 试 所 用 参 数 : 电 压 50 ~ 70 V, 延 时 5 秒 1. 6 摇 血 清 SOD 检 测 造 模 结 束 后, 用 10% 水 合 氯 醛 溶 液 以 0. 3 ml / 100 g 体 重 腹 腔 麻 醉, 断 头 取 血, 置 于 冰 上, 使 用 4 益 低 温 离 心 机 以 3000 转 / 分 离 心 15 分 钟, 取 得 上 清 置 于 Eppendorf 管 中, 保 存 于 -20 益 冰 箱 待 用 采 用 黄 嘌 呤 氧 化 酶 法 测 定 SOD 活 力 每 组 选 取 9 只 离 心 效 果 好 的 血 清 进 行 检 测 1. 7 摇 前 额 叶 皮 质 区 BDNF 蛋 白 检 测 摇 组 织 切 片 摇 造 模 结 束 麻 醉 后, 于 冰 上 取 每 组 半 数 大 鼠 的 全 脑, 去 除 嗅 球 及 小 脑 后, 用 液 氮 迅 速 冷 冻, 待 脑 组 织 变 白 置 于 -80 益 冰 箱 待 用 从 -80 益 冰 箱 取 出 组 织, 在 - 20 益 冰 冻 切 片 机 内
3 环 球 中 医 药 2012 年 4 月 第 5 卷 第 4 期 摇 Global Traditional Chinese Medicine, April 2012,Vol 郾 5, No 郾 4 摇 257 进 行 组 织 切 片, 参 考 脑 部 定 位 图 谱 在 前 额 叶 皮 质 区 连 续 切 片, 厚 度 为 8 滋 m, 贴 于 载 玻 片, 在 混 合 [4] 固 定 液 中 固 定 切 片 5 分 钟 后 放 置 于 -20 益 冰 箱 待 用 摇 免 疫 组 化 检 测 摇 从 -20 益 冰 箱 取 出 冰 冻 切 片, 室 温 平 衡 2 分 钟, 按 照 说 明 采 用 微 波 热 修 复 法 置 于 抗 原 修 复 液 (1 颐 100) 中 进 行 修 复, 待 修 复 液 自 然 冷 却 至 室 气 温, 将 玻 片 取 出,PBS 漂 洗 3 分 钟 伊 3 次, 去 离 子 水 冲 洗 ; 以 0. 3% H 2 O 2 去 除 内 源 性 过 氧 化 物 酶 ( 室 温 避 光 30 分 钟 ),PBS 漂 洗 5 分 钟 伊 3 次 ; 羊 血 清 封 闭 (3 颐 益 30 分 钟 ); 倾 去 多 余 血 清, 滴 加 BDNF 兔 来 源 的 多 克 隆 一 抗 (1 颐 60 4 益 过 夜 ),PBS 漂 洗 5 分 钟 伊 3 次 ; 滴 加 二 抗 (1 颐 200, 37 益,45 分 钟 ),PBS 漂 洗 5 分 钟 伊 3 次 ; 滴 加 A B 液 (1 颐 100,37 益,45 分 钟 ),PBS 漂 洗 5 分 钟 伊 3 次 ; DAB 显 色 (1 颐 20), 显 色 过 程 中 可 一 边 观 察 脑 片 阳 性 物 质 的 显 色 情 况, 最 后 进 行 上 行 酒 精 脱 水 二 甲 苯 透 明, 封 片, 镜 下 观 察 照 相, 每 组 随 机 抽 取 3 只 大 鼠, 每 只 大 鼠 每 个 部 位 9 个 视 野, 应 用 NIS 鄄 Elements BR 3. 1 软 件 进 行 图 像 分 析, 结 果 以 平 均 光 密 度 值 表 示 蛋 白 表 达 相 对 量 1. 8 摇 数 据 统 计 运 用 SPSS 软 件 分 析,Y 迷 宫 成 绩 血 清 SOD 海 马 各 BDNF 蛋 白 表 达 均 用 均 值 依 标 准 差 ( 軃 x 依 s) 表 示, 组 间 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析 ( One 鄄 Way 鄄 ANOVA) 检 验, 以 P<0 郾 05 为 显 著 差 异,P<0. 01 为 差 异 非 常 显 著 2 摇 结 果 2. 1 摇 Y 迷 宫 测 试 结 果 Y 迷 宫 结 果 显 示, 造 模 前 最 后 一 次 各 组 间 错 误 反 应 次 数 和 主 动 回 避 率 基 本 无 差 异 造 模 第 7 天, 从 错 误 反 应 次 数 显 示, 与 对 照 组 比 较, 模 型 组 明 显 增 多, 有 非 常 显 著 差 异 ( P<0. 01), 疏 肝 补 肾 治 疗 组 也 多 于 对 照 组, 有 显 著 差 异 ( P<0. 05); 与 模 型 组 比 较, 疏 肝 补 肾 治 疗 组 的 错 误 反 应 次 数 明 显 减 少 (P<0. 