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1 通 过 定 点 突 变 增 强 纳 豆 激 酶 的 热 稳 定 性 刘 中 美, 何 孝 天, 崔 文 璟, 周 哲 敏 ( 江 南 大 学 生 物 工 程 学 院, 工 业 生 物 技 术 教 育 部 重 点 实 验 室, 江 苏 无 锡 ) 摘 要 : 血 栓 导 致 的 心 脑 血 管 疾 病 是 当 前 危 害 人 类 健 康 导 致 死 亡 率 最 高 疾 病 之 一, 因 此 近 年 来 溶 栓 药 物 及 具 有 溶 栓 功 能 保 健 食 品 的 研 发 进 展 得 十 分 迅 速 纳 豆 激 酶 因 其 特 有 的 高 效 溶 血 栓 作 用, 成 为 国 内 外 科 研 热 点 之 一 本 研 究 针 对 目 前 纳 豆 激 酶 稳 定 性 的 问 题, 以 纳 豆 激 酶 的 晶 体 结 构 和 序 列 比 对 为 基 础, 通 过 定 点 突 变 构 建 组 纳 豆 激 酶 突 变 体, 对 可 能 影 响 纳 豆 激 酶 热 稳 定 性 的 氨 基 酸 进 行 研 究 在 构 建 的 5 个 突 变 体 中,P14L N76D 两 个 突 变 体 的 热 稳 定 性 有 明 显 提 高, 在 65 下 的 半 衰 期 由 20 min 分 别 提 高 为 30 min 和 50 min 同 源 建 模 和 分 子 动 力 学 研 究 结 果 表 明, 这 两 个 氨 基 酸 位 点 是 通 过 不 同 机 理 对 纳 豆 激 酶 催 化 活 性 以 及 热 稳 定 性 产 生 的 重 要 作 用 本 研 究 可 为 纳 豆 激 酶 的 基 因 工 程 改 造 以 及 其 生 产 和 应 用 提 供 理 论 基 础 和 技 术 支 持 关 键 词 : 纳 豆 激 酶 ; 定 点 突 变 ; 热 稳 定 性 ; 枯 草 芽 孢 杆 菌 文 章 篇 号 : (2015) DOI: /j.mfst Enhancing Thermostability of Nattokinase by Site-directed Mutagenesis LIU Zhong-mei, HE Xiao-tian, CUI Wen-jing, ZHOU Zhe-min (The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi , China) Abstract: Cardiovascular and cerebrovascular diseases caused by thrombi are often life-threatening, contributing to the highest mortality rate. This has fuelled rapid development of thrombolytic drugs and functional foods with thrombolytic activity in the past few years. Due to its strong thrombolytic effect, nattokinase (NK) has become the focus of international interest. The aim of this study was to enhance the thermostability of NK. Based on its sequence alignments and crystal structure, NK mutants were prepared by site-directed mutagenesis and the amino acids that might affect NK thermostability were studied. Among the five mutants generated in this study, P14L and N76D showed significantly increased thermostability and their half-life at 65 improved from 20 min (wild type) to 30 and 50 min, respectively. Homology modeling and molecular dynamics analysis showed that two