2012 年 第 1 期 叶 胜 蓝 等 : 土 壤 放 线 菌 P3-2 的 分 类 鉴 定 及 抗 菌 活 性 研 究 157 对 活 性 成 分 的 抗 菌 谱 进 行 了 初 步 研 究 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 供 试 菌 种 放 线 菌 菌 株 P3-2 系 本
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1 研 究 报 告 生 物 技 术 通 报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012 年 第 1 期 土 壤 放 线 菌 P3-2 的 分 类 鉴 定 及 抗 菌 活 性 研 究 叶 胜 蓝 汪 江 峰 黄 剑 ( 贵 州 大 学 精 细 化 工 研 究 开 发 中 心 教 育 部 绿 色 农 药 与 农 业 工 程 重 点 实 验 室, 贵 阳 ) 摘 要 : 对 从 贵 州 土 壤 微 生 物 中 筛 选 到 的 放 线 菌 菌 株 P3-2 进 行 了 分 类 学 和 抗 菌 活 性 的 研 究 采 用 多 相 分 类 法, 对 该 菌 株 的 形 态 特 征 培 养 特 征 生 理 生 化 特 性 以 及 16S rdna 基 因 序 列 进 行 了 研 究 结 果 表 明, 放 线 菌 P3-2 菌 株 属 于 链 霉 菌 属 ;16S rdna 序 列 长 度 为 bp, 序 列 分 析 和 系 统 进 化 树 分 析 表 明 其 序 列 与 Streptomyces recifenis ST100 的 同 源 性 最 高, 为 99.4% 但 与 S. recifenis ST100 相 比 较,P3-2 菌 株 的 培 养 特 征 和 生 理 生 化 特 性 中 多 项 指 标 都 存 在 着 不 同, 初 步 确 定 菌 株 P3-2 为 链 霉 菌 属 中 S. recifenis ST100 的 一 个 亚 种, 暂 定 名 为 Streptomyces sp. P3-2 P3-2 菌 株 的 10 倍 稀 释 发 酵 液 对 油 菜 菌 核 病 菌 黄 瓜 灰 霉 病 菌 小 麦 赤 霉 病 菌 水 稻 纹 枯 病 菌 及 半 夏 立 枯 病 菌 的 抑 制 率 高 达 99%, 对 烟 灰 霉 病 菌 玉 米 小 斑 病 菌 等 9 种 病 原 真 菌 均 有 不 同 程 度 的 抑 制 作 用, 对 金 黄 色 葡 萄 球 菌 蜡 状 芽 孢 杆 菌 和 枯 草 芽 孢 杆 菌 有 一 定 的 抑 制 作 用 关 键 词 : 放 线 菌 P3-2 链 霉 菌 菌 株 鉴 定 抗 菌 活 性 Identification and Antibacterial Activity of Actinomycetes P3-2 in Soil Ye Shenglan Wang Jiangfeng Huang Jian (Research and Development Center of Fine Chemicals,Guizhou University,Key Laboratory of Green Pesticide and Bioengineering, Ministry of Education,Guiyang ) Abstract: Actinomycete strain P3-2 obtained and screened from soil in Guizhou province was studied for its taxonomy and antimicrobial activity. Polyphasic taxonomy was adopted to study its morphological characteristics, cultural characteristics, physiological and biochemical properties as well as 16S rdna gene sequence. The morphological and cultural studies showed that strain P3-2 belonged to the streptomyces and designated as Streptomyces sp. P3-2; 16S rdna sequence is bp in length. Its sequence and phylogenetic tree analysis showed that it shared highest