01) 主 动 回 避 率 结 果 显 示, 与 对 照 组 比 较, 模 型 组 降 低, 具 有 非 常 显 著 差 异 ( P<0. 01); 与 模 型 组 比 较, 疏 肝 补 肾 治 疗 组 增 多, 差 异 非 常 显 著 ( P < 0 郾 01) 说 明 睡 眠 剥 夺 对 机 体 产 生 明 显 的 学 习 记 忆 力 障 碍, 疏 肝 补 肾 方 药 可 调 节 学 习 记 忆 能 力 见 表 1 表 1 摇 各 组 大 鼠 造 模 第 0 7 天 测 试 结 果 ( x 軃 依 s,n = 9) 错 误 反 应 次 数 主 动 回 避 率 (% ) 组 别 0 天 7 天 0 天 7 天 对 照 组 依 依 依 依 模 型 组 依 依 a 依 依 a 疏 肝 补 肾 治 疗 组 依 依 bc 依 依 c 摇 摇 注 : 与 对 照 组 比 较, a P <0. 01; 与 对 照 组 比 较, b P <0. 05; 与 模 型 组 比 较, c P < 摇 血 清 SOD 含 量 结 果 显 示, 与 对 照 组 比 较, 模 型 组 SOD 的 含 量 减 少, 差 异 非 常 显 著 (P<0. 01); 与 模 型 组 比 较, 疏 肝 补 肾 治 疗 组 SOD 含 量 明 显 增 多, 差 异 非 常 显 著 ( P< 0. 01) 说 明 睡 眠 剥 夺 后 机 体 的 SOD 不 能 有 效 的 消 除 应 激 产 生 的 氧 自 由 基, 机 体 组 织 细 胞 损 伤 明 显 加 重, 而 疏 肝 补 肾 中 药 能 显 著 增 多 SOD 的 含 量 见 表 2 表 2 摇 各 组 大 鼠 血 清 学 指 标 的 对 比 ( x 軃 依 s,n = 9) 组 别 超 氧 化 物 歧 化 酶 (U / ml) 对 照 组 依 模 型 组 依 a 疏 肝 补 肾 治 疗 组 依 b 摇 摇 注 : 与 对 照 组 比 较, a P<0. 01; 与 模 型 组 相 比, b P< 摇 前 额 叶 皮 质 BDNF 蛋 白 表 达 变 化 在 冰 冻 切 片 进 行 免 疫 组 织 化 学 检 测 中,BDNF 阳 性 反 应 物 呈 圆 形 软 圆 形 或 梭 形 颗 粒, 染 色 为 棕 黄 色, 分 布 在 胞 浆 中, 所 有 阴 性 对 照 切 片 均 无 特 异 性 着 色 比 较 BDNF 阳 性 反 应 物 平 均 密 度 值, 模 型 和 疏 肝 补 肾 治 疗 组 与 对 照 组 相 比 明 显 减 少, 具 非 常 显 著 差 异 (P<0. 01); 与 模 型 组 比 较, 疏 肝 补 肾 治 疗 组 阳 性 反 应 物 增 多, 具 有 非 常 显 著 差 异 ( P<0. 01) 说 明 睡 眠 剥 夺 减 少 BDNF 在 前 额 叶 皮 质 的 蛋 白 表 达, 而 疏 肝 补 肾 治 疗 组 能 显 著 调 节 BDNF 的 减 少 趋 势 见 表 3 图 1 表 3 摇 大 鼠 前 额 叶 皮 质 BDNF 免 疫 阳 性 反 应 物 的 变 化 ( x 軃 依 s ) 组 别 大 鼠 数 ( 只 ) 平 均 光 密 度 值 对 照 组 依 模 型 组 依 a 疏 肝 补 肾 治 疗 组 依 ab 摇 摇 注 : 与 对 照 组 比 较, a P <0. 01; 与 模 型 组 比 较, b P <0. 01
4 摇 258 环 球 中 医 药 2012 年 4 月 第 5 卷 第 4 期 摇 Global Traditional Chinese Medicine, April 2012,Vol 郾 5, No 郾 4 图 1 摇 各 组 冰 冻 切 片 大 鼠 前 额 叶 皮 质 BDNF 表 达 3 摇 讨 论 BDNF 广 泛 存 在 于 脑 的 各 个 区 域, 以 大 脑 皮 层 和 海 马 居 多 在 成 年 中 枢 系 统,BDNF 的 表 达 受 一 系 列 因 素 的 调 节, 也 表 现 为 以 活 动 依 赖 性 的 方 式 它 是 一 个 重 要 的 能 够 调 节 突 触 可 塑 性, 从 而 影 响 学 习 记 忆 的 中 介 [5],BDNF 依 赖 性 信 号 传 导 途 径 通 过 活 化 TrkB 受 体, 使 水 解 磷 脂 酶 C 磷 脂 酰 环 己 六 醇 激 酶 鄄 3 细 胞 外 信 号 调 节 激 酶 促 细 胞 分 裂 活 性 蛋 白 激 酶 等 的 信 号 通 路 