amino acid sites influenced thermostability and catalytic activity of NK through different mechanisms. This study provides a theoretical and technical basis for the genetic reconstruction, production, and application of NK. Key words: nattokinase; site-directed mutagenesis; thermostability; Bacillus subtilis 纳 豆 激 酶 是 由 日 本 传 统 发 酵 食 品 纳 豆 发 酵 而 生 成 的 纳 豆 激 酶 以 其 特 有 的 溶 栓 功 效 很 快 成 为 国 内 外 保 健 食 品 的 研 究 与 开 发 的 热 点 1987 年, 日 本 学 者 须 见 洋 行 等 首 次 从 纳 豆 中 分 离 纯 化 得 到 一 种 具 有 高 效 溶 血 栓 作 用 的 蛋 白 酶, 因 其 与 链 激 酶 尿 激 酶 等 溶 血 栓 药 物 具 有 同 样 的 功 能, 故 最 初 被 命 名 为 纳 豆 激 酶 (nattokinase,nk) [1] 纳 豆 激 酶 以 其 特 有 的 溶 栓 功 效 很 快 成 为 国 内 外 的 科 研 热 点 自 从 1987 年 被 发 现 以 后, 其 分 子 水 平 的 研 究 取 得 了 很 大 进 展 :1992 年 Nakamura 首 次 报 道 了 其 基 因 序 列 转 录 调 控 区 域 [2] ; 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 留 学 回 国 人 员 科 研 启 动 基 金 ( 第 47 批 );863 科 技 计 划 项 目 (2014AA02130) 作 者 简 介 : 刘 中 美 (1978-), 女, 博 士, 副 教 授, 研 究 方 向 : 生 物 酶 学 蛋 白 质 工 程 通 讯 作 者 : 周 哲 敏 (1969-), 男, 博 士, 教 授, 研 究 方 向 : 生 物 酶 学 发 酵 工 程 随 后, 其 活 性 位 点 底 物 结 合 位 点 催 化 机 制 重 要 酶 学 性 质 等 都 得 到 了 深 入 解 析 与 研 究 [3] ; 通 过 定 点 突 变 技 术 等 对 纳 豆 激 酶 进 行 分 子 改 造, 使 其 酶 活 力 半 衰 期 热 稳 定 性 均 得 到 了 不 同 程 度 的 提 高 [4~5] 2010 年 Yanagisawa 等 人 获 得 了 纳 豆 激 酶 结 晶, 使 其 三 维 晶 体 结 构 得 到 解 析 [6] 对 于 纳 豆 激 酶 基 因 工 程 方 面 的 研 究 也 有 诸 多 报 道 1999 年, 刘 北 域 等 从 纳 豆 芽 孢 杆 菌 基 因 组 中 扩 增 了 纳 豆 激 酶 原 基 因 和 全 长 基 因, 实 现 了 纳 豆 激 酶 在 大 肠 杆 菌 中 的 表 达 ;2002 年 该 课 题 组 又 构 建 了 穿 梭 表 达 质 粒, 实 现 了 枯 草 芽 孢 杆 菌 中 的 成 功 表 达 2013 年 [7] Nguyen 等 采 用 基 因 工 程 方 法 克 隆 了 来 源 于 Bacillus subtilis VTCC-DVN 的 纳 豆 激 酶 基 因 并 在 缺 陷 型 菌 株 WB800 中 进 行 了 高 效 表 达 本 课 题 组 也 已 通 过 信 号 肽 筛 选 构 建 了 重 组 纳 豆 激 酶 的 高 效 分 泌 表 达 质 粒, 表 达 量 达 到 190 mg/l [8] 本 研 究 旨 在 通 过 分 子 改 造 提 高 纳 豆 激 酶 的 热 稳 定 37