homology with S.recifenis ST 100 sequence. The fermention products of this strain was diluted 10 times and had an inhibition of 99% against Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Thanatephorus cucumeris, Rhizoctonia solani, and had a comprehensive inhibition effects against Alternaria alternata, Bipolaris maydis. Also, there was a certain inhibition against Staphylococcus aureus, Bacillus cereus and Bacillus subtilis, but no effect against Escherichia coil. Key words: Actinomycete P3-2 Streptomyces Identification Antibacterial activity 土 壤 中 的 放 线 菌 是 拥 有 巨 大 应 用 价 值 的 一 类 微 生 物 类 群, 能 产 生 多 种 有 益 代 谢 产 物 且 具 有 很 高 经 济 价 值,80% 的 抗 生 素 来 源 于 放 线 菌, 特 别 是 链 霉 菌 属 [1] 到 目 前 为 止, 从 放 线 菌 中 发 现 的 具 有 生 物 活 性 的 物 质 大 约 有 种, 大 约 占 整 个 天 然 生 物 活 性 物 质 的 50%, 其 中 仅 仅 从 链 霉 菌 一 个 属 就 发 现 近 万 种 [2] 因 此, 放 线 菌 的 研 究 具 有 十 分 重 要 的 [3, 科 学 价 值 和 实 用 价 值 4] 拮 抗 性 放 线 菌 的 筛 选 与 分 离 是 新 农 药 和 新 医 药 开 发 的 基 础 在 对 贵 州 省 多 个 地 区 土 壤 进 行 拮 抗 放 线 菌 的 筛 选 过 程 中, 发 现 并 分 离 得 到 一 株 具 有 较 高 农 用 抗 菌 活 性 的 放 线 菌 菌 株 P3-2, 该 菌 株 发 酵 产 物 中 抗 菌 物 质 对 温 度 光 照 不 敏 感, 对 酸 稳 定, 仅 碱 性 条 件 下 稳 定 性 稍 差 [5], 对 多 种 植 物 病 原 真 菌 均 有 较 强 的 抑 制 作 用 本 文 旨 在 对 该 菌 株 的 形 态 特 征 培 养 特 征 生 理 生 化 特 性 以 及 16S rdna 序 列 进 行 研 究, 以 确 定 其 分 类 地 位, 并 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 贵 州 省 科 技 工 业 攻 关 项 目 ( 黔 科 合 GY 字 (2006)3011), 贵 州 大 学 引 进 人 才 项 目 基 金 项 目 作 者 简 介 : 叶 胜 蓝, 女, 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 : 农 药 学 ; yeshenglan0327@163.com 通 讯 作 者 : 黄 剑, 男, 教 授, 研 究 方 向 : 农 药 毒 理 学 和 天 然 产 物 ; jhuang66@163.com
2 2012 年 第 1 期 叶 胜 蓝 等 : 土 壤 放 线 菌 P3-2 的 分 类 鉴 定 及 抗 菌 活 性 研 究 157 对 活 性 成 分 的 抗 菌 谱 进 行 了 初 步 研 究 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 供 试 菌 种 放 线 菌 菌 株 P3-2 系 本 实 验 室 研 究 人 员 从 贵 州 省 山 区 cm 深 度 土 层 中 分 离 纯 化 得 到, 接 种 于 高 氏 一 号 培 养 基,4 保 存 供 试 病 原 菌 供 试 植 物 病 原 真 菌 14 种 和 供 试 细 菌 4 种, 由 贵 州 大 学 教 育 部 绿 色 农 药 与 生 物 工 程 重 点 实 验 室 提 供 培 养 基 形 态 特 征 培 养 特 征 以 及 生 理 生 化 特 性 试 验 所 用 培 养 基 均 采 用 放 线 菌 培 养 分 类 鉴 定 常 规 培 养 基 [6,7] 抑 菌 活 性 培 养 基 根 据 微 生 物 学 实 验 手 册 