激 活, 通 过 细 胞 内 Ca 2+ 发 挥 作 用, 且 也 调 节 BDNF TrkB mrna 的 转 化 和 蛋 白 向 树 突 的 运 输, 这 些 机 制 是 负 责 蛋 白 翻 译 并 调 节 突 触 传 递 和 突 触 形 成, 从 而 增 强 和 维 持 学 习 记 忆 功 能 [6] [7] Mizun 等 实 验 提 出 BDNF 鄄 TrkB 信 号 通 路 与 N 鄄 甲 基 鄄 D 鄄 天 冬 氨 酸 (NDMA) 受 体 存 有 内 在 联 系, 这 种 联 系 在 海 马 空 间 记 忆 中 起 到 了 重 要 作 用 实 验 结 果 证 明, 与 对 照 组 比 较, 模 型 组 Y 迷 宫 成 绩 下 降, 血 清 SOD 水 平 降 低, 前 额 叶 皮 质 BDNF 免 疫 阳 性 物 质 表 达 显 著 减 少, 说 明 中 长 期 睡 眠 剥 夺 能 造 成 脑 损 伤, 有 可 能 通 过 BDNF 介 导 的 神 经 通 路 影 响 突 触 可 塑 性 ; 经 过 疏 肝 补 肾 方 药 的 干 预, 与 模 型 组 比 较,SOD 增 多, 氧 自 由 基 对 脑 功 能 损 伤 的 趋 势 减 弱,Y 迷 宫 学 习 成 绩 提 高, 同 时 BDNF 在 前 额 叶 皮 质 的 表 达 上 调, 说 明 同 时 应 用 疏 肝 法 和 补 肾 法 能 调 节 机 体 的 代 谢 状 态, 保 护 脑 功 能, 并 通 过 诱 发 长 时 程 增 强 增 强 学 习 记 忆 能 力 在 以 往 的 研 究 中, 多 采 用 安 神 补 脑 补 肾 益 气 的 方 法 改 善 睡 眠 剥 夺 等 应 激 后 所 致 的 学 习 记 忆 能 力 障 碍, 本 研 究 考 虑 到, 睡 眠 剥 夺 作 为 一 种 目 前 生 活 中 常 见 的 应 激 方 式, 肝 主 疏 泄 功 能 的 影 响 贯 穿 整 个 造 模 过 程 中, 可 以 认 为 是 一 种 主 要 的 影 响 因 素, 所 以 本 实 验 设 计 运 用 疏 肝 补 肾 结 合 的 方 法 观 察 大 鼠 学 习 记 忆 能 力 的 改 善 睡 眠 剥 夺 模 型 模 拟 的 是 想 睡 而 不 能 睡 冶 的 病 因 病 理 过 程, 大 鼠 在 睡 眠 剥 夺 箱 内 虽 然 可 以 自 由 活 动 饮 食, 因 受 水 的 刺 激, 欲 逃 窜 的 心 理 很 明 显, 在 笔 者 相 关 试 验 中 也 发 现, 大 鼠 在 睡 眠 剥 夺 期 间 的 攻 击 性 增 强 根 据 中 医 理 论, 肝 主 疏 泄 调 畅 气 机, 所 欲 不 得 冶, 气 血 运 行 不 畅, 诸 阳 气 会 诸 于 头, 气 机 失 调 则 脑 失 濡 养 而 影 响 神 经 相 关 功 能, 所 以 通 过 疏 肝 调 畅 气 机, 肝 肾 同 源, 又 肾 主 骨 生 髓, 脑 为 髓 海, 疏 肝 的 同 时 予 以 补 肾, 则 髓 海 充 养, 学 习 记 忆 功 能 增 强 针 对 实 验 所 复 制 的 造 模 方 法, 本 研 究 首 先 选 用 伤 寒 论 中 的 四 逆 散 以 疏 肝 郁 调 畅 气 机, 正 如 素 问 四 时 刺 逆 从 论 所 述 血 气 上 逆, 令 人 善 忘 冶, 陈 士 铎 在 辨 证 录 中 所 说 气 郁 不 舒, 忽 忽 如 有 所 失, 目 前 之 事 竟 不 记 忆, 乃 肝 气 之 滞 冶, 并 结 合 具 有 补 肾 养 心 作 用 的 生 慧 汤, 通 过 肝 心 肾 的 交 互 作 用, 说 明 睡 眠 剥 夺 过 程 及 造 成 学 习 记 忆 障 碍 的 证 候 应 用 疏 肝 补 肾 方 药 调 节 大 鼠 的 学 习 记 忆 功 能, 影 响 BDNF 的 分 布 和 表 达, 该 通 路 其 他 递 质 受 体 是 否 也 参 与 对 LTP 的 调 节, 待 后 续 研 究 参 考 文 献 [1] 摇 Machado RB, Hip 佼 lide DC, Benedito 鄄 Silva AA, et a1. Sleep deprivation induced by the modified multiple platform technique: quantification of sleep loss and recovery [ J]. Brain Research, 2004, 1004(1 鄄 2):45 鄄 51. [2] 摇 王 跃 春, 王 子 栋, 孙 黎 明, 等. 