2 性, 将 有 助 于 在 工 艺 生 产 高 温 环 节 中 保 证 酶 活, 并 延 长 其 在 机 体 内 的 作 用 时 间, 促 进 纳 豆 激 酶 作 为 溶 栓 剂 [9] 的 开 发 与 应 用 Zhao 等 通 过 Staggered Extension process( 交 错 延 伸 技 术,StEP) 技 术 获 得 热 稳 定 性 有 显 著 提 高 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 蛋 白 酶 E(subtilisin E), 并 对 subtilisin E 的 热 稳 定 性 具 有 促 进 作 用 的 突 变 点 进 行 了 归 纳 总 结 纳 豆 激 酶 同 subtilisin E 均 有 276 个 氨 基 酸, 同 源 性 高 达 99% 本 研 究 参 照 Zhao 等 的 实 验 结 果, 对 纳 豆 激 酶 进 行 定 点 突 变 以 期 提 高 热 稳 定 性 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 与 试 剂 菌 株 与 质 粒 枯 草 芽 孢 杆 菌 WB600 Escherichia coli JM109 质 粒 载 体 pma0911 均 由 本 实 验 室 保 存 试 剂 与 仪 器 Pfu DNA 聚 合 酶 购 自 日 本 宝 生 物 工 程 ( 大 连 ) 有 限 公 司, 质 粒 DNA 提 取 试 剂 盒 胶 回 收 试 剂 盒 和 PCR 产 物 纯 化 试 剂 盒 均 购 自 上 海 生 物 工 程 公 司, 凝 血 酶 牛 纤 维 蛋 白 原 巴 比 妥 钠 购 自 Sigma 公 司, 其 它 试 剂 均 为 国 产 或 进 口 分 析 纯 AKTAXPRESS 蛋 白 纯 化 系 统, 通 用 电 气 ( 中 国 ) 医 疗 器 械 集 团 ;HiTrap SP HP (1mL), 通 用 电 气 ( 中 国 ) 医 疗 器 械 集 团 ;UV1100 紫 外 - 可 见 分 光 光 度 计, 上 海 美 谱 达 仪 器 有 限 公 司 枯 草 芽 孢 杆 菌 表 达 培 养 基 成 分 为 :12 g/l 蛋 白 胨 24 g/l 酵 母 粉 4 ml/l 甘 油 2.3 g/l KH 2 PO g/l K 2 HPO 4 3H 2 O 0.2 g/l CaCl 方 法 定 点 突 变 表 1 点 突 变 引 物 序 列 Table 1 Primer sequences for site-directed mutagenesis Mutants Sequence (5-3 ) S9F-F S9F-R P14L-F P14L-R S37T-F S37T-R N76D-F N76D-R S161C-F GTTCCTTATGGCATTTTTCAA ATTAAAGC GCGCTTTAATTTGAAAAATGCCATAAGG CTCAAATTAAAGCGCTGGCTCTTCACTC CCTTGAGAGTGAAGAGCCAGCGCTTTAATTTG CGACAGCGGAATTGACACGTCTCATCC CGTTTAAGTCAGGATGAGACGTGTCAATTCC CGATTGCCGCTCTTGATAACTCAATCG CAGAACACCGATTGAGTTATCAAGAGCGGC CGAAGGTTCATCCGGATGCACAAGCACAGTC S161C-R GTAGCCGACTGTGCTTGTGCATCCGGATGA ACC 注 : 突 变 位 点 为 下 划 线 部 分 以 质 粒 载 体 pma0911-wapa-pro-nk [8] 为 模 板 设 计 引 物 ( 表 1) 进 行 全 质 粒 扩 增, 将 所 获 得 PCR 产 物 用 Dpn I 消 化 甲 基 化 模 版 pma09-wapa-pro-nk 后, 转 化 入 E. coli JM109 中, 得 到 突 变 体 S9F P14L N76D S37T S161C, 以 上 所 有 质 粒 均 经 过 测 序 验 证 重 组 质 粒 在 枯 草 杆 菌 表 达 系 统 中 的 表 达 及 纯 化 将 测 序 正 确 的 重 组 质 粒 转 化 枯 草 芽 孢 杆 菌 WB600, 挑 取 平 板 单 菌 落, 接 种 于 5 ml 含 100 g/ml 卡 那 霉 素 的 表 达 培 养 基 中, r/min 振 荡 过 夜 培 养 将 1 ml 上 述 过 夜 培 养 物 接 种 于 100 ml 含 100 g/ml 卡 那 霉 素 的 表 达 培 养 基 中, r/min 振 荡 培 养 至 48 h 左 右 8000 r/min 离 心 后 留 取 上 清 进 行 硫 酸 铵 盐 析, 收 集 硫 酸 铵 饱 和 度 40%~60% 下 的 蛋 白 沉 淀 于 Buffer A(20 mm 磷 酸 盐 缓 冲 液,pH 6.0) 过 夜 透 析, 经 过 阳 离 子 交 换 层 析 柱 HiTrap SP HP 纯 化 目 的 蛋 白, 采 用 Buffer B( 