配 制 [8] 试 剂 PCR 反 应 试 剂 DNA Marker(DL2000) 琼 脂 糖 和 DNA 回 收 试 剂 盒 均 购 自 宝 生 物 工 程 ( 大 连 ) [9] 有 限 公 司 ; 菌 株 16S rdna 的 扩 增 采 用 通 用 引 物 Primer fd1:5'-agagtttgatcctggctcag-3'; PrimerrP2:5'- aaggaggtgatccagccgca-3', 由 北 京 三 博 远 志 生 物 技 术 有 限 公 司 合 成 1.2 方 法 菌 株 的 初 步 鉴 定 1 形 态 特 征 : 采 用 插 片 法, 将 菌 株 用 高 氏 一 号 培 养 基 培 养,28 培 养 7 d, 观 察 并 记 录 菌 落 特 征 取 插 片 用 OlympusBH-2 光 学 显 微 镜 高 倍 镜 观 察 菌 丝 体 形 态, 并 用 电 子 显 微 镜 扫 描 样 品 2 培 养 特 征 : 按 国 际 链 霉 菌 计 划 (ISP) 所 推 荐 培 养 基, 将 菌 株 接 种 于 高 氏 一 号 等 7 种 培 养 基 上, 28 恒 温 培 养, 分 别 在 7 d 14 d 21 d 观 察 气 生 菌 丝 基 内 菌 丝 可 溶 性 色 素 的 颜 色 及 表 观 特 征 ;3 生 理 生 化 特 性 : 参 考 文 献 [10] 所 推 荐 的 培 养 基 和 方 法 [7] 4 16S rdna 序 列 分 析 : 采 用 酶 解 法 提 取 放 线 菌 基 因 组 总 DNA, 并 对 其 16S rdna 序 列 进 行 PCR 扩 增, 扩 增 反 应 条 件 :94 预 变 性 5 min, 然 后 94 使 DNA 变 性 1 min,56 退 火 1 min,72 延 伸 1 min, 共 35 个 循 环, 循 环 结 束 后 72 延 伸 5 min [11] 扩 增 反 应 经 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 得 到 一 条 1.5 kb 左 右 的 条 带 扩 增 片 段 用 DNA 回 收 试 剂 盒 进 行 回 收 回 收 的 DNA 片 段 送 北 京 三 博 远 志 生 物 技 术 有 限 公 司 测 序 采 用 ClustalX2.0 软 件 对 所 测 得 的 16S rdna 序 列 进 行 人 工 严 格 校 对 将 校 对 后 的 16S rdna 序 列 提 交 到 NCBI 的 GenBank 数 据 库 进 行 BLAST 比 较, 调 出 同 源 性 大 于 97 % 以 上 的 相 关 种 属 的 序 列 信 息, 将 其 与 GenBank 中 的 参 考 菌 株 的 16S rdna 序 列 进 行 比 较 分 析 采 用 ClustalX2.0 软 件 进 行 多 序 列 匹 配 排 列, 通 过 MEGA4.0 软 件 进 行 系 统 进 化 树 的 构 建 生 物 活 性 测 定 选 择 多 种 植 物 病 原 真 菌 和 细 菌 作 为 供 试 菌, 将 菌 株 P3-2 的 发 酵 液 稀 释 10 倍, [12] 分 别 用 抑 制 生 长 速 率 法 和 管 碟 法 进 行 抗 菌 谱 的 测 定 2 结 果 2.1 形 态 及 培 养 特 征 观 察 在 高 氏 一 号 培 养 基 上, 放 线 菌 P3-2 菌 株 的 气 生 菌 丝 生 长 较 好, 孢 子 丝 成 螺 旋 型, 基 内 菌 丝 生 长 较 好, 无 横 断 ( 图 1) 其 生 长 形 态 呈 现 典 型 的 链 霉 菌 形 态 特 征 生 长 周 期 相 对 较 短,28 时 培 养 1-2 d 时, 气 生 菌 丝 非 常 少 ;3 d 时 菌 落 呈 白 色, 基 内 菌 丝 无 色 ; 培 养 5 d 时 菌 落 呈 浅 灰 色, 基 内 菌 丝 黄 色 ; 培 养 到 7 d 时, 气 生 菌 丝 生 长 繁 茂, 菌 落 呈 灰 色, 基 内 菌 丝 呈 红 褐 色, 无 可 溶 性 色 素 产 生 电 镜 扫 描 结 果 ( 图 2) 显 示,P3-2 菌 株 孢 子 丝 较 长, 孢 子 成 指 骨 形, 表 面 不 光 滑, 有 皱 褶 A. 孢 子 丝 ;B. 菌 丝 图 1 菌 株 P3-2 的 形 态 特 征 (400 ) A. 孢 子 图 2 菌 株 P3-2 的 孢 子 结 构 ( )