动 物 学 习 记 忆 能 力 的 Y 鄄 型 迷 宫 测 试 法 [J]. 暨 南 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 与 医 学 版 ),2001,22(5): 137 鄄 140. [3] 摇 王 秀 利, 唐 洪 丽, 索 国 玲. 癫 痫 持 续 状 态 对 发 育 期 大 鼠 学 习 记 忆 及 海 马 磷 酸 化 的 CAMP 反 应 元 件 结 合 蛋 白 表 达 的 影 响 [J]. 实 用 儿 科 临 床 杂 志,2007,22(22):1723 鄄 [4] 摇 邱 前 程, 卢 善 明, 黄 杰 雄, 等. 不 同 固 定 剂 对 冰 冻 切 片 免 疫 组 化 结 果 的 影 响 [J]. 分 子 诊 断 与 治 疗 杂 志,2009,1(4):250 鄄 252. [5] 摇 Musumeci G, Sciarretta C, Rodr 侏 guez 鄄 Moreno A, et al. TrkB Modulates Fear Learning and Amygdalar Synaptic Plasticity by Specific Docking Sites [ J ]. J Neurosci, 2009, 29 ( 32 ):
5 环 球 中 医 药 2012 年 4 月 第 5 卷 第 4 期 摇 Global Traditional Chinese Medicine, April 2012,Vol 郾 5, No 郾 4 摇 鄄 [6] 摇 Poulin B, Butcher A, McWilliams P, et al. The M3 鄄 muscarinic receptor regulates earning and memory in a receptor phosphorylation / arrestin 鄄 dependent manner[ J]. Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(20):9440 鄄 [7] 摇 Angelucci F, Math 佴 AA, Aloe L. Neurotrophic factors and CNS disorders: findings in rodent models of depression and schizophrenia[j]. Pro Brain Res,2004,146(3):151 鄄 165. ( 收 稿 日 期 :2012 鄄 02 鄄 19) ( 本 文 编 辑 : 钮 丽 霞 ) 解 毒 护 肝 饮 药 物 血 清 对 异 烟 肼 致 HepG2 坏 死 和 凋 亡 的 干 预 杨 铂 摇 刘 靓 雯 摇 王 小 利 摇 袁 成 民 摇 安 勇 揖 摘 要 铱 摇 目 的 摇 观 察 解 毒 护 肝 饮 药 物 血 清 对 异 烟 肼 致 人 肝 癌 细 胞 株 ( human hepatocellular carcinoma cell lines,hepg2) 病 变 的 干 预, 并 分 析 其 机 制 方 法 摇 制 备 解 毒 护 肝 饮 和 甘 草 酸 二 铵 的 药 物 血 清, 建 立 异 烟 肼 致 HepG2 细 胞 损 伤 模 型, 以 解 毒 护 肝 饮 和 甘 草 酸 二 铵 药 物 血 清 加 入 HepG2 培 养 液, 观 察 对 HepG2 坏 死 和 凋 亡 的 干 预, 以 及 对 HepG2 Fas / FasL 表 达 的 影 响, 以 评 价 解 毒 护 肝 饮 的 疗 效 机 制 结 果 摇 解 毒 护 肝 饮 药 物 血 清 对 异 烟 肼 致 HepG2 损 伤 有 明 显 抑 制 作 用, 可 以 减 少 HepG2 细 胞 凋 亡 和 坏 死, 并 减 少 其 Fas / FasL 表 达, 效 果 优 于 甘 草 酸 二 铵 胶 囊 组 结 论 摇 以 清 热 利 湿 解 毒 兼 养 阴 化 瘀 为 治 法 的 解 毒 护 肝 饮 有 确 切 的 减 少 异 烟 肼 致 HepG2 坏 死 和 凋 亡 的 作 用, 其 抗 细 胞 凋 亡 作 用 与 减 少 HepG2 的 Fas / FasL 的 表 达 有 关 揖 关 键 词 铱 摇 解 毒 护 肝 饮 ; 摇 药 物 性 肝 炎 ; 摇 异 烟 肼 ; 摇 药 