含 有 1 M NaCl 的 20 mm 磷 酸 盐 缓 冲 液,pH 6.0) 进 行 线 性 洗 脱 按 峰 来 收 集 样 品, 将 收 集 的 样 品 进 行 SDS-PAGE 及 活 性 分 析 蛋 白 质 定 量 采 用 常 规 的 Bradford 法, 采 用 牛 血 清 蛋 白 为 标 准 蛋 白 热 稳 定 性 提 高 突 变 体 的 初 步 筛 选 纤 维 蛋 白 平 板 的 制 备 参 照 文 献 [10], 于 制 作 好 的 纤 维 蛋 白 平 板 上 打 孔 取 各 突 变 重 组 质 粒 及 原 始 重 组 质 粒 在 枯 草 芽 孢 杆 菌 WB 600 中 表 达 48 h 后 的 发 酵 上 清 液 100 L, 于 65 下 热 处 理 30 min 于 制 作 好 的 纤 维 蛋 白 平 板 上 打 孔, 每 孔 点 样 热 处 理 后 的 样 品 各 20 L, 37 下 温 育 5 h, 比 较 形 成 的 透 明 圈 的 大 小 原 始 纳 豆 激 酶 及 突 变 体 在 65 下 热 稳 定 性 的 测 定 取 适 量 纳 豆 激 酶 以 及 各 突 变 体 的 纯 酶 液 溶 解 于 Tris-HCl(pH 8.0) 缓 冲 液 中, 在 65 下 分 别 孵 育 min, 采 用 紫 外 分 光 光 度 计 法 测 定 剩 余 的 酶 活 将 最 高 的 酶 活 力 定 义 为 100%, 并 以 相 对 酶 活 的 百 分 比 对 时 间 作 图 紫 外 分 光 光 度 计 法 测 定 酶 活 紫 外 分 光 光 度 计 法 测 定 纳 豆 激 酶 活 性 参 照 日 本 纳 豆 激 酶 协 会 建 立 的 方 法 ( jnka_nk_english.html), 并 稍 作 改 进 取 1.4 ml 50 mm Tris-HCl(pH 8.0) 缓 冲 液 与 0.4 ml 0.72%(m/V) 的 纤 维 蛋 白 原 溶 液 混 匀 后,37 放 置 5 min 向 上 述 溶 液 中 加 入 0.1 ml 凝 血 酶 溶 液 (20 U/mL) 充 分 混 匀, 37 放 置 10 min 再 向 上 述 反 应 体 系 中 加 入 0.1 ml 稀 释 的 酶 液 充 分 混 匀, 于 37 水 浴 中 保 温 反 应, 分 38

3 别 在 反 应 开 始 后 的 20 min 和 40 min 时, 分 别 混 匀 10 s 在 准 确 计 时 60 min 后 加 入 2 ml 0.2 mol/l 的 三 氯 乙 酸 终 止 反 应, 并 在 37 水 浴 中 再 保 温 20 min 上 述 反 应 液 于 r/min 下 离 心 10 min, 测 定 离 心 上 清 液 在 275 nm 处 的 吸 光 值 一 个 酶 活 力 单 位 (FU) 定 义 为 在 37 ph 8.0 的 条 件 下, 每 分 钟 在 275 nm 处 吸 光 值 变 化 0.01 所 需 的 酶 量 比 酶 活 定 义 : 每 mg 蛋 白 所 含 的 酶 活 力 单 位 数, 即 比 活 力 = 活 力 FU/mg 蛋 白 同 源 建 模 与 分 子 动 力 学 分 析 以 蛋 白 质 数 据 库 中 纳 豆 激 酶 的 晶 体 结 构 (PDB: 4DWW) 为 模 板, 采 用 Discovery Studio 进 行 同 源 建 模, 建 模 之 后 用 分 子 模 拟 手 段 对 结 果 进 行 修 正 对 模 拟 好 的 结 构 用 namd 软 件 进 行 分 子 动 力 学 模 拟 分 析 其 步 骤 是 先 加 大 小 合 适 的 水 盒 子, 再 使 体 系 呈 电 中 性, 然 后 进 行 体 系 能 量 最 小 化, 最 后 是 实 际 的 计 算 机 分 子 动 力 学 运 算 一 般 来 讲 体 系 运 行 得 时 间 越 长 越 可 信, 本 实 验 中 体 系 在 平 衡 相 中 能 量 优 化 至 少 超 过 5 ns, 条 件 允 许 的 话 要 重 复 进 行 分 子 动 力 学 分 析, 以 确 保 模 拟 结 果 的 准 确 度 对 动 力 学 的 结 果, 采 用 vmd 软 件 分 析, 然 后 用 Pymol 作 图 2 结 果 与 讨 论 2.1 热 稳 性 改 造 突 变 点 设 计 图 2 重 组 纳 豆 激 酶 的 纤 溶 活 性 分 析 Fig.2 Fibrinolytic activity of wild-type nattokinase