3 158 生 物 技 术 通 报 Biotechnology Bulletin 2012 年 第 1 期 在 国 际 链 霉 菌 计 划 (ISP) 推 荐 的 7 种 培 养 基 上, 放 线 菌 菌 株 P3-2 经 28 培 养 5-7 d, 其 培 养 特 征 结 果 见 表 1 并 将 其 与 模 式 菌 株 S. recifensis ST100 [13] 进 行 对 比 表 1 菌 株 P3-2 和 S. recifensis 在 不 同 培 养 基 上 的 培 养 特 征 培 养 基 放 线 菌 株 P3-2 S. recifensis 无 机 盐 可 溶 性 淀 粉 培 养 基 生 长 差, 气 生 菌 丝 白 色, 基 内 菌 丝 浅 黄 色, 无 可 溶 性 色 素 产 生 生 长 好, 气 生 菌 丝 灰 色, 基 内 菌 丝 无 鉴 别 色 素 高 氏 一 号 培 养 基 生 长 繁 茂, 气 生 菌 丝 灰 色, 基 内 菌 丝 红 褐 色, 无 可 溶 性 色 素 产 生 NR 麦 芽 片 培 养 基 生 长 繁 茂, 气 生 菌 丝 浅 灰 色, 基 内 菌 丝 浅 黄 色, 无 可 溶 性 色 素 产 生 生 长 好, 气 生 菌 丝 灰 色, 基 内 菌 丝 无 鉴 别 色 素 察 氏 培 养 基 生 长 繁 茂, 气 生 菌 丝 浅 灰 色, 基 内 菌 丝 浅 黄 褐 色, 无 可 溶 性 色 素 产 生 NR 酵 母 膏 蛋 白 胨 培 养 基 生 长 良 好, 气 生 菌 丝 浅 灰 色, 基 内 菌 丝 浅 黄 色, 无 可 溶 性 色 素 产 生 生 长 好, 气 生 菌 丝 灰 色, 基 内 菌 丝 无 鉴 别 色 素 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 生 长 繁 茂, 气 生 菌 丝 灰 色, 基 内 菌 丝 红 褐 色, 痕 量 可 溶 性 色 素 产 生 NR 营 养 琼 脂 生 长 差, 气 生 菌 丝 浅 灰 色, 基 内 菌 丝 浅 黄 色, 无 可 溶 性 色 素 产 生 NR NR 表 示 未 见 报 道 2.2 菌 株 生 理 生 化 特 性 碳 源 的 利 用 测 定 了 菌 株 P3-2 对 多 种 供 试 碳 源 的 利 用 情 况, 结 果 见 表 2 结 果 表 明 菌 株 P3-2 能 利 用 D- 葡 萄 糖 蔗 糖 D- 甘 露 糖 肌 醇 和 甘 露 醇, 微 弱 利 用 L- 阿 拉 伯 糖 D- 果 糖, 不 能 利 用 D- 木 糖 棉 籽 糖 通 过 菌 株 P3-2 与 S. recifensis 碳 源 利 用 的 情 况 比 较 发 现, 两 者 在 能 否 利 用 D- 木 糖 肌 醇 棉 籽 糖 上 有 着 明 显 的 不 同, 除 此 以 外 其 它 指 标 是 一 致 的 表 2 放 线 菌 P3-2 和 S. recifensis 菌 株 碳 源 利 用 碳 源 放 线 菌 P3-2 S. recifensis D- 葡 萄 糖 + + 蔗 糖 + + D- 木 糖 - + D- 甘 露 糖 + NR 肌 醇 + - L- 阿 拉 伯 糖 +- + 棉 籽 糖 - + 甘 露 醇 + + D- 果 糖 表 示 利 用 ; +- 表 示 微 弱 利 用 ; - 表 示 不 利 用 ; NR 表 示 未 见 报 道 酶 学 特 性 菌 株 P3-2 能 使 明 胶 液 化 牛 奶 凝 固 与 胨 化 淀 粉 水 解 产 生 硫 化 氢 ; 但 不 能 利 用 纤 维 素 而 对 照 菌 株 S. recifensis 不 产 生 硫 化 氢 结 果 见 表 3 表 3 放 线 菌 P3-2 菌 株 和 S. recifensis 的 酶 学 特 性 生 理 指 标 放 线 菌 P3-2 S. recifensis 明 胶 液 化 + NR 牛 奶 凝 固 与 胨 化 + NR 淀 粉 水 解 + NR 纤 维 素 利 用 - NR 硫 化 氢 产 生 表 示 阳 性 反 应 ; - 表 示 阴 性 反 应 ; NR 表 示 未 见 报 道 S rdna 序 列 分 析 序 列 测 定 结 果 表 明, 菌 株 P3-2 的 16S rdna 核 苷 酸 序 列 由 bp 组 成, 将 此 序 列 提 交 到 NCBI, 在 数 据 库 GenBank 登 录 号 为 HM 用 BLAST 软 件 从 GenBank 等 数 据 库 中 进 行 序 列 相 似 性 搜 索, 发 现 P3-2 菌 株 与 S. recifensis ST100 菌 系 统 发 育 关 系 最 密 切, 两 株 菌 的 16S rdna 序 列 同 源 性 非 常 高, 达 到 99.4% P3-2 菌 株 构 建 系 统 发 育 树 所 用 的 链 霉 菌 参 考 菌 