物 血 清 ; 摇 凋 亡 ; 摇 人 肝 癌 细 胞 株 ; 摇 体 外 培 养 ; 摇 Fas / FasL 揖 中 图 分 类 号 铱 摇 R 摇 揖 文 献 标 识 码 铱 摇 A 摇 doi: / j. issn 鄄 郾 007 Effect of Jiedu Hugan Decoction containing serum on the death and apoptosis of HepG2 which were damaged by isoniazid 摇 YANG Bo, LIU Jing 鄄 wen, WANG Xiao 鄄 li, et al. Liver Disease Units, Ji 爷 nan Infectious Hospital,Ji 爷 nan ,China Corresponding author:an Yong,E 鄄 mail:an 鄄 yong666@ 163. com 揖 Abstract 铱 摇 Objective 摇 To observe the effect of Jiedu Hugan Decoction containing serum on HepG2 damaged by isoniazid, and reveal the mechanism of it. Methods 摇 Establish iv votro HepG2 cell damaged by isoniazid culture experiment model. The serum was collected from the rats using Jiedu Hugan Decoction and Gancaosuaneran and incubated with the HepG2 model. After 24 hours, observe the death and apoptosis of HepG2 郾 And the expressions of Fas / FasL were measured by flow cytometry. Results 摇 Culture experiment model of iv votro HepG2 cell damaged by isoniazid was established successfully. Jiedu Hugan Decoction containing serum significantly inhibited apoptosis and necrosis of the HepG2 cells and the expression of Fas / FasL. The curative effect of this is better than control group which were given Gancaosuaneran decoction containing serum. Conclusion 摇 Jiedu Hugan Decoction according to qingre lishi jiedu can evidently reduce the hepatitis by decrease the expression of the factor associated with apoptosis. So it can improve the syndromes and experimental index of hepatitis induced by anti 鄄 tubercular drug. 基 金 项 目 : 财 政 部 国 家 中 医 药 管 理 局 2009 年 中 医 药 行 业 科 研 专 项 ( 鄄 1) 作 者 单 位 : 济 南 市 传 染 病 医 院 ( 杨 铂 刘 靓 雯 袁 成 民 安 勇 ); 济 南 护 理 职 业 学 院 ( 王 小 利 ) 作 者 简 介 : 杨 铂 (1979- ), 硕 士, 主 治 医 师 研 究 方 向 : 中 西 医 结 合 肝 病 传 染 病 的 防 治 E 鄄 mail:optyb@ sina. com 通 讯 作 者 : 安 勇 (1967- ), 硕 士, 主 任 医 师 研 究 方 向 : 中 西 医 结 合 肝 病 传 染 病 的 防 治 E 鄄 mail:an 鄄 yong666@ 163. com
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