and mutants 注 :1- 原 始 纳 豆 激 酶 ( 对 照 );2-S9F;3-P14L;4-N76D;5-S37T; 6-S161C 2.3 突 变 体 P14L N76D 的 纯 化 与 热 稳 定 性 测 定 本 研 究 参 照 Huimin Zhao 等 的 实 验 结 果, 将 纳 豆 激 酶 与 subtilisin E 进 行 氨 基 酸 序 列 比 对 ( 图 1), 在 其 中 选 取 了 5 个 氨 基 酸 位 点 进 行 突 变 图 3 纳 豆 激 酶 突 变 体 纯 化 SDS-PAGE Fig.3 SDS-PAGE results for purified nattokinase mutants 注 :M- 蛋 白 分 子 量 标 准 ;1-P14L;2-N76D 图 1 氨 基 酸 序 列 比 对 Fig.1 Sequence alignment of nattokinase and subtilisin E 注 : 表 示 突 变 位 点 2.2 突 变 体 初 步 筛 选 突 变 体 及 原 始 酶 在 65 热 处 理 30 min 后 酶 活 情 况 如 图 2 所 示 由 结 果 可 见, 突 变 体 P14L N76D 热 处 理 后 其 活 性 与 原 始 酶 及 其 它 三 个 突 变 体 相 比 较 高, 于 是 选 择 这 两 个 突 变 体 作 为 进 一 步 研 究 对 象 图 4 野 生 型 及 各 突 变 体 在 65 C 下 的 热 稳 定 性 Fig.4 Thermostability of wild-type and mutant nattokinases 将 突 变 体 P14L N76D 进 行 分 离 纯 化, 利 用 Hitrap SP HP 阳 离 子 交 换 柱 经 过 一 步 纯 化 即 可 得 到 较 纯 的 目 的 蛋 白 ( 图 3) 原 始 纳 豆 激 酶 及 突 变 体 P14L 和 N76D 在 65 下 孵 育 不 同 时 间 后, 其 酶 活 变 化 如 图 3 所 示 由 实 验 结 果 可 以 看 出, 原 始 酶 在 65 下 的 半 衰 期 约 为 20 min( 半 衰 期 是 以 10 min 为 单 位 测 定 ),N76D 突 变 体 在 65 下 的 半 衰 期 延 长 至 30 min 以 上,P14L 39

4 突 变 体 半 衰 期 约 为 50 min, 为 原 始 酶 的 2.5 倍 两 个 增 强 另 一 方 面,76 位 的 Asn 突 变 为 带 有 负 电 荷 的 突 变 体 的 热 稳 定 性 有 了 显 著 提 高 Asp, 可 能 增 强 了 Ca 2+ 与 结 合 位 点 的 静 电 吸 引, 从 而 2.4 突 变 体 P14L N76D 比 酶 活 测 定 提 高 了 热 稳 定 性 表 2 突 变 体 酶 活 测 定 Table 2 Specific activity of mutant nattokinases 纳 豆 激 酶 比 酶 活 /[FU/mg] 相 对 酶 活 /% P14L 684±41 65 N76D 736±52 70 Wild-type 1052± 突 变 体 P14L N76D 的 酶 活 性 有 不 同 程 度 的 损 失 比 酶 活 测 定 结 果 如 表 2 所 示,P14L N76D 突 变 体 比 酶 活 分 别 为 原 始 酶 的 65% 和 70%, 表 明 这 两 个 氨 基 酸 位 点 对 于 纳 豆 激 酶 的 催 化 活 性 也 具 有 一 定 的 影 响 2.5 热 稳 定 性 提 高 的 突 变 酶 的 耐 热 机 理 分 析 根 据 纳 豆 激 酶 的 晶 体 结 构, 如 图 5a 所 示,Pro14 为 刚 性 氨 基 酸, 与 周 围 氨 基 酸 之 间 不 存 在 相 互 作 用 将 14 位 的 Pro 突 变 为 Leu, 通 过 同 源 建 模 ( 图 5b) 发 现,14 位 的 Leu 与 17 位 的 His 之 间 存 在 氢 键 相 互 作 用, 使 得 14 位 的 Leu 参 与 形 成 螺 旋 同 时 14 位 的 Pro 突 变 为 Leu 之 后,Pro 所 在 区 域 由 转 角 结 构 (Turn) 转 变 为 loop 结 构, 稳 定 了 原 来 Turn 区 两 侧 的 螺 旋, 从 而 其 热 稳 定 性 有 一 定 程 度 的 提 高 图 6 原 始 酶 及 N76D 突 变 体 的 三 