株 16S rdna 序 列 注 册 号 见 表 4 17 株 链 霉 菌 菌 株 16S rdna 序 列 构 建 的 系 统 发 育 进 化 树 ( 图 3) 2.4 抗 菌 谱 的 测 定 用 放 线 菌 P3-2 菌 株 发 酵 液 的 10 倍 稀 释 液 分 别 对 供 试 14 种 植 物 病 原 真 菌 和 4 种 细 菌 进 行 了 抑 菌 活 性 测 定, 结 果 分 别 见 表 5 表 6 结 果 表 明, 该 菌 株 所 产 生 的 抗 生 素 对 供 试 的 病 原 真 菌 具 有 广 谱 抑 菌 活 性 其 中 对 油 菜 菌 核 病 菌 黄 瓜 灰 霉 病 菌 水 稻 纹 枯 病 菌 半 夏 立 枯 病 菌 的 抑 制 率 高 达 99% 以 上, 对 小 麦 赤 霉 病 菌 和 苹 果 腐 烂 病 菌 抑 制 率 为 90% 以 上,
4 2012 年 第 1 期 叶 胜 蓝 等 : 土 壤 放 线 菌 P3-2 的 分 类 鉴 定 及 抗 菌 活 性 研 究 159 对 烟 灰 霉 病 菌 玉 米 小 斑 病 菌 等 8 种 病 原 真 菌 均 有 不 同 程 度 的 抑 制 作 用, 对 革 兰 氏 阳 性 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 蜡 状 芽 孢 杆 菌 和 枯 草 芽 孢 杆 菌 有 一 定 的 抑 制 作 用, 尤 其 对 蜡 状 芽 孢 杆 菌 的 抑 制 效 果 较 好, 对 革 兰 氏 阴 性 的 大 肠 杆 菌 无 效 表 4 菌 株 P3-2 构 建 系 统 发 育 树 所 用 链 霉 菌 属 16S rdna 序 列 注 册 号 种 名 注 册 号 菌 株 编 号 同 源 性 (%) Streptomyces lanatus AJ ISP Streptomyces lanatus AB NBRC Streptomyces miharaensis AB NBRC Streptomyces diastatochromogenes subsp. luteus AB NBRC Streptomyces roseochromogenus subsp. albocyclini AB NBRC Streptomyces misawanensis AB NBRC Streptomyces triostinicus EU CKM7 99 Streptomyces recifensis EU ST Streptomyces rameus AB NBRC Streptomyces hawaiiensis EU NRRL Streptomyces chrestomyceticus AY NRRLB Streptomyces corchorusii AB NBRC Streptomyces fimbriatus AB NBRC Streptomyces spinichromogenes AB NBRC Streptomyces capoamus AB NBRC Streptomyces galbus AB NBRC 图 3 基 于 16S rdna 核 苷 酸 序 列 构 建 的 菌 株 P3-2 系 统 发 育 树 分 析
5 160 生 物 技 术 通 报 Biotechnology Bulletin 2012 年 第 1 期 表 5 菌 株 P3-2 发 酵 液 抗 菌 图 谱 测 定 结 果 供 试 病 原 菌 抑 制 率 (%) 油 菜 菌 核 病 菌 (Sclerotinia sclerotiorum) 99.6±0.2 黄 瓜 灰 霉 病 菌 (Botrytis cinerea) 99.8±0.1 小 麦 赤 霉 病 菌 (Fusarium graminearum) 94.7±0.4 水 稻 纹 枯 病 菌 (Thanatephoris cucumeris) 99.3±0.2 烟 灰 霉 病 菌 (Botrytis cinerea) 85.4±0.5 玉 米 小 斑 病 菌 (Bipolaris maydis) 84.7±0.3 马 铃 薯 晚 疫 病 菌 (Phytophthora infestans) 53.6±0.3 苹 果 腐 烂 病 菌 (Cytospora mandshurica) 91.9±0.2 辣 椒 枯 萎 病 菌 (Fusarium oxysporum) 89.1±0.2 半 夏 立 枯 病 菌 (Rhizoctonia solani) 99.7±0.1 莴 苣 黑 斑 病 菌 (Stemphylium chisha) 35.8±0.4 烟 草 赤 星 病 菌 (Alternaria alternate) 55.9±0.2 