维 结 构 Fig.6 Three-dimensional crystal structures of wild-type and the mutant nattokinase, N76D 注 :a: 原 始 酶, 蓝 色 球 表 示 Ca 2+ ;b:n76d 3 结 论 本 研 究 通 过 定 点 突 变 构 建 重 组 纳 豆 激 酶 突 变 体, 阐 述 了 两 个 氨 基 酸 位 点 对 于 纳 豆 激 酶 催 化 活 性 以 及 热 稳 定 性 具 有 重 要 作 用 经 过 初 步 筛 选 得 到 两 株 热 稳 定 性 显 著 提 高 的 突 变 体 P14L 和 N76D, 但 是 两 者 的 比 酶 活 有 不 同 程 度 的 下 降 虽 有 研 究 报 道, 通 过 定 点 突 变, 酶 的 热 稳 定 性 和 催 化 活 性 同 时 得 到 改 善, 但 以 热 稳 定 性 提 高 伴 随 催 化 活 性 降 低 居 多 [11] 因 为 酶 的 催 化 活 性 建 立 在 空 间 构 象 的 柔 性 的 基 础 上 的, 而 热 稳 定 性 则 需 要 构 象 具 有 刚 性, 以 抵 御 外 力 ( 高 温 钝 化 作 用 ) 的 破 坏 [12] 因 此 在 很 多 情 况 下, 一 个 酶 的 活 性 和 其 热 稳 定 性 是 一 种 此 消 彼 长 的 关 系, 本 研 究 的 结 果 也 与 之 符 合 参 考 文 献 [1] Sumi H, Hamada H, Tsushima H, et al. A noval fibrinolytic enzyme in the vegetable cheese natto: a typical land popular 图 5 原 始 酶 及 P14L 突 变 体 三 维 结 构 Fig.5 Three-dimensional crystal structures of wild-type and the mutant nattokinase, P14L 注 :a: 原 始 酶 ;b:p14l 枯 草 芽 孢 杆 菌 蛋 白 酶 一 个 共 有 特 征 即 是 含 有 一 或 两 个 Ca 2+ 结 合 位 点, 与 Ca 2+ 结 合 可 影 响 热 失 活 速 度 根 据 纳 豆 激 酶 的 晶 体 结 构, 可 知 在 原 始 纳 豆 激 酶 当 中 76 位 Asn 的 O δ1 和 2 位 Gln 的 N ε2 之 间 形 成 氢 键, 同 时 2 位 的 Gln 与 Ca 2+ 之 间 也 存 在 一 定 的 相 互 作 用 ( 图 6a) 通 过 同 源 建 模 发 现,76 位 Asn 突 变 为 Asp 导 致 与 2 位 的 Gln 之 间 氢 键 缺 失 ( 图 6b) 一 方 面, 这 可 能 赋 予 了 2 位 Gln 更 大 的 柔 性, 更 有 利 于 2 位 Gln 与 Ca 2+ 之 间 相 互 作 用, 从 而 使 突 变 体 N76D 的 热 稳 定 性 得 到 soybean food in the Japanese diet [J]. Experientia, 1987, 43(20): [2] Nakamura T, Yamagata Y, Ichishima E. Nucleotide sequence of the Subtilisin NAT gene, aprn, of Bacillus subtilis (natto) [J]. Biosci Biotech Biochem, 1992, 56(11): [3] 须 见 洋 行, 马 场 健 史, 岸 丁 明 纳 豆 中 のづロウキナゼ 活 性 化 酵 素 と 血 栓 溶 解 能 [J]. 日 本 食 品 科 学 工 学 会 志, 1996, 43(10):46-49 Sumi H, Banba T, Kishitei A. Pro-urokinase activation enzyme and thrombolysis ability in natto beans [J]. Journal of Japanese Food Science, 1996, 43(10):46-49 [4] Zheng ZL, Ye MQ, Zuo ZY, et al. Probing the importance of hydrogen bonds in the active site of the subtilisin nattokinase 40

5 by site-directed mutagenesis and molecular dynamics 30(5): simulation [J]. Biochem. J., 2006, 395(3): [9] Zhao H, Arnold F H. Directed evolution converts subtilisin E [5] Yongjun C, Wei B, Shujun J, et al. Directed evolution into a functional equivalent of thermitase [J]. Protein Eng., improves the fibrinolytic activity of nattokinase from Bacillus 1999, 12(1): natto [J]. FEMS Microbiol. Lett., 2011, 325(2): [10] Weng M, Zheng Z, Bao W, et al. Enhancement of oxidative [6] Yanagisawa Y, Chatake T, Chiba-Kamoshida K, et al. stability of the subtilisin nattokinase by site-directed Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction mutagenesis expressed in Escherichia coli [J]. Biochim. experiment of nattokinase from Bacillus subtilis natto [J]. Acta Biophys. Acta, 2009, 1794(11): Crystallographica Section F Structural Biology and [11] Martin A R, DiSanto R, Plotnikov I, et al. Improved activity Crystallization Communications, 2010, 66(12): and thermostability of (S)-aminotransferase by error-prone [7] Nguyen TT, Quyen TD, Le HT. Cloning and enhancing polymerase chain reaction for the production of a chiral amine production of a detergent- and organic-solvent-resistant [J]. Biochem. Eng. J., 2007, 37(3): nattokinase from Bacillus subtilis VTCC-DVN by using [12] 秦 久 福. 通 过 体 外 分 子 进 化 技 术 提 高 淀 粉 液 化 芽 孢 杆 菌 an eight-protease-gene-deficient Bacillus subtilis WB800 [J]. BS5582-1,3-1,4- 葡 聚 糖 酶 热 稳 定 性 的 研 究 [D]. 无 锡 : 江 南 Microb. Cell Fact, 2013, 12: 79 大 学,2010 [8] 何 孝 天, 刘 中 美, 崔 文 璟, 周 哲 敏. 介 导 纳 豆 激 酶 分 泌 表 达 的 信 QIN Jiu-Fu. Study on improving thermostability of 号 肽 比 较 [J]. 现 代 食 品 科 技,2014,30(5): ,3-1,4-glucanase from Bacillus amyloliquefaciens BS5582 HE Xiao-Tian, LIU Zhong-Mei, CUI Wen-Jin, et al. by molecular directed evolution [D]. Wuxi: Jiangnan Comparison of signal peptides for nattokinase secretory University, 2010 expression [J]. Modern Food Science and Technology, 2014, 41

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