玉 米 大 斑 病 菌 (Exserohilum turcicum) 63.8±0.3 甘 薯 黑 疤 病 菌 (Ceratocystis fimbriata) 79.1±0.1 供 试 样 品 浓 度 为 发 酵 液 稀 释 10 倍, 数 据 为 3 次 重 复 的 平 均 值 表 6 菌 株 P3-2 的 发 酵 液 对 细 菌 的 抑 菌 活 性 供 试 细 菌 名 称 P3-2 氨 苄 青 霉 素 (30 μg/ml) 革 兰 氏 染 色 金 黄 色 葡 萄 球 菌 阳 性 大 肠 杆 菌 - - 阴 性 枯 草 芽 孢 杆 菌 阳 性 蜡 状 芽 孢 杆 菌 阳 性 表 示 抑 菌 圈 非 常 清 晰, + + 表 示 抑 菌 圈 清 晰, + 表 示 可 看 到 抑 菌 圈, - 表 示 无 抑 菌 圈 3 讨 论 与 16 株 链 霉 菌 属 菌 株 的 16S rdna 进 行 序 列 比 对 发 现, 菌 株 P3-2 与 S. recifensis ST100 的 序 列 同 源 性 高 达 99.4% 但 是 在 对 菌 株 P3-2 的 培 养 特 征 和 生 理 生 化 特 性 的 研 究 中 发 现, 与 S. recifensis ST100 相 比, 各 项 指 标 都 存 在 着 许 多 的 不 同 : 在 国 际 链 霉 菌 计 划 推 荐 的 几 种 培 养 基 上, 模 式 菌 株 S. recifensis ST100 基 内 菌 丝 无 可 鉴 别 色 素, 而 菌 株 P3-2 基 内 菌 丝 呈 现 红 色 到 红 褐 色 ; 生 化 特 性 中, 在 碳 源 利 用 上, 菌 株 P3-2 与 模 式 菌 株 S. recifensis ST100 相 比, 对 能 否 利 用 D- 木 糖 肌 醇 棉 籽 糖 上 有 着 明 显 的 不 同 ; 在 酶 学 特 性 上, 菌 株 P3-2 对 硫 化 氢 产 生 呈 阳 性 反 应, 而 模 式 菌 株 S. recifensis ST100 对 硫 化 氢 产 生 呈 阴 性 反 应 综 合 形 态 学 特 征 培 养 特 征 生 理 生 化 特 性 等 多 相 分 类 结 果, 暂 将 菌 株 P3-2 初 步 鉴 定 属 于 链 霉 菌 属 S. recifensis ST100 的 亚 种, 命 名 为 Streptomyces sp. P3-2 菌 株 P3-2 确 切 的 分 类 学 地 位 还 有 待 于 与 S. recifensis ST100 之 间 DNA-DNA 杂 交 的 数 据 进 行 分 析 比 较 每 种 拮 抗 菌 都 有 自 己 的 抗 菌 谱 抗 菌 谱 的 测 定 可 以 为 拮 抗 菌 的 使 用 范 围 提 供 实 验 依 据 选 用 黄 瓜 灰 霉 菌 等 14 种 植 物 病 原 真 菌 和 金 黄 色 葡 萄 球 菌 等 4 种 细 菌 作 为 供 试 菌, 对 P3-2 菌 株 发 酵 液 的 抗 菌 活 性 进 行 测 定, 结 果 表 明 P3-2 菌 株 的 发 酵 液 的 抗 真 菌 谱 较 广, 对 油 菜 菌 核 病 菌 黄 瓜 灰 霉 病 菌 小 麦 赤 霉 病 菌 水 稻 纹 枯 病 菌 苹 果 腐 烂 病 菌 和 半 夏 立 枯 病 菌 具 有 较 强 抑 制 作 用, 抑 制 率 都 达 90% 以 上, 对 辣 椒 枯 萎 病 菌 等 也 呈 现 出 不 同 程 度 的 抑 制 作 用 选 定 的 4 种 细 菌 中, 对 革 兰 氏 阳 性 细 菌 如 蜡 状 芽 孢 杆 菌 作 用 较 好, 有 较 强 的 抑 制 作 用, 对 金 黄 色 葡 萄 球 菌 和 枯 草 芽 孢 杆 菌 也 有 不 同 程 度 的 抑 制 作 用, 但 对 革 兰 氏 阴 性 的 大 肠 杆 菌 无 作 用 微 生 物 源 农 药 具 有 高 效 低 毒 低 残 留 环 境 友 好 等 优 点, 近 几 十 年 一 直 备 受 人 们 的 关 注 而 放 线 菌 的 次 生 代 谢 产 物 是 微 生 物 源 农 药 的 重 要 来 源, 通 过 对 其 天 然 产 物 活 性 物 质 的 筛 选, 所 获 得 的 新 型 药 物 可 以 引 导 许 多 医 用 和 农 用 药 物 的 开 发 [15,16] 链 霉 菌 又 是 放 线 菌 中 产 活 性 物 质 最 多 的 一 个 属, 作 者 分 离 得 到 的 Streptomyces sp.p3-2 菌 株 抑 菌 谱 之 广, 可 进 一 步 对 其 发 酵 液 中 活 性 组 分 进 行 分 离, 有 望 开 发 成 杀 菌 谱 广 的 农 用 或 医 用 的 抗 生 素 4 结 论 从 贵 州 高 原 土 壤 中 分 离 得 到 的 具 有 抑 菌 活 性 的 放 线 菌 P3-2 菌 株 进 行 了 分 类 鉴 定 和 抗 菌 活 性 的 研 究 发 现 菌 株 P3-2 的 形 态 特 征 培 养 特 征 以 及 生 理 生 化 特 征 表 现 出 链 霉 菌 属 的 典 型 特 征, 属 于 烬 灰 类 群 参 考 文 献 [1]Perlman D. Advances in applied microbiology[m]. NewYork: Academic, 1974: [2] 姜 怡, 徐 平, 娄 恺, 等. 放 线 菌 药 物 资 源 开 发 面 临 的 问 题 与 对 策. 微 生 物 学 通 报,2008,35(2): [3]Lazzarini A, Caveletti L, Toppo G, et a1.rare genera of actinomycetes
6 2012 年 第 1 期 叶 胜 蓝 等 : 土 壤 放 线 菌 P3-2 的 分 类 鉴 定 及 抗 菌 活 性 研 究 161 as potential producers of new antibiotics. Antonie van Leeuwenhock, 2000,78: [4]Barakate M, Ouhdouch Y, Oufdou KH, et a1. Characterization of rhizospheric soil streptomycetes from Moroccan habitats and their antimicrobial activities. World J Microbiol Biotechnol,2002, 18: [5] 汪 江 峰, 张 玲 玲, 黄 剑. 放 线 菌 P3-2 的 抗 菌 活 性 筛 选 及 发 酵 稳 定 性 研 究. 现 代 农 业 技 术,2010,6: [6] 杜 连 祥. 微 生 物 实 验 技 术 [M]. 北 京 : 中 国 轻 工 出 版 社,2006: 165. [7] 徐 丽 华, 李 文 均, 刘 志 恒. 放 线 菌 系 统 学 原 理 方 法 及 实 践 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社,2007: [8] 周 德 庆. 微 生 物 学 实 验 手 册 [M]. 上 海 科 学 技 术 出 版 社,1983: [9]Weisburg WG, Barns SM, Palletier DA, Lane DL. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J Bacteriology, 1991, 173: [10] 中 国 科 学 院 微 生 物 所 放 线 菌 分 类 组. 链 霉 素 鉴 定 手 册 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社,1975: [11] 陈 华 保, 张 敏, 杨 春 平, 吴 文 君. A 2 C 菌 株 杀 菌 活 性 研 究 及 菌 株 初 步 鉴 定. 江 苏 农 业 科 学,2007,2: [12]Suthindhiran K, Kannabiran K. Hemolytic activity of Streptomyces VITSDK 1 spp. Isolated from marine sediments in Southern India. J Mycol Med, 2009, 19: [13] 布 坎 南 RE, 吉 本 斯 NE, 等. 伯 杰 细 菌 鉴 定 手 册 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社,1984. [14] 阎 逊 初. 放 线 菌 的 分 类 和 鉴 定 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社,1992. [15]Clardy J, Walsh C. Lessons from natural molecules. Nature, 2004, 432: [15]Cragg GM, Newman DJ, Snader KM. Natural products in drug discovery and development. J Nat Prod, 1997, 60: ( 责 任 编